Rongeurs
Importance du sens trigeminal pour la perception des odeurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Comprendre comment le cerveau décode l'intensité des odeurs, en démêlant ce qui revient à l'olfaction et ce qui revient aux fibres nerveuses trigéminales : pour cette question, 582 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une biopsie de la queue vers six jours sert au génotypage, puis viennent une heure de chirurgie sous isoflurane pour injecter un virus et implanter des fibres optiques dans le cerveau, et des séances quotidiennes de discrimination olfactive de vingt minutes pendant huit à dix jours. Pour que les souris travaillent, leur eau de boisson est additionnée d'acide citrique afin qu'elles boivent moins et cherchent la récompense, ce qui fait baisser leur poids. Le porteur annonce des points limites "établis préalablement" sans dire lesquels, et ne précise pas combien des 582 souris passent par la chirurgie.
Objectifs
L'odorat joue un rôle essentiel dans l'interaction avec le milieu environnant, la détection des sources d'alimentation potentiellement dangereuses et l'évaluation de la comestibilité des aliments. Ces dernières années, l'importance de l'odorat est devenue de plus en plus évidente, en raison de l'augmentation des troubles de l'odorat provoquée par les infections par le SRAS-CoV2. Par rapport à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a attiré peu d'attention en partie parce qu'il s'agit d'une condition socialement « invisible ». La pandémie de COVID-19 a considérablement augmenté l'incidence de cette maladie et a également sensibilisé le grand public à ce sujet. Pourtant il n'existe aucune intervention thérapeutique permettant de récupérer ou d'améliorer les capacités olfactives. Cette absence de solutions découle d'un manque de connaissances sur les mécanismes physiologiques qui régissent le système olfactif. Les principes fondamentaux qui déterminent la perception de mélanges d'odeurs complexes, les stimuli olfactifs les plus courants dans la nature restent non élucidés. La plupart des odeurs à des concentrations spécifiques peuvent activer les fibres nerveuses trigéminales dans l'épithélium olfactif provoquant des sensations telles que le froid, le chaud ou l'irritation, dont on sait qu’elles interagissent avec le système olfactif. Ce projet vise à comprendre comment le bulbe olfactif décode l'intensité des odeurs en étudiant comment sont intégrés les signaux olfactifs et trigéminaux déclenchés par les odorants.
Bénéfices attendus
Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. Toutefois, comparée à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a souvent été négligée par les institutions médicales et gouvernementales. Pourtant l’anosmie est fréquemment associée à une nette détérioration de la qualité de vie amenant très souvent à une dépression. Notre étude permettra de mieux comprendre le lien entre olfaction et sens trigeminal et de mieux connaître le traitement cérébral des odeurs, résultats qui seront utiles pour améliorer la qualité de vie des patients ayant des troubles de l'odorat.
Procédures
Les animaux seront génotypés à l'aide d'une biopsie de queue faite vers 6 jours. Nous réaliserons des chirurgies pour l'injection virale et l’implantation chronique de fibres optiques d'enregistrement chez la souris éveillée (chirurgie environ 1h sous isoflurane). Pour le test comportemental de discrimination olfactive (environ 1 séances de 20 min par jour pendant 8-10 jours) les animaux auront de l'acide citrique dans leur eau de boisson afin de limiter leur prise hydrique, diminution contrebalancée par la récompense obtenue dans la cage de comportement, la nourriture est donnée ad libitum. Le poids des animaux est mesuré plusieurs fois par semaine. Les odorants et le CO2 sont présentés à des intensitées non aversives pour les animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux seront génotypés à l'aide d'une biopsie de queue faite vers 6 jours ce qui peut entraîner une légère douleur de courte durée. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer une douleur et des problèmes de récupération (modérée). Les tests olfactifs seront réalisés en donnant de l'acide citrique dans l'eau de boisson ce qui permettra de les laisser ad libitum. Cela fera baisser leur poids (car ils boivent moins). La présentation de CO2 peut être aversive à forte dose, toutefois nous resterons dans une gamme de dosage sans effet pour l'animal. Les effets indésirables pourront se produire lors de l'injection de methimazole. Les données de la littérature indiquent que l'inflammation à court terme est spécifique de l'épithelium olfactif. L’anosmie transitoire peut perturber la prise alimentaire ainsi que le poids des animaux (légères).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements du cerveau à la fin de la procédure.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus, selon le protocole nous utiliserons des tests de two-way ANOVA suivis de tests post hoc Sidak pour les comparaisons 2 à 2, ou des t-test ou leur équivalent non paramétrique. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Les animaux non utilisés à l'issue du génotypage seront proposés au don. Nous avons prévu une étude pilote en amont des expériences afin de valider les sites précis d'injection et ainsi réduire le nombre total d'animaux utilisés. Lors du prélèvement des tissus, certains tissus non utilisés pourront être récupérés par d'autres membres de l'équipe.
Raffinement
Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris, et de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton et des batons de bois. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Les comportements olfactifs, alimentaires, de recherche de récompense peuvent être étudiés avec pertinence chez la souris en comparaison avec l’homme. La souris permet également de manipuler certains gènes permettant d’accéder à la partie plus mécanistique des processus dans un environnement physiologique comparable à l’homme. Nous utiliserons des mâles et des femelles. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 2-3 mois) afin que les réseaux neuronaux soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale accrue.
Effet de l’irradiation sur la neurocognition chez l’enfant.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génotypées par biopsie à l'état vigile, irradiées au cerveau sous anesthésie à l'âge de 21 jours, injectées, puis soumises à six tests comportementaux évaluant le comportement social, la motricité et la mémoire, 728 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 440 d'entre elles et modéré pour 288. Quatre-vingts passent en plus deux heures d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésie. Le projet cherche à savoir si le vieillissement prématuré des cellules du cerveau explique les troubles de l'attention et de la mémoire dont souffrent les enfants traités par radiothérapie pour une tumeur cérébrale, et le porteur attend chez les souris irradiées une anxiété accrue et de l'agressivité. Toutes sont tuées par chirurgie terminale sous anesthésie, pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs solides les plus fréquentes chez les enfants, qui sont traitées généralement par radiothérapie, souvent précédée d'une chirurgie et d'une chimiothérapie. Le taux de survie à cinq ans varie de 70 à 99 %, selon le type de tumeur. Les effets tardifs à long terme chez les enfants traités pour des tumeurs cérébrales sont préoccupants. Ces patients souffrent de graves handicaps physiques, fonctionnels et psychosociaux, notamment de la fatigue et des altérations de certaines fonctions cognitives spécifiques telles que des troubles de l'attention, de la mémoire de travail et de la vitesse de traitement de l’information. De nombreuses études, ont montré que l'exposition aux rayonnements ionisants induit la sénescence (processus de vieillissement prématuré) des cellules du cerveau. L'impact de la sénescence cellulaire sur les lésions cérébrales et les déficits cognitifs après la radiothérapie chez les enfants ayant survécu à des tumeurs cérébrales n'a jamais été étudié. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la sénescence cellulaire dans le cerveau de jeunes souris irradiées, les déficits cognitifs induits par l’irradiation à l’aide de tests comportementaux et les lésions cérébrales, en utilisant des méthodes d’évaluation cognitives spécifiques telles que l’histologie (analyse des tissus) des cerveaux irradiés et l’imagerie par résonance magnétique. L’utilisation d’un modèle génétique permettant de bloquer ce processus de vieillissement prématuré sera utilisé pour étudier l’implication de la sénescence cellulaire dans les séquelles cérébrales induites par radiothérapie (RT) afin de les traiter. L’utilisation de molécules qui agissent sur les cellules sénescentes constitue une voie thérapeutique prometteuse et innovante dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Le projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la sénescence et du dysfonctionnement cellulaire dans la propagation des lésions cérébrales induites par la radiothérapie. L’équipe projet espère proposer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l'apparition de séquelles cérébrales hautement délétères lors de la radiothérapie chez l'enfant.
Procédures
Etablissement Ulitisateur (EU1) élevage et irradiation : Le génotypage par biopsie sera effectuée sur l’animal vigile (durée de 2 minutes, sur 360 souris). L’irradiation sera effectuée sous anesthésie (durée de 5 minutes par animal, sur 160 souris). Les injections seront réalisées sur des animaux vigiles (durée de 1 minute par animal, sur 160 souris). Chaque souris effectuera 6 tests de comportement différents (durée d’un test estimé à 5 à 15 minutes par animal, sur 240 souris) afin d’évaluer leur comportement social, leurs capacités motrices ainsi que leur mémoire. EU 2 imagerie: L’imagerie par résonance magnétique sera réalisée une seule fois par animal, sous anesthésie (durée de 120 minutes par animal, nombre de souris 80). EU1 mise à mort des souris: elle sera effectuée par chirurgie terminale sous anesthésie pour permettre le prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : - des problèmes d’anesthésie entrainant la perte d’un animal, de l’hypothermie, des douleurs liées aux injections, des douleurs et des saignements liées au prélèvement pour le génotypage ; - un déficit mental et/ou social associé à un dysfonctionnement cognitif. Il est attendu que l’anxiété soit un peu augmentée et génère de l’agressivité ; - une perte de poids liée à un problème d’alimentation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires.
