Rongeurs

Une perte de 25 % du poids, ou un score de douleur de huit à neuf sur la grille du laboratoire, déclenche la mise à mort. 313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome mitochondrial rare, elles sont suivies de la naissance jusqu'à deux ans, avec prélèvements sanguins et urinaires à un, deux, quatre et six mois, tests de force et d'endurance et séances d'IRM et d'échocardiographie sous anesthésie aux mêmes âges. Le porteur attend un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire, et présente ce travail comme l'étape préalable au test de candidats médicaments déjà repérés sur des cellules de patients.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - les symptômes de la maladie retrouvés dans le modèle murin sont équivalents à ceux retrouvés chez l'homme suggérant qu'un candidat médicament efficace dans le modèle murin le sera également chez l'homme Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

Cathétérisées au ventricule gauche après une échocardiographie sous anesthésie, 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux interventions durent quinze et trente minutes par animal, sur des souris transgéniques privées de certaines protéines dans un organe précis. Le projet cherche pourquoi la relaxation du cœur se dégrade davantage chez les femmes après la ménopause, en explorant un axe entre le foie et le cœur. Le porteur justifie la mise à mort par le "bien être à long terme de la souris", au motif que la chirurgie qu'il vient de pratiquer risque de provoquer des complications.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont responsables de 4 millions de décès par an en Europe et représentent la principale cause de décès. Cependant, l'incidence des MCV varie considérablement en fonction du sexe, du statut hormonal et du statut métabolique. En effet, avant la ménopause, les femmes semblent être protégées des MCV par rapport aux hommes du même âge, mais leur incidence et leur gravité rejoignent ensuite celles des hommes après la ménopause, suggérant ainsi un rôle protecteur des œstrogènes. Parmi les MCV, l'insuffisance cardiaque (IC) avec fraction d'éjection préservée (ICFEP), caractérisée par une dysfonction diastolique (relaxation cardiaque) et une function systolique normale ( contraction cardiaque) est désormais considérée comme la forme prédominante d’IC (>50%). L’ICFEP présente un dimorphisme cardiaque puisque les femmes âgées sont davantage touchées par rapport aux hommes. Aujourd’hui, le diagnostic précoce de la maladie est difficile et, contrairement à l’ICFER (IC à fraction d’éjection réduite), il n’existe que peu de médicaments efficaces. Ce constat provient du fait que l‘on connait très mal le fonctionnement de la relaxation cardiaque et ses régulateurs, d’où la nécessité urgente d’étudier ces mécanismes. Dans ce contexte, dans l’équipe, nous avons identifié récemment Ephrine-B1 comme un déterminant moléculaire de la diastole. Plus récemment, des données de microscopie électronique du tissu cardiaque ont révélé des régulateurs potentiels d’Ephrine-B1 avec notamment le rôle des œstrogènes et le rôle du métabolisme hépatique . Aussi, l’OBJECTIF DU PROJET consistera maintenant à explorer, dans différents modèles de souris le rôle de ces différentes pistes moléculaires dans la régulation spécifique de la fonction diastolique cardiaque, mais également de la fonction systolique. Les différences mâles/femelles chez ces animaux nous permettront également d’explorer la dimension dimorphique sexuelle de l’ICFEP.

Bénéfices attendus

Les mesures de pressions intra-cavitaires et les échocardiographies permettront de connaitre avec précision les fonctions de relaxation et de contraction du cœur et nous permettront ainsi de définir la présence ou non d’une ICFEP chez nos animaux. Ce projet nous permettra pour la 1ère fois, au travers la régulation de la protéine Ephrine-B1, d’apprécier le rôle des œstrogènes et du métabolisme hépatique dans la relaxation cardiaque et donc de présenter l’axe foie/cœur comme un nouvel axe thérapeutique potentiel dans l’ICFEP. En effet, les dysfonctions métaboliques du foie pourraient donc entrainer des dysfonctions de la relaxation cardiaque. En accord avec cette hypothèse, les maladies métaboliques du foie touchent les mêmes catégories de patients que l’ICFEP avec, de la même façon, une incidence plus élevée chez les femmes. A terme, ce projet devrait permettre de mieux appréhender l’ICFEP touchant différemment les hommes et les femmes et une meilleure prise en charge thérapeutique personnalisée.

