Rongeurs
Etude de l’effet thérapeutique des MSC métaboliquement standardisées et de leur suivi post-injection intra articulaire dans un modèle murin de l’arthrose.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Tester si des cellules souches au métabolisme standardisé freinent la dégradation du cartilage suppose d'abord de détruire ce cartilage. 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses radiologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections de collagénase sont pratiquées dans le genou droit à deux jours d'intervalle sous anesthésie gazeuse, puis une injection de cellules une semaine plus tard. L'arthrose ainsi provoquée peut plonger les souris dans la prostration, les isoler de leurs congénères et leur faire cesser le toilettage social, un signe clinique déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique, trois la mise à mort.
Objectifs
L’arthrose (OA) est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50 % de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble des tissus de l’articulation et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’OA est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements palliatifs non spécifiques existent et ne permettent pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’OA. Dans ce contexte, les cellules souches adultes et leur potentiel thérapeutique ont été largement étudiés. Des études pré-cliniques et cliniques ont montré des résultats prometteurs. Cependant, des inconvénients majeurs ont été mis en évidence, la fuite des cellules du site d’injection, leur faible viabilité après l’injection et la variabilité de l’efficacité des cellules en fonction des donneurs. Les travaux de nos collaborateurs ont montré que le métabolisme des cellules joue un rôle primordial pour leurs propriétés thérapeutiques. L’un des objectifs du projet est de standardiser le métabolisme des cellules afin de maximiser leurs propriétés thérapeutiques et rendre plus reproductible les résultats obtenus avec différents donneurs de cellules. L’objectif de ce projet vise à montrer l’effet immunosuppresseur des cellules traitées quel que soit le donneur de cellules dans un contexte arthrosique et de suivre le devenir des cellules injectées. Les données recueillies permettront d’envisager une étude chez un plus gros animal que la souris. Selon les résultats obtenus, nous envisagerons ensuite d'encapsuler les cellules traitées dans un hydrogel afin de les protéger d’une fuite du site d’injection et de la mort cellulaire afin de prolonger leur effet thérapeutique.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints d’arthrose (OA) est à ce jour peu efficace et, compte-tenu de l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le traitement de l’OA représente un enjeu économique et social majeur. Ce projet permettra de mettre en évidence l’importance du statut métabolique des cellules souches mésenchymateuses (MSC) in vivo pour le traitement de l’OA et de suivre le devenir des MSC injectées dans l’articulation. Ces travaux pourront, à long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques pour des essais cliniques chez le chien (animal présentant naturellement de l’OA comparable à l’Homme) puis chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections intra-articulaires de 5 µL de la molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage ou d'une solution saline pour les groupes « contrôle » dans le genou droit à deux jours d’intervalle. Puis, une semaine après, une partie des animaux recevront une injection de 8 µL de cellules dans ce même genou pour étudier leur effet thérapeutique. Ces injections dureront quelques secondes par animal et seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure.
Impact sur les animaux
Lors du développement de l’arthrose (OA), de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration (état dans lequel l’animal est inactif, immobile et en repli sur lui-même), s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une infection pourrait intervenir au niveau du point d’injection de la collagénase puis des cellules. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué tel qu’un changement mineur, une boiterie, une mobilité réduite, …) seront attentivement observés afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial. L’ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d’une pathologie comme dans le cas de l’arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour lesquelles il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes. De précédentes études ont été réalisées pour le suivi de cellules marquées notamment après injection sous la peau. Ainsi nous n’utiliserons pas d’animaux pour la mise au point technique de la détection des cellules marquées. De plus, des études in vitro ont permis d’optimiser le protocole de standardisation des cellules souches adultes afin de limiter le nombre de groupes de souris lors de la procédure d’expérimentation animale.
Raffinement
De façon générale, un suivi quotidien par un personnel impliqué dans la procédure pendant la première semaine post-injection puis hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois / semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration de analgésique ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours). Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l’enrichissement du type frisottis et d’un dôme. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour le cas particulier des injections, les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure et sont suivies quotidiennement pendant les 3 premiers jours post-injection.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose (OA), plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autre part, elle permet la constitution de groupes d’animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré la faisabilité du modèle et qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation permettant d’obtenir des résultants pertinents et reproductibles. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose (OA) est possible et documentée dans la littérature.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
1 888 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 580 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection unique de virus modifié, soit dans la veine, soit directement dans le cerveau après ouverture du crâne sous anesthésie de quatre-vingt-dix à cent vingt minutes, avec barres d'oreille et risque de saignement. Deux tests de mémoire à court terme et d'apprentissage sont menés sur une journée ou après quatre à huit jours d'entraînement, avant un prélèvement de liquide céphalo-rachidien suivi de la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ni système synthétique ne reproduit la complexité architecturale des cellules du cerveau, et tient le recours aux modèles animaux pour "essentiel".
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives. La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative affectant les fonctions cognitives, notamment la mémoire, l’apprentissage ou encore le langage, et responsable d’une perte d’autonomie des patients. La maladie d’Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives et représente plus de 70 pourcents de l’ensemble des démences de la personne âgée. Environ 1 million de personnes sont touchées en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Plus de 35 millions de personnes sont touchées dans le monde.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les animaux seront génotypés par un prélèvement de l'extrémité distale de la queue. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d’un anti-douleur et injection d'analgésique en post-opératoire). Deux tests comportementaux permettent de mesurer la mémoire à court terme, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, les animaux seront anesthésiés et analgésiés, puis nous réaliserons un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes) et sanguin (1 minute) préalablement à l'euthanasie (pas de réveil entre les actes).
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) pourrait être observée (5 à 7 pourcents du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux. 8) douleur de courte durée engendrée par le génotypage invasif par prélèvement de l’extrémité distale de la queue. 9) le phénotype dommageable de la lignée (modèle de maladie neurodégénérative (Maladie d’Alzheimer), déficits cognitifs).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1888) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Le geste de génotypage invasif est parfaitement maitrisé par les zootechniciens : prélèvement de la queue réalisé sur un animal très jeune où l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite, au même moment que le tatouage pour limiter les manipulations, dans une pièce dédiée au calme, rapidement avec des ciseaux adaptés et désinfectés après chaque portée. Le souriceau est surveillé immédiatement après (absence de saignement et bonne reprise en charge par sa mère), puis 20-30 minutes après avant de replacer la cage sur le portoir d’hébergement. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’application locale d’anesthésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection sur les yeux de l’animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post-opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L’applicateur est formé au geste d’injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. A partir de 9 mois, les animaux seront pesés deux fois par semaine avec ajout de croquette/poudre sur le fond de la cage et observation attentive à chaque pesée. De plus, certains tests comportementaux étant réalisés sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (jusqu’à 14 mois d’âge) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes (entre 5 et 7 mois d'âge) et évaluerons les effets du traitement (entre 6 mois et 14 mois d'âge) à différents âges et stades de la neuropathologie afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Évaluation de l’impact sur les performances myocardiques de l’irrégularité ventriculaire en fibrillation atriale par analyse invasive de la courbe pression-volume à partir d’un modèle de rat stimulé
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le cou ouvert pour canuler la carotide, une sonde de stimulation poussée par la veine jugulaire, 120 rats subissent un cathétérisme cardiaque de vingt à trente minutes, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. L'objectif déclaré est de mesurer cycle par cycle ce qu'une irrégularité du rythme ventriculaire coûte aux performances du cœur, un modèle de cœur isolé perfusé ayant montré ses limites. Le porteur reconnaît que l'animal peut mourir pendant le cathétérisme et juge "indispensable" la confirmation in vivo de cet effet délétère. Le thorax est ensuite ouvert et l'exérèse du cœur provoque la mort.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier les effets hémodynamiques délétères de l’irrégularité ventriculaire en fibrillation atriale par analyse des courbes de pression-volume à partir d’un modèle de rat stimulé.