Remplacement
L’étude de l’impact de l’irradiation sur la sénescence au cours du développement nécessite d’irradier le cerveau de souriceaux et d’étudier les conséquences sur le cerveau à l’âge adulte au niveau histologique, imagerie par résonance magnétique et tests comportementaux. Il n’existe pas d’alternative non animale permettant étudier l’effet de l’irradiation sur la sénescence sur le cerveau de souris au cours du développement (équivalent de l’adolescence chez l’homme) et d’évaluer les altérations cognitives à l’âge adulte.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. Cependant, nous prévoyons d’utiliser 15 souris par groupe afin d’assurer le nombre minimum d’animaux pour les analyses de comportement et réaliser des expériences complémentaires en : imagerie par résonance magnétique, histologie 2-3D et séquençage, de façon à corréler l’ensemble des résultats obtenus. Nous utiliserons également 5 souris par groupe pour des analyses en cytométrie en flux (méthode de tri des cellules en fonction de certaines propriétés).
Raffinement
Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis pendant les 24h suivant l’anesthésie (irradiation, IRM). Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Les animaux sont transportés entre les deux EU concernés par un transporteur agrée. Afin de préserver le bien-être des souris pendant le transport, celles-ci sont placées dans des boîtes de transport jetables contenant de la litière, du coton, de l’eau gélifiée, des croquettes ainsi qu’un enrichissement de type tunnel. La taille des boîtes est adaptée au nombre d’animaux et permet de conserver leur répartition initiale par cage.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain tout au moins pour notre approche, et qui permettra donc d’extrapoler les résultats. Les souris seront étudiées à l’âge de 21 jours, au moment du sevrage et de la première vague de spermatogenèse, avant la maturité sexuelle qui a lieu à 50 jours environ. Cet âge chez la souris correspond à la préadolescence chez l’homme qui marque une transition entre l’enfance et le début de la puberté. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social dans le modèle de souris transgénique qui permet de mettre en évidence facilement la sénescence.
Mieux comprendre la physiopathologie de la dénutrition sévère et son dimorphisme sexuel lors d’interventions probiotiques et vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sevrées à 21 jours puis nourries quatre à huit semaines avec un régime carencé en macronutriments et en micronutriments, des souris juvéniles reçoivent ensuite par gavage des probiotiques, une souche vaccinale, puis une souche bactérienne virulente qui provoque une infection intestinale. 1 140 souris vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 660 dans des procédures d'un niveau sévère, avec six prélèvements sanguins caudaux par animal. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur écrit pourtant que son modèle "ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance", tout en reconnaissant que la combinaison de la dénutrition et de l'infection peut faire souffrir les souris non vaccinées.
Objectifs
Près d'une personne sur trois dans le monde souffre de malnutrition. L'apparition précoce de la malnutrition a des conséquences désastreuses plus tard dans la vie. Au moment du sevrage, un changement du microbiote intestinal (flore intestinale) se produit et induit une réaction immunitaire qui protège des pathologies futures liées au système immunitaire. La malnutrition entrave ce processus, entraînant une plus grande sensibilité aux maladies non transmissibles, aux infections et une diminution de l'efficacité vaccinale. Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale notamment chez les enfants souffrant de dénutrition sévère aigüe (Severe Acute Malnutrition, SAM). La guérison de la SAM nécessite la prise en compte simultanée des paramètres de croissance, immunitaires et du microbiote intestinal. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Récemment, nous avons développé un modèle de SAM chez la souris mâle juvénile qui récapitule fidèlement les principales caractéristiques de la SAM observés chez les enfants. La prépondérance des différences entre les hommes et les femmes dans la malnutrition plaide en faveur de l'inclusion des deux sexes dans la recherche, et lors de la conception de thérapies. Dans notre modèle murin de la SAM, nous avons démontré que le microbiote intestinal et l'immunité intestinale ne sont pas restaurés lors d’une intervention nutritionnelle et ce malgré un retour de croissance. Il faut donc étudier comment restaurer l’ensemble de ces paramètres simultanément. Les probiotiques sont des microorganismes vivants et non pathogènes qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Certaines souches ont démontré leur capacité à limiter les retards de croissance et les infections intestinales. Dans ce projet nous étudierons donc 1/ le dimorphisme sexuel de la SAM, 2/ l’impact de la SAM sur l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection à Salmonella enterica Typhimurium, 3/ la capacité de probiotiques à améliorer la SAM et 4/ la capacité de probiotiques à améliorer l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection intestinale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet permettra l'identification des mécanismes à l'origine des différences entre les mâles et les femelles dans la dénutrition ainsi que la caractérisation de ses effets lors d’interventions vaccinales et probiotiques. Ce projet permettra non seulement de disséquer la pathogénie de la dénutrition mais aussi de fournir les connaissances manquantes pour améliorer les interventions thérapeutiques. Ce projet permettra notamment l’identification de nouvelles thérapies pour restaurer le microbiote intestinal et l'immunité, pour in fine renforcer l’écosystème intestinal général face aux infections et optimiser la formulation des régimes thérapeutiques et des vaccins. Ce projet fera avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection, la vaccinologie et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme : ce projet fournira des informations importantes pour concevoir des thérapies nutritionnelles adaptées aux garçons et aux filles souffrant de malnutrition. Des stratégies multifactorielles comprenant des probiotiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Consommation d’un régime alimentaire carencé en macro- et micronutriments durant 4 semaines ou 8 semaines. Prise de poids sur animaux vigiles quotidienne ou hebdomadaire, durée estimée à 2 minutes/souris. Contention des souris associée à l’administration par gavage de probiotiques, de molécules servant à étudier la perméabilité intestinale ou la capacité d’absorption des graisses, d’une solution de glucose (2g/Kg pour suivi glycémique), de souche vaccinale et souche virulente de bactéries causant des infections intestinales sur animaux vigiles : durée estimée à environ 30 secondes/souris (gestes de contention 10 secondes + de gavage 10 secondes). Mise à jeun 4h00 ou sur la nuit : 1 fois durant la procédure. Prélèvements sanguins sous-mandibulaire sur animaux endormis : 1 à 2 fois/souris sous mélange à 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène. Prélèvements sanguins caudaux sur animaux vigiles : 6 fois/souris.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet est de suivre l’impact d’une alimentation entrainant une dénutrition sévère sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus. Grâce à notre expérience dans ce domaine, nous savons aujourd’hui que notre modèle murin de malnutrition ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance chez les mâles juvéniles. Nous nous attendons à ce que les femelles juvéniles soient moins sévèrement impactées du fait de leur capacité à mieux résister à certaines carences en vitamines. Dans ce projet, nous nous intéressons donc à caractériser les différences entre mâles et femelles lors d’une dénutrition apportée par un régime fortement carencé en macro- et micronutriments. Ces différences seront également étudiées lors d’essais vaccinaux réalisés avant l’infection. L’administration du vaccin ne devrait pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Par contre la combinaison d’une malnutrition et d’une infection intestinale peut engendrer une souffrance liée à une réponse immunitaire faible chez les groupes d’animaux qui n’auront pas été vaccinés. Afin de renforcer le système immunitaire et contrer les effets de la dénutrition, des probiotiques seront également testés chez les souris dénutries et vaccinées. L’administration des probiotiques ne devraient pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Des gavages seront également réalisés sur animaux vigiles. Les gestes de contention (10 secondes), de gavage (10 secondes) génère du stress chez l’animal que nous évaluons à environ 30 secondes/intervention de ce type. En fonction de la procédure cette intervention est occasionnelle, hebdomadaire ou quotidienne. De même, nous allons mettre à jeun les souris 4h00 ou sur la nuit ainsi que réaliser des prélèvements sanguins qui généreront également du stress.