Procédures

IL y a 2 intervention : l'échocardiographie, non invasive sous anesthésie légère - Durée: 15 min / souris et l'intervention 2: cathétérisme ventricule gauche cardiaque, procédure chirurgicale Durée : 30 min / souris

Impact sur les animaux

Une mauvaise gestion de l'anesthésie pourrait entrainer soit la mort prématurée de la souris ou, au contraire, un réveil de cette dernière en cours de chirurgie. Cependant, le manipulateur peut ajuster en temps réel le % d'anesthésique. De plus, le système du cathéter est doté de sonde permettant de mesurer le rythme cardiaque qui est un excellent indicateur de la qualité de l'anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, l'acte chirurgical présente un risque de développer des complications post opératoires. Pour le bien être à long terme de la souris, il est nécessaire d'euthanasier les animaux à la fin de cette intervention.

Remplacement

Pour diagnostiquer l’ICFEP, il est nécessaire d’évaluer la fonction cardiaque diastolique (mesures des flux et vitesses de relaxation en Echocardiographie Doppler-Intervention 1 + mesures de pression intra-cavitaires par cathétérisme ventricule gauche-Intervention 2) mais aussi la fonction systolique (Echocardiographie-Intervention 1) sur animal entier vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’obtenir l’ensemble de ces données fonctionnelles cardiaques nécessaires pour étudier l’ICFEP, à part ces 2 interventions fonctionnelles sur l’animal.

Réduction

Les souris utilisées pour l'échocardiographie sont les mêmes que celles utilisées pour le cathétérisme ventriculaire. Par ailleurs, des études antérieures de notre équipe mais également d’autres équipes ont démontré que 20 souris par groupe est le minimum pour faire une analyse statistiquement correcte pour les mesures de pressions cardiaques intra-cavitaires en tenant compte de la variabilité de mesure dans les cas pathologique d’ICFEP mais également en tenant compte des animaux pour lesquels il est quelquefois impossible d’introduire le cathéter au niveau ventriculaire.

Raffinement

Les mesures de raffinement mises en place pour minimiser le stress et améliorer la qualité de vie au quotidien de nos animaux est une alimentation et une source d'eau ad libitum. Un enrichissement du mileu est fait grâce à l'utilisation de morceaux de papier et de cartons permettant au souris de fabriquer un nid. De plus, des tunnel en cartons sont également utilisés pour occuper au quotidien nos souris. Concernant l’intervention 1 (imagerie cardiaque), nous utilisons une anesthésie légère par inhalation car c’est une intervention non invasive. Nous utilisons également une table thermorégulée pour le bon maintien de la température de la souris. Le point limite de cette intervention est une mauvaise adaptation de l'animal à l'anesthésie (respiration haletante ou trop diminuée), qui est compensée par une régulation immédiate de la concentration de produit délivré. Pour l’intervention 2 (chirurgie), l’anesthésie se fait comme pour l’intervention 1 (imagerie cardiaque) mais nous utilisons en plus à la fois une analgésie globale et une analgésie locale. Ceci nous permet d’avoir une couverture maximale de la douleur lors de la procédure chirurgicale. Cette intervention 2 est une chirurgie donc elle peut entrainer une diminution de la température corporelle de la souris, et pour palier à cela nous utilisons un tapis chauffant. Pour éviter un dessèchement des yeux, un gel occuloprotecteur est également utilisé. Les points limites concernant cette intervention 2 sont l’hémorragie, une mauvaise réaction aux analgésiques et ou anesthésiques. L'expertise chirurgicale de l'expérimentateur permet de gérer toute complication et le cathéter, capable de détecter la fréquence cardiaque de l’animal, permet de réagir au plus vite si l’un de ces points limites est atteint. Cela est couplé à une surveillance visuelle constante de l’animal et de la zone chirurgicale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous avons pu générer grâce à cette espèce différents modèles transgéniques présentant une délétion (= absence d'expression) de différentes protéines d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier la régulation de la fonction diastolique cardiaque à l’âge adulte chez le mâle et la femelle. Les animaux sont tous utilisés au stade postnatal 60 jours (P60) quand le coeur a fini définitivement sa maturation.

