Poissons zèbres
Création et maintien de lignées de poisson zèbre pour étudier le rôle de différents gènes impliqués dans un type de mémoire, l’habituation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour créer et entretenir des lignées de poissons zèbres privés de gènes liés à l'habituation, une forme de mémoire, 8 700 individus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Cent d'entre eux au maximum subissent à deux mois, sous anesthésie, le prélèvement d'un fragment de nageoire caudale, seul geste invasif du protocole. Les poissons dépourvus de la double mutation recherchée sont tués aussitôt, les reproducteurs à douze mois pour éviter les signes de vieillissement. Le porteur annonce vouloir démontrer que ces invalidations génétiques n'entraînent aucun mal-être, sans expliquer comment le total de 8 700 individus se rapporte aux cinquante reproducteurs par génération qu'il dit suffisants pour maintenir les lignées.
Objectifs
Le poisson zèbre, quand il est soumis à des éclairs ou des bruits, réagit en changeant de direction. Lorsqu'il est soumis de façon répétée à ces stimuli, cette réponse diminue, formant un type de mémoire connu sous le nom d’habituation. Suite à la recherche de gènes impliqués dans cette habituation, nous étudions 12 protéines d'intérêt. Dans ce projet, nous voulons générer des poissons zèbres avec des neurones où les gènes codant ces protéines d'intérêt seront ciblés et remplacés par un marqueur fluorescent. Cela nous permettra d'étudier le rôle de ces protéines invalidées sur l'habituation en évitant le prélèvement d'un petit morceau de la nageoire caudale. L’autre objectif sera de montrer que les poissons doublement mutants pour ces gènes ne présentent aucun effet délétère indésirable et donc que l'invalidation de ces gènes n'entraine aucun mal-être chez l'animal alors même qu'ils ont des problèmes d'habituation.
Bénéfices attendus
Les défauts d'habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l'Homme nous montrent l'importance de cette étude. En comparaison des lignées classiques invalidées pour ces gènes, la création de ces lignées nous permettra non seulement de comprendre où sont localisées les protéines qui nous intéressent mais aussi d'éviter de recourir à une biopsie de la nageoire caudale. La création de poissons doublement mutants nous permet de montrer que le bien-être des poissons mutants générés n'est pas impacté.
Procédures
Seuls 100 poissons âgés de 2 mois issus de la génération 3, subiront le prélèvement d'une partie infime de leur nageoire caudale, sous anesthésie générale, afin de ne garder que les individus porteurs des doubles mutations. Le temps total de réalisation de la biopsie sera de moins de 2 min et il s’agit là du seul geste invasif qu’auront à subir ces poissons-zèbres au cours de leur vie.
Impact sur les animaux
Pour l'ensemble des animaux de ce projet (génération et élevage d'individus mutants), il sera évalué en continu si les mutations ainsi créées engendrent des souffrances chez l'animal. Les poissons dés la 2e génération seront issus d'un croisement entre un poisson sélectionné pour sa fluorescence dans les neurones à l'état larvaire avec un poisson de type "sauvage" ne présentatnt pas de fluorescence. Les poissons sélectionnés pour mener le projet le seront sur la base de la présence de fluorescence dans les neurones à l'état larvaire. La réalisation d'une biopsie de la nageoire caudale, effectuée sous anesthésie générale, à l'âge de 2 mois pour certains animaux (100 maximum) peut entrainer des nuisances légères comme un réveil trop long ou une reprise de nage inhabituelle, des lésions suite à la biopsie ou la non repousse de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Les nuisances ou effets indésirables sont extrêmement rares avec ce protocole établi et utilisé en routine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à 12 mois pour éviter l'apparition de signes de vieillissement et donc d'impacter le bien-être des animaux. Les animaux ne présentant pas d'intérêt sur le plan génétique (absence de double mutations) seront mis à mort directement.
Remplacement
L'étude de la mémoire et du comportement ne peut pas être réalisée in vitro (sur des cellules en culture) et implique nécessairement l'utilisation de modèles animaux vivants. En effet, la complexité des connexions neuronales ne peut-être reproduit in vitro. Le poisson zèbre représente le modèle le plus simple de cerveau nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés sachant que le cerveau et le génome du poisson zèbre présente des similarités importantes avec celui de l'Homme.
Réduction
Une sélection des embryons âgés de moins de 5 jours présentant une fluorescence appropriée dans les neurones permettra de réduire drastiquement le nombre d'individus à élever au delà de 5 jours de développement en ne gardant uniquement que les poissons d'intérêt. Un nombre minimum d'individus est élevé pour maintenir la lignée (50 par génération) et obtenir des alevins nécessaires aux études de comportement réalisés avant 5 jours de développement et donc hors champ réglementaire. Pour le maintien des lignées, une nouvelle génération est réalisée tous les 8 mois ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre total de générations et donc d'individus. Pour l'étude de l'existence de nuisances chez les double mutants, seul le nombre minimum d'animaux nécessaires au maintien des lignées (soit 100 maximum) subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale.
Raffinement
D'après notre expérience précédente, il n'est pas attendu d'effets délétères indésirables chez les poissons-zèbres générés et conservés. Le prélèvement d'un petit morceau de la nageoire caudale sera le seul geste invasif fait sous anesthésie générale sur 100 animaux maximum et une seule fois dans leur vie.A la suite de la réalisation d'un prélèvement de la nageoire caudale, les poissons sont maintenus deux par deux dans un bac, avec un séparateur entre les deux, pour une durée maximale de 24h, afin d'éviter le stress de l'isolement. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière des individus tout au long du projet pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt de souffrances bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.
Choix des espèces
Les gènes de l'Homme et du poisson zèbre présentent de grandes similarités, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier le fonctionnement du système nerveux humain. La fécondation externe, avec des pontes de plus de 100 œufs, permet de générer rapidement de nombreux individus par rapport à d'autres modèles tels que la souris et ainsi d'obtenir des résultats statistiquement très robustes. Enfin, la transparence optique des larves permet un suivi non invasif en temps réel du système nerveux en développement, ce qui permet de relier les événements dans les neurones avec le comportement d'apprentissage de l'animal. Notre objectif est de maintenir des couples reproducteurs qui nous permettront de générer des individus de moins de 5 jours pour les études de comportement/apprentissage (hors cadre réglementaire). Aussi, les reproducteurs seront gardés jusqu'à 12 mois et avant l'apparition de signes de vieilliesse. Pour les individus subissant une biopsie de la nageoire caudale, celle-ci sera réalisée à 2 mois de développement de l'individu. Cet âge permet d'avoir un individu de taille conséquente, de réduire la taille du fragment prélevé et donc la gêne engendrée par cet acte et une régénération optimale de la nageoire ainsi amputée.
Création et maintien de lignées avec phénotype potentiellement dommageable chez Danionella cerebrum et Danio rerio et Génotypage chez le Danio rerio
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Autres poissons : 7500
Élevés sur place pour alimenter les projets de neurobiologie de l'institut, 68 750 poissons zèbres et 7 500 Danionella cerebrum vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Les Danio rerio génotypés subissent une biopsie de la nageoire caudale à vif, un prélèvement par individu, qui peut provoquer un déséquilibre de nage dans les premières secondes. Une partie de ces poissons est tuée, une autre sert de reproducteurs dans les projets pour lesquels les lignées ont été créées. Le porteur reconnaît que les effets des mutations ne sont pas connus au moment où les lignées sont générées, estime à moins de 1 % la part de lignées qui développeront des caractéristiques dommageables, et fonde l'effectif de 76 250 poissons sur son expérience de l'élevage.
Objectifs
Les projets scientifiques des équipes de recherche de notre institut visent à comprendre l’organisation anatomique et fonctionnelle des circuits neuronaux et visuels ainsi que leurs mécanismes moléculaires sous-jacents. Danio rerio et Danionella cerebrum sont deux espèces de poisson adaptés à la modélisation de maladies humaines du système nerveux et visuel via des techniques de mutagénèse. La création, le maintien des lignées et l’étude des caractéristiques génétiques des lignées créées sont nécessaires à la réalisation des différents projets de recherche de l’Institut. Le Danio a environ trois-quarts de son génome en commun avec l’Homme, il est transparent durant les premiers jours de vie ce qui facilite les études par imagerie sur ces lignées. L’utilisation de l’espèce Danionella, permettra quant à elle, de réaliser des études in-vivo à long terme, en prenant avantage de la transparence de l’espèce tout au long de sa vie
Bénéfices attendus
Les lignées génétiquement modifiées crées dans le cadre de cette demande seront des outils précieux pour les différents projets de recherche du laboratoire. Elles permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement et fonctionnement du système visuel et nerveux central du Danio et du Danionella. La forte homologie structurelle et fonctionnelle avec celui des mammifères, dont l’Homme, aidera à la compréhension des mécanismes fondamentaux impliqués dans le développement et permettra de mieux comprendre sa mise en place afin d’apporter des pistes de recherche pour certaines maladies humaines et ainsi faire progresser les traitements.
Procédures
La biopsie de la nageoire caudale est réalisée sur des animaux vigiles. Un seul prélèvement sera réalisé par individu et ce geste est pratiqué en moins d’une minute par du personnel habilité.
Impact sur les animaux
Les effets des mutations crées ne sont pas clairement connus au moment de la génération de la lignée. Certaines des lignées (moins de 1 pour cent) peuvent développer des caractéristiques ayant un impact négatif. La biopsie de la nageoire caudale peut provoquer un léger déséquilibre de nage lors des premières secondes
Devenir
Les animaux sont soit euthanasiés, soit utilisés comme reproducteurs dans des projets pour lesquels ils ont été générés.