Devenir
De par la nécessité de prélever des organes vitaux pour analyses, tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
De nos jours la complexité de l’écosystème intestinal et notamment l’interaction entre système immunitaire et microbiote intestinal ne peut être reproduite in vitro, les organoïdes ne peuvent pas remplacer l’animal dans ce projet. L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à un test effectué au préalable sur 6 souris femelles (3 souris sur régime contrôle (Ctrl) + 3 souris sous régime SAM), nous avons pu réaliser un test statistique basé sur la prise de poids hebdomadaire des souris, et calculer l’effectif nécessaire par expérience pour obtenir une puissance du test 80% minimum, avec un risque de se tromper de 5%. Ceci nous amène à un nombre sujets de 5/groupe pour une puissance du test de 81%. Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées. En parallèle des souris femelles, nous allons utiliser certaines souris mâles que nous allons décomptés d’une autre DAP et non de cette DAP. Nous allons également étudier certains paramètres avant la mise à mort des souris, qui seront par la suite mises à mort pour l’analyses d’autres paramètres. Nous aurons donc besoin de 5 souris/groupe. Nous réaliserons 3 expériences indépendantes pour chaque lot de souris enrôlé dans chaque procédure. Le nombre de souris utilisé est justifié au sein de chaque procédure expérimentale, soit 1140 souris. Nous aurons également 60 souris mâles qui seront décomptés dans une autre DAP.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 souris/cage maximum avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes pour la surveillance des souris seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La souffrance potentielle induite par ce régime et son impact sur l’efficacité vaccinale sera prise en compte dans le respect du bien-être animal, et les souris seront observées quotidiennement ou 2 fois par jour afin de prévenir l’apparition de points limites : prise alimentaire et poids corporel, signes cliniques (fièvre, respiration), comportement, apparence générale (poils et sécrétions). Des mesures adéquates seront prises pour soulager la douleur comme l’administration éventuelle d’un analgésique.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal de la souris sont suffisamment proches de celui de l’Homme pour pouvoir utiliser la souris comme modèle avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les effets de la dénutrition ont été validés chez les souris mâles. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris mâles et femelles sevrées à 21 jours afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. En effet, l’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. Par ailleurs notre étude chez les mâles a montré que la dénutrition induite à 21 jours reproduit les principaux critères de dénutrition décrits chez l’Homme. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Évaluation du potentiel thérapeutique d’un composé d’intérêt dans un modèle murin d’épilepsie du lobe temporal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des points limites sont censés interrompre l'expérience avant la mort, mais environ 20 % des souris peuvent mourir directement des crises provoquées. 42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Jusqu'à neuf injections en quatre jours déclenchent chez elles un état de mal épileptique, puis une partie subit l'implantation de sondes cérébrales et vit isolée jusqu'à cinq semaines, avec vingt-quatre à trente-deux injections supplémentaires et des enregistrements allant jusqu'à dix heures par jour pendant douze jours. Le bénéfice annoncé pour les patients pharmacorésistants, éviter une résection chirurgicale du foyer épileptique, reste au conditionnel, quand l'état de mal épileptique, lui, est infligé d'emblée.
Objectifs
L’épilepsie est l’une des affections neurologiques les plus fréquentes avec une prévalence de près de 1 pour cent au niveau mondial. En particulier, l’épilepsie du lobe temporal mésial (mTLE) avec sclérose hippocampique est la forme la plus fréquente d’épilepsie focale chez l’adulte. Près de 30 pour cent des patients souffrant de cette forme d’épilepsie ne répondent pas aux traitements antiépileptiques conventionnels et sont dits pharmacorésistants. Une résection chirurgicale du foyer épileptique est alors parfois la seule option thérapeutique disponible pour ces patients. L’objectif du projet sera de tester spécifiquement l’effet et le potentiel thérapeutique d’une administration répétée d’une molécule dans un modèle murin d’épilepsie expérimentale. Spécifiquement, nous testerons l’effet de ce composé sur la fréquence des crises et des activités de type épileptique dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de valider le potentiel thérapeutique d’une nouvelle classe de molécules dans les épilepsies du lobe temporal, offrant une nouvelle piste thérapeutique pour les patients pharmacorésistants et leur évitant ainsi le recours à une procédure chirurgicale.
Procédures
Les animaux recevront des injections intrapéritonéales et sous-cutanées, sur animal vigile (durée inférieure à 1 minutes par injection, 9 injections maximum réparties sur 4 jours) afin d’induire un état de mal épileptique jusqu’à la fin de la procédure (durée 9 semaines maximum). Une partie des animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptées pour l’implantation de sondes au niveau du cerveau (1 fois, durée 1h). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu’à la fin de la procédure, soit 5 semaines maximum. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, afin d’évaluer l’effet d’un composé sur notre modèle pathologique, les animaux opérés recevront des injections d’une molécule d’intérêt ou de son contrôle pendant 2 périodes de 6-8 jours, 2 fois par jour (matin et soir), soit 24-32 injections intrapéritonéales maximum (durée inférieure à 1 minute). Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, l’activité électrique du cerveau des animaux opérés sera mesurée, pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement, vigiles et libres de se déplacer durant les mesures (maximum 10 heures par jour, pendant 12 jours consécutifs). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L'injection de la molécule permettant de mettre en place notre modèle chez la souris peut entraîner une perte de poids, une fatigue et une réduction de la mobilité pendant quelques jours. Environ 20 pour cent des souris peuvent mourir à cause de crises épileptiques sévères. Les injections peuvent causer une légère douleur au point d'injection. Les manipulations nécessaires pendant les procédures peuvent être stressantes pour les souris. L'implantation d'électrodes dans le cerveau peut causer une douleur temporaire et une légère perte de poids. Les souris implantées seront isolées pendant trois à cinq semaines, ce qui peut également être une source de stress pour elles.
Devenir
Une partie des animaux sont susceptibles de décéder spontanément des suites de l’état de mal épileptique. Le reste des animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien prévue ou plus tôt en cas d’atteinte d’un point limite. En effet, ces animaux ayant subi un état de mal épileptique, il n’est pas possible de les réutiliser pour un autre projet.
Remplacement
Les composés utilisés dans cette étude ont déjà été testés sur des modèles cellulaires et des modèles humains (tissus postopératoires) afin d’en prédire le potentiel thérapeutique. Toutefois, ces modèles ne permettent pas d’en tester directement l’effet sur des crises d’épilepsie. Pour cela, le recours à un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux (42 souris) mis en œuvre dans ce projet est basé sur les travaux précédents du laboratoire et de la littérature. Ainsi un nombre de 10 animaux par groupe a été défini, en prenant en compte : - la mortalité liée à l’induction d’un état de mal épileptique (environ 20 pour cent) - le taux d’échec d’induction d’un état de mal épileptique (environ 25 pour cent) - l’absence de développement d’une épilepsie chronique (environ 15-20 pour cent) afin d’atteindre un nombre d’animaux expérimentaux minimal de 10 par groupe avec 2 groupes expérimentaux (test et contrôle). Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux agréés, en groupes sociaux de 5 individus maximum (sauf en post-chirurgie où ils seront en hébergement individuel, identifié et avec enrichissement complémentaire) et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d’un bâtonnet à ronger au minimum. Ils auront accès à l’eau et à une nourriture adaptée à leur stade physiologique ad libitum. Une observation quotidienne des animaux sera assurée par l’équipe de zootechnie. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront pris en charge avec les soins nécessaires ou exclus du protocole. Depuis plusieurs années, nous avons raffiné notre protocole d’induction d’état de mal épileptique chez la souris, nous avons testé et comparé plusieurs protocoles d’induction et retenu celui offrant le plus haut taux de succès (survie de l’animal et développement d’une épilepsie chronique). Un soutien nutritionnel et une surveillance de la récupération des animaux sont assurés lors de l’induction du modèle pathologique. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température de l’animal durant toute la durée de l’anesthésie. Après la chirurgie la surveillance des animaux sera renforcée pendant au minimum une semaine. A partir de la chirurgie les animaux seront hébergés seuls afin d’éviter tout endommagement du matériel mis en place, ils bénéficieront alors d’un d’enrichissement complémentaire (lanière de kraft et maison en cellulose). Des points limites sont définis et seront respectés afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle rongeur est standard dans notre domaine de recherche. D’autre part, les paradigmes d’induction de crises que nous souhaitons tester ont été très bien caractérisés chez la souris. Enfin, nous avons conduit sur cette espèce des essais préalables dans ce modèle visant à l'optimiser, en réduisant notamment les doses de molécules injectées pour la mise en place du modèle, la mortalité et la fréquence des échecs d'induction, limitant ainsi le nombre d'animaux mis en œuvre. En outre, les procédures d’anesthésie et d’analgésie sont également très bien standardisées dans cette espèce. Les animaux seront étudiés à 8 semaines (stade jeune adulte) qui est le stade le plus proche des conditions de la pathologie humaine.
Rôle de différents types de cellules dendritiques dans l’infection cutanée par le HSV-1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
724 souris vont être utilisées, toutes tuées deux jours après l'inoculation pour prélèvement d'organes, dont 100 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 624 un niveau modéré. Sous anesthésie, elles sont tondues, dépilées à la crème, puis la peau du flanc est abrasée avant l'inoculation du virus de l'herpès et la pose d'un pansement. Le porteur décrit une douleur modérée au réveil pendant un à deux jours, une irritation cutanée possible, des lésions vésiculaires au cinquième ou sixième jour, et le risque que les souris se coincent les dents dans le pansement pendant la nuit. Les anti-douleurs, écrit-il, "ne peuvent être utilisés sans compromettre les résultats expérimentaux".