Toutes tuées en fin de procédure pour que leurs organes soient prélevés, 552 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux injections intramusculaires, 360 subissent une ouverture du thorax ou de l'abdomen, et 144 sont enfermées seules en cage à métabolisme sur une grille métallique, quatre-vingt-seize heures la première fois. Quarante-huit autres sont gavées deux fois par jour pendant neuf jours, et le porteur évoque une chirurgie sans réveil alors que le tableau des gravités ne déclare aucun animal dans cette catégorie. Il affirme que seules des expériences sur des animaux non-humains permettent d'étudier les effets d'un excès d'aldostérone sur l'équilibre du potassium, les cellules en culture ne suffisant pas.

Objectifs

L’hyperaldostéronisme primaire est un syndrome dans lequel le taux d'aldostérone est anormalement élevé à cause d’un excès de sa production par les glandes surrénales. Cette hormone agit sur le rein et stimule la réabsorption de sel et la sécrétion de potassium. En condition d’hyperaldostéronisme, quand l’organisme n’a pas besoin de cette hormone mais qu’elle est tout de même produite, le rein va retenir le sel dans l’organisme ce qui conduit à une hypertension sévère, généralement résistante à tous les traitements classiques. Ainsi, l’hyperaldostéronisme primaire est à l’origine de 6-18 pourcents des cas d’hypertension selon les populations étudiées et représente presque un quart des hypertensions résistantes à tout traitement. En parallèle, l’excès d’aldostérone va stimuler l’excrétion rénale de potassium, conduisant à une perte de potassium dans les urines et une baisse sévère de sa concentration dans le sang (hypokaliémie) pouvant avoir des conséquences fatales sur le système cardiaque. Deux protéines travaillent de concert pour permettre de limiter les pertes rénales de potassium et l’hypokaliémie. Ce projet vise à étudier si ces deux protéines participent également à la réponse à l’hyperaldostéronisme en tentant de s’opposer à l’effet hypokalémiant de l’aldostérone.

Bénéfices attendus

L’hyperaldostéronisme primaire, maladie qui est caractérisée par une surproduction anormale de l’hormone aldostérone, conduit au développement d’une hypertension et d’une hypokaliémie (baisse de la concentration en potassium dans le sang). La découverte récente d’un lien entre un facteur de croissance, un transporteur rénal de potassium et la capacité du rein à retenir le potassium, nous a amené à envisager que cette voie pourrait être mis en œuvre dans le contexte de l’hyperaldostéronisme en réponse à l’hypokaliémie. Notre projet, qui utilisera des souris mâles et femelle invalidées ou non pour les gènes à tester permettra d’évaluer si cette voie existe, ce qui pourrait permettre d’envisager d’agir dessus pharmacologiquement au bénéfice des malades.

Procédures

Tous les animaux, vigiles, (552 souris) subiront deux injections intramusculaires sur deux sites d’injection différent le premier jour de chaque procédure (1 minute par animal). Une partie des animaux subiront une thoracotomie (180 souris, 15 minutes par animal) ou une laparotomie (180 souris, 15 minutes par animal) sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Pour une autre partie des animaux, trois recueils urinaires sur animal vigile en cage à métabolisme seront réalisés sur un groupe de 144 souris (96 heures en cage à métabolisme pour le premier dont 48h d’habituation et 24h pour les deux autres recueils). Nous effectuerons, également, 2 prélèvements sanguins à 7 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal, sur 144 souris). De plus, deux mesures de la composition corporelle par résonance magnétique nucléaire espacées de 7 jours (2 minutes par animal) seront effectuées sur ces 144 souris. Une autre partie des animaux (48 souris) sera soumise à un maximum de 9 jours de gavages deux fois par jour (30 secondes par animal) et subira un prélèvement sanguin unique sous anesthésie (1 minute par animal). Toutes les souris sont euthanasiées en fin de procédure (552 souris).