Remplacement
Les projets scientifiques des équipes de recherche consistent à comprendre l’organisation anatomique et fonctionnelle des circuits neuronaux et visuel ainsi que leurs mécanismes moléculaires sous-jacents. Les techniques alternatives in-vitro, ne peuvent pas remplacer la complexité d’un organisme vivant avec ses interactions cellulaires. Dans les projets de recherche de nos équipes, l’utilisation de certaines espèces de poissons est particulièrement adaptée à leurs études du fait de leurs caractéristiques ( fécondation et développement externe, transparence des œufs et leur grande capacité proliférative).
Réduction
Au cours du projet, nous élèverons 76 250 animaux. Ce nombre d’individus élevé est basé sur notre expérience de l’élevage et de la création de nouvelles lignées chez les espèces utilisées. Nous élèverons le nombre minimum d’individus pour générer les lignées de poissons avec les caractéristiques génétiques voulues et nécessaires aux études des chercheurs afin d’obtenir des résultats significatifs et scientifiquement interprétables. Pour le zebrafish : Nous estimons à 20 le nombre de lignées qui seront nouvellement créées par année. Nous possédons également à l’heure actuelle 50 lignées, ce qui représente 68750 zebrafish au total. Pour le danionella : Nous estimons à 5 le nombre de lignées qui seront nouvellement créées par année pour cette espèce. Pour cette espèce nous élèverons 7500 animaux au cours du projet.
Raffinement
Les animaux concernés par les procédures décrites ici feront l’objet d’une surveillance accrue. En cas de signe de mal-être d’un poisson, des actions sont menés afin de réduire le stress ou la douleur des individus concernés soit par un hébergement individuel avec présence d’analgésiant temporaire, soit par l’euthanasie par surdose d’anesthésiant de ce dernier. Nous évaluons notamment les paramètres suivants : nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Pour éviter la détérioration de l’eau lors du co hébergement, l’eau des aquariums, sera renouvelé toutes les 48 heures. Pour les nouvelles lignées, l’évaluation de l’apparition de caractéristiques avec un impact négatif sur l’individu sera réalisée sur la seconde génération au stade larvaire et à 12 mois. L’évaluation du bien-être des animaux sera réalisé avec la structure du bien-être animal de l’établissement.
Choix des espèces
Le génome du zebrafish présente soixante-dix pour cent d’homologie avec celui de l’Homme, et près des quatre-vingt-dix pour cent des gènes impliqués dans une maladie humaine y sont présents. L’espèce présente également l’avantage de se reproduire facilement avec une maturation sexuelle rapide. La fécondation, le développement externe et la transparence des œufs sont également des atouts majeurs de ce modèle pour l’étude de la neurobiologie par le développement et la création de lignées transgéniques Le Danionella cerebrum a de nombreux points communs avec le zebrafish. Leur proximité phylogénétique permet une transposition facile des techniques scientifiques. Il est moins prolifique mais à l’avantage d’être dépourvu de pigment tout au long de sa vie. Son crâne étant cartilagineux, permet un accès direct pour l’imagerie in-vivo chez l’adulte Le maintien des lignées génétiquement modifiées de zebrafish ou de danionella nécessite des animaux en âge de se reproduire soit entre 3 et 24 ou 36 mois. La création de lignées est réalisée au stade 1 cellule (entre 15 et 45 min après la ponte). La biopsie caudale nécessaire au génotypage sera réalisée dès que les animaux auront atteint une taille suffisante pour limiter l’impact de celle-ci sur la nage des poissons, soit entre 3 et 6 mois
Essai de toxicité aux premiers stades de la vie sur le poisson zèbre Danio rerio
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Nage en tire-bouchon, convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème, hémorragie : ces signes déclenchent la mise à mort du poisson concerné. 8 640 poissons zèbres vont être utilisés, 4 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 2 880 un niveau modéré et 1 440 un niveau léger, tous tués à l'issue. Des œufs fraîchement fécondés sont exposés à cinq concentrations d'un produit chimique pendant environ trente jours après l'éclosion, la gamme étant calée pour que la plus faible concentration produise environ 10 % d'effet et la plus forte environ 90 %. Le test répond à l'obligation réglementaire REACH pesant sur des monomères que l'entreprise produit et qu'elle ne pourrait plus vendre en Europe sans lui.
Objectifs
Le test OCDE 210 est destiné à déterminer les effets létaux et sub-léthaux des produits chimiques sur les stades de développement de l'espèce étudiée (ici le poisson zèbre) et consiste à exposer des poissons aux premiers stades de leur vie à une série de 5 concentrations du produit chimique dissout dans l’eau, les effets étant comparés à un lot témoin non exposé. Ce test fait partie d’un ensemble de tests d’écotoxicité imposé par certaines réglementations (REACh notamment), il n’est réalisé qu’à la demande des autorités compétentes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de réaliser les tests selon la ligne directrice OCDE 210 et de répondre ainsi à une exigence réglementaire qui consiste à caractériser les dangers et risques associés à la production et l’utilisation de nos produits. En absence de réponse à cette exigence, ces substances ne pourront plus être produites et/ou utilisées en Europe (les substances concernées sont des monomères produits par notre société et relevant notamment du règlement REACh qui s’applique aux produits chimiques hors biocides et produits phytosanitaires).
Procédures
Le test consiste à exposer des oeufs fraichement fécondés à une série de 5 concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau, pendant environ 30 jours après l’éclosion. Les points d’observation suivants, spécifiés dans la ligne directrice, seront relevés : - Éclosion et survie : dénombrement quotidien des éclosions et des survivants. Les oeufs moisis, embryons et larves morts seront retirés dès qu’ils sont repérés. - Apparence anormale : dénombrement (à minima 3 fois par semaine) des larves et juvéniles présentant une anomalie corporelle. En cas de malformations et apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, celui-ci sera retiré de l’essai et euthanasié. - Comportement anormal : hyperventilation, nage mal coordonnée, immobilité ou comportement alimentaire atypiques seront notées à minima 3 fois par semaine. - Poids & longueur totale : après euthanasie des poissons ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'essai.- Paramètres physico-chimiques pH, oxygène dissous et température : mesure quotidienne. Les effets léthaux et subléthaux sont évalués et comparés aux valeurs témoin pour déterminer la concentration la plus basse pour laquelle on observe un effet, et la concentration sans effet observé.
Impact sur les animaux
Selon les substances et les concentrations testées, les nuisances attendues tout au long de la période d’essai peuvent être les suivantes : stress, douleur, comportement anormal, ralentissement anormal de la croissance (en termes de taille et de prise de poids). Parmi ces atteintes, seules celles définies comme étant des points limites auront pour conséquence une euthanasie des organismes concernés. Le protocole d'essai est clairement établi et ne peut être dérogé sous peine d'invalidité du test réalisé. La gamme d’essai étant choisie de sorte que la plus faible concentration testée ait environ 10% d’effet et la plus forte concentration environ 90%, nous considérons que les animaux exposés aux 2 plus faibles concentrations subiront un degré de gravité modéré et les animaux exposés aux 3 concentrations les plus élevées un degré sévère. Les organismes témoins subiront un degré de gravité légère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés ne peut pas être réutilisés et doit être euthanasiés.
Remplacement
Ce test est une exigence réglementaire imposé par les autorités compétentes. Aucun test in vitro n’ayant été validé par les autorités, il ne sera procédé à aucun test in vitro en amont. Le test de toxicité selon la ligne directrice OCDE 210 est le seul test validé par les autorités compétentes, il n’est réalisé que sur leur autorisation, obtenue pour chacune des substances testées. De même, il n'existe pas de modélisation validée pour remplacer l'utilisation d'animaux.
Réduction
Pour chaque test, le nombre d'animaux utilisé est défini par le protocole d'essai et ne peut être diminué. Cependant, la ligne directrice autorise la possibilité de réaliser un pé-test permettant de définir les conditions exactes du test définitif, notamment la gamme de concentrations. Ce prétest est réalisé sur un nombre de concentration et de réplicat plus faibles. Afin de limiter le recours à ce test préliminaire, , nous définissions nos gammes de concentrations à partir de données de toxicité aiguë déjà disponibles sur chacune de nos substances et obtenues sur d’autres organismes (algues et daphnies notamment) mais également sur des poissons adultes de la même espèce. Ce processus permet également de réduire le risque d’invalidation d’un test dans le cas où la gamme de concentrations choisie ne permettrait pas d’atteindre les objectifs (par exemple dans le cas de concentrations trop élevées qui entraineraient une mortalité excessive ne permettant pas d’analyses statistique fiable. Dans cette situation nous serions obligé de recommencer le test et donc d’augmenter le nombre d’animaux utilisés).
Raffinement
Les organismes géniteurs sont commandés auprès de fournisseurs disposant de l’agrément européen. Dès réception, les poissons sont transférés dans un local indépendant où se situe le système d’hébergement. Ils sont d’abord versés dans un aquarium « tampon », puis l’eau de transport est progressivement diluée avec l’eau provenant du système d’hébergement (on remplace 1L tous les 1/4h environ). Les poissons sont maintenus dans un milieu à 50% de dilution pendant au moins 30 minutes puis sont transférés à l’aide d’une épuisette dans le système d’hébergement final (environ 6 individus par bac de 3.5L). Une période d’observation de 2 semaines minimum est respectée afin de valider le lot reçu. Le système d’hébergement est une armoire spécifiquement dédiée à l’hébergement des poissons, composée de racks d’aquariums de 3.5L sous lesquels un visuel de gravier a été ajouté pour améliorer le bien-être des animaux. Le système régule la température à 26°C et le renouvellement du milieu (composé d’eau osmosé et de sels minéraux); des sondes associées à un système d’alarme contrôlent en permanence la température, le pH et la conductivité. Les techniciens contrôlent à minima une fois par semaine les paramètres oxygène dissous, nitrates, nitrites, ammoniaque et dureté. Ils assurent également quotidiennement l’apport en nourriture (aliment en poudre, daphnies et artémias). Une photopériode de 16h de jour/8h de nuit est appliquée automatiquement. Les organismes soumis au test OCDE 210 (organismes témoins et organismes exposés à la substance testée) seront placés dans des aquariums nus (sans visuel de gravier) et maintenus dans les mêmes conditions environnementales que les géniteurs, de sorte que seule la concentration de la substance testée peut avoir un impact. Les comportements et anomalies suivants ont été définis comme des points limites nécessitant une euthanasie des individus concernés (dans le cadre de l’hébergement et des tests de toxicité) : nage « en tire-bouchon », convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème et hémorragie. Dans le cadre de raffinement, la nourriture vivante (rotifère et artémies) est privilégiée.