Objectifs
La majorité de la population est chroniquement porteuse du virus de l’Herpès, suite à une infection dans la petite enfance lors d’un contact salivaire. Après son excrétion sur la peau, le virus de l’Herpès migre dans le ganglion nerveux du trijumeau, où il établit une infection latente. Il devient dormant et les hôtes infectés peuvent rester asymptomatiques toute leur vie. Des facteurs génétiques et environnementaux peuvent déclencher une réactivation rapide du virus. Une réactivation régulière peut entraîner l'apparition précoce de troubles auto-immuns (lupus). Des troubles cutanés sous-jacents (dermatite atopique) peuvent provoquer le développement d'un eczéma herpétique nécessitant souvent une hospitalisation. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la reconnaissance et du contrôle immunitaire du virus de l’Herpès est essentielle pour progresser vers la mise au point de nouvelles thérapies visant à éradiquer ce virus ou à mieux soigner ses effets pathologiques. In-vitro, les cellules dendritiques de type 1 (cDC1s) sont capable de réguler l’activation des lymphocytes contre le virus de l’Herpès. Les lymphocytes jouent un rôle important dans le contrôle de la réactivation du virus mais on ne sait pas si c’est le cas au cours de l’infection cutanée initiale. Les cellules dendritiques plasmacytoides (pDCs) produisent des interférons lors d'une infection virale. Les interférons sont essentiels pour lutter contre les infections virales mais ils peuvent parfois avoir des effets nocifs. Les pDCs sont essentielles au contrôle d'une infection généralisée par le virus de l’Herpès, mais leur rôle est controversé dans le cas d’infections locales. ; il n’a jamais été abordé dans le cas d’une infection cutanée. Dans ce projet nous voulons étudier 1/ la cinétique des différentes phases de la réponse immunitaire précoce à une infection cutanée par le virus de l’Herpès ; 2/ le rôle des pDCs et des cDC1s dans la réponse immunitaire à une infection cutanée par le virus de l’Herpès ; 3/ le rôle des pDCs et des cDC1s dans la génération de la réponse immunitaire mémoire contre le virus de l’Herpès.
Bénéfices attendus
Nos travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la reconnaissance et du contrôle immunitaires du virus de l’Herpès. Ces recherches seront essentielles pour progresser vers la mise au point de nouvelles thérapies permettant de lutter contre les complications graves observées chez certains patients infectés. Notre Laboratoire dispose d’ores et déjà d’outils pour étudier le rôle de certains gènes, à la fois chez la souris et chez l’homme.
Procédures
1ère type d’intervention : sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc gauche suivie d’une inoculation du virus, puis elles seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements puis elles seront mises à mort pour analyses. 2ème type d’intervention : les souris recevront un traitement par ingestion ou injection pour éliminer un groupe donné de cellules immunitaires. Sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc gauche et une inoculation locale du virus puis seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements. 27 jours après une primo-infection, les souris recevront un second traitement par ingestion ou injection pour éliminer un groupe donné de cellules immunitaires. Sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc droit et une seconde inoculation locale du virus puis seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements. Les souris seront mises à mort pour analyses.
Impact sur les animaux
La piqure d’aiguille pour l’injection d’anesthésie entraine une légère douleur de courte durée. L’application de crème dépilatoire au-delà du temps préconisé peut entrainer une irritation modérée de la peau de l’animal pendant moins d’une journée . L’abrasion du flanc sous anesthésie peut entrainer une douleur modérée au réveil de la souris, d’une durée d’un à deux jours , une fois les effets de l’analgésie dissipés. L'inoculation des flancs au virus de l’Herpès entraîne l'apparition de lésions vésiculaires dans l’épide au 5ème/6ème jour qui guérissent spontanément à partir du 7ème jour. Durant la nuit suivant la pose de bandage post-infection, les souris peuvent se coincer les dents dans le pansement s’il n’est pas bien réalisé ce qui entraine des difficultés à se mouvoir et s’alimenter. La technique d’administration de substance par voie intragastrique peut être modérément douloureuse, le temps de l’intervention , si le geste n’est pas maitrisé.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. Soit un total de 724 animaux.
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours d’une infection virale in vivo. L’importance et la complexité des nombreuses interactions cellulaires nécessaires au développement du système immunitaire ainsi qu’à la mise en place d’une réponse immunitaire suite à une infection virale justifient l’utilisation de modèles d’études vivants. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable.
Réduction
Nous réaliserons des expériences pilotes, afin de réduire la variabilité et le nombre de souris utilisées. Ces expériences nous permettront également de définir la temporalité optimale des analyses pour nos études. Selon les résultats, nous pourrions réduire le nombre total de souris utilisées à 622 : soit une réduction possible de 102 souris. Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits le plus possible. Nous travaillons avec des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de réduire la taille des groupes expérimentaux à 5 souris pour chaque condition, et afin de répondre aux exigences des tests statistiques nécessaires à effectuer. Pour les souris non infectées, la variabilité étant moindre, nous réduirons la taille des groupes à 3 individus par condition. Aussi, nous répéterons chaque expérience de façon indépendante seulement 2 fois.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupe. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids. Pour la partie infectieuse, les animaux seront rapidement transférés en animalerie de confinement et immédiatement hébergés dans des cages ventilées étanches. Ce type d’hébergement offre une protection contre les pathogènes et prévient aussi toute contamination entre cages adjacentes. Les animaux seront observés quotidiennement, avec attribution d’un score clinique. En fonction de ce score, des mesures adéquates seront prises pour minimiser la souffrance des animaux. Pour un score faible, ( pas de souffrance ou seulement très légère), aucune mesure ne sera prise. Pour un score moyen, (souffrance modérée), l’accès à la nourriture et à l’eau sera facilité ainsi que l’ajout d’enrichissements supplémentaires pour nidation, et la surveillance sera accrue à deux fois par jour. Pour un score élevé (une souffrance ne pouvant être soulagée), les animaux seront immédiatement mis à mort. Les anti-douleurs ne peuvent être utilisés sans compromettre les résultats expérimentaux. Lors de la pose des pansements, une vérification sera réalisée le lendemain, afin de s’assurer que les animaux ne se sont pas coincés les dents dans les bandages. Dans le cas où les modèles de souris que l’on testera dans ce projet présenteraient une infection aggravée, nous solliciterons l’avis de la Structure du Bien-Etre Animal de notre établissement, afin d’adapter notre grille de score. L’ensemble des gestes techniques sur souris vigile sera effectué par du personnel expérimenté, afin de réduire le plus possible le stress des animaux.
Choix des espèces
La taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées, pour lesquelles des stratégies interventionnelles expérimentales sont nécessaires, y compris l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire humain. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.
Maintien et production pour l’expérimentation de la lignée de souris ASV-B à phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Produire des souris atteintes d'un cancer du foie et les expédier vers un autre établissement, c'est tout l'objet de ce projet, qui n'y ajoute aucune expérience. 1 680 souris mâles porteuses de la modification ASV-B vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles développent une dysplasie du foie à huit semaines, des nodules et un abdomen gonflé à douze, puis un carcinome diffus à partir de seize semaines. 600 d'entre elles sont expédiées vivantes avant sept semaines, avant l'apparition du phénotype, les 1 080 gardées pour la reproduction étant tuées avant quatre mois.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC= cancer du foie) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. La mortalité élevée du cancer du foie est principalement liée au manque de traitements curatifs pour les formes avancées. En effet¸ malgré les avancées technologiques dans le dépistage du cancer du foie, seuls 30-40% des patients sont éligibles à un traitement curatif (résection chirurgicale, destruction percutanée, transplantation hépatique). Afin de proposer des traitements curatifs à une plus large proportion des patients, il est important d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques et de pouvoir les tester dans un modèle pertinent d’un point de vue de la pathologie humaine. L’objectif de ce projet est de produire, dans notre établissement, un modèle de souris transgéniques (ASV-B) développant un cancer du foie sur foie sain, mimant parfaitement la maladie qui se développe chez le patient. Ces animaux seront ensuite expédiés dans un autre établissement utilisateur afin d’y tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’élevage de ces animaux permettra d'obtenir des animaux reproduisant de manière très fidèle la pathologie humaine. Ces animaux seront intégrés dans un projet scientifique qui vise à permettre l’évaluation de nouvelles thérapies anti-angiogéniques mais également l’intérêt de l’immunomodulation dans le carcinome hépatocellulaire.
Procédures
Les mâles ASV-B utilisés pour l’élevage dans notre EU peuvent manifester un phénotype dommageable léger au-delà de 12 semaines (abdomen légèrement tendu à la palpation sans gêne particulière) et seront mis à mort avant un stade avancé de la pathologie (avant 4 mois). Les mâles ASV-B utilisés pour l'expérimentation seront expédiés avant 7 semaines, soit avant le début de l’expression du phénotype dommageable dans notre EU. Au total, 1680 mâles ASV-B seront générés en 5 ans : 1080 pour l’élevage et 600 pour l’expérimentation. Pour cette DAP, aucune autre intervention ne sera réalisée dans notre établissement.