Bénéfices attendus
Nous disposons de données provenant d’études physiopathologiques très anciennes menées chez l’homme et le gros animal (modèle canin) montrant qu’une irrégularité du rythme cardiaque pourrait être à l’origine de conséquences hémodynamiques délétères. Récemment, de nouvelles techniques ont été développées dans le domaine clinique de la stimulation cardiaque permettant de régulariser le rythme cardiaque chez les patients en arythmie cardiaque. Il existe donc un regain d’intérêt pour l’étude des conséquences de l’irrégularité du rythme cardiaque. Le projet présenté s’inscrit dans la continuité de notre thématique de recherche actuelle. Nous avons mené des premières expérimentations sur modèle de cœur rat isolé-perfusé où nous cherchons à étudier l’impact de l’irrégularité cardiaque et déterminer une valeur seuil à partir de laquelle l'irrégularité se traduit par une dégradation des performances cardiaques. Ce modèle présente des limites inhérentes aux modèles in vitro avec notamment l’absence de variation des conditions de charge du cœur. Nous souhaitons donc étudier les conséquences de l’irrégularité ventriculaire dans un modèle in vivo. L'analyse par cathétérisme cardiaque est nécessaire afin de déterminer en continu, pour chaque cycle cardiaque, les performations cardiaques. Cette nouvelle approche basée sur l'évaluation de l’irrégularité ventriculaire, et non sur le contrôle de la fréquence cardiaque seule, permettrait d'orienter vers de nouvelles approches pronostiques et thérapeutiques.
Procédures
La procédure sera effectuée sous anesthésie et analgésie. La durée de l’examen est de 20-30 minutes par animal. Sous anesthésie, une cervicotomie droite est pratiquée pour accéder à la carotide et la canuler avec une sonde hémodynamique. Une sonde de stimulation ventriculaire sera insérée par voie jugulaire. À la fin de l'examen, le thorax est ouvert et l’éxèrese du cœur provoque la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
L'analyse de l'hémodynamique cardiaque sera effectuée sous anesthésie générale. L'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir des courbes de pression-volume au niveau du coeur du rat et pour insertion de la sonde de stimulation par voie jugulaire. Chaque animal sera mis à mort à la fin de la procédure. Il se peut que l'animal décède lors du cathétérisme cardiaque.
Devenir
Pour l’ensemble des animaux, à la fin de l'examen, sous anesthésie générale, le thorax est ouvert et l’éxèrese du cœur provoque la mort de l’animal.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. Il est indispensable de réaliser ces expérimentations animales afin de confirmer un effet délétère de l'irrégularité ventriculaire sur les fonctions systolique et diastolique myocardiques.
Réduction
Nous avons limité les protocoles de stimulation à 4 séquences (régulière, irrégulière 30%, 50% et 70%) permettant de mimer l’irrégularité rencontrée aux cours de l’arythmie cardiaque la plus fréquente chez l’homme (fibrillation atriale). L'utilisation de rats sera limitée à l'obtention de résultats reproductibles quant à l'impact éventuel de ces différentes irrégularités ventriculaires.
Raffinement
Afin de limiter l’angoisse des animaux, une période d'acclimatation d'une semaine aura lieu après l’arrivée des rats au sein de l’animalerie afin qu’ils aient un temps d’adaptation et de repos suite au transport. L’hébergement en petits groupes sociaux (n=4) par cage sera réalisé ce qui permet, non seulement de répondre aux normes éthiques, mais également de réduire l’agressivité des animaux entre eux. Une manipulation régulière de nos animaux par une seule personne sera réalisée pour diminuer l'angoisse. L’ensemble de la procédure sera réalisée sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Il existe du matériel de cathéterisme cardiaque adapté au petit animal. Nous avons conçu un stimulateur cardiaque avec des intervalles de stimulation compatibles avec la fréquence cardiaque intrinsèque du rat. Les rats Wistar utilisés seront des rats matures de 12 semaines. Ils auront 14 semaines au moment de leur mise à mort.
Caractérisation de thérapies ciblées dans des modèles murins de LAM et cancer du poumon
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 à 2 000 mm3, se nécrose, ou qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées. 2 707 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever organes, sang et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la veine des cellules leucémiques prélevées sur des patients ou une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, puis deux prises de sang par semaine à la veine jugulaire sous anesthésie, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. Le porteur écrit que la diminution de la tumeur chez la souris "présage" sa diminution chez l'humain lors des futurs essais cliniques.
Objectifs
Malgré les progrès permanents dans la compréhension des cancers et dans les traitements disponibles, de nombreux patients ne répondent pas aux traitements classiques ou rechutent après différentes périodes de rémission. L’objectif est de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les leucémies aigües myeloïdes. Le microenvironnement tumoral (MET) dans les cancers est aujourd’hui reconnu comme ayant un fort impact sur la résistance des cancers aux thérapies. Parmi les composantes cellulaires du MET, il y a les macrophages et les lymphocytes T (LT) auxquels nous nous intéressons plus particulièrement dans l’équipe. Les LT sont normalement capables d'éliminer les cellules tumorales et les macrophages associés aux tumeurs (TAM) sont capables d'aider la tumeur à grossir. Nous cherchons donc à activer les LT et désactiver les TAM au sein de la tumeur grâce à de nouvelles molécules plus efficaces et surtout plus spécifiques que celles déjà existantes. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser des traitements classiques et/ou de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les LAM.
Bénéfices attendus
L’inoculation des différentes molécules dans les modèles murins considérés permettra de réduire les masses tumorales et/ou d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques impliquées dans l’éradication de la tumeur. Le but est de mieux comprendre le développement tumoral, d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, ou de comprendre les mécanismes d'action de certains médicaments, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine. L'utilisation d'animaux permet d'appréhender tous ces mécanismes au niveau de la tumeur mais également au sein de son microenvironnement. A terme, la validation de certains médicaments conduiront à des essais cliniques chez l'homme. Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge de l'évolution de la tumeur, donc une diminution de la tumeur sous l'effet des molécules thérapeutiques utilisées dans ce projet. La diminution de la tumeur chez la souris présage donc une diminution de la tumeur chez l'humain lorsque que ces mêmes molécules seront testées en essais cliniques.