Choix des espèces
Cette espèce est l'une de celles recommandées par la ligne directrice. Elle est employée par le laboratoire depuis plus de 20 ans pour d'autres projets (dont le test de toxicité aiguë sur adultes). La ligne directrice impose d'exposer les organsimes au produit chimique depuis le stade oeuf fécondé jusqu'au stade juvénile (soit environ 30 jours après l'éclosion).
Evaluation des effets combinés des stress thermique, chimique et radiologique chez le poisson modèle Danio rerio
- Protection de l’environnement
Exposés jusqu'à trente jours à la chaleur, à des substances chimiques et à un rayonnement gamma, 6 960 poissons zèbres vont être utilisés, 6 528 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 432 un niveau sévère. La mortalité des larves fait partie du protocole, établir les relations dose-réponse supposant, écrit le porteur, d'obtenir 100 % de l'effet recherché. Il affirme par ailleurs que les poissons adultes ne ressentent pas de douleur dans cette procédure, et indique que l'anesthésie et l'analgésie des embryons et des larves resteraient difficiles à appliquer, puisqu'elles masqueraient les effets recherchés. Tous les poissons exposés sont tués à l'issue, les embryons témoins également, pour les analyses moléculaires.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment différents facteurs de stress affectent les écosystèmes aquatiques. Ces écosystèmes sont exposés à des produits chimiques et à des radiations. Le changement climatique augmente la température, ce qui perturbe la vie des animaux et rend les produits chimiques plus toxiques. Habituellement, on étudie la toxicité de chaque substance séparément. Ce projet veut voir comment ces substances interagissent ensemble, soit en augmentant, soit en diminuant leurs effets. Des études précédentes sur le poisson ont montré des résultats intéressants. Ce projet complète les recherches en cours sur les effets combinés des radiations et de la chaleur sur les poissons.
Bénéfices attendus
Ce projet confronte la méthodologie de l’évaluation du risque actuellement en cours. Il devrait fournir une réponse sur la nature des interactions entre le stress ionisant et d’autres stresseurs (substances chimiques, stress thermique) présents dans les écosystèmes aquatiques.
Procédures
Les animaux seront exposés à 3 stresseurs combinés pendant maximum 8 jours pour les larves et 30 jours pour les adultes.
Impact sur les animaux
La méthodologie de protection de l’environnement nécessité l’identification d’effets phénotypiques ayant des conséquences sur la structure et le fonctionnement des écosystèmes. Il conviendra d’acquérir des données sur la mortalité des stades précoces. La construction des relations dose/réponse (mortalité) nécessite d’obtenir 100 % de l’effet recherché. L’exposition parentale contribue à la radiosensibilité des stades précoces, conduisant à la mortalité des larves. Ainsi, certaines conditions expérimentales conduiront à la mortalité des larves. D’autres conditions d’exposition conduiront à des effets sublétaux, sans conduire à la mort de l’animal : retard dans l’éclosion, croissance impactée (ralentissement).
Devenir
Les embryons utilisés dans le projet seront produits par les poissons zèbres adultes de notre animalerie. Excepté pour les conditions contrôles, les embryons seront exposés à différents stresseurs, nécessitant leur euthanasie à l’issue des 8 jours d’expérimentation post fertilisation. La recherche des effets moléculaires nécessite l’utilisation des embryons « contrôles ». Il en est de même pour le stade adulte.
Remplacement
Le projet utilise un modèle animal in vivo pour mesurer des effets phénotypiques délétères en lien avec la perturbation de la structure et/ou du fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Il n’existe pas de méthodologie pour déterminer de telles perturbations sans utiliser de modèle animal.
Réduction
Les travaux antérieurs ont permis de déterminer le nombre d’individus (embryons et adulte) nécessaires aux expérimentations. Les effets subtils de l’irradiation gamma nécessitent d’utiliser au moins 72 embryons/larves par condition afin de mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. Le retour d’expérience du laboratoire montre que l’obtention régulière d’œufs nécessite la présence de 20 couples reproducteurs (procédure 1). Un minimum de 5 couples par condition est nécessaire pour obtenir suffisamment d’œufs pour la procédure 2.2.
Raffinement
Les poissons adultes ne ressentent pas de douleur dans cette procédure. Les mesures pour réduire la douleur sont donc appliquées aux poissons au stade embryonnaire et larvaire. Cependant, l'utilisation d'anesthésie et d'analgésie peut cacher les effets que les chercheurs cherchent à observer, ce qui rend leur application difficile. Le suivi des limites expérimentales ou de la mortalité ne peut pas être effectué dans certaines conditions, mais il est possible dans des conditions où la mortalité n'est pas induite.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un organisme modèle régulièrement utilisé en écotoxicologie. De nombreuses données en écophysiologie, en biologie de la reproduction et des outils moléculaires performants sont disponibles. L’équipe utilise depuis de nombreuses années ce modèle animal. Contrairement aux poissons autochtones, il permet la fourniture d’œufs tout au long de l’année, facilitant la réalisation des expérimentations. De plus, son développement embryonnaire est rapide, permettant l’étude des effets de stresseurs sur ce stade biologique radiosensible. Les recherches montrent que les premiers stades de développement des animaux sont les plus sensibles aux rayonnements ionisants. Nos expériences sur le poisson confirment cette sensibilité chez les embryons et les larves. C'est pourquoi nous avons choisi de concentrer notre étude sur ces stades de développement particulièrement sensibles.
Prélèvements « invasifs » en routine pour la caractérisation génétique de poisson-zèbre génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Sur les 14 400 poissons zèbres génotypés en cinq ans, 1 440 seront tués faute de génotype intéressant, 2 880 partiront vers d'autres projets, 1 440 deviendront géniteurs. Ces poissons sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun est pêché à l'épuisette, anesthésié, amputé d'un fragment de nageoire caudale d'un millimètre, puis isolé jusqu'à trois jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress chez une espèce grégaire. Les 8 640 restants, plus de la moitié de l'effectif, sont annoncés comme "écartés à différentes étapes", entre vieillissement naturel et "gestion standard de la colonie".
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés pour étudier le rôle des gènes dans la santé humaine, animale et l’environnement. Ces animaux sont élevés dans des conditions spécifiques pour répondre aux besoins de la recherche scientifique. Ils sont sélectionnés pour des caractéristiques précises, comme leur fertilité et leur capacité à produire des portées, afin de fournir des groupes d’animaux adaptés aux objectifs des projets. Dans ce projet, les animaux sont étudiés pour mieux comprendre le rôle de certains éléments génétiques dans des maladies comme le cancer, le vieillissement et les troubles du comportement. Pour cela, des échantillons de nageoires sont prélevés sur les poissons pour analyser leur génétique et déterminer la présence de mutations ou de gènes modifiés. Les recherches portent sur trois grands axes : comprendre l'impact de certains gènes sur le cancer de la peau (mélanome), étudier leur rôle dans le vieillissement, et explorer comment des changements génétiques influencent la santé intestinale et le comportement des poissons. Ces études aideront à faire avancer nos connaissances dans des domaines comme la lutte contre le cancer, le vieillissement et l’étude des interactions entre gènes et microbiome intestinal.
Bénéfices attendus
Ce projet de prélèvement de tissus pour identification permet de sélectionner les poissons génétiquement modifiés et ainsi d'optimiser la gestion et l’élevage des animaux destinés aux expérimentations futures. Le prélèvement de nageoires pour l'identification est une méthode simple, fiable et minimise les risques de contamination entre les échantillons. Lorsqu'elle est scientifiquement justifiée, cette approche constitue un bon compromis, respectant les principes de réduction et de raffinement dans la recherche.
Procédures
Les animaux seront d'abord soumis à une anesthésie, d'une durée estimée à 1 à 2 minutes. Ensuite, un prélèvement de tissus sera effectué, à savoir un échantillon d'environ 1 mm de diamètre à l'extrémité de la queue, et cette procédure prendra moins de 5 minutes. Après le prélèvement, les animaux seront temporairement isolés pour garantir leur sécurité et leur bien-être, avec une durée maximale d'isolement de 3 jours. Cette période permet également de déterminer leur génotype tout en réduisant au minimum le stress pour les animaux.
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées pour pêcher le poisson, telles que l'utilisation d'une épuisette et le transfert dans un nouveau bac, induisent un stress léger. Le prélèvement d'un fragment de nageoire caudale (environ 1 mm de diamètre) entraîne une douleur légère. L'isolement des poissons pendant un maximum de trois jours pour la procédure de génotypage provoque un stress ou une angoisse légère chez cette espèce grégaire.