Impact sur les animaux

En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont isolés et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. Ils subiront un prélèvement de sang sous anesthésie et antalgique pouvant entrainer une hémorragie. Certaines souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle par mesure de résonance nucléaire magnétique. Cette procédure peut entraîner un léger stress au moment de la manipulation des souris pour vider leur vessie par massage abdominale et le temps de la mesure (2 minutes). Des animaux subiront également un gavage qui pourrait conduire à une fausse route. Certains animaux subiront également une chirurgie sans réveil susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire. L’injection intra-musculaire peut entrainer également une douleur ponctuelle.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences physiopathologiques d’un hyperaldostéronisme primaire sur l’équilibre de la balance potassique. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 552 souris. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous l’avons calculé au plus faible à l’aide de tests statistiques et sur la base de notre expérience. Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et qui pourraient impacter négativement certains résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles ou si nous constatons que certaines de nos hypothèses concernant l’implication de nos protéines d’intérêt ne sont pas validées.

Raffinement

Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre sur cette grille ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier en n’étant plus en contact permanent avec la grille, ce dispositif n’altérant pas le recueil d’urine. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation classique avant que son état ne se détériore. Le suivi de ces points limites continuera afin de vérifier s’ils reviennent à la normal. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagé. Pour la mesure dans l’appareil à résonnance magnétique, les animaux seront habitués à être manipulés pour avoir la vessie vidée et à être placer dans le tube de mesure. Quelques jours seront consacrés à laisser les souris découvrir le tube de mesure, à y être placées puis ressorties. Ce tube est en plastique rouge pour diminuer le stress de la souris. Le tube est muni de trou pour permettre la circulation de l’air. La souris est maintenue dans le fond du tube par un piston de diamètre légèrement plus petit que le diamètre du tube. La hauteur du piston est réglable et permet de laisser la souris se mouvoir librement. La queue de la souris peut passer entre le piston et la paroi du tube sans être pincée. La mesure dure 2 minutes. Nous avons noté que les souris habituées stressent moins dans le tube après habituation : ne perdent pas de fèces pendant la mesure, sortent du tube sans hésitation. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil. L’ensemble des expériences sera mené dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur, par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associés à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles âgées de 8 à 15 semaines afin d’évaluer l’effet de l’induction d’un hyperaldostéronisme sur la balance du potassium et d’évaluer l’implication de deux facteurs protéiques dans la réponse à cette induction. Nous utilisons des souris mâles et femelles « normales » et transgéniques (invalidées pour nos gènes d'intérêts) âgées de 8 à 15 semaines afin d’évaluer l’effet de l’induction d’un hyperaldostéronisme sur la balance du potassium et d’évaluer l’implication d’un facteur de croissance et d’un transporteur ionique dans la réponse à cette induction.

196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune opérée du cerveau deux fois, une première injection virale avant l'âge de quatre jours, une seconde entre vingt-quatre et vingt-huit jours. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère jusqu'à deux heures pour la première intervention. Le porteur identifie le cannibalisme maternel comme le principal problème de ses procédures et énumère cinq parades, dont des friandises données aux femelles pour qu'elles associent son intervention à quelque chose de positif. L'enjeu est de vérifier dans un cerveau vivant un mécanisme de transport cellulaire déjà décrit sur des cultures de neurones, les retombées médicales étant renvoyées à d'éventuelles pistes futures.

Objectifs

Comment les cellules du cerveau (les neurones) peuvent-elles réagir si rapidement aux signaux, alors qu'il faut parfois des minutes, voire des heures, pour que les molécules voyagent d’une cellule à l’autre? Grâce à l’utilisation de techniques in vitro et à la modélisation mathématique, nous avons découvert un nouveau mode de transport cellulaire expliquant comment le signal se transmet de façon rapide et efficace le long des connections cérébrales. Ces résultats, obtenus in vitro sur culture cellulaire de neurones, nécessitent maintenant d’être validés in vivo afin de démontrer la pertinence physiologique de ce nouveau mécanisme dans le cerveau de mammifère. Pour cela, nous proposons d’exprimer une molécule fluorescente dans le cerveau de souris adultes qui sera transportée le long des connections cérébrales. Nous bloquerons ensuite le mécanisme de transport en injectant un inhibiteur que nous avons identifié. Nous analyserons ensuite la localisation de la molécule fluorescente après fixation des tranches de cerveau. Si le nouveau mode de transport que nous avons découvert existe in vivo, nous devrions observer une accumulation de la molécule fluorescente au niveau des points de contact avec les neurones cibles. Ces travaux permettront ainsi de démontrer comment les neurones gèrent leur communication pour la transmission rapide et efficace du signal à travers le cerveau.