Impact sur les animaux
Les souris ASV-B mâles développent la pathologie en 3 phases : à 8 semaines le foie grossit (dysplasie, sans douleur), à 12 semaines, peuvent apparaître un léger gonflement de l’abdomen et de petites taches blanches sur le foie (nodules) mais les animaux restent actifs, se nourrissent et se déplacent. À partir de la 16ème semaine, la totalité du foie commence à être atteinte (carcinome diffus). Des études ont déjà été menées par les porteurs de projet avec ce modèle et ont démontré que le foie tumoral ne devrait augmenter ni au point d’interférer significativement avec les fonctions normales du corps, ni au point d’induire, du fait de son emplacement, souffrance et/ou détresse, entre la 6ème à la 22ème semaine de vie de l’animal concernant les mâles. Selon nos observations, les mâles gardés au-delà de 12 semaines pour la reproduction peuvent manifester un phénotype léger (abdomen légèrement tendu à la palpation sans gêne particulière) et sont mis à mort avant un stade avancé de la pathologie (avant 4 mois).
Devenir
Une partie des mâles portant le génotype d’intérêt ASV-B sera expédiée avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée pour expérimentation dans un autre établissement utilisateur. Une autre partie des mâles ASV-B sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement. Les mâles utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 4 mois, soit avant le stade avancé de pathologie, ou plus tôt si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g.si surplus). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.
Remplacement
Dans le développement des médicaments anti-cancéreux, l’utilisation d’animaux est aujourd’hui indispensable. En effet, les résultats in vitro sont une étape primordiale, puisqu’ils permettent d’évaluer les effets directement sur les cellules tumorales. Toutefois, les immunothérapies et les anti-angiogéniques nécessitent également de pouvoir évaluer les effets dans un système « intégré ». Nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. À ce jour, aucun modèle ne permet de mimer ce type d’interaction, d’où un passage obligatoire par le modèle animal.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 1680 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, l’élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivé pour utilisation ultérieure.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (6 maximum par cage) comportant des enrichissements permettant la nidification. Les mâles ASV-B sont susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 12 semaines et seront ainsi expédiés avant 7 semaines pour l’expérimentation dans un autre établissement, avant le début de l’expression du phénotype dommageable. Dans le cas où les mâles ASV-B ne sont pas transférés vers l’autre établissement pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 4 mois, avant le stade avancé de la pathologie (abdomen légèrement gonflé sans gêne particulière peut être observé après 12 semaines). Ils seront suivis tous les jours à partir de 8 semaines et ce jusqu'à leur mise à mort avec la grille d’évaluation du bien-être animal contenant des mesures de raffinement (croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage) et des points limites précoces.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent car la plupart des immunomodulateurs reconnaissent les cibles murines. De plus, les grosses molécules comme les anticorps, sont réputés pour être difficiles à tester dans des conditions in vitro, et de ce fait, les tests in vivo peuvent être privilégiés. Nous utilisons un modèle de souris transgénique qui développe un carcinome hépatocellulaire (CHC), le modèle ASV-B. C’est un modèle syngénique avec un système immunitaire fonctionnel, idéal pour tester les immunomodulateurs, présentant les mêmes anomalies vasculaires que la pathologie humaine. Dans ce modèle, la carcinogenèse et l’angiogenèse miment à la perfection celles observées chez l’homme (CHC sur foie sain). La pathologie évolue en 3 phases : à 8 semaines le foie grossit (dysplasie, sans douleur), à 12 semaines peuvent apparaître un léger gonflement de l’abdomen et de petites taches blanches sur le foie (nodules) mais les animaux restent actifs, se nourrissent et se déplacent. À partir de la 16ème semaine, la totalité du foie commence à être atteinte (carcinome diffus). Les mâles ASV-B seront ainsi envoyés pour expérimentation avant 7 semaines, avant le début de l’expression du phénotype dommageable. Les mâles ASV-B seront utilisés pour les croisements dès l’âge de 6 semaines et ce jusqu’à 4 mois, soit avant le stade avancé du phénotype dommageable (abdomen légèrement gonflé sans gêne particulière peut être observé après 12 semaines). Les femelles non porteuses de la modification ASV-B étant saines, aucune restriction d’âge n’est attendue. Elles seront utilisées pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable.
Étude et caractérisation du lien causal entre la dysbiose induite par une pneumonie et la progression de maladies cardiovasculaires dans des modèles précliniques de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
Les souris utilisées sont génétiquement hypercholestérolémiques et développent rapidement des plaques d'athérosclérose dès qu'elles reçoivent un régime gras. Elles sont 2 148, toutes tuées pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pneumonie leur est provoquée par instillation dans la trachée sous anesthésie générale, et le sang est prélevé plusieurs fois par incision de l'extrémité de la queue sur animal éveillé, entre dix semaines et huit mois d'âge. Le porteur annonce une première étape vers la prévention de l'athérosclérose après une pneumonie, et justifie l'effectif en une phrase, un nombre "réduit au minimum" pour permettre une analyse statistique fiable.
Objectifs
Les pneumonies font partie des maladies infectieuses principales, qu’elles soient acquises dans la communauté (comme la grippe ou la COVID-19) ou au cours d’une hospitalisation. Les maladies cardiovasculaires sont quant à elles l’une des causes les plus fréquentes de mortalité dans le monde. Il a été observé que l’incidence des maladies cardiovasculaires augmente après une infection, mais les mécanismes reliant l’un et l’autre n’ont pas encore été mis en évidence. L’idée principale du projet est d’étudier la relation causale entre la progression des maladies cardiovasculaires et les altérations observées suite à une pneumonie au niveau de la réponse immunitaire et de l’ensemble des microorganismes vivant en communauté complexe au sein du poumon. Ceci permettrait d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués et nous permettrait de contribuer, sur une plus grande échelle, à de nouvelles pistes pour mieux identifier les patients à risque, à trouver de nouvelles cibles thérapeutiques, et globalement à améliorer le rétablissement des patients et diminuer l’impact des infections. Notre objectif pour cette partie est de mettre en place et caractériser un modèle murin de pneumopathie dans un contexte de prédisposition aux maladies cardiovasculaires, ici l’athérosclérose, une maladie fréquente et caractérisée par le dépôt d’une plaque essentiellement composée de lipides (aussi appelée athérome) sur la paroi des artères. À terme, ces plaques peuvent entrainer une lésion de la paroi artérielle (sclérose) et conduire à l’obstruction des vaisseaux ou à leur rupture avec des conséquences souvent graves. Pour cela, nous allons : 1) Étudier la réponse de l’hôte à une pneumonie après le développement de plaques d’athérosclérose et d’une hypercholestérolémie, et caractériser le paysage immunitaire pendant et après la guérison de la pneumonie. 2) Étudier la progression des maladies cardiovasculaires après résolution d’une pneumonie et étudier la composition des cellules immunitaires dans les lésions d'athérome Pour ces deux parties, nous chercherons également à identifier les médiateurs immunitaires affectant la susceptibilité à la progression des maladies cardiovasculaires.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de comprendre comment l'athérosclérose influence la réponse immunitaire des poumons pendant la pneumonie, ce qui contribuera à améliorer les soins aux patients souffrant de maladies cardiovasculaires et d'infections respiratoires. En caractérisant les réponses immunitaires, le projet mettra en lumière les interactions complexes entre l'athérosclérose et les infections pulmonaires, ce qui pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet constitue la première étape pour prévenir la progression de l'athérosclérose et améliorer les résultats du traitement après la pneumonie.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Pour toutes les souris, plusieurs prélèvements de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sera réalisé à différents temps, sur animaux vigiles. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Tous les gestes d’IT, SC et prélèvements sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles entraînant quelques nuisances attendues et contrôlées (type perte de poids et poils hérissés) avec une récupération de l’état général des souris à partir de 2 jours après l’infection. Une petite douleur consécutive à l’instillation intratrachéale peut survenir, due à l’insertion de la sonde de gavage. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) et modérée (environ 10%) est observée, sans perte de motricité. Les souris présentent une hypercholestérolémie et développent une athérosclérose lorsqu’elles sont nourries avec un régime hyperlipidique, sans impact négatif sur la vie de l’animal. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés par incision minime à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles après application d’une crème anesthésiante.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie et l'athérosclérose nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Celui-ci permet notamment d’évaluer l’aspect physique global (perte poids et état de la peau, présence de plaie), le comportement des animaux (prise d’eau et de nourriture ; absence d’activité et perte de mobilité) et la modification des selles et des urines. Un système de score a été établi en fonction des signes cliniques observés, et selon les résultats obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d’analgésique pour anesthésier localement la trachée. Une crème anesthésiante est utilisée comme anesthésiant local lors des prélèvements sanguins. Les volumes de sang et les temps de récupération ont été définis selon les recommandations (prélèvement inférieur à 7.5% du volume sanguin total et temps de récupération minimal d’une semaine). Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol et des maladies cardiovasculaires. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte : ils auront 10 semaines au début des procédures et environ 8 mois à la fin. À ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables et le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.