Devenir
Dans ce projet, nous maintiendrons 48 lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés. Chaque année, des prélèvements de nageoires seront réalisés sur 60 poissons par lignée, soit 2 880 poissons génotypés par an (48 × 60), et 14 400 poissons génotypés sur 5 ans. À l’issue du génotypage, les poissons seront répartis de la manière suivante : 576 poissons par an (soit 2 880 sur 5 ans) seront gardés en vie pour être utilisés dans des procédures expérimentales relevant d'autres demandes d'autorisation. 288 poissons par an (soit 1 440 sur 5 ans) seront gardés en vie pour devenir géniteurs, afin de maintenir les lignées. 288 poissons par an (soit 1 440 sur 5 ans) seront mis à mort, en raison d’un génotype sans intérêt scientifique ou pour la gestion de l’élevage, avec ou sans prélèvements post-mortem. Ainsi, au total, 5 760 poissons sur 5 ans seront directement affectés (utilisés expérimentalement, conservés pour la reproduction, ou euthanasiés). Le reste des poissons génotypés (soit 8 640 poissons sur 5 ans) correspond aux animaux écartés à différentes étapes (non sélectionnés pour la reproduction ou les expériences, vieillissement naturel, gestion standard de la colonie).
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition pour des projets scientifiques d’animaux modèles génétiquement modifiés. Le remplacement ne se situe donc pas directement à ce niveau mais en amont lors du choix du modèle par les chercheurs. Nous privilégions le génotypage des larves de moins de 5 jours, car elles ne sont pas considérées comme des animaux au sens réglementaire. Cela permet d’éviter le recours aux animaux adultes et constitue une stratégie de remplacement en soi. Toutefois, lorsque des analyses génétiques plus complexes nécessitent une quantité d’ADN plus importante, nous procédons à un prélèvement de nageoires sur les adultes. Afin de limiter l’impact sur ces derniers, ces prélèvements sont réalisés de manière ciblée et optimisée : nous ne prélevons que le nombre strictement nécessaire d’adultes et effectuons un seul prélèvement par individu. Bien que l’utilisation des larves représente une alternative intéressante, elle n’est pas toujours applicable à toutes les expérimentations. En effet, les prélèvements sur ces jeunes stades peuvent présenter des risques de contamination, des résultats moins reproductibles ou affecter leur survie. C’est pourquoi, dans les cas où la fiabilité des analyses l’exige, le prélèvement sur adultes reste nécessaire mais est strictement encadré afin de minimiser son impact.
Réduction
La nomenclature est harmonisée pour éviter les redondances et la duplication de lignées proches ou identiques. Le chiffre de 2 880 poissons par an (soit 60 poissons par lignée), estimé au minimum, permet de maintenir un effectif suffisant pour garantir la diversité génétique tout en limitant la production d’animaux au strict nécessaire pour les projets scientifiques et le maintien des lignées.
Raffinement
Dans ce projet, les éléments de raffinement mis en œuvre visent à limiter le stress et la douleur des animaux. Les biopsies sont réalisées individuellement, et la méthodologie pour le prélèvement de nageoire a été améliorée en réduisant la taille de l'échantillon prélevé (environ 1 mm de diamètre) par rapport aux méthodes habituelles. Les conditions d'isolement ont également été adaptées pour permettre aux animaux de maintenir des échanges visuels avec leurs congénères. Enfin, les procédures sont réalisées par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.
Choix des espèces
Sa petite taille permet des manipulations aisées comparé à d’autres espèces de poissons. Ces dernières années, un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées, s’avérant être des outils pertinents et efficaces pour l’étude du vieillissement. Bien que le poisson-zèbre puisse vivre jusqu'à 5 ans, notre modèle tert ne dépasse pas les 20 mois. Les animaux seront utilisés aux stades larvaires et adultes. La taille du prélèvement de nageoire (environ 1 mm de diamètre) sera moins dommageable, en termes de surface prélevée et douleur, chez des adultes que chez des stades juvéniles, qui sont de plus, plus difficiles à manipuler. Cependant, l’utilisation des larves de moins de 5 jours prend en compte l’une des règles des 3R (remplacement).
Étude des circuits neuronaux et gènes impliqués dans le contrôle de la navigation et de la morphogénèse du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, isolement jusqu'à sept jours en attente du résultat de génotypage, puis placement en arène de comportement pendant six heures au maximum sous stimulations visuelles ou mécaniques. 5 520 poissons zèbres vont être utilisés, dont 500 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 5 020 dans des procédures légères. Les larves sont immobilisées dans l'agar pour l'enregistrement de leur activité neuronale, jusqu'à cinq sessions de trente minutes à deux heures, ce qui peut provoquer une baisse d'oxygénation et des tentatives de fuite, afin de relier des mutations de gènes parkinsoniens à des défauts moteurs. Une centaine de poissons adultes seront proposés à l'adoption par du personnel de l'établissement, les autres étant tués, y compris les reproducteurs maintenus jusqu'à dix-huit mois pour entretenir les lignées.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson ont des origines génétiques et environnementales, affectant la motricité, la posture et la cognition. Pour comprendre ces troubles comportementaux, un modèle animal s’impose. Nous étudions le poisson zèbre car cet organisme partage 70 pourcents de ses gènes avec l'humain et est transparent durant son développement larvaire, permettant une observation non invasive du cerveau et de la moelle épinière. Le poisson zèbre offre des avantages pour étudier la posture et la locomotion, car ses contraintes posturales et biomécaniques sont plus proches de celles des humains (bipèdes) que celles des quadrupèdes. Nous comparerons dans ce projet des poissons témoins à des mutants présentant des pertes de fonction pour des gènes identifiés chez des patients Parkinsoniens avec un développement précoce de la maladie. Nous analyserons chez ces mutants leur navigation en réponse à des stimulations sensorielles, leur capacité à capturer des proies, et examinerons les défauts des circuits moteurs sous-jacent par des techniques innovantes d’imagerie et de physiologie. Cette approche permettra d'identifier les origines des défauts du comportement moteur dans les circuits neuronaux du cerveau et de la moelle épinière et d'améliorer notre compréhension des maladies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
Ce projet offre deux bénéfices principaux : d’un point de vue translationnel pour l’humain et d’un point de vue fondamental pour augmenter nos connaissances sur les formes larvaires des poissons. D’un point de vue scientifique, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension du rôle des gènes dans l’organisation et la fonction des circuits moteurs vertébrés. Notre approche se fonde sur des résultats obtenus pour des gènes associés à la maladie de Parkinson. En vue de progresser dans notre compréhension de la maladie de Parkinson, ce projet permettra d’établir un lien entre mutations géniques et le dysfonctionnement et la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques qui affectent les circuits moteurs. Ainsi d’un point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux traitements par stimulation ciblée génétiquement des circuits moteurs chez les patients Parkinsoniens. D’un point de vue écologique, le contrôle de la locomotion chez les poissons aux stades larvaires est très peu connu. Notre étude permettra en se focalisant sur le poisson zèbre et en le comparant à d’autres espèces grâce à des collaborations (poissons cavicoles du Mexique, poissons clown de la barrière de corail), d’établir des principes fondamentaux conservés dans la navigation larvaire des espèces aquatiques.
Procédures
Afin de connaitre le patrimoine génétique d’une partie des poissons potentiellement mutants, une biopsie minimale de la nageoire caudale sera réalisée sous anesthésie générale (durée de moins d’une minute par animal et une seule fois). Ils seront ensuite hébergés seuls jusqu’à réception des résultats (durée inférieure à 7 jours). Dans le but de déceler des dysfonctionnements des circuits moteurs associés à des mutations identifiées chez des patients de la maladie de Parkinson, une partie des poissons zèbre seront placés dans des arènes de comportement. Après une habituation de 30 minutes maximum, ces poissons seront soumis à des stimulations visuels ou mécaniques légères pour évaluer leur aptitude motrice et cela pendant 360 minutes maximum. Afin de comprendre l’effet des mutations génétiques sur les neurones impliqués dans le contrôle du mouvement, une partie des animaux sera placée sous un microscope afin d’enregistrer l’activité de populations de neurones par imagerie ou par électrophysiologie (une session de 30 min à 2h maximum par jour, qui sera répétée si besoin jusqu’à 5 fois).
Impact sur les animaux
Les manipulations et déplacements des aquariums nécessaires au cours du projet pourront être source de stress pour les animaux. Chez l’adulte, l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale sous anesthésie générale brève (moins de 3 minutes) peut provoquer un stress lié à la capture et une légère douleur due à la lésion de l’extrémité de la nageoire. L’anesthésie présente des risques très limités pour l’animal du fait de sa durée courte et de la sédation peu profonde. Il est possible qu’un phénotype dommageable émerge par suite des modifications génétiques générées. Les effets indésirables de nos expériences comportementales sur les larves sont le confinement dans une arène et la stimulation sensorielle qui peuvent augmenter leur stress. L’immobilisation des larves pour les enregistrements optiques et électrophysiologiques peut générer du stress lors de l’immobilisation en agar, une diminution d’oxygénation, un comportement moteur d’échappement ou une réduction des fréquences operculaire et cardiaque.
Devenir
A l’issue des manipulations, l’ensemble des animaux sera euthanasié. Des prélèvements de tissus seront effectués pour analyser l’anatomie du système nerveux. Une partie des animaux sera maintenue en vie pour être adoptée (une centaine d’animaux) si leurs caractéristiques génétiques et leur statut sanitaire le permettent. Les poissons adultes permettant le maintien des lignées sur la durée du projet seront maintenus en vie jusqu’à 18 mois, âge de fin de vie où ils seront euthanasiés.
Remplacement
Les études de mutations de la maladie de Parkinson in vitro ont permis d’observer des défauts cellulaires au niveau des mitochondries, mais n’expliquent pas la source des défauts moteurs et ne permettent pas d’élucider quels réseaux neuronaux au sein des circuits moteurs demeurent résilients chez ces mutants. Une étude comportementale est inévitable pour comprendre comment des mutations génétiques entrainent des défauts moteurs. Pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents aux pertes de fonction motrice, il est nécessaire de procéder à la perte de fonction du gène ciblé dans des animaux modèles car posture, locomotion ou cognition ne peuvent être évidemment récapitulées in vitro. Pour l’étude du tronc cérébral dans le contrôle moteur, le poisson zèbre (Danio rerio) est un organisme génétique modèle dont le génome comporte 70 pourcents de conservation avec celui de l’être humain. L’analyse du comportement du poisson zèbre porteurs de mutations de gènes candidats parkinsoniens en comparaison à des animaux intacts permettra ainsi d’associer ces mutations à des défauts moteur.
