Rongeurs

Après cinq jours d'injections quotidiennes, des souris, en grande majorité des femelles, subissent sous anesthésie une chirurgie qui provoque un lymphœdème dans une patte, une injection de cellules tumorales, ou les deux. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un récepteur aux œstrogènes, ERα, dans les vaisseaux lymphatiques. Le porteur décrit le lymphœdème humain comme une "accumulation massive" de liquide et de graisse dans un membre, puis écrit que la chirurgie qui le provoque chez la souris "ne génère pas d'effet indésirable majeur", tout en annonçant "des douleurs modérées" liées aux chirurgies et aux tumeurs. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs tissus, et celles qui passent par une lymphographie, injection fluorescente dans les pattes sous anesthésie, sont tuées sans réveil.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Enfin les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux chirurgies de trente minutes à une semaine d'intervalle créent un anévrisme intracrânien, suivies de quatre mois d'eau salée pour provoquer une hypertension, avec mesures de pression artérielle et injections répétées de tamoxifène pour inactiver un gène dans les cellules endothéliales. Le porteur signale un risque d'infection des sutures, un risque de nécrose intestinale après remise en place de l'intestin, une irritation aux points d'injection et une perte de poids de deux à trois jours après chaque opération. Les 36 000 hémorragies intracrâniennes annuelles citées pour l'Union européenne justifient un projet dont le résultat attendu est d'identifier le rôle d'une seule protéine, le porteur écrivant qu'aucune approche alternative n'apporte le degré d'information voulu.

Objectifs

Les cellules endothéliales qui tapissent les artères sont en contact direct avec le sang qui exerce des forces de frottement sur ces cellules. Une mauvaise perception ou une mauvaise réponse des cellules endothéliales à ces forces contribue à la survenue de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’anévrisme intracrânien (AIC). L’AIC est une anomalie vasculaire fréquente et généralement asymptomatique affectant environ 3 % de la population générale. La complication dévastatrice de l'AIC est sa rupture et surtout l'hémorragie intracrânienne qui en résulte, mortelle dans 30% des cas, ou laissant des séquelles neurologiques majeures. L’anévrisme se forme spécifiquement là où les forces de frottement générées par le flux sont particulièrement perturbées. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces (faibles ou élevées) permettra l’identification de nouvelles cibles pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce à un travail réalisé in vitro, nous avons pu identifier une protéine , ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions des cellules endothéliales. Nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Un premier modèle (haut flux/bas Flux_HF/BF) nous permettra de mieux comprendre le rôle d’ARHGEF18 dans les cellules endothéliales en conditions pathologiques (forces de frottement perturbées). Le second modèle chirurgical d’anévrisme intracrânien nous permettra alors de mieux comprendre le rôle d’ARHGEF18 dans la formation des anévrismes intracrâniens. Les résultats obtenus conjointement pour ces deux modèles permettront à terme de découvrir des cibles pharmacologiques potentielles pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture.

Bénéfices attendus

La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie intracrânienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle de notre protéine dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.

Procédures

Modèle de variations de flux (HF/BF) : Réalisation du modèle sous anesthésie générale à l'âge de 8 semaines. Durée de l'intervention: 30 minutes maximum Modèle d'anévrisme intracrânien réalisé à l'âge de 8 semaines: 2 chirurgies de 30 minutes chacune sont faites à 1 semaine d'intervalle, suivi d’un traitement au sel (0.9%) dans l’eau de boisson pendant 4 mois pour induire une hypertension modérée. La pression artérielle systolique est mesurée avant la chirurgie, puis 1.5 mois après la chirurgie puis avant le sacrifice de l'animal. Chaque série de mesures dure en moyenne 20 minutes. Enfin, pour invalider spécifiquement nos souris dans les cellules endothéliales, des injections sont réalisées soit à la naissance (P1/P2/P3), soit à l'âge adulte (1f/j/5j sur 2 semaines). L'injection ne prend qu'une minute par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Les animaux récupèrent très bien des chirurgies, grâce à la mise en place d’un protocole péri-opératoire adapté. Certains points de vigilance restent à surveiller : -les injections intrapéritonéales répétées chez l'adulte de tamoxifène (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. Pour palier à ce risque, nous réaliserons les injections côté droit de la souris, en évitant de réaliser les injections aux mêmes endroits (carré d’injection). -modèle HF/BF : risque d’infection au niveau des zones de suture, les souris pouvant elle-même essayer de retirer leur fils. Un risque de nécrose des intestins est également possible si ce dernier subit des torsions quand il est remis dans la cavité abdominale. Il est à noter que, dans nos mains, ce risque n’est jamais survenu. -modèle AIC : La présence d’un anévrisme intracrânien est, la plupart du temps, asymptomatique, ce qui en rend difficile sa détection, de surcroît chez la souris. La rupture d’un anévrisme, quant à elle, est imprévisible et brutale, suivie dans 50% des cas par un coma voire une mort subite. Les symptômes de la rupture sont consécutifs à l’hémorragie intracrânienne qu’elle occasionne. Leur intensité dépend de l’ampleur et de la localisation de l’hémorragie. Notre modèle d’AIC n’est pas un modèle de rupture. Par conséquent, nous n’avons jamais constaté de nuisances ou de souffrance en lien avec la survenue d’une hémorragie intracrânienne. Une perte de poids est observée dans les 2 jours suivant les chirurgies mais grâce à l’ajout de nourriture hydratée dans la cage, les souris peuvent se nourrir facilement. Le retour au poids initial se fait en 2 à 3jours. Comme pour le premier modèle, une infection aux zones de suture pourrait survenir. C’est pourquoi, les souris sont surveillées 2 à 3 fois/jour/3jours en post-opératoire.