Procédures
Afin que la souris développe une LAM (leucémie aigue myéloïde) humaine, après anesthésie, les cellules primaires de patients seront injectées très doucement par voie intraveineuse dans la veine caudale. La prise de la maladie sera suivie par 2 prélèvements sanguins par semaine à la veine jugulaire pour minimiser l'impact sur les animaux quiauront été anesthésiés au préalable. La mise en place du modèle de cancer de poumon sera faite par injection en sous-cutané dans le flan des animaux des cellules tumorales. Afin de suivre les cellules greffées nous injecterons une molécule fluorescente spécifique des cellules ciblées par voie intraveineuse dans la queue de l'anima, l'animal sera ensuite anesthésié et observé en imagerie non invasine. Afin d'éliminer de manière totale les cellules tumorales, des molécules de thérapie ciblée seront injectées par voie intraveineuse (veine caudale) ou en intrapéritonéal.Les animaux seront surveillé pour leur bien-être, la tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Les animaux ne subiront pas de chirurgie. La durée de chaque intervention (acte expérimental) est d'environ 3 minutes pour chaque souris.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales peut avoir un impact sur les animaux: une injection en sous-cutané pourra conduire à une croissance tumorale importante, à une légère perte de poids. Les animaux peuvent être stressés par le prélèvement sanguin au niveau de la veine jugulaire. L'injection de molécules en intrapéritonéal ou en intraveineux peut engendrer un léger stress (poils légèrement hérissés).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes, le sang et les tumeurs afin d'étudier l'impact du traitement appliqué.
Remplacement
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation en imagerie in vivo non invasive dans la mesure du possible. Ainsi, nous remplacerons dans la mesure du possible les mesures invasives par de l'imagerie, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Le recours à l'expérimentation animale pour nos projets est essentiel car elle nous permet de prendre en compte le microenvironement tumoral de la tumeur qui intervient d'une manière très importante dans les mécanimes que nous étudions et notamment ceux reliés à l'immunothérapie qui est basée sur le système imunitaire dans sa globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux sera de 6 animaux maximum par groupe. Dans le cas d'une étude d'efficacité de thérapies anti-cancéreuses, il s'agira de distinguer les groupes d’animaux recevant la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence. Nous respecterons ainsi la règle des 3R. Le nombre de 6 animaux à été déterminé afin d'avoir des tests statistiques fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, les doses de molécules thérapeutiques à utiliser seront préalablement définies grâce a des expériences in vitro notamment avec des modèles 3D (sphéroides) que nous avons mis en place au laboratoire.
Raffinement
Les manipulations des animaux sont effectuées en environnement stérile. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Pour l'analyse des animaux à l'IVIS (In Vivo Imaging System), les animaux seront anesthésiés. Les animaux, quelque soit le mode d'injection, seront observés tous les jours afin d’évaluer leur état général. Tout animal présentant une souffrance ou une détresse sera euthanasié par élongation cervicale. Pour cela, le comportement général de l’animal sera observé (posture, réaction à un stimulus externe tel que le bruit, manque d’appétit, hérissement des poils) et des mesures seront réalisées (poids, taille de la tumeur). Si l’animal perd plus de 15% de poids ou si la taille de la tumeur correspond à une prise de charge tumorale supérieure à 10% (volume max: 1500-2000 mm3) ou si la tumeur est nécrosée (score 2: >-50%), l’animal sera euthanasié . Les personnes en charge du projet ont été formés aux gestes qu'ils vont mettre en oeuvre.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et sont devenus les modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’Homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisés en clinique. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes.
Elevage d’une lignée de souris modèle de la lipofuscinose neuronale céroïde de type 7, une maladie neurodégénérative héréditaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Sur 2 340 souris élevées, 600 seront transférées vers d'autres projets utilisant la même lignée et les autres tuées, aussi bien les surnuméraires d'élevage que celles dont on prélève les organes. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un morceau de queue est coupé sur chaque animal pour le génotypage, et des mâles reproducteurs sont isolés une semaine afin d'obtenir des embryons d'âge daté. La lignée porte une maladie neurodégénérative héréditaire qui paralyse progressivement les souris homozygotes à partir de huit mois, aussi le porteur prévoit de toutes les mettre à mort avant sept mois pour éviter que ce phénotype ne s'exprime.
Objectifs
L’objectif du projet est d'élever une lignée de souris modèle de la lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 afin de mieux comprendre la maladie et de tester des approches thérapeutiques. La lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 est une maladie neurodégénérative rare qui est diagnostiquée vers l’âge de deux ans. Les enfants présentent rapidement des déficits moteurs puis cognitifs et meurent avant l’âge de dix ans car il n’existe aucun traitement curatif. Le modèle de la maladie que nous allons utiliser récapitule plusieurs aspects de la pathologie humaine dont l’altération progressive des fonctions motrices et la mort prématurée. Nous allons isoler des cellules à partir de différents organes des souris (peau, cerveau) afin de tester une nouvelle approche thérapeutique in vitro. Si nos résultats sont concluants, nous pourrons évaluer l'efficacité de notre approche in vivo dans ce même modèle de souris.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer in vitro la possibilité de traiter la céroide lipofuscinose neuronale de type 7 par une nouvelle approche de thérapie cellulaire. Si elle est concluante, nous pourrons poursuivre le projet in vivo chez la souris et ensuite chez l’Homme et ainsi nous pourrons proposer un traitement aux enfants atteints par cette maladie. De manière plus générale, cette étude pourrait ouvrir la voie au traitement de plusieurs maladies neurologiques héréditaires pour lesquelles il est nécessaire de délivrer ue protéine thérapeutique dans le système nerveux central.
Procédures
Un petit morceau de queue sera prélevé sur tous les animaux pour pouvoir réaliser une analyse génétique.
Impact sur les animaux
Certains animaux (homozygotes pour la mutation) présentent un phénotype dommageable qui apparait vers l'âge de huit mois sous la forme d'une paralysie progressive corrélée à une perte de poids qui évolue jusqu'à l'âge de 11 mois. La procédure de génotypage des animaux implique de réaliser une biopsie de queue qui peut povoquer un stress (contention) et une douleur de très courte durée et d'intensité faible. L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) peut conduire à une légère perte de sang. Pour obtenir des embryons d’âge défini, certains mâles reproducteurs devront être isolés dans des cages pendant une semaine avant la mise en accouplement.
Devenir
Les animaux de génotype d'intérêt seront mis à mort (prélèvement d'organes) ou transférés dans de nouveaux projets utilisant cette lignée. Les animaux surnuméraires d'élevage seront mis à mort.
Remplacement
La lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 est une maladie génétique qui atteint plusieurs organes dont le système nerveux central. Il n'existe aujourd'hui pas de lignée cellulaire "naturelle" (fibroblastes de peau de souris ou d'Homme immortalisés) ou obtenue par génie génétique dans laquelle on observe les défauts cellulaires caractéristiques de la maladie. Nous devrons travailler sur des cellules mises en culture à partir de tissus (peau, cerveau, foie...) prélevés chez des souris sauvages et mutantes adultes ou au stade embryonnaire tardif dans lesquelles les défauts cellulaires sont visibles. Ces cellules doivent être renouvelées régulièrement car elles ne peuvent pas être gardées longtemps en culture. Il n'existe pas pour le moment de modèle informatique de la maladie. Il s'agit d'une maladie rare assez peu étudiée et pour laquelle nous disposons donc de peu de données.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous prélèverons plusieurs organes simultanément sur les mêmes animaux (neurones et fibroblastes de peau sur embryons ; cerveau et foie sur adultes). La lignée sera maintenue avec un nombre minimal d'accouplements.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe sauf dans le cas des accouplements contrôlés nécessaires pour la mise en culture des cellules pour lesquels des mâles seront isolés. Pour que les cellules survivent en culture, les tissus doivent être prélevés sur des embryons d'âge défini. Pour cela il est indispensable de dater les accouplements. L'isolement préalable des mâles permet d'en augmenter la probabilité de réussite au cours de la nuit pendant laquelle les animaux sont mis ensemble et donc d'éviter de mettre à mort des femelles qui n'auraient pas été fécondées. L’isolement des mâles sera limité strictement dans le temps afin de minimiser le stress induit par l’absence de congénères et l’enrichissement sera augmenté dans les cages. Les animaux qui portent la copie délétère du gène sur les deux allèles (homozygotes) présentent un phénotype dommageable qui commence à se manifester vers l’âge de huit mois. Il n’est pas nécessaire dans ce projet d’utiliser des animaux homozygotes âgés de plus de sept mois. Ils seront donc tous mis à mort au plus tard à sept mois pour éviter l’expression du phénotype dommageable et ainsi du stress et des souffrances inutiles.