Réduction
Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux pour notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure. Pour cela nous nous sommes basés sur un calcul de puissance statistique prenant compte de l’amplitude des effets et de la variabilité du comportement afin d’avoir le nombre minimal d’individus pour détecter un effet. Pour diminuer le nombre d’adultes à élever, si cela est compatible avec les mutations générées, nous génotyperons dès le stade larvaire ce qui permettra de n’élever que des poissons d’intérêts (poissons porteurs des mutations d’intérêt et témoins sains. Pour identifier avec le minimum d’animaux possibles les mutations entraînant des défauts moteurs, nous utiliserons une approche de criblage reposant sur l’analyse des stades larvaires entre 5 et 7 jours de développement. Pour chaque quantification, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet sera de 5 520 poissons zèbre.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera conforme à la réglementation : en incubateur jusqu’à 6 jours puis mise en eau avec flux progressif favorisant une prise alimentaire optimale. Nous respecterons le besoin social des poissons zèbre et, quand utile, un enrichissement avec des poissons de souche différente aura lieu pour former un groupe social avec un sexe ratio optimal. Les poissons en aquarium seront nourris 2 à 3 fois par jour avec une nourriture adaptée à leur taille et stade physiologique. Surveillés chaque jour, ils sont hébergés dans des conditions précautionneuses : suivi des paramètres physico-chimiques de l’eau journalier et contrôle sanitaire 3 fois/an. Une fois par semaine, notre équipe observera en détail les poissons mutants en vérifiant mobilité, flottabilité, prise alimentaire et morphologie adéquate pour leur âge. Nous manipulerons à minima les animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère) en plastique. Autant que possible, nous génotyperons les larves à 3 jours par « grattage » minimalement invasif de la queue pour n’élever que des poissons mutants et témoins sauvages et diminuer la variabilité de phénotypes en les séparant précocement. Quand le génotypage adulte s’impose, la biopsie de la nageoire caudale se fera sous anesthésie générale via des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec outils désinfectés. Nous n’inclurons dans nos procédures expérimentales que des larves ou adultes en apparente bonne santé. Les animaux auront une période d’habituation adéquate au changement environnemental dans les chambres de comportement et d’imagerie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Afin de limiter l’inconfort des animaux et de diminuer la douleur lorsque des enregistrements par imagerie et électrophysiologie, les larves seront anesthésiées durant toutes les phases de manipulation et de préparation des enregistrements. L’anesthésie sera graduellement levée une fois que l’animal sera préparé. Afin d’offrir une fin de vie de qualité pour nos poissons non utilisés, nous offrons la possibilité au personnel formé et sensibilisé aux bases de l’aquaculture de pouvoir recueillir des animaux adultes chez eux via un programme d’adoption dédié.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle de choix pour étudier les défauts moteurs associés à des mutations dans des gènes critiques pour le fonctionnement des neurones et conservés au sein des espèces vertébrées. Notre connaissance réduite de la structure et du fonctionnement dynamique des circuits moteurs vient notamment du fait qu’ils sont difficiles d’accès chez les mammifères. Le poisson zèbre dont le tronc cérébral et la moelle épinière restent accessibles optiquement pendant le premier mois de vie est donc un modèle de choix pour mesurer l’activité neuronale de manière dynamique et non invasive en utilisant la lumière car les circuits moteurs sont ainsi conservés au niveau moléculaire, anatomique et physiologique. Notre projet repose sur l’étude des comportements larvaires et adultes. Nous sonderon phénotypes moteurs tels que navigation et capture de proies sur des larves de 5-7 jours puis les comportements sociaux sur des larves de 21-28 jours. Nous utiliserons l’électrophysiologie et l’imagerie optique reposant sur la transparence du tronc cérébral et de la moelle épinière de la larve auront lieu de 7 à 28 jours de développement.
Etablissement d’une lignée zébrafish mutante pour l’étude d’un gène impliqué dans la sécrétion ionique par les cellules épithéliales intestinales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un fragment de nageoire coupé sous anesthésie, puis un prélèvement de sperme pour les mâles : 1 050 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet crée une lignée mutante pour un gène exprimé dans l'intestin, absent chez la souris, afin d'observer les effets de son inactivation sur le microbiote. Le porteur indique que 48 poissons seulement seront analysés après leur mise à mort, répartis entre individus mutants et non modifiés. Il ne dit rien du sort des mille autres, au-delà du fait qu'il faut selon lui "un grand nombre d'œufs" pour obtenir la mutation recherchée.
Objectifs
Un nouveau type de cellules a récemment été découvert dans l’intestin chez plusieurs espèces dont l’humain et le poisson-zèbre. Ces cellules pourraient jouer un rôle important dans le fonctionnement de l’intestin en régulant la composition du mucus, le pH et la production de substances antimicrobiennes. Elles pourraient donc avoir un impact sur le microbiote, qui est essentiel à la digestion et à la santé. Cependant, la fonction exacte de ces cellules reste inconnue, car elles ne sont pas présentes chez la souris, un modèle couramment utilisé en recherche. Pour mieux comprendre leur rôle, ce projet vise à étudier le rôle d’un gène (BEST4) spécifiquement exprimé par ces cellules chez le poisson-zèbre. Après modification génétique, l’intestin des poissons sera analysé afin d’observer les éventuels changements dans sa structure et son fonctionnement, ainsi que sur le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Aucun modèle animal n’a encore été développé pour étudier l’inactivation de ce gène. Ce projet permettra donc de mieux comprendre le rôle de ces cellules récemment découvertes dans l’intestin de nombreuses espèces. Ces nouvelles connaissances sur le fonctionnement de l'intestin pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter certaines maladies digestives, tant chez l’humain que chez l’animal.
Procédures
Les animaux sont des animaux mutants qui seront prélevés pour organes post-mortem. Il s'agit donc de créér une lignée génétiquement modifiée dont les animaux subiront un génotypage et prélèvement de sperme pour les mâles concernés.
Impact sur les animaux
Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système digestif, car ce gène est surtout exprimé dans l’intestin. Des modifications pourraient affecter la sécrétion d’ions, l’hydratation du mucus, la régulation du pH et la production de substances antimicrobiennes, ce qui pourrait influencer l’équilibre du microbiote intestinal et, par conséquent, la santé intestinale. Cependant, comme ce gène n’est pas fonctionnel chez la souris sans provoquer de troubles majeurs, il est probable que l’intestin du poisson-zèbre puisse s’adapter en compensant l’absence de ces cellules. Le genotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction de l'activité de nage. La récolte de gamètes est bien maîtrisée et ne génère pas d’inconfort ou de nuisance pour les animaux.
Devenir
Ce projet vise à étudier le fonctionnement de l’intestin après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes.
Remplacement
Les cellules intestinales peuvent être étudiées à l’aide de modèles in vitro. Toutefois, ces modèles ne reproduisent pas encore toute la complexité de l’intestin, notamment la présence d’un microbiote diversifié. Il n’existe donc pas d’alternative aux études sur l’animal pour comprendre le rôle de ces cellules dans l'intestin.
Réduction
Au total, 48 poissons seront étudiés après euthanasie, répartis équitablement entre deux groupes : des individus mutants et des individus non modifiés. Pour obtenir ces poissons, un grand nombre d'œufs doit être produit, car seuls quelques-uns porteront la mutation recherchée. Le nombre strictement nécessaire de poisson sera produit afin de garantir l'obtention des 48 poissons nécessaires aux analyses.
Raffinement
Les poissons seront élevés dans des conditions optimales, adaptées à leur espèce, en veillant à la température, à l’éclairage, à la qualité de l’eau et à la densité des aquariums (30 individus maximum par bac dans un volume de 9.5 litres). Des plantes seront ajoutées pour enrichir leur environnement. Toutes les manipulations, comme la mise en ponte ou l’anesthésie, seront effectuées rapidement afin de minimiser le stress. Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’apparition de symptômes, qu’ils soient liés ou non à la modification génétique, le poisson sera pris en charge par le vétérinaire du laboratoire, qui décidera des mesures à adopter pour préserver son bien-être.
Choix des espèces
Les études sur la physiologie digestive utilisant des techniques de modification génétique sont souvent réalisées chez la souris. Cependant, ce modèle n’est pas adapté ici, car les cellules spécifiquement étudiées sont absentes dans son intestin. Le poisson-zèbre a été choisi car ces cellules sont bien présentes dans son intestin et partagent des caractéristiques similaires avec celles des mammifères. De plus, cette espèce est idéale pour la recherche génétique en raison de sa reproduction très efficace (plus de 200 œufs par femelle), du développement rapide des embryons, et du fait qu’un individu atteint sa maturité en seulement trois mois. Enfin, le poisson-zèbre est déjà largement utilisé pour mieux comprendre le fonctionnement de l’intestin des mammifères. Dans ce projet, les analyses seront réalisées sur des animaux adultes, afin d’étudier l’intestin à un stade de développement mature.
Etude de l’impact du Phosphate dans le contexte d’une pathologie osseuse grâce à l’utilisation d’un modèle de poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Tous tués pour que leurs tissus osseux soient analysés, 2 640 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie, deux séances d'imagerie sous anesthésie et un mois et demi de régime pauvre ou riche en phosphate. Une partie d'entre eux porte une mutation responsable d'une pathologie osseuse, et le porteur range les malformations squelettiques attendues parmi les nuisances, au même rang que le stress de l'anesthésie. Il présente pourtant le poisson comme une espèce permettant "des approches largement non-invasives sans nécessité d'intervention chirurgicale".