Bénéfices attendus

Le transport des vésicules dans les neurones est un processus essentiel qui permet de déplacer des protéines importantes du corps cellulaire vers les zones de communication entre les neurones, appelées synapses. Dans une étude précédente, nous avons découvert un nouveau mode de transport que nous avons surnommé "Sushi-go-round", qui joue un rôle dans la régulation de ces communications. Ce projet va nous permettre de prouver l'exitence de ce mode de transport chez les mammifères, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment les neurones communiquent et s'adaptent. Ces découvertes pourraient avoir des implications majeures en neurosciences, en nous aidant à mieux saisir le fonctionnement du cerveau et en ouvrant de nouvelles voies pour comprendre les maladies qui affectent le système nerveux.

Procédures

Dans cette étude, des souris, qui n'ont même pas encore quatre jours de vie, vont recevoir une injection de virus dans une zone du cerveau. Cette opération dure entre 10 et 20 minutes. Pendant ce temps, les souriceaux seront séparés de leur mère pour un maximum de deux heures. Ensuite, quand ils seront âgés entre 24 et 28 jours (après sevrage), ils subiront une autre injection dans une autre partie précise de leur cerveau. Cette deuxième opération prendra un peu plus de temps, entre 30 et 45 minutes. Après un temps défini dans l’étape 0 du projet, les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux pour analyse.

Impact sur les animaux

- stress : Les souris nouveau-nés (P0-P4) et leurs mères seront séparés momentanément (120min maximum) donc cela engendrera du stress. -anesthésie : risque de déshydratation, dépression cardio-vasculaire et respiratoire, hypothermie. Après l’injection des nouveaux nés, un suivi de l’animal sera mis en place tous les jours pendant une semaine pour vérifier l’apparition de signes de souffrance (peau de couleur bleutée, vocalisation, changement de la respiration abdominale). Concernant les animaux sous chirurgie, un suivi postopératoire sera également mis en place pendant les 4h de traitement (Agité ou très immobile, vocalisation ou automutilation, Augmentation de la fréquence et de la respiration abdominale), jusqu’à leur mise à mort. Un traitement analgésique en sous cutané sera utilisé en présence de signes de souffrance.

Devenir

Tous les animaux ayant subis une chirurgie seront mis à mort pour les prélèvements.

Remplacement

Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une recherche précédente qui a été réalisée dans notre laboratoire, où nous avons découvert un nouveau moyen par lequel les cellules nerveuses peuvent communiquer rapidement entre elles. . Ces résultats proviennent d’analyse à partir de culture de cellules de souris. Maintenant, nous devons vérifier si ce même processus se produit dans un organisme vivant, la souris. C'est pourquoi nous ne pouvons pas nous passer de ce modèle animal pour nos prochaines étapes de recherche.

Réduction

Pour réaliser nos expériences, nous devons déterminer combien de souris nous avons besoin. Cette décision est basée sur des études précédentes, ce qui nous aide à garantir que nos résultats seront fiables et reproductibles. Nous avons prévu d'utiliser 15 souris par groupe pour certaines analyses, en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour une autre partie de notre étude, qui concerne l'activité électrique des neurones, nous utiliserons 10 souris par groupe. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires tout en assurant que nos résultats soient cohérents, nous allons d'abord tester les paramètres d'injection des virus. Cela nous permettra d'optimiser nos méthodes avant de commencer les expériences principales.

Raffinement

Lors de la chirurgie, les souriceaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).

Choix des espèces

Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle du transport axonal. Nous utiliserons des souris C57/BL6J. Les injections seront réalisées à deux stades de développements : 1/ Cerveau immature : injection de virus avant les 4 jours de vie du souriceaux 2/ Cerveau mature : injection après 21 à 24 jours de latence (après expression du virus) d'un inhibiteur du transport, pour visualiser l'accumulation de vésicules ( petites sacs) au niveau des prolongements des cellules nerveuses qui se trouve dans la zone du cerveau qui relie les deux hémisphères.