Rôle des cellules immunitaires et du nerf vague dans un modèle murin de fibrose hépatique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une section chirurgicale du nerf vague au cou, cinq gavages quotidiens, des injections dans l'abdomen trois fois par semaine et un régime qui attaque les canaux biliaires : 8 832 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La finalité déclarée est de comprendre les liens entre cellules immunitaires, nerf vague et cholangite sclérosante primitive, maladie rare qui touche six à dix personnes sur cent mille en France et pour laquelle aucun médicament n'a fait la preuve de son efficacité. Le porteur prévoit qu'une perte de poids de 20 % conduira à interrompre le régime quelques jours, avant de le reprendre pour atteindre la durée totale prévue. L'effectif est rapporté à un calcul de puissance, sans qu'un seul chiffre soit donné.
Objectifs
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie hépatique chronique, rare (6 à 10/100 000 habitants en France) caractérisée par une inflammation du foie, une prolifération des cholangiocytes et une fibrose péri-portale. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. A ce jour, aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la maladie et la prévention des complications qui lui sont associées. Des études suggèrent que certaines cellules immunitaires pourraient induire les lésions hépatobiliaires au cours de la CSP, notamment la fibrose. Toutefois, les mécanismes, notamment ceux à l’origine de la fibrose, demeurent encore mal connus. Afin de mieux appréhender les interactions complexes opérant au cours de la CSP, une perspective globale en examinant le rôle potentiel de diverses populations cellulaires dans la mise en place de la fibrose sera adoptée. D’autre part, le rôle du nerf vague dans la CSP sera étudié. En effet, la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, bien que les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux appréhender ces interactions complexes, une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront ensuite soumises à un régime pour induire la CSP, sera réalisée. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre l’inflammation, le nerf vague, la pathogenèse de la CSP et sa résolution. En décryptant ces mécanismes, les bénéfices attendus du projet sont d'ouvrir de nouvelles perspectives permettant le développement de nouveaux traitements et ainsi contribuer à une meilleure prise en charge de la CSP. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important pour le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Bénéfices attendus
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie rare qui touche entre 6 à 10 personnes pour 100 000 habitants en France. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. Aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la progression de la maladie et la prévention des complications. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important dans le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Procédures
Les souris seront soumises à : 1.une administration de molécule pour les modèles murins inductibles (via soit 5 gavages quotidiens pendant 5 jours, d'une durée de moins de deux minutes par gavage ; soit nourriture changée une fois par semaine ou eau de boisson changé tous les deux jours ; soit injection intrapéritonéale 3 fois par semaine, d'une durée de moins de deux minutes par injection, tout au long de la mise sous régime) 2.un régime alimentaire spécial (tous les jours pendant 28 jours maximum) 3.des traitements par injection d'anticorps en intrapéritonéale sur animal vigile (une à deux fois par animal, durée de quelques secondes) 4.une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (une fois par animal, durée de 10minutes) 5.un prélèvement sanguin sur animal vigile (une fois par animal, durée de quelques secondes) 6.Une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une modification du poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Le régime induisant la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) peut provoquer une perte de poids. Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de l'oesophage. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. La procédure chirurgicale pourra induire une douleur en post-opératoire malgré la prise en charge prévue ainsi que des risques d'infections dans de rares cas. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.
Réduction
8832 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins.
Raffinement
Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois au minimum). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. En cas d'observation d'une perte de poids trop rapide (20 pourcents par rapport à l’initiation des régimes), des mesures appropriées seront prises. Plus spécifiquement, le régime sera interrompu pendant quelques jours afin de permettre une récupération, puis le régime induisant la cholangite sclérosante primitive sera repris pour atteindre la durée totale prévue du régime. Cette approche vise à assurer une tolérance optimale du régime, comme démontré dans des études antérieures.
Choix des espèces
Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP). La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la CSP. En effet, le modèle murin permet de modéliser et d’intégrer les réponses immunitaires comme observé chez l’Homme. La souris offre l’avantage d’être un modèle bien établi pour l’étude de la CSP et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Les animaux âgés d’au moins 8 semaines seront utilisés pour l'entrée dans la procédure expérimentale afin que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris pourront entrer en procédure dès leur 8ème semaine d’âge et en ressortiront après 1, 2 ou 4 semaines de régime.
Formation en expérimentation animale CONCEPTION ET RÉALISATION DES PROCÉDURES – Rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 50
Tués à la fin de la séance parce que l'établissement déclare ne pas pouvoir garder en vie des animaux de réforme, 50 souris et 50 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques impliquant un niveau de souffrance léger. Un animal par apprenant sert à enchaîner plusieurs gestes, prise de sang à la veine caudale et à la veine mandibulaire sans anesthésie, injections dans l'abdomen, sous la peau et dans la veine, gavage. Le porteur précise que ce sont les gestes qui comptent et non les doses, le liquide injecté étant du sérum physiologique. Il écrit n'avoir jamais observé de souffrance dans ces apprentissages, tout en prévoyant l'hématome, la fausse route du gavage, et la mise à mort de l'animal par le formateur dans ces situations.
Objectifs
Ce projet a été conçu dans le respect de la règle des 3 R. Nous avons Réduit l’utilisation des animaux au minimum (1 rat et souris par personne impliquée dans la formation). La formation s’inscrit également dans le cadre de Raffinement, car elle a pour objectif de former aux meilleurs gestes techniques d’administration et de prélèvement chez l’animal, et de mise à mort les mieux adaptées aux rongeurs. La formation conception et réalisation des procédures – Rongeurs mise en place ici, incluera aussi des cours et travaux dirigés sur les méthodes alternatives, d’anatomie virtuelle et de travaux pratiques d’initiation sur des maquettes d’animaux, ceci correspondant au Remplacement. Ce projet a pour but de former du personnel aux techniques proposées.
Bénéfices attendus
A l'issu de la formation les apprenants auront l'obtention de leur niveau de formation concepteur et ou maintien de compétences. La formation a pour objectif de former aux meilleurs gestes techniques d’administration et de prélèvement chez l’animal, et de mise a mort les mieux adaptées aux rongeurs.
Procédures
Sans anesthésie, seront effectués : 1) un prélèvement de sang au niveau de la veine caudale chez le rat et la souris, en 5 minutes, 2) un prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire chez la souris, en 5 minutes. Les volumes de solution de NaCl injectés lors de ces travaux pratiques seront réduit au miminum(Intrapéritonéale, Sous Cutanée, gavage et Intraveineuse). Ici, c'est l'apprentissage des gestes techniques qui priment et non les doses administrées. L'ensemble dure 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuissances légères et effets indésirables possibles sont: - un stress qui peut être ressenti par la souris lors de la contention lié au fait d'une première expérience des étudiants sur souris vigile - un hématome lors de l'Intraveineuse , un mauvais passage lors du gavage . Le formateur d’euthanasiera l’animal lors de ces situations.
Devenir
Tous le animaux seront mis à mort .Notre établissement ne peut pas garder en vie les animaux de ce projet qui sont des animaux réformés.
Remplacement
La formation conception et réalisation des procédures – Rongeurs, mise en place ici, incluera aussi des cours et travaux dirigés sur les méthodes alternatives, d’anatomie virtuelle et de travaux pratiques d’initiation sur des mannequins d’animaux. Ceci correspond au concept de Remplacement. Ce projet a pour but de former du personnel aux techniques proposées. L’utilisation d’animaux reste donc indispensable.
Réduction
Nous avons Réduit l’utilisation des animaux au minimum (1 rat et 1 souris par apprenant). Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons des animaux de réforme issus des élevages internes (non utilisés). Si aucun animal de réforme n'est disponible, ils seront achetés chez un éleveur agrée. Par TP, un animal sera utilisé pour plusieurs gestes et il sera mis à mort à la fin de la séance.
Raffinement
La formation s’inscrit également dans le cadre du Raffinement, car elle a pour objectif de former aux meilleurs gestes techniques d’administration et de prélèvement chez l’animal, et de mise a mort les mieux adaptées aux rongeurs. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux harmonieux dans des cages avec enrichissement. Etant donné, que tous les gestes techniques ont été appris et répétés sur mannequins, nous estimons que le risque de nuisance est au plus bas. De plus, en ce qui concerne le gavage, il sera réalisé avec des sondes souples qui limitent la douleur. Par ailleurs, d’expériences, nous n’avons jamais observé de souffrance causée aux animaux dans ces apprentissages.
Choix des espèces
La FORMATION CONCEPTION, REALISATION DES PROCEDURES que nous proposont concernent l'utilisation des rongeurs (rats et souris) majoritairement utilisés dans les laboratoires de recherche. Notre agrément de formation concerne uniquement ces espèces. Nous demanderons des animaux réformés. Les animaux seront tous adultes pour faciliter l'apprentissage des gestes techniques.