Choix des espèces
Le modèle murin de lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 avec lequel nous avons choisi de travailler récapitule assez bien les phénotypes observés dans la pathologie humaine. Les cellules dérivées de ces souris devraient également présenter les phénotypes associés à la maladie et ainsi permettre de tester notre approche thérapeutique in vitro puis in vivo si notre preuve de concept est validée.
Etude de la capacité d’un minétique synthétique de l’héparane sulfate à promouvoir la réparation et la régénération du tissu pulmonaire dans un monde murin de dommage alvéolaire diffus
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Anesthésiées, les souris reçoivent une instillation de toxine bactérienne directement dans la trachée, puis des injections répétées dans la veine de la queue, avant une heure d'exploration respiratoire sur animal éveillé. 2 028 souris vont être utilisées, dont 1 740 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que le développement des lésions pulmonaires est indolore faute d'innervation sensitive du poumon, tout en prévoyant une insuffisance respiratoire sévère, une mortalité accrue, et une grille de score allant de l'immobilité aux vocalisations et à l'automutilation. Vingt-quatre, quarante-huit ou soixante-douze heures après l'induction, elles sont tuées pour prélever poumons, sang et liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Objectifs
Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aigue, les exacerbations aigues de maladies pulmonaires fibrosante ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l'utilisation de mimétiques de polysaccharides pulmonaires afin d'améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aigue. Les effets bénéfiques seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité de notre molécule à réduire l'inflammation, les altérations des mécanismes de formation de nouveaux vaisseaux et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d'éviter les séquelles de lésions pulmonaires aigues caractéristiques des dommages alvéolaires diffus.
Bénéfices attendus
La survenue de dommage alvéolaire diffus (DAD) est une véritable problématique dans l'évolution des maladies pulmonaires. La DAD est une réaction aiguë non spécifique du poumon commune au syndrome de détresse respiratoire aiguë chez au moins 50 pourcents des patients, mais aussi dans les exacerbations aiguës des maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques, dans les pneumopathies sévères du COVID-19 ou dans d'autres conditions diverses, dues à une multitude d'agents nocifs (infections, médicaments, etc..). L'évolution clinique de la DAD peut être aiguë, définissant des formes sévères potentiellement mortelles de pneumonie interstitielle aiguë, ou subaiguë-chronique, qui, après un schéma histologique initial de DAD, évolue vers des pneumopathies interstitielles fibrosantes (PIF) ou une fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) avec une fibrose interstitielle étendue et une hypertension pulmonaire. Au cours de ces phases, des enzymes sont libérées et vont dégrader des protéines impliquées dans l’architecture du tissu. L'hypothèse de recherche de ce projet est que la molécule administrée par voie intra-veineuse chez la souris présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aigues en permettant une cicatrisation de l’épithélium pulmonaire. Ainsi cet agent (1) remplacera le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire remodelée suite à l'induction des lésions (2) améliorera la formation de nouveaux vaisseaux et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite l'induction de lésion pulmonaire aigue (72h). Dans un premier temps nous déterminons la dose optimale de toxine bactérienne nécessaire pour induire des lésions pulmonaires. Pour cela les animaux anesthésiés recevront 1 instillation intratrachéale (durée 3 minutes) de cet toxine ou de sérum physiologique. Suite à cela nous déterminerons les effets d'injections intraveineuses unique ou multiple d'agent thérapeutiques (Animaux vigiles, durée quelques secondes). Le groupe contrôle (animaux vigiles) recevra une injection intrapéritonéale d'anti-inflammatoire (durée quelques secondes). Après une exploration fonctionnelle respiratoire (animaux vigiles, durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes (durée 10 minutes) afin de déterminer les mécanismes d'action de cet agent thérapeutique à 24h, 48h et 72h après induction des lésions pulmonaires. Enfin une étude du devenir de l’agent thérapeutique dans l’organisme (distribution dans les différents organes-10 minutes) sera réalisée à différents temps (5 min, 30min, 3h, 6h, 12h et 24h) après son administration par voie intra-veineuse.
Impact sur les animaux
L'administration de toxine bactérienne via la trachée est l'un des modèles de rongeurs les plus couramment utilisés pour induire des les lésions pulmonaires aigues. Dans ce modèle expérimental, le tissu pulmonaire est endommagé en 48 à 72h. Le modèle présente une réponse inflammatoire conduisant à des lésions au niveau des vaisseaux sanguins et alvéoles. Ces éléments sont des caractéristiques des patients atteints de lésions pulmonaires aigues. L'instillation par la trachée n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement de lésions pulmonaires est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le tissu pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité plus importante. L’évaluation de la respiration de l’animal peut entrainer un stress. La contention lors des injections intrapériotnéales et intraveineuses peuvent induire un stress. Les injections IV répétées dans la queue des souris peuvent entrainer des blessures à la queue, des irritations, des saignements, une sensibilisation, des hématomes. Les injections intrapéritonéales peuvent entrainer des réactions au site d’injection et des lésions viscérales. Les anesthésies par voie intra-péritonéale sont suivies par l'euthanasie de l’animal (sans réveil). Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux seront ajustés en temps réels afin d’éviter les risques anesthésiques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire. tous les prélèvements sont nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite l'induction de lésions pulmonaires in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes d'action d'un mimétique de l'héparane sulfate dans le cadre d'une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqué est de 2028. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d'arrêt d'expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du lipopolysaccharide et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'insitllation intra-trachéale, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe de fermeture des paupiéres, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivant: immobilité, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité (faiblesse musculaire, manque de coordination, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.
Choix des espèces
Ce projet nécessite d'induire des lésions pulmonaires aigues, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Le modèle murins de lésions pulmonaires induits par une toxine bactérienne permet d'explorer les mécanismes de plusieurs pathologies respiratoires aigues. C’est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et fournit des informations utiles pour la découverte de nouveaux biomarqueurs et de nouvelles cibles médicamenteuses. Pour réaliser notre étude nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. De plus, Le vieillissement augmente l'incidence et la mortalité du syndrome de détresse respiratoire aigu chez l'homme et les modèles animaux vont dans le même sens, les souris âgées présentant une augmentation de l'infiltration neutrophile et de la perméabilité alvéolo-capillaire après une exposition aux toxines bactériennes. Compte tenu de ces éléments et de la littérature existante sur le sujet, nous avons décidé d’utiliser des souris âgées de 8 semaines.