Injectées cinq jours de suite dans l'abdomen pour faire apparaître des lésions précancéreuses de la prostate, 20 souris mâles attendent ensuite plusieurs mois avant de recevoir un gavage quotidien pendant deux semaines. Elles sont toutes tuées à l'issue pour que leur prostate soit analysée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de confirmer sur un animal vivant qu'inhiber une voie de signalisation réduit le potentiel métastatique, effet déjà observé sur des systèmes ex vivo. Ni le produit qui déclenche les lésions ni la molécule testée ne sont nommés, et la durée réelle de détention des souris tient dans un "plusieurs mois plus tard".

Objectifs

Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements. Notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes moléculaires de progréssion des lésions précancéreuses indolores et benignes vers les tumeurs invasives et agressives. Nous avons demontré que l'activation d'une voie de signalisation dans les lésions précancéreuses promeut l'aggresivité et l'invasion métastatique. Nous avons également montré dans les systèmes ex vivo que l'inhibition de cette voie dans les cellules prostatiques diminue leur plasticité et donc le potentiel métastatique. Le but de cette étude est de valider cet effet in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider le potentiel thérapeutique d'un composé montré bénéfique pour diminuer le potentiel métastatique in vivo. L'ensemble de l'étude nous permet une meilleure compréhension de la pathogénèse du cancer de la prostate ouvrant des nouvelles perspectives thérapeutiques et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux de ce projet (20) seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition de lésions précancéreuses prostatiques. Cette procédure prend 10 secondes comprenant la préhension de la souris et l'injection en elle-même. Plusieurs mois plus tard, les animaux seront soumis à un traitement pharmacologique soit avec la molécule active, soit avec son adjuvant. Ces solutions seront administrées par la voie orale, à l'aide d'une sonde. Cette procédure prend 10 secondes comprenant la préhension de la souris et l'administration du composé. Le traitement sera quotidien pensant 2 semaines, et à la fin de la procédure les tissus seront récupérés post-mortem pour des analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Les lésions précancéreuses restent indolores jusqu'à 5 mois après injection du premier composé, nous ne nous attendons donc pas à une agressivité et donc à une douleur. L'administration par gavage oral, une irritation au niveau de la voie d'administration est possible, mais très peu probable. Le composé est bien toléré à la dose et la durée de traitement prévues pour cette étude, et même pendant les périodes de traitement prolongées et à forte dose.

Devenir

Une fois les procédures terminées, les prostates des animaux seront prélevées post-mortem pour les analyses ultérieures.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire impliquée dans l'évolution des lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et en disséquer les méchanismes moléculaires. Nous avons étudié l'effet de ce composé dans des systèmes ex vivo préalablement à cette étude.

Réduction

Etant donné la variablité inter-individuelle observée dans nos études précédentes, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement. Ainsi, nous avons prévu les groupes de souris de sorte à avoir 10 souris par analyse effectué pour le groupe expérimental donné.

Raffinement

Tout le long des traitements par injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les irritations ou l'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Tout le long des traitements par voie orale, les animaux seront surveillées pour les signes des douleurs au niveau de la voie d'injection, notamment l'hydratation de l'animal sera survéillée quotidiennement par le pincement de la peau, le poids des animaux sera également surveillé quotidiennement pendant la durée du traitement. De la nourriture en gel sera ajoutée dans les cages dès le premier jour des traitements. Le composé lui-même a été décrit dans la littérature comme bien toléré par les animaux à des doses et pour la durée de traitement que nous prévoyons pour notre étude. Nous ne nous attendons donc pas à une souffrance des animaux en liaison avec le traitement. Toutefois, les souris seront surveillées quotidiennement, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude. Tout au long de leur vie, les animaux seront surveillés par le personnel compétent, les cohortes seront constituées de sorte qu'aucun animal ne se retrouve isolé et l'enrichissement (des nids en fibres) sera ajouté dans la cage.