Objectifs
Des malformations du crâne sont retrouvées dans des maladies associées à un métabolisme du phosphate défectueux. Le but de ce projet est d’étudier, les effets d'un régime pauvre ou riche en phosphate sur la formation du crâne et des sutures crâniennes chez des poissons exprimant une mutation génétique responsable de pathologie osseuse. Les mécanismes cellulaires impliqués seront observés grâce à des techniques d'imagerie non invasives en temps réel, tandis que des analyses post-mortem permettront d'étudier la structure du crâne et la minéralisation des os.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du phosphate au cours de la formation du crâne dans des conditions normales et pathologiques. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défauts du squelette craniofacial. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
- Prélevement nageoire caudale sous anesthésie: 1 fois,
Impact sur les animaux
- Prélevement nageoire caudale : douleur légère - Isolement : stress - Anesthésie : stress - Malformations squelettiques : douleur légère
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet sera mis à mort pour prelevements et analyses des tissus osseux
Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différents types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencés par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statisques nécessaires à l'analyses des données.
Raffinement
Les poissons sont élevés dans des conditions optimales où la qualité de l’eau, la température et l’éclairage sont vérifiés régulièrement. Nous serons attentifs au comportement des animaux face à la nourriture qui sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les zootechniciens. D’autre part, l’apparition de symptômes comportementaux (immobilité, nage anormale) sera suivie et les poissons seront scorés deux fois par semaine par le chercheur en charge du projet durant la mise sous régime des animaux. Les poissons seront génotypés sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésique pendant 48h. L’acquisition d'images sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette . Le squelette présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d’observer par microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse sera réalisée de 1,5 mois post fécondation à 3 mois post fécondation, période de formation de la voûte crânienne.
Un modèle poisson pour tester des agents à visée thérapeutique dans le syndrome Kabuki
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
820 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains passant deux à trois heures dans un test de mémoire dont une heure entière de stimulations électriques. Ils subissent aussi la coupe d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie brève, des séances d'imagerie, et pour d'autres une exposition à des agents pharmacologiques par bain ou par injection. Le porteur qualifie ces chocs de faible intensité et affirme qu'ils n'induisent pas de douleur, tout en retenant le nombre de stimulations reçues par un même individu comme l'un des deux points limites de la procédure. Les poissons expérimentaux sont tués à l'issue, les reproducteurs porteurs de la mutation liée au syndrome Kabuki étant gardés en vie pour maintenir la lignée.
Objectifs
Le syndrome Kabuki, principalement causé par un exemplaire non fonctionnel d'un gène identifié chez l’homme, est caractérisé par une déficience intellectuelle et des troubles immunologiques pour lesquels il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement. Les mécanismes à l'origine de ce syndrome ne sont pas élucidés. Les 3 principaux objectifs du projet sont : (1) de modéliser les anomalies au niveau du système immunologique et du système nerveux du syndrome Kabuki grâce à une lignée de poissons dont l'un des 2 exemplaires du gène correspondant n’est pas fonctionnel; (2) de caractériser chez ces poissons les problèmes induits par le défaut génétique au niveau des cellules nerveuses et immunitaires, et enfin (3) de tester l’effet thérapeutique de plusieurs agents pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait d’abord valider l'utilisation du modèle pour étudier les troubles immunologiques et du système nerveux du syndrome Kabuki. Une fois ce modèle validé, il nous aidera à déterminer quels sont les gènes et les types cellulaires plus spécifiquement impliqués dans la survenue des problèmes immunologiques et nerveux associés à ce syndrome. Enfin, les tests avec des agents à visée thérapeutique réalisés à la fin de ce projet pourraient aboutir à de nouvelles pistes pour le développement de traitements pour les patients.
Procédures
L’utilisation d’une lignée de poissons-zèbre déficiente pour un gène particulier portant une mutation nécessite de vérifier la présence de cette mutation. Pour cela, une unique procédure d'identification à partir du prélèvement d’un fragment de tissu de la nageoire caudale est réalisée sous anesthésie générale brève (
Impact sur les animaux
La nageoire régénérant rapidement et spontanément chez cette espèce, le prélèvement d'un fragment de tissu de la nageoire caudale ne crée pas de gêne ou d’incapacité durable chez les animaux maintenus en hébergement. Réalisée par un personnel qualifié, elle n’induit généralement aucune douleur. Au cours des tests comportementaux, la stimulation électrique sera calibrée de façon à ne pas interrompre l'exploration spontanée des animaux selon des protocoles bien documentés qui n’induisent pas de douleur. Une attention particulière sera toutefois portée : 1) aux signes de stress, notamment lors de l’introduction dans la zone de test, et 2) au nombre de stimulations subi par un même individu lors de la phase de conditionnement. Ces deux paramètres constituent les points limites majeurs pour cette procédure. Lors des tests pharmacologiques, qui peuvent générer du stress et/ou de l’inconfort sur les animaux, le comportement de nage et la prise alimentaire des animaux expérimentaux seront donc surveillés avec attention durant et après le traitement selon des grilles de scoring adaptées.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à l’issue des procédures décrites dans cette demande d'autorisation de projet, exceptés les animaux portant un exemplaire non fonctionnel du gène d'intérêt, et identifiés après une procédure de vérification de la présence de cette mutation. Ces derniers seront gardés en vie afin de maintenir la lignée à l'état hétérozygote pour assurer la reproduction lors du projet.
Remplacement
Le comportement des poissons et le fonctionnement des cellules immunitaires ne peuvent être étudiés qu’in vivo au niveau d’un organisme entier, il n’est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet de recherche. Le comportement examiné et les cellules immunitaires d'intérêt n’étant matures qu’aux stades juvéniles, il n’est pas possible de mener cette étude à des stades précoces du développement.
Réduction
Nous réaliserons une expérience pilote chez des larves de moins de 5 jours de développement afin de déterminer quel agent thérapeutique de notre panel compense le mieux les effets de la mutation de notre gène d'intérêt chez l’espèce étudiée et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’individus à utiliser a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Enfin nous avons établi des procédures en étapes successives, ce qui permet de stopper l'expérimentation dès que les objectifs scientifiques sont atteints.
Raffinement
Les poissons utilisés sont maintenus avec un seul exemplaire du gène d'intérêt non fonctionnel, ce qui permet d'éviter l'apparition de défauts dommageables pour le bien être des animaux au cours de l'expérimentation. Des grilles d'évaluation seront utilisées pour effectuer un suivi complet du bien-être des animaux selon leur aspect, leur activité, leur prise alimentaire et leur comportementet afin de définir des points limite adaptés en fonction de leur âge. Cette surveillance fine permet, à chaque étape du projet, de prendre des mesures adaptées pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux voire d'interrompre l'expérimentation. Une grande attention sera portée aux conditions d’hébergement et le comportement de nage ainsi que la prise alimentaire des animaux reproducteurs seront l’objet d’une surveillance régulière, trois fois par jour.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre a été choisi pour ce projet car les processus biologiques étudiés (mémoire, immunité) ont été bien décrits chez cette espèce. De plus, une lignée de poissons mutante pour le gène d’intérêt a déjà été générée et son étude à des stades précoces a montré l’existence d'atteintes chez ces poissons semblables à celles du syndrome Kabuki. Ces résultats indiquent donc que le poisson-zèbre est un modèle de choix pour permettre à la fois d’étudier les mécanismes de la maladie humaine et de procéder à des tests pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les poissons seront utilisés à des stades juvéniles (1 à 2 mois de vie) pour toutes les procédures décrites et sont justifiés scientifiquement par des études préalables qui ont démontré que : 1) le comportement que nous allons tester chez les poissons mutants se développe seulement à partir de 3 semaines de vie, et que 2) concernant l’étude immunologique, les cellules d’intérêt sont impliquées dans la régénération de la nageoire entre 3 et 8 semaines de vie. Une étude pilote utilisant des jeunes larves sera également menée afin de sélectionner de façon rapide et fiable le(s) meilleur(s) candidat(s) parmi les agents pharmacologiques à tester ensuite à des stades plus tardifs.
Mécanismes de régénération d’un lésion cardiaque
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
39 345 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 17 275 d'entre eux et modéré pour 22 070. Certains subissent une lésion cardiaque sous anesthésie, d'autres des injections dans le ventre ou dans l'enveloppe du cœur, d'autres encore un maintien d'une heure en eau tiède. 2 770 retournent à l'élevage, tous les autres sont tués pour analyses post-mortem. Le porteur écarte l'analgésie après la chirurgie cardiaque au motif qu'elle interfère avec la régénération, en s'appuyant sur des recommandations et des méta-analyses portant sur des patients humains opérés du cœur.
Objectifs
Les crises cardiaques sont la principale cause de décès dans le monde. Une blessure au cœur humain entraîne la perte de millions de cellules cardiaques et est remplacée par une cicatrice raide qui limite les battements du cœur. Il n’existe actuellement aucune option thérapeutique pour guérir une crise cardiaque. Le poisson zèbre, en revanche, peut se remettre efficacement d’une lésion cardiaque. L’objectif général du projet est donc d’identifier et de comprendre comment le poisson zèbre peut régénérer son cœur après une blessure.