Utilisation de modèles transgéniques murins pour l’étude de la lymphomagenèse
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet ont été construites pour surexprimer la protéine humaine BCL2 et porter une seconde altération génétique, de façon à développer un lymphome folliculaire. Elles sont 1 284, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, dont 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 40 un niveau modéré. Elles reçoivent trois gavages, des injections dans l'abdomen et des prises de sang à fréquence mensuelle, une partie subissant en plus une irradiation du corps entier de trente minutes suivie d'une greffe de cellules. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des stades de la lymphomagenèse.
Objectifs
Le lymphome folliculaire (LF) est un cancer des cellules immunitaires se développant au sein des ganglions. Cette pathologie, malgré des avancées thérapeutiques notables, reste à l’heure actuelle incurable et sa fréquence est en constante augmentation dans les pays industrialisés. Les cellules tumorales de LF se caractérisent par l'accumulation d'altérations génétiques. La première altération conduit à la surexpression de la protéine de survie BCL2, puis d'autres altérations additionnelles sont fréquemment observées. Ainsi les modèles murins que nous avons développés pour mimer le LF surexpriment la protéine BCL2 humaine et possèdent une altération fréquemment décrite chez les patients. Ces multiples anomalies présentes dans le LF favorisent la croissance tumorale et la résistance au traitement en agissant directement sur la survie ou la prolifération des cellules tumorales mais aussi en favorisant le dialogue des cellules tumorales avec les cellules qui l’entourent, les cellules du microenvironnement. Nos modèles murins permettent ainsi d'analyser le développement tumoral en étudiant la fonctionnalité des cellules tumorales et en caractérisant la composition du microenvironnement tumoral.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension des différents stades et acteurs de la lymphomagenèse.
Procédures
1)- La majorité des animaux aura une administration par voie orale d'une molécule chimique à 3 reprises pour l'induction des altérations d'intérêt, ce geste prend quelques secondes. En parallèle, ces souris recevront à une fréquence mensuelle une administration intrapéritonéale pour stimuler leur système immunitaire, cette administration prendra moins de 30 secondes. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum mensuelle et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l'imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration intrapéritonéale prenant moins de 30 secondes. 2)- Une petite partie du projet sur des souris non transgéniques implique cette fois-ci une irradiation de 30 minutes des souris sous oxygène (évite le stress), puis une injection intraveineuse de cellules, réalisée en moins d'une minute, pour reconstituer les souris.
Impact sur les animaux
L'administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c'est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques portant la double altération et conservés plus de 6 mois, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l'Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l'apparition de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Concernant les souris ayant reçues une irradiation corps entier, une perte de poids en lien avec des diarrhées induites par l'irradiation peut être attendue.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.
Remplacement
La caractérisation des évènements géniques impliqués dans le développement du cancer que nous étudions (lymphome folliculaire) ne peut être réalisée que partiellement in vitro puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire la complexité du microenvironnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) alors que celui-ci est justement essentiel au développement de ce type de cancer. Même si nous travaillons en parallèle à développer des modèles 3D plus complexes et de plus en plus fidèles à la réalité afin d'avoir recours au minimum à l'expérimentation d'animaux, l'utilisation de modèles animaux est indispensable pour certaines étapes de nos recherches sur la lymphomagenèse.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. Les croisements principaux des souris pour l'élevage ont été conçus de manière à obtenir uniquement des souris qui pourront être expérimentées sans produire des souris de mauvais génotype à euthanasier. Lorsque des expérimentations différentes sont nécessaires pour l'analyse des différents types cellulaires, les organes non utilisés sur chaque souris expérimentée seront congelés pour des analyses complémentaires afin d'éviter d'avoir d'autres souris à expérimenter pour générer ces échantillons. Notre expérience précédente nous a permis de dimensionner les groupes de souris pour l'étude des stades tardifs par la connaissance du taux de développement tumoral. Enfin, lorsque cela était pertinent, un calcul d'effectif a été réalisé afin de définir la taille des groupes d'animaux permettant d'observer l'éventuel effet des mutations étudiées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, un environnement contrôlé (température, humidité, pression), avec alternance jour/nuit (12h/12h), accès à la nourriture et l’eau de boisson ad libitum, change des cages 1 fois/semaine, et hébergement en groupe avec respect de la densité recommandée. Ils bénéficient également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin qu’elles puissent se construire un «nid». Afin de limiter le stress lié aux gavages et injections, une acclimatation à la manipulation sera réalisée (manipulation préalable sans administration dans la salle d’expérimentation) par les expérimentateurs. Pour l'irradiation des animaux, ils seront placés dans une boite de confinement afin de maintenir une asepsie maximum, et de l'oxygène sera administré dans cette boite en continu à l'aide de filtre pour éviter l'apparition de stress ou de l'inconfort aux souris. Egalement, dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
La souris possède un système immunitaire proche du système humain. Les mécanismes de diversification du répertoire et de réponse à une stimulation antigénique sont similaires. De plus le modèle murin a déjà démontré sa pertinence pour reproduire les mécanismes de développement de nombreuses pathologies lymphoprolifératives humaines. Les souris transgéniques seront utilisées à partir de 12 semaines et jusqu'à 18 mois dans le cadre de la procédure la plus longue, ce stade a été déterminé afin de reproduire au mieux la pathologie humaine survenant tardivement et avec un développement s'étalant sur plusieurs années. Les souris sauvages seront utilisées à 6 semaines puisque ce stage jeune favorise une reconstitution post-greffe efficace.
Squelette neuronal et dyskinésie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris subit une chirurgie cérébrale de trente minutes sous anesthésie générale, puis reçoit des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines. 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau, dont 412 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif déclaré est de comprendre comment la L-Dopa s'intègre au squelette interne des neurones et provoque les mouvements involontaires des patients parkinsoniens traités au long cours. Le porteur ramène les atteintes à une perte de poids et à une perte d'autonomie pour boire et manger, compensées selon lui par les soins, et annonce des tests comportementaux moteurs tous les deux jours sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une affection cérébrale qui perturbe les mouvements et peut avoir un impact considérable sur la vie quotidienne. La L-Dopa, le médicament le plus couramment utilisé, aide à gérer les symptômes de la maladie de Parkinson, mais après un traitement prolongé, elle peut provoquer des effets secondaires très gênants tels que des mouvements involontaires anormaux nommés dyskinésies. Il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme en cause afin d’identifier un moyen de limiter ces effets indésirables. Nous avons découvert que la L-Dopa peut s'intégrer directement dans les structures qui composent le squelette interne des neurones, appelées microtubules. Ces microtubules sont importants pour la transmission d'informations d'un neurone à l'autre. Notre projet vise à comprendre le rôle des microtubules contenant de la L-Dopa dans le développement de la dyskinésie et à contribuer à mieux comprendre les défauts neurologiques chez les patients en traitement prolongé à la L-Dopa.
Bénéfices attendus
Étant donné que la L-Dopa est le traitement standard de la maladie de Parkinson et que son utilisation à long terme peut entraîner des effets secondaires tels que les mouvements involontaires (dyskinésie), il est très important de comprendre son impact sur le fonctionnement normal du squelette neuronal dans la communication entre les neurones. En étudiant les protéines impliquées dans la modification de ce squelette neuronal par la L-Dopa, nous pourrions trouver de nouvelles façons de minimiser les effets secondaires de ce traitement.