Choix des espèces

Le modèle de souris qu'on utilise recapitule de manière fidèle l'apparition et l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'effet d'un traitement et que le les cellules environnantes les lésions précancéreuses jouent le rôle clé dans l'évolution des lésions, nous sommes dans l'impossibilité d'utiliser les systèmes cellulaires qui ne récapitulent pas la complexité d'un tissu. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés dans ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection dans la veine caudale sous anesthésie, puis subit neuf prélèvements sanguins par voie sous-mandibulaire, avant que son cœur, son foie, ses poumons et sa thyroïde ne soient prélevés pour y doser le produit. Il s'agit de mesurer où se répartit dans le corps une amiodarone encapsulée dans des nanocapsules lipidiques, première étape du développement d'un médicament contre la fibrillation atriale. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ni aucune modélisation ne permettent ces mesures, et juge "indispensable" de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Objectifs

La fibrillation atriale est le plus fréquent des troubles du rythme cardiaque et touche environ 300 000 personnes en France. Le médicament antiarythmique amiodarone est le seul médicament autorisé pour le traitement de cette pathologie en cas d’insuffisance cardiaque malgré ses effets indésirables cardiaques et extracardiaques associés. En effet, l'amiodarone se distribue dans le coeur mais également dans de nombreux organes tels que la thyroïde, le foie, le poumon ou l'oeil. Améliorer les formulations médicamenteuses permettrait donc de mieux traiter les patients. Ce projet vise à utiliser les nanomédecines pour cibler le coeur et diminuer la distribution d'amiodarone aux autres organes afin de limiter ses effets secondaires. L'introduction de l’AMD dans des particules de très petite taille, appelée encapsulation, représente une stratégie prometteuse pour diminuer sa toxicité et améliorer son efficacité. L’objectif de ce projet est d’évaluer la biodistribution , c'est-à-dire la répartition dans les différents organes , la pharmacocinétique, c'est-à-dire le devenir dans l’organisme et la toxicité de l’amiodarone encapsulée par rapport à la molécule seule in vivo chez le rat. Les études de la pharmacocinétique et de la distribution tissulaire des différentes formulations d'amiodarone représentent une étape essentielle dans le développement d’un potentiel nanomédicament. Ce projet permettra d’analyser le devenir des formulations dans l’organisme, d'évaluer une potentielle accumulation dans les organes et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables propres à la nanoparticule. L'objectif est de valider la première étape de développement d'un nouveau médicament qui entraîne moins d'effets secondaires que le médicament actuel.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si l'introduction de l’AMD dans des particules de très petite taille est capable de cibler le coeur. La fibrillation atriale est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge précoce des patients, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité aigue, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer un accident vasculaire cérébral. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la morbi-mortalité reste élevée. A ce jour, la fibrillation atriale constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients et rendre l'amiodarone accessible à un plus grand nombre de patients. Le but du présent projet est de démontrer que l'encapsulation d'AMD pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse et originale pour le traitement de la fibrillation atriale.

Procédures

Les animaux anesthésiés (isoflurane) seront soumis à une procédure d'injection dans la veine caudale. La durée totale de l’intervention est d'environ 3 min. 9 prélèvements de sang seront réalisés en sous-mandibulaire.

Impact sur les animaux

Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Une douleur modérée au site de ponction veineuse pourrait être induite par les prélèvements sanguins multiples.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale en vue du prélèvement des organes post-mortem (coeur, foie, poumon, tyroïde) pour les dosages tissulaires d'amiodarone.

Remplacement

Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible des études de biodistribution et pharmacocinétique qui doivent être réalisées in vivo.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 6 rats par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience et a aussi été estimé à l'aide d'un logiciel de biostatistiques. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux la biodistribution tissulaire et la pharmacocinétique de l'amiodarone encapsulée , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience. Une analyse statistique des résultats sera ainsi réalisée à l’aide de tests non paramétriques. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur un même rat: prélèvements sanguin et tissulaires.

Raffinement

Nous raffinerons cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l'état général). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation systématique d’anesthésique avant la procédure et d’analgésique si l'animal montre des signes de douleurs. Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la procédure et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les rats sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix pour les études de biodistribution et de pharmacocinétique. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques pour la biodistribution et la pharmacocinétique. Rats jeunes adultes de 3 mois pour s'affranchir de l'effet du vieilissement.