Bénéfices attendus
Le cœur humain réagit mal à une crise cardiaque. Il n’existe actuellement aucun traitement pour traiter la cause de la maladie, mais uniquement les symptômes et les complications dus à la blessure. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies pour améliorer les résultats pour les patients. Ce projet examine comment le poisson zèbre peut régénérer son cœur de manière robuste après une blessure. Le projet identifiera les facteurs responsables de cette guérison réussie après une blessure. Ces facteurs identifiés peuvent potentiellement être utilisés dans le contexte humain pour développer de nouvelles thérapies pour traiter les patients atteints de crise cardiaque. Ce projet améliorera nos connaissances sur la façon dont le poisson zèbre peut régénérer naturellement et avec succès son cœur. Ces connaissances permettront d’expliquer pourquoi le cœur humain a une capacité de régénération très limitée. Les chercheurs bénéficieront directement de ce projet puisqu’il peut constituer la base de futures études scientifiques et peut être appliqué au domaine de la cardiologie, de la régénération tissulaire chez le poisson zèbre et de la régénération dans d’autres modèles animaux. Ce sera également un avantage à court terme. Le bénéfice à long terme sera la contribution des connaissances à la science médicale. Les résultats précliniques du projet pourraient fournir de nouvelles stratégies de traitement visant à améliorer la régénération du cœur humain blessé. De plus, ces connaissances pourraient être utilisées pour améliorer davantage les stratégies diagnostiques et thérapeutiques actuelles.
Procédures
La collecte des spermatozoïdes et des ovules implique une légère pression sur le ventre des poissons anesthésiés et la procédure prend moins d’une minute. Certains poissons zèbres subiront des blessures cardiaques sous anesthésie. La procédure prend 5 minutes. Certains poissons seront injectés dans le ventre ou le sac qui recouvre le cœur (la procédure prend moins d'une minute sur animal anesthésié), ou recevront leur traitement directement dans l’eau d’un aquarium (la procédure peut durer de 1 jour jusqu'à 60 jours) ou en maintenant le poisson dans de l'eau tiède (la procédure dure 1 heure).
Impact sur les animaux
Le poisson zèbre blessé développera une douleur aiguë directement après la blessure. La procédure prend 5 minutes et les effets de la blessure durent moins d’une heure, car le poisson zèbre présente des comportements normaux en matière de nage, d’alimentation et social après cette période. Une surveillance des comportements anormaux est donc effectuée pendant cette période. Il n’y a aucun dommage indirect après 24 heures de blessure, car le poisson zèbre peut se régénérer naturellement et le cœur se rétablira complètement dans les 60 à 90 jours suivant la blessure.
Devenir
Animaux retournés à l'élevage ou mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des études très en amont ont porté sur des cœurs de porc issus d’abattoirs. Cependant, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Les cellules cardiaques humaines cultivées dans une boîte sont une bonne source de cellules cardiaques pures. Cependant, elles se comportent comme des cellules cardiaques de bébés. Puisque les crises cardiaques sont presque exclusivement observées chez les patients adultes, il est difficile pour ces cellules cardiaques de modéliser la situation des adultes.
Réduction
Certaines expériences utiliseront tout le cœur et ne pourront donc pas être réutilisées. Lorsque les expériences n’utilisent pas la totalité du cœur, le cœur restant sera conservé indéfiniment au congélateur pour de futures expériences. Ainsi, le tissu peut être utilisé au maximum et éviter tout gaspillage inutile. Les femelles et les mâles seront utilisés pour des expériences Le nombre d'animaux requis est basé sur l'expérience antérieure et la littérature publiée. Ces chiffres sont désormais largement utilisés dans le domaine de la régénération cardiaque à des fins d’analyse statistique. La cryoconservation réduit le nombre d'animaux Afin d'identifier les modifications génétiques du poisson zèbre, la coupe des nageoires était auparavant utilisée pour prélever un petit morceau de la nageoire pour analyse (génotypage). Nous utilisons désormais la méthode du prélèvement cutané qui consiste à frotter doucement la peau et à prélever un peu de mucus pour analyse (geste non invasif). Cela ne nécessite aucune intervention et donc aucun dommage pour le poisson. Cette méthode d'identification des poisson positifs a réduit la quantité de poisson utilisée.
Raffinement
Le chercheur se tiendra au courant de la littérature pour garantir que les techniques utilisées sont appliquées de la manière la plus précise et la plus humaine possible. Par exemple, les fabricants fabriquent continuellement des aiguilles plus petites pour les injections. Ce qui crée donc des blessures plus petites. Les techniques utilisées dans ce projet ont été bien documentées, décrites et publiées. Par conséquent, les taux de mortalité, les comportements et la santé globale du poisson zèbre sont connus. Ceux-ci serviront de base au suivi et aux soins postopératoires et grâce à une grille de score déterminé pour le projet. Cette grille de score permettra de suivre objectivement l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera alors mis à mort. Pour minimiser la douleur, la souffrance et la détresse, une molécule agissant à la fois comme anesthésique et analgésique sera utilisée pendant la chirurgie ). Les analgésiques postopératoires actuels interfèrent avec la régénération et la fonction cardiaque. Pour l’Homme, la recommandation actuelle est de surveiller étroitement les patients après une chirurgie cardiaque et d'administrer des analgésiques uniquement si nécessaire (Grant et al. 2023). Seuls 1,8 % des patients ont ressenti un soulagement bénéfique de la douleur avec les opioïdes (Wagner et al. 2021), ce qui ne justifie pas le risque d'addiction (Grant et al. 2023). Une méta-analyse des données des patients a montré que le traitement par AINS (anti-inflammatoire non stéroïdien) augmente le risque d'infarctus du myocarde plus tard dans la vie (Bally 2017), annulant ainsi le bénéfice temporel de l'utilisation des AINS après la chirurgie cardiaque. Au vu de ces résultats obtenus chez l'homme, nous adopterons les mêmes mesures pour la chirurgie cardiaque chez le poisson zèbre. Le chercheur se tiendra au courant de la littérature et modifiera les procédures si le consensus change. Le génotypage des animaux sera réalisé par écouvillonnage cutané. Cette méthode est moins nocive que la coupe des nageoires, qu'elle ne nécessite pas d'anesthésie et qu'elle n’est pas invasive Avec cette nouvelle méthode de génotypage, aucun animal n’est blessé et il y a donc une réduction des contraintes sur les animaux utilisés.
Choix des espèces
Le poisson zèbre (Danio rerio) est le modèle de choix pour étudier la régénération cardiaque. Des souches de poisson zèbre de type sauvage seront utilisées car ce sont les plus courantes dans le domaine de la régénération cardiaque. Le poisson zèbre génétiquement modifié sera également utilisé pour tester l’importance de signaux spécifiques dans le contrôle de la régénération. Le poisson zèbre affiche une réponse robuste et naturelle suite à une lésion cardiaque. Par conséquent, déterminer les signaux qui permettent à cette régénération naturelle de se produire sera précieux pour comprendre et potentiellement appliquer les connaissances à la situation humaine où les patients sont incapables de se remettre d’une lésion cardiaque. Le poisson zèbre adulte âgé de 6 à 12 mois est utilisé pour les études de régénération. Cet âge se situe dans la même fourchette que celle à laquelle les humains commencent à présenter des lésions cardiaques.
Méthode de génotypage invasif dans le cadre de création et maintien de lignées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Isolés jusqu'à trois jours, anesthésiés, amputés en moins d'une minute d'un fragment de nageoire caudale, 2 400 poissons zèbres adultes passent par un génotypage invasif dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le prélèvement sert à séquencer un gène et à repérer les porteurs d'une mutation reproduisant des maladies rénales génétiques humaines. 1 020 poissons sont gardés vivants et deviennent reproducteurs. Les 1 380 autres, ceux qui ne portent pas la mutation attendue, sont tués.
Objectifs
Certaines maladies rénales génétiques sont responsables de l’arrêt de fonctionnement des reins avant l’âge adulte. Il n’y a pas de traitement disponible à ce jour pour ces maladies qui nécessitent inévitablement la dialyse et une transplantation rénale. Ces maladies génétiques sont variables avec des différences d’âge d’apparition de la maladie ou d’autres organes atteints. Ceci suggère l’existence de gènes capables de modifier l’expression de la maladie. Ce projet a pour but de créer des modèles de ces maladies chez le poisson zèbre en modifiant les gènes impliqués par des techniques d’édition du génome qui vont permettre d’introduire des mutations similaires à celles retrouvées chez les patients. Ces modèles seront utilisés pour valider l’implication de nouveaux gènes ce qui est essentiel au diagnostique, mieux comprendre les mécanismes à la base de ces maladies rénale pour obtenir de nouvelles pistes de traitements, et mener des études pour tester l’efficacité de molécules qui pourraient ouvrir la voie vers un possible médicament.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouveaux modèles animaux des maladies rénales génétiques. Ces modèles permettront un meilleur diagnostique des patients en validant l’implication de nouveaux gènes, de mieux comprendre le rôle des gènes dans le développement rénal, l’impact de certaines mutations identifiées chez les patients et de disposer de modèles pré-cliniques robustes et fiables permettant de tester l’efficacité de molécules thérapeutiques candidates.
Procédures
Prélevement nageoire caudale : 1 fois, durée inférieure à 1 minute
Impact sur les animaux
Stress léger dû à l’isolement des animaux (3 jours maximum, 1 seule fois).
Devenir
A la fin de la procédure, seuls les poissons porteurs des mutations sont gardés en vie et utilisés comme reproducteurs.
Remplacement
Certains des défauts du rein observés chez les patients sont retrouvés chez les embryons de poisson zèbre de moins de 5 jours porteurs de mutations des mêmes gènes que les patients, permettant ainsi de disposer de modèles robustes et fiables pour étudier les mécanismes responsables de ces maladies, caractériser l’impact des mutations des gènes impliqués ainsi que de tester des pistes thérapeutiques pour lesquelles l’expérimentation animale reste incontournable. Une des approches de remplacement envisagée est l’utilisation d’organoïdes rénaux, mais cette approche utilisant des cellules humaines en culture ne permet pas l’étude de reins fonctionnels ni, pour l’instant, d’étudier les différents aspects de la maladie.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet.