Formation aux tests comportementaux généraux et modèles de douleur chez la souris
- Formation professionnelle
Nés avec un génotype non souhaité ou arrivés en fin d'une autre procédure, 1 600 souris vont servir à former des étudiants, des techniciens et des chercheurs. Toutes sont tuées à l'issue, dont 450 utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 100 un niveau léger et 50 sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit un à trois tests comportementaux parmi les vingt-cinq enseignés, et certaines cohortes une chirurgie d'induction de douleur neuropathique ou une incision de la patte, une injection sous-cutanée d'agent inflammatoire ou une injection intrathécale. Le porteur écrit que la douleur modérée qui suit ces chirurgies "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude", et juge l'animal vivant "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques entre individus.
Objectifs
L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Ce projet à donc un objectif de formation, il s'agit de former des étudiants, des personnels techniques et des chercheurs à différents tests comportementaux ou différents modèles murins de douleur couramment utilisés en recherche préclinique sur la douleur chronique et ses conséquences anxio-dépressives, cognitives, motrices ainsi que sur le bien-être.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les tests comportementaux et gestes techniques chirurgicaux, chez la souris. L’apprentissage des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests comportementaux (1 à 3 tests différents par animal) avec des délais entre les tests variant de 30 min à 48 heures (tests répartis sur 1 à 3 jours). Chaque test dure de 3 minutes à 1 heure. Certaines cohortes d’animaux subiront une chirurgie d’induction de douleur neuropathique (d'une durée de 10 min environ) ou post-chirurgicale (d'une durée de 10 min environ). Un protocole d’anesthésie s’applique dans ce cas. Certaines cohortes d’animaux subiront une injection sous-cutanée d’agent inflammatoire sous anesthésie gazeuse (d'une durée de 5 min environ). D’autres cohortes subiront une injection intrathécale d’agent anesthésiant sous anesthésie gazeuse (d'une durée de 5 min environ). Un lot d’animaux subira une surdose d’anesthésique afin de réaliser une perfusion intracardiaque (durée totale 10 min environ).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des sessions de tests comportementaux qui durent entre 3 minutes et 1h maximum, avec au moins 1h minimum de repos entre chaque test ou session. Il n’y aura pas plus de 3 tests ou sessions consécutives. Lors de ces tests, les animaux sont soumis à des stress légers, à modérés pouvant induire des réactions d’évitement, de peur, voire d’aversion. Dans les tests nociceptifs, une stimulation nociceptive mécanique ou thermique sera induite provoquant une secousse ou un léchage de la patte. Pour les formations aux modèles de douleurs (réservées aux étudiants/personnels possédant une formation règlementaire de chirurgie sur rongeur), il y a chez les animaux une présence de douleur modérée qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique ou incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathiques ou incisionnelles vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux vont subir des injections intrathécales lombaires.
Devenir
A l’issu de chaque procédure (pouvant contenir plusieurs tests comportementaux) les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs ou bien ce sont des animaux déjà réutilisés.
Remplacement
Avant toute manipulation des animaux, les étudiants ou le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations vidéos ou réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Les premières séances d’apprentissage et d’entraînement aux chirurgies d’induction de modèles de douleur sont réalisées sur animaux morts, au préalable du travail sur animaux vivants anesthésiés. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci et la manipulation des êtres vivants demande de la maîtrise qui ne peut s’acquérir qu’en pratiquant avec l’animal vivant.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux nécessaire, le geste est d’abord expliqué à l’aide d’un schéma ou d’une vidéo et/ou réalisé sur animal mort. Pour la partie pratique nous n’utiliserons que des animaux qui ne peuvent pas être utilisés dans d’autres projets ou destinés à être mis à mort, par exemple parce qu’ils sont nés avec un génotype non souhaité ou car ils sont en fin de procédure expérimentale. Le nombre d’animaux inclus est fonction du nombre de compétences à acquérir et du nombre de personnes concernées. A ce jour, ce projet concerne 5 à 10 expérimentateurs par an et englobe 17 procédures avec au total 31 gestes techniques chez la souris dont les compétences sont à acquérir (25 tests comportementaux, 2 gestions d’injections spécifiques et 4 gestes chirurgicaux). 2 à 4 souris (selon les gestes techniques) sont nécessaires pour acquérir une compétence pour une personne. Au total 320 animaux seront nécessaires par an soit sur 5 ans 1600 animaux.
Raffinement
Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de deux semaines est appliquée avant toute manipulation des animaux. Pour les tests comportementaux, avant d’expérimenter sur des animaux vivants, le geste est expliqué par le formateur, puis l’apprenant observe des personnes expertes dans la réalisation de ces gestes. Ensuite tous les gestes seront réalisés par les étudiants ou le personnel concerné. De plus, les mêmes animaux vont pouvoir subir plusieurs tests successivement (3 au maximum); ceci est possible car les différentes procédures qui vont se succéder sur un même animal concernent la stimulation d'une partie différente du corps de l'animal (pattes ou queue) ou bien l'application d'une stimulation différente (thermique ou mécanique), et un délai de 30 minutes au minimum est appliqué entre chaque test comportementaux. Pour les chirurgies, dans un premier temps, les séances d’apprentissage à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts. Dans un second temps, ces actes sont réalisés sur des animaux anesthésiés. L’ensemble des gestes chirurgicaux sont réalisés en condition de stérilité afin d’éviter tout risque d’infection. Une fois anesthésiés, les animaux sont installés sur des couvertures chauffantes pour assurer le maintien de leur température corporelle. L’état clinique des animaux est évalué plusieurs fois par jour par les personnes impliquées dans ces formations. Des points limites sont établis permettant de limiter la souffrance de l’animal. L’atteinte des points limites conduit à la mise à mort des animaux concernés.
Choix des espèces
Les différents tests comportementaux et modèles de douleur qui font l'objet de cette formation ont principalement été caractérisés et validés chez la souris. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (habituation des animaux aux locaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).
La maladie vasculaire du foie : prédire et comprendre sa progression
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
110 souris vont être utilisées, chacune recevant deux injections le même jour à deux heures d'intervalle, une fois par semaine, pendant cinq à huit semaines. Toutes sont tuées à quinze ou dix-huit semaines de vie pour prélever le foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté provoque une maladie des petits vaisseaux du foie, avec accumulation de liquide dans le ventre, altération de l'état général et modification du comportement, la dernière semaine ajoutant trente minutes d'anesthésie pour une imagerie hépatique. Le porteur indique avoir utilisé des tests statistiques pour fixer l'effectif, sans donner ni le calcul ni la taille des groupes.
Objectifs
La maladie des petits vaisseaux du foie appelée MVPS est une maladie rare (2,5 cas pour 100 000 habitants) caractérisée par l'atteinte des petits vaisseaux dans le foie mais sans lésion de cirrhose (foie dur et fibreux non fonctionnel). La maladie des petits vaisseaux du foie touche des individus jeunes, en moyenne de 45 ans. Elle est souvent associée à d'autres maladies comme des maladies du sang (cancer du sang), des maladies du corps qui s'attaquent à lui-même (appelées maladies auto-immunes) ou encore des maladies génétiques. Les mécanismes à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie sont inconnus. Sa progression peut conduire au développement d'une hyperpression dans les grosses veines situées avant le foie et qui sont censées le traverser pour ramener le sang au cœur, cette hyperpression s’appelle une hypertension portale. Cette pression dans les veines abdominales peut entrainer des ruptures de ces veines avec des saignements dans le tube digestif, l’accumulation de liquide dans le ventre appelé ascite, ou encore la formation d'un caillot dans ces veines empêchant la circulation du sang. Il n'existe actuellement aucun traitement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Comme cette maladie est encore largement incomprise, les progrès dans la recherche de traitement sont difficiles. Si l’implication des cellules formant les vaisseaux du foie est depuis longtemps suspectée puisqu’il s’agit d’une maladie des vaisseaux, l’une des nouvelles voies de recherche est l’étude d'autres cellules : les cellules de défense de l'organisme. Ces cellules, qui jouent un rôle contre les bactéries, peuvent être au repos dans le foie ou activer une réaction inflammatoire en cas de signal de danger de l’organisme. Elles ont été étudiées ces dernières années et leur nombre ainsi que leur activation semblent jouer un rôle dans le développement de nombreuses maladies dont certaines du foie comme la cirrhose. Notre hypothèse est donc que ces cellules pourraient, par leur interaction avec les cellules formant les vaisseaux du foie, être des acteurs clés dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. L'objectif est donc d’étudier leur impact dans son développement et sa progression. A terme, en cas d'implication, elles pourraient devenir des cibles thérapeutiques. La première étape pour ces études est de développer la maladie des petits vaisseaux chez les souris.
Bénéfices attendus
Il existe plusieurs bénéfices à ce projet : en effet, la maladie des petits vaisseaux du foie touche des sujets jeunes et est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ en cas d’implication des cellules de défenses de l'organisme dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, ces cellules pourraient devenir des cibles thérapeutiques ce qui permettrait d’éviter ou de ralentir le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie.