Procédures
Les souris subissent des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes. Nous administrons quotidiennement des substances par injections dans l'abdomen pendant deux semaines. Les souris participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrices impactées par l'administration du traitement contre la maladie de Parkinson. Ces tests dureront de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaines, avec un test tous les deux jours. Les souris peuvent subir une injection intraveineuse sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place d'un état pathologique chez le rongeur affectant l'autonomie des souris à s'hydrater et se nourrir et donc une perte de poids, n'impactant pas leur taux de survie grâce aux soins apportés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour l'étude de l'anatomie du cerveau.
Remplacement
Une première partie des expériences a été faite in vitro et sur des neurones en culture. Pour la suite du projet, il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau et les mouvements anormaux.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Pour permettre l'acclimatation, un minimum d'une semaine sera alloué lorsque les animaux seront transférés d'autres installations. Afin de donner la priorité au bien-être des animaux et de minimiser la douleur, la détresse ou la souffrance potentielles pendant les expériences, nous surveillons l'état de santé et de stress des souris tout au long de l'étude. Pendant les semaines de convalescence suivant l'opération, les souris seront surveillées et recevront de la nourriture supplémentaire. En cas de douleur ou d'inconfort, un analgésique sera administré. Nous utilisons des points limites adaptés permettant d’intervenir rapidement pour limiter la souffrance de l’animal. Étant donné que la procédure chirurgicale pour l'induction de la lésion qui générerait la maladie de Parkinson peut entraîner des problèmes d'alimentation et de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée d'une solution de glucose et de sérum physiologique immédiatement après l'opération et une fois par jour pendant la première semaine postopératoire. Compte tenu de la possibilité de complications postopératoires, un dossier complet d'évaluation de la santé sera tenu pour chaque souris pendant les 14 premiers jours suivant l'opération. Des tests comportementaux seront effectués après une période d'entraînement pour limiter le stress de la nouveauté.
Choix des espèces
La souris est un mammifère génétiquement modifiable, dont l'anatomie et la physiologie sont comparables à celles de l'homme, de sorte que les connaissances acquises peuvent également être appliquées à l'homme. En outre, l'élevage des souris et les conditions de leur utilisation expérimentale sont bien établis. Des modèles génétiquement modifiés d'intérêt existent déjà dans notre laboratoire et les échelles de dyskinésie pour les souris sont maintenant bien validées et largement utilisées. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines.
Modèle expérimental de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1425
Lapins : 1425
Une lésion est provoquée sur un seul œil de chaque animal, puis des gouttes sont instillées jusqu'à six à huit fois par jour et des produits injectés dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical. 1 425 souris, 1 425 rats et 1 425 lapins vont être utilisés, soit 4 275 individus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une gêne ou une douleur limitée à quelques heures après l'induction, tout en indiquant ailleurs que la lésion entraîne une altération partielle et permanente de la vision. Tous les animaux ayant suivi la procédure entière sont tués pour des analyses histologiques et des dosages.
Objectifs
La cornée, partie du globe oculaire située en avant de l'œil est un tissu transparent. Dans certaines pathologies, des vaisseaux sanguins envahissent de façon anormale l’intérieur de la cornée. Ce phénomène appelé « néovascularisation cornéenne », est un problème majeur de santé publique car la perte de la transparence de la cornée empêche une vision correcte et peut conduire à une cécité. Les origines de ce phénomène sont multiples : maladies héréditaires, séquelles d’un traumatisme ou d’une brûlure, complications d’infections virales ou bactériennes, complications de greffes de cornées, port prolongé de lentilles de contact. La majorité des traitements actuels ciblent la régression des vaisseaux par : - Application de produits anti-inflammatoires, - Coagulation des vaisseaux à l’aide d’un laser ophtalmique, - Transplantation de membrane amniotique. Ces traitements ne sont pas toujours efficaces et les effets secondaires fréquents ne sont pas à négliger : - Augmentation de la pression intra oculaire avec risque de glaucome, - Apparition de cataracte (opacification du cristallin, autre structure de l’oeil dont la transparence est capitale pour la vision). Les récents traitements visent les facteurs directement impliqués dans la formation de ces nouveaux vaisseaux au niveau moléculaire. L’objectif du projet est la mise en place au sein de l’établissement utilisateur de modèles expérimentaux de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur afin de participer au développement de nouvelles thérapies pour cette pathologie. Le principe est d’induire sur un seul oeil, par différentes méthodes, la prolifération de vaisseaux suite à une lésion cornéenne.
Bénéfices attendus
Les pathologies de la cornée sont un réel handicap puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. L’assemblage en couches cellulaires très organisées et dépourvues de vaisseaux, garantit la transparence du tissu essentielle à la vision. Ce « privilège » anti-angiogénique résulterait d’un équilibre entre production de facteurs anti-angiogéniques et répression de facteurs pro-angiogéniques. Lors d’une atteinte de la cornée, il y a une rupture dans cet équilibre, en faveur de la production de facteurs angiogéniques. Cette rupture entrainerait le développement de nouveaux vaisseaux à partir du limbe vers le centre de la cornée, le limbe étant la zone de transition entre la sclère opaque et la cornée transparente.
Procédures
La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, l’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.
Distribution 3D de la bléomycine après instillation intratrachéale et relation dose-effet dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Une instillation de bléomycine directement dans la trachée sous anesthésie, répétée jusqu'à trois fois pour le groupe suivi trente jours, provoque chez 48 souris une fibrose pulmonaire. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour prélever les poumons et cartographier en trois dimensions la distribution du produit et des lésions. Le projet doit fournir un atlas de référence à un modèle mathématique, présenté comme une étape vers un "jumeau numérique" qui réduirait ensuite le nombre d'animaux utilisés. Le porteur affirme que l'instillation ne cause aucune douleur au réveil et que le développement de la fibrose est indolore faute d'innervation sensitive du poumon, tout en annonçant une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 % après sept à dix jours à forte dose.
Objectifs
La fibrose pulmonaire progressive correspond à un ensemble pathologie pulmonaire fibrosante qui met en jeu le pronostic vital et qui recouvre des causes très différentes, avec des réponses hétérogènes et insatisfaisantes aux traitements. L’étude de cette pathologie nécessite de développer des modèles réalistes pour comprendre les mécanismes impliqués dans le remodelage tissulaire à l’origine de la morbidité associée à la maladie et la proposition de nouveaux traitements ciblés. Le modèle de fibrose pulmonaire le plus largement utilisé est réalisé in vivo chez la souris par instillation dans la trachée d'un agent pro-fibrosant. Cependant, ce modèle présente des inconvénients tels que l'hétérogénéité spatiale anatomique des lésions. Ce modèle étant malgrés tout le plus utilisé et reproduisant un certains nombre d’éléments retrouvé chez le patient, nous envisageons : 1/ d’évaluer virtuellement la distribution de l'agent pro-fibrosant après instillation intra-trachéale en utilisant les mathématiques probabilistes, d'abord appliquées à un modèle simplifié ; 2/ de comparer les résultats obtenus dans les modèles virtuels avec la distribution pulmonaire 3D de cet agent pro-fibrosant immédiatement après instillation intra-trachéale, ainsi que les lésions fibrotiques induites 1 semaine plus tard.