Raffinement
Les poissons sont élevés dans des conditions optimales où la qualité de l’eau, la température et l’éclairage sont vérifiés régulièrement. Les poissons bénéficient d’un apport en nourriture vivante (Paramécies et Artémias), d’un enrichissement social en s’assurant du maintien d’un nombre de poissons suffisant par aquarium et d’accouplement régulier.
Choix des espèces
Les maladies rénales sur lesquelles nous travaillons sont des maladies génétiques récessives, seuls les individus porteurs des deux copies mutées du gène impliqué développent la maladie. C’est la même chose chez le poisson où seuls les animaux porteurs de deux copies de la mutation générée présentent des phénotypes. Ce projet a pour but la création et l’élevage de poissons porteurs d’une seule copie du gène mutée qui ne sont donc pas malades. Ils servent à la reproduction pour obtenir des embryons qui portent deux copies du gène mutées qui eux présentent les défauts du rein qui nous intéressent et que l’on visualise au microscope sur des embryons anesthésiés de moins de 5 jours par une méthode non invasive. Pour identifier les poissons porteurs d’une seule copie du gène mutée et les différencier des poissons ne portant aucune mutation, il est nécessaire d’effectuer un prélèvement d’une toute petite partie de la nageoire caudale pour pouvoir séquencer le gène d’intérêt. Ce prélèvement ne peut être fait que chez le poisson adulte agé de trois mois. Il est réalisé sous anesthésie générale et sous analgésie. La nageoire régénère spontanément en quelques jours.
Nouvelles stratégies de réduction de l’inflammation intestinale chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Sans possibilité de retour à l'élevage ni d'adoption, 8 480 larves de poisson zèbre sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem. Une entérocolite leur est provoquée par des molécules pro-inflammatoires ajoutées à leur eau pendant trois jours, dès le troisième jour après la fécondation. Certaines sont gavées sous anesthésie, d'autres immobilisées deux minutes pour être observées au microscope. Le porteur reconnaît ne pas pouvoir exclure un état général dégradé, un comportement anormal ou la mort, et met en avant la transparence des larves, qui offre selon lui une clarté optique appréciable.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des pathologies multifactorielles caractérisées par une inflammation chronique de l’intestin associée à une réponse immunitaire excessive et un déséquilibre du microbiote. Cela peut entraîner des symptômes sévères comme des douleurs abdominales, des diarrhées, et une fatigue intense, affectant gravement la qualité de vie des patients. Ce projet s’incrit dans un projet plus global multiéchelle et pluridisciplinaire allant de la molécule jusqu’au patient. Les stratégies testées ici auront été au préalable validées par des expériences sur des modèles cellulaires. Ce projet, mettra à profit les avantages de la larve de poisson zèbre, chez qui il est possible d’induire une inflammation de l’intestin, afin de valider des molécules candidates ou des stratégies de délivrance afin de réduire l’inflammation. Avec le poisson zèbre nous pourrons évaluer plusieurs paramètres du tube digestif tels que l’anatomie, l’intégrité de la barrière intestinale, la réponse inflammatoire, le stress oxyydant,… Nous espérons ainsi valider de nouvelles perspectives thérapeutiques pertinentes pour le traitement des MICI.
Bénéfices attendus
En utilisant un modèle largement utilisé en routine dans des études pharmaco-toxicologiques, les larves de poisson zèbre, nous pourrons accélérer considérablement le processus de sélection des candidats médicamenteux prometteurs ou de modalité de délivrance de ces composés pour une amélioration nette et durable des symptomes des MICI. Les larves de poisson zèbre ne seront utilisées qu’après une première phase d’étude qui comportera des analyses chimiques des composés (pureté, activité) et des études in vitro sur cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires (cultures isolée, coculture ou utilisation de la technologie organ-on-chip). Ces larves offrent un système intégré, rapide, efficace et simple d’évaluation de la toxicité et de l’efficacité des composés préselectionnés lors de la première phase. De plus, de part la transparence du modèle au stade larvaire, celui-ci nous offre une très belle clartée optique fortement appréciable et permettant des observations in vivo non invasives grâce à des techniques d’imagerie de pointe.
Procédures
Les larves seront soumises aux interventions suivantes : Lors des sessions d’imagerie au microscope, les larves anesthésiées seront éclairées avec différents sources lumineuses. La durée totale de la procédure est courte puisqu’elle durera 2 min minutes par animal. La puissance de la source lumineuse sera choisie pour permettre l’observation sans endommager les tissus. Les larves vigiles seront exposées à des molécules ajoutées dans l’eau du bain : Ces larves seront exposées aux molécules durant 3 jours à partir du stade 3 jours post fécondation avec un changement des bains journalier de 4 à 6 jours. Certaines larves seront gavées avec une molécules fluorescente non toxique qui permet d’évaluer l’intégrité de la barrière intestinale. Le gavage, d'une durée de 2 secondes, sera réalisé sous anesthésie, un seul gavage sera réalisé par animal.
Impact sur les animaux
L’entérocolite chez la larve sera induite par différentes molécules pro-inflammatoires. Nous sélectionnerons la molécule, la dose et la fenêtre de traitement permettant d’induire une entérocolite sans toxicité sévère. Cependant, nous ne pouvons pas exclure que le traitement avec nos molécules ne cause pas des effets indésirables tels qu’un état général dégradé, un comportement anormal ou de la mortalité.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure. En effet, ces larves étant exposées à des molécules nous n’avons pas l’autorisation de les remettre dans l’élevage ou de les faire adopter. De plus, l’euthanasie des animaux est nécessaire car des prélèvements et analyses post-mortem seront réalisées sur l’ensemble des animaux.
Remplacement
Dans ce projet, nous ne pouvons pas nous passer d’un modèle animal et nous avons choisi le poisson zèbre. Une première partie du projet impliquera une étude in vitro, réduisant le nombre d’animaux de cette étude. Toutefois ces modèles cellulaires ne permettent pas de prendre en compte la complexité des interactions de l’épithélium avec d’autres acteurs (système immunitaire et environnement de la lumière du tube digestif). Le poisson zèbre nous fournira un modèle simple et intégré d’entérocolite chez un vertébré, où les réponses in vivo au niveau tissulaire, cellulaire et moléculaire seront facilement observables et quantifiables. Une tâche longue et ardue dans un modèle murin. Un modèle animal est essentiel pour la bonne évaluation des effets induits par les composés chimiques et permettra d’étudier les acteurs mis en jeu dans cette étude.
Réduction
Nous avons prévu 8460 larves de poisson zèbre pour réaliser les six procédures décrites dans ce projet qui a pour objectif de réduire l’inflammation dans un modèle d’inflammation induite du tube digestif. Nous avons déterminé ce chiffre en prenant en compte : -Les articles déjà publiés sur l’inflammation induite du tube digestif chez le poisson zèbre afin de limiter les conditions et les protocoles à mettre en place -Les expériences préliminaires réalisées sur les molécules anti-inflammatoire que nous souhaitons tester. Les effets bénéfiques de ces molécules ont été ou seront étudiés sur des cultures de cellules de vaisseaux sanguins ou des cellules immunitaires de sujets sains et de patients atteints de maladie inflammatoire du tube digestif (MICI). Ces expériences nous donneront des informations sur les doses à utiliser. -des tests permetant de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour une interprétation fiable des résultats -les données obtenues à partir d’expériences précédentes seront réutilisées et intégrées dans les nouvelles études lorsque cela est possible, évitant ainsi des répétitions inutiles.
Raffinement
Deux personnes expérimentées suivent quotidiennement les animaux de l’animalerie et procèdent au nourrissage bi-quotidien. Un prestataire agrémenté assure les nourrissages et suivis pendant les week-end et jours fériés. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées par du personnel formé et dans des locaux ayant obtenu un agrément du ministère. Des inspections sont effectuées régulièrement. Afin d’améliorer le bien-être des larves au cours des expériences, différentes méthodes de raffinement seront appliquées. Les larves seront gardées dans une enceinte thermostatée dédiée au poisson zèbre dans des conditions de vie optimale afin de réduire leur stress avec une température de 28 degrés Celsius et un pH de 7.2. Les larves seront contrôlées quotidiennement lors des changements de leur eau. Une grille de suivi de l’état des animaux sera complétée rigoureusement lors de ces contrôles et des indicateurs d’une éventuelle souffrance et/ou détresse aussi appelés points limites ont été identifiés. Ces points de surveillance garantissent le bien-être des larves et respectent des standards éthiques. Nous privilégions des techniques non invasives. Lors des sessions d’imagerie au microscope, les larves seront anesthésiées pour éviter tout stress.
Choix des espèces
Le poisson zèbre présente de nombreux avantages. Ces larves offrent un système digestif complexe, intégré dans un organisme qui nous permettra d’évaluer facilement l’efficacité des composés préselectionnés lors de la phase préliminaire réalisée sur cellules en culture. Leurs systèmes digestif, cardiovasculaire, neurologique et immunitaire sont bien étudiés, présents chez la larve et comparables à ceux des mammifères, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les effets de médicaments sur ces systèmes. La larve de poisson zèbre est devenue un modèle reconnu d’étude de l’inflammation intestinal. Dans ce projet, nous étudierons le système digestif chez des larves de poisson zèbre jusqu’à 6 jours post-fécondation comme décrit dans les études d’inflammation du tube digestif induite. A ce stade, ce tube présente des caractéristiques physiologiques et anatomiques permettant de répondre à nos objectifs expérimentaux. Enfin, les larves sont transparentes ce qui permet une observation directe et non invasive des processus biologiques internes grâce à des techniques d’imagerie.