Procédures
Les expériences dans notre étude durent 5 à 8 semaines. Tout d’abord nous déterminerons le nombre nécessaire et l’endroit (ventre de la souris ou veines de la souris) des injections du produit permettant le développement de la maladie vasculaire chez la souris. Pour cela, un premier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, vigiles, des injections dans le ventre du produit entrainant la maladie (l'injection dure 30 secondes, il y a 2 injections le même jour dans le ventre à 2 heures d'intervalle). Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang directement dans la veine qui revient au coeur (veine cave) sera réalisée pour obtenir un volume de sang suffisant. Un second groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (5 minutes d'anesthésie environ, le temps d'injection étant d'une minute environ). 2 injections le même jour seront réalisées chaque semaine, à 2 heures d'intervalle. Ces injections seront réalisées pendant 8 semaines et les souris recevront également pendant ces 8 semaines un régime alimentaire spécial. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 18 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée. Enfin, un dernier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (procédure idem groupe de souris précédent). La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines et les souris recevront également pendant ces 5 semaines un régime alimentaire spécial. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée.
Impact sur les animaux
Les souris qui reçoivent le produit pour développer une maladie des petits vaisseaux du foie peuvent présenter une altération de l’état général avec perte ou une prise de poids (en cas de formation de liquide dans le ventre). Pour les souris recevant les injections dans le ventre vigiles, les injections répétées de produit peuvent générer un stress ainsi que des douleurs temporaires au moment de l’injection. Le stress induit par le développement de la maladie (liquide dans le ventre, altération de l’état), les manipulations et les injections peuvent entraîner une modification du comportement de la souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés puis nous préléverons leur foie pour les analyses.
Remplacement
Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la MVPS et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur (par exemple la génétique).
Réduction
Pour limiter le nombre de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier les cellules de défenses sur le sang de patients atteints de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous réaliserons également des études préliminaires des interactions des cellules immunitaires avec les cellules des vaisseaux du foie sur des cellules isolées en laboratoire. Pour les souris, une seule souris fournira des prélèvements de sang et de foie pour plusieurs analyses différentes ce qui permet de diminuer le nombre de souris nécessaires. Nous avons également réduit le nombre d’animaux au strict minimum afin d’être en mesure d’obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous inclurons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les groupes.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par du personnel qualifié dans l’animalerie, hébergement dans des cages en groupe afin de limiter le stress (présent tout de même du fait des manipulations des souris), enrichissement de l’environnement avec du coton ou des batônnets en bois. Toutes les procédures pouvant faire souffrir ou occasionner plus de stress (comme les imageries) seront réalisées sous analgésie et anesthésie. L’état général de la souris sera évalué par une grille d’évaluation (étude du comportement de l’animal, mesure de son poids, état du poil...) remplie une fois par semaine, pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. En cas d'altération de l'état général, un antalgique sera administré pendant 72h. En l'absence d'amélioration de l'état général la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier l’ADN, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 10 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l’âge auquel apparaît cette maladie chez l’homme) et au maximum jusqu’à 18 semaines de vie (âge de développement de la maladie par injections du produit).
Etude fonctionnelle des cellules dendritiques dans les réponses T de la peau.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 80 d'entre elles reçoivent pendant cinq jours un traitement qui déclenche une dermatite atopique, les 344 autres une injection dans le derme des deux oreilles, geste de six minutes sous anesthésie, avant sept jours d'attente. Une inflammation des oreilles avec démangeaisons et rougeur est attendue. Les résultats obtenus hors de l'animal n'étant pas clairs, le porteur les attribue à des conditions trop simples et conclut qu'il faut retrouver ses cellules dans "un organisme entier".
Objectifs
La dermatite atopique (DA) est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui affecte jusqu’à 20% des enfants et 10% des adultes dans les pays développés. Elle est caractérisée par du prurit et de l’eczéma, ainsi qu’une inflammation de la peau accompagnée d’infiltration de cellules immunitaires et des niveaux d’anticorps anormaux. L’absence de traitements curatifs et la difficulté de vie des patients rendent nécessaire la recherche de nouvelles stratégies et cibles thérapeutiques. Notre laboratoire a mis en place un modèle murin reproduisant la dermatite atopique observée chez l'humain. A l'aide de ce modèle, nous avons pu mettre en évidence et caractériser une nouvelle sous-population de cellules immunitaires que nous avons démontré comme induisant préférentiellement une réponse anti-inflammatoire. Nous avons également cherché à tester la capacité de ces cellules immunitaires à induire une réponse pro-inflammatoire, mais les résultats préliminaires obtenus ne sont pas clairs, ce que nous supposons être dû à des conditions simples et contrôlées, ne reproduisant pas la complexité d’un organisme entier. Dans ce projet, nous souhaitons donc réaliser et confirmer nos études préliminaires dans un environnement immunitaire plus complet et complexe. Pour cela, nous souhaitons obtenir spécifiquement nos cellules immunitaires et les injecter dans la peau des animaux afin de tester le potentiel de ces cellules à induire une réponse pro- ou anti-inflammatoire au niveau local. Nous serons alors amenés à étudier la réponse immunitaire au niveau de la peau des animaux et dans des organes immunitaires par différentes techniques.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de la fonction de nos cellules immunitaires dans la modulation des réponses inflammatoires constituerait une nouvelle cible thérapeutique intéressante dans le traitement de pathologies comme la dermatite atopique ou en lien avec le système immunitaire, comme les maladies auto-immunes ou le cancer. En effet, la modulation de la réponse immunitaire permettrait d'atténuer ou de restreindre l'inflammation dans un contexte d'allergie ou de maladie auto-immune, ou de l'amplifier dans un contexte de cancer.
Procédures
Lors de la première procédure, 80 souris seront anesthésiées par voie gazeuse et traitées pendant une durée de 5 jours (le traitement est d'une durée d'environ 30 secondes) afin d'induire une dermatite atopique. Pour la deuxième et troisième procédure, 344 souris seront anethésiées et injectées par voie intra-dermique avec des cellules immunitaires au niveau des deux oreilles et gardés pendant 7 jours (l'injection est d'une durée de 6 minutes).
Impact sur les animaux
D'après l'expérience du laboratoire sur de précédents projets, l'induction de la dermatite atopique pendant un temps de traitement court de 5 jours engendrera uniquement un léger stress de courte durée. L'injection au niveau des oreilles génèrera également un léger stress et une légère douleur de courte durée. Il sera également possible d'observer une inflammation au niveau des oreilles, accompagnée de démangeaisons et d'une rougeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever les différents organes ou tissus nécessaires à l'étude de la réponse immunitaire.
Remplacement
Les résultats préliminaires ont été obtenus dans des modèles simplifiés et contrôlés qui ne nous permettent pas de reproduire la complexité des réactions immunitaires qui ont lieu dans différents organes ou qui impliquent divers acteurs de l'immunité. La réalisation d'expériences avec des animaux est nécessaire pour mettre en évidence la fonction de nos cellules immunitaires d'intérêts dans un environnement immunitaire complet et complexe et pour confirmer les résultats précédemment obtenus.
Réduction
Le protocole d'induction de la dermatite atopique sera appliqué à un total de 7 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules immunitaires d'intérêts ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. Cependant, les cellules immunitaires d'intérêts représentent moins de 1% de la population cellulaire totale des organes immunitaires après induction de la dermatite atopique et, par expérience sur de précédents projets, nous savons qu'il est nécessaire d'avoir environ 10 animaux dans chaque lignée murine pour avoir un nombre de cellules suffisant pour la suite du projet. Seul un groupe traité sera nécessaire dans l'obtention des cellules immunitaires d'intérêts, donc nous n'incluerons pas de groupe non traité comme contrôle. Le protocole d'injection des cellules immunitaires d'intérêts obtenues depuis les animaux ou générées en dehors d'organismes sera réalisée sur un total de 2 lignées afin d'étudier la réponse immunitaire mis en place par les cellules injectées. Dans le cas de l'obtention des cellules immunitaires d'intérêts depuis des animaux, un total de 2 groupes composés de 8 animaux sera mis en place. Dans le cas des cellules immunitaires générées en dehors d'organismes, un total de 3 groupes composés de 8 animaux sera mis en place. Dans les deux cas, ce nombre est justifié par l'obtention de résultats statistiquement interpétrables pour les différents paramètres mesurés. Après analyse, nous effectuerons des tests statistiques permettant de comparer les réponses immunitaires induites par les cellules immunitaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience. L'induction de la dermatite atopique et l'injection des cellules immunitaires sont réalisées sous anethésie gazeuse légère. Pendant l'expérience, il pourrait être possible d'observer une inflammation au niveau de l'oreille, accompagné de démangeaisons et d'une rougeur, mais n'impactera pas le comportement des animaux (soin du pelage, posture, activité normale, ...). Cependant, si un animal vient à dépasser les points limites fixés par la grille de score de chaque procédure expérimentale, il sera retiré de l'étude et euthanasié.
Choix des espèces
Un modèle de souris est plus adapté de par son système immunitaire proche de celui de l'humain, avec notamment la présence d'un système immunitaire adaptatif. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines après leurs naissances afin de mener nos études sur un système immunitaire adulte.