Bénéfices attendus
La fibrose pulmonaire progressive est une pathologie qui met en jeu le pronostic vital et qui recouvre des causes très différentes, avec des réponses différentes aux traitements disponibles. Cette pathologie pulmonaire est considérée comme un problème majeur de santé publique. L’étude de cette pathologie nécessite de développer des modèles animaux en injectant dans le poumon un agent fibrosant. Ces modèles permettent de comprendre les mécanismes impliqués dans les modifications de l’organisation du tissu pulmonaire à l’origine des symptômes associés à la maladie. Ce projet vise à approfondir nos connaissances du modèle de souris qui reproduit la fibrose pulmonaire progressive. L’objectif est de construire un « atlas de référence » de l’apparition et de l’évolution de la maladie à partir d'un modèle mathématique. Ce modèle permettra de prédire l’apparition et la distribution des lésions afin de mieux comprendre et mieux traiter les modifications de l’organisation du tissu pulmonaire. Nous utiliserons une technique d’imagerie tridimensionnelle à haute résolution afin de : 1) déterminer la distribution 3D des instillations de l’agent fibrosant injecté dans le poumons des souris en fonction des programmes d'administration (injection unique ou répétée) ; 2) déterminer la distribution des lésions dans le poumon de la souris; 3) réaliser un "atlas" de référence pour la construction des modèles mathématiques. Une meilleure connaissance du modèle animal permettra de construire un jumeau numérique afin de réduire le nombre d'animaux utilisé et permettra également une meilleure connaissance de la pathologie humaine.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite deux types d’induction et deux temps de maintien. L’induction de lésion pulmonaire aigue (8 jours) via l’administration unique d’un agent pro-fibrosant sous anesthésie générale (durée 10 min). L’induction de lésion pulmonaire progressive (30 jours) via l’administration répétée d’un agent pro-fibrosant sous anesthésie générale (durée 10 min répétée 3 fois). Les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses soit immédiatement après administration de l’agent pro-fibrosant soit une semaine après.
Impact sur les animaux
L'instillation intra-trachéale d’un agent fibrosant n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement d'une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 pour cent après 7 à 10 jours suite à l’administration d’une forte dose d’agent fibrosant ou de 10 pour cent après 45 jours lors des instillations répétées de faibles doses de cet agent. Les anesthésies par voie intra-péritonéale sont suivies par l'euthanasie de l’animal (sans réveil). Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux seront ajustés en temps réels en fonction des réactions de l’animal afin d’éviter les risques anesthésiques.
Devenir
A la fin de la période de maintien ou en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes. Tous les prélèvements sont nécessaires pour répondre à la question scientifique
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite d’instiller des agents pro-fibrosant et des produits de contratse avant d’étudier leurs distributions post instillation ainsi que l'induction de lésions pulmonaires in vivo. De fait, il n'existe pas de méthodes alternatives à l'expérimentation animale in vivo à ce jour pour cette expérimentation.
Réduction
48 animaux sont prévus dans ce projet. Le nombre de souris par groupe à été estimé en fonction de la littérature existante. Il s’agit du nombre minimum d’animaux requis pour l’obtention des acquisitions par tomographie par contraste de phase à rayons X à haute résolution permettant une imagerie volumétrique nécessaire à l’étude de la distribution 3D des lésions.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'instillation intra-trachéale, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'à leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédant l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiée via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe de fermeture des paupières, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivants: immobilité, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité (faiblesse musculaire, manque de coordination, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif d’induire des lésions pulmonaire puis de prélever les poumons afin visualiser la distribution de ces des lésions pulmonaires. Notre choix c'est porté sur la souris car le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale d'agents pro-fibrosant est un modèle validé dans la littérature et couramment utilisé pour l’étude des fibroses pulmonaires progressives. Il est parfaitement décrit et il a permis l’identification de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été́ utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques Pour réaliser notre étude, nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. Les souris jeunes semblent moins sensibles aux agents pro-fibrosant comparées aux souris âgées. Cependant, il est bien décrit dans la littérature que les souris plus âgées, développent une fibrose pulmonaire plus sévère, ce qui risquerait d’induire une surmortalité. Le compromis qui a été choisi est un âge de 8 semaines.
Evaluation de nouveaux outils radiothérapeutiques ciblant le noyau des cellules cancéreuses – EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Les souris retenues sont dépourvues de thymus, donc privées d'une grande partie de leurs cellules immunitaires, pour que leur organisme ne rejette pas la tumeur humaine qu'on leur greffe. 2 480 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à six anesthésies, une greffe sous-cutanée, une injection intraveineuse de composé radiomarqué, jusqu'à 45 minutes d'imagerie et des mesures de tumeur au pied à coulisse, avec hébergement individuel après l'injection radioactive, ce que le porteur décrit comme un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression". La mise à mort sert à compter la radioactivité organe par organe, le cadavre étant lui aussi récupéré.
Objectifs
Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un élément radioactif à une molécule, ou vecteur, capable de se lier de manière spécifique à une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que le vecteur puisse diriger et concentrer l’élément radioactif dans les cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur par imagerie nucléaire ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Ces rayonnements détruisent l’ADN des cellules cancéreuses, menant à la destruction de la tumeur. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Plusieurs types de vecteurs capables de se lier spécifiquement à la protéine N ont été développés. A la différence de nombreuses autres protéines exprimées par les cellules cancéreuses, la protéine N est capable de transporter les vecteurs qui s’y lient jusqu’à son noyau cellulaire qui contient l’ADN. En rapprochant l’élément radioactif de l’ADN, il est possible de potentialiser l’effet de la thérapie, tout en diminuant sa toxicité pour les cellules saines. Nous avons sélectionné deux vecteurs se liant à la protéine N de manière différente afin de maximiser les chances d’identifier un système efficace. Comme il existe plusieurs types d’élément radioactif avec des propriétés très différentes, il est nécessaire de comparer l’efficacité de plusieurs combinaisons vecteur-élément radioactif afin d’identifier le couple le plus efficace. Alors que certains de ces éléments radioactifs émettent des rayonnements ionisants capables de détruire les cellules cancéreuses, d’autres peuvent être utilisés pour détecter les tumeurs par imagerie, ce qui permettra dans un premier temps de vérifier que les vecteurs s’accumulent bien dans la tumeur chez la souris. Dans un second temps, l’imagerie permettra de sélectionner les patients dont les tumeurs expriment la protéine N et qui seront donc éligibles à la thérapie. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels par radiothérapie interne vectorisée sont presque systématiquement accompagnés d’effets secondaires graves dus aux dommages provoqués aux cellules non-cancéreuses. En dirigeant les éléments radioactifs de manière spécifique au noyau des cellules cancéreuses, la stratégie de ce projet a pour but d’augmenter l’efficacité de ces thérapies tout en diminuant leur toxicité. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l’Homme à la fin de l’étude
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - 1 Injection en sous-cutané au moment de la greffe de cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum). - 1 injection de produit en intraveineuse dans la veine de la queue lors des expérimentations d'imagerie ou de traitement (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum). - Anesthésie à l'isoflurane réalisée lors de la greffe des cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum), lors de l’injection intraveineuse des produits (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ou au moment de la mise à mort (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ainsi que pendant l’acquisition des images (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). Il y aura au total 6 anesthésies au maximum pour chaque animal. - Imagerie à l’aide d’un scanner dans les procédures d’imagerie (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). - Mesures du poids et de la taille des tumeurs dans les procédures d’imageries et d’évaluation de l’efficacité des traitements (réalisée dans l'établissement 2, 1 min maximum).
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : - douleurs générées lors de la greffe des cellules tumorales, lors de l’injection des agents d’imagerie ou de thérapie. - lésions locales au site d’injection dû à la rétention du composé radiomarqué. - gêne ou douleur provoquée par la croissance des tumeurs - fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines ou troubles digestifs dans les jours suivant l'injection du traitement radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. - stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. - sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie et de biodistribution.
Devenir
Les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris incluse dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficacité thérapeutique.
Remplacement
Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. La procédure d’imagerie permet d’observer la localisation du vecteur au cours du temps sans avoir mettre l’animal à mort (suivi longitudinal), ce qui permet de maximiser les informations recueillies en minimisant le nombre d’animaux mis à mort. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées.
Raffinement
Méthodes utilisées pour réduire la douleur : Raffinement des conditions d'hébergement : - Dans les procédures 1 et 2, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection du vecteur radiomarqué et de permettre un contact visuel des animaux. Chaque boite sera également enrichie d'un igloo et d'une roue en polycarbonate. - Dans toutes les procédures, des croquettes mouillées seront rajoutées dans les cages des souris souffrant de fatigue ou de faiblesse. Dans les procédures 3 et 4, des croquettes mouillées seront ajoutées systématiquement la première semaine suivant l’injection des vecteurs radiomarqués. - De la litière de cellulose sera utilisée pour limiter l’apparition de plaie chez les souris porteuses de tumeurs. - Le transport des animaux de l’EU1 à l’EU2 sera réalisée à l’aide de cages opaques à couvercle filtrant. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés lors de la greffe des cellules tumorales (5 min maximum), lors de l'injection intraveineuse des composés (5 min maximum), lors des acquisitions d'image (45 min maximum) et lors de leur mise à mort (5 min maximum). Analgésie: en cas d'apparition de douleur, des analgésiques seront administrés aux animaux. Des points limites spécifiques à ce projet ont été mis en place pour limiter la souffrance des animaux au minimum. Ces points limites seront appliqués de manière stricte.
Choix des espèces
Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux humains est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de tumeurs humaines car celles-ci se caractérisent par l'absence d’un organe (le thymus), ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge, et ils sont plus résistants aux radiations.
Evaluation de traitements contre la rhinite chez le cobaye
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Sensibilisés quatre fois par injection, triés selon leur réaction inflammatoire, puis exposés à l'allergène dans les deux narines, 1 260 cobayes développent éternuements, frottements du museau, larmoiement et écoulement nasal, comportements observés pendant deux heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 1 080 d'entre eux et léger pour 180, avec jusqu'à 28 administrations d'un candidat médicament sur quatre semaines. Le porteur écrit que "les symptômes de la rhinite ne sont pas graves en soi" au moment de justifier l'intérêt du projet, après avoir décrit ces mêmes symptômes comme le résultat recherché chez les cobayes. Les animaux répondants sont tués pour prélèvement terminal du liquide nasal, du sang et d'organes, les 180 non-répondants restant en vie pour de "potentielles études futures".
Objectifs
La rhinite allergique est une maladie chronique des voies respiratoires très fréquente. Sa prévalence a augmenté considérablement ces dernières décennies, au point de constituer un problème de santé publique. 25% de la population est affectée dans les pays développés. La rhinite allergique constitue un problème de première importance en raison de sa prévalence élevée, des coûts qu’elle occasionne, de son évolution vers l’asthme et de ses effets considérables sur la qualité de vie des personnes affectées. La rhinite est déclenchée par une réaction excessive du système immunitaire en présence d’un allergène, comme le pollen ou les acariens. Pour défendre l’organisme, le système immunitaire libère divers composés, notamment de l’histamine, qui sont responsables des symptômes allergiques. Le traitement le plus efficace est l’éviction de l’allergène en cause, mais ceci est difficilement possible en pratique (e.g. cas d’une allergie aux pollens). Différents traitements sont disponibles. Cependant, les corticoïdes en suspension nasale ont des d’effets indésirables, tels que saignement de nez, irritation, fragilisation de la muqueuse nasale en cas de traitement prolongé. Les antihistaminiques peuvent également entrainer de la sédation. L’immunothérapie spécifique ou désensibilisation permet aussi d’induire une tolérance à un ou plusieurs allergènes. Dans ce contexte, le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et les symptômes (éternuement, écoulement nasal,…) de la rhinite chez le cobaye.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l'efficacité de substances en cours de développement sur l'apparition des symptômes de la rhinite mais également sur la réponse inflammatoire. En effet, si les symptômes de la rhinite ne sont pas graves en soi, leur association peut les rendre difficiles à supporter et avoir un impact non négligeable sur la qualité de vie des patients (troubles du sommeil, fatigue chronique, difficultés de concentration, baisse de performance,…). Sans compter que les allergies peuvent exacerber les maladies suivantes : asthme, infection des voies respiratoires supérieures, sinusite ou bronchite. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer un traitement efficace afin d’inhiber les symptômes de la rhinite et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Dans ce projet, les cobayes seront sensibilisés à 4 reprises en standard par l'injection d’un réactif (durée d’environ quelques secondes). Une semaine a minima après la dernière sensibilisation, les animaux répondants seront sélectionnés par injection (durée de quelques secondes) du même réactif (observation non invasive pendant 40 minutes de l’apparition d’une réaction inflammatoire au point d’injection). La rhinite est ensuite induite par une injection du réactif au niveau des 2 narines, durée de quelques secondes. Les symptômes de la rhinite seront évalués par observation du comportement de l’animal (en général pendant 2 heures après le challenge, après une période d'habituation de 30 minutes). Des prélèvements sanguins (durée de quelques secondes) peuvent être réalisés au cours de l’étude (maximum 2 prélèvements). Après l’évaluation des symptômes, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements, e.g. sang, liquide nasal ou organes d’intérêt (durée de quelques secondes). Les candidats médicaments seront administrés (durée de quelques secondes) de manière aigue (une administration unique) ou chronique (durée maximum de 4 semaines selon le composé, soit 28 administrations).
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédure, il est attendu le développement des symptômes de la rhinite après le challenge par voie nasale, i.e. principalement éternuement, frottement du museau, larmoiement, rhinorrhée et sécrétion de mucus. Il n’est pas attendu d’effets indésirables pendant la phase de sensibilisation des animaux. Pendant la phase d’observation des animaux, ces derniers sont isolés afin de mieux les observer. Des prélèvements intermédiaires réalisés au cours de l’expérience chez les animaux vigiles pourraient également constituer un stress.
Devenir
Tous les animaux répondants sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (prélèvement du liquide nasal, de sang et/ou d'organes) afin d'évaluer l'effet des candidats médicaments sur la réponse inflammatoire. Les animaux non-répondants à la sensibilisation sont maintenus en vie car ils ne présentent pas de symptômes particuliers et pourront donc être utilisés dans de potentielles études futures.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests in vitro et in silico ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système respiratoire chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études (otamment, les prélèvements terminaux systématiques permettent d'éviter d'utiliser d'autres animaux). Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe non sensibilisé, à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux par groupe est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Le cobaye est reconnu comme un bon modèle d'asthme ou inflammation pulmonaire, car contrairement à la souris et au rat, il démontre une réaction allergique précoce et tardive comme c'est le cas chez l'humain. C'est également l'espèce classiquement utilisée pour l'évaluation des symptômes de rhinite ou toux. Les études sont principalement réalisées chez des cobayes sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément à la bibliographie scientifique.