Devenir

Modèle de variations de flux: Animaux mis à mort après 4 ou 14 jours en fonction des lots pour analyser le remodelage et la réactivité vasculaire des artères. Modèle anévrisme: Animaux mis à mort après 4 mois de traitement pour étudier la structure et la morphologie du réseau artériel cérébral.

Remplacement

Dans ce projet, le recours au modèle animal nous permettra de comprendre le rôle de notre protéine d’intérêt dans un système intégré, le système vasculaire, dépendant de nombreux facteurs extérieurs, non reproductible in vitro. Malheureusement, il n’existe pas d’approche expérimentale alternative apportant le degré et la qualité d’informations scientifiques nécessaires pour répondre à cette question. Toute approche in vitro nous permettant d’orienter notre travail et de réduire le nombre d’expériences menées in vivo sera réalisé en amont du travail sur l’animal (remplacement).

Réduction

Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure, nous nous sommes basés sur notre expérience et sur nos résultats antérieurs, en tenant compte de la variabilité expérimentale. L’effet de la mutation entre les deux groupes sera étudié en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour ce projet, nous prévoyons d’analyser également l’effet sexe sur les différents paramètres étudiés. Nous réaliserons donc des groupes mixtes. Si nous n’observons pas de différence significative entre les 2 sexes sur les paramètres étudiés, alors les effectifs seront réduits de moitié par rapport à nos prévisions. De même, nous prévoyons de réaliser différentes expérimentations sur des animaux invalidés à la naissance mais aussi à l’âge adulte. Nous commencerons par les groupes invalidés à la naissance. En fonction des résultats obtenus, l’analyse des groupes invalidés à l’âge adulte ne sera peut-être pas nécessaire, réduisant également le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront groupées de 3 à 5 par cage avec des petits morceaux de papiers leur permettant de faire un nid. Les animaux seront observés quotidiennement, week-end compris, pour détecter tout signe précoce de douleur, à minima par les animaliers mais également par le personnel en charge de nos animaux. Une surveillance accrue est réalisée en période péri-opératoire, les animaux étant alors observés 2 à 3f/jour. Une grille de score et de points limites sera mise en place et permettra de déterminer le palier de douleur (4 paliers : 0 pour une absence de douleur, et 3 pour une douleur sévère).Toute évolution anormale (perte de poids supérieure à 15%, prostration de l’animal, changement de comportement, isolement, blessure…) pourra ainsi être détectée. Le traitement analgésique sera alors mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Si la douleur ne peut être traitée, l’animal sera alors mis à mort

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire Notre modèle animal est un modèle permettant une délétion, dans le temps et dans l’espace, de notre protéine spécifiquement dans les cellules endothéliales à 2 stades : 1) en post-natal (3 jours après la naissance) ou à l’âge adulte (8 semaines). Toutes nos chirurgies sont ensuite réalisées à l’âge adulte, le réseau vasculaire étant mature. Le modèle d’anévrisme intracrânien est un modèle assez long car il comprend un traitement hypertenseur de 4 mois. Les animaux sont donc utilisés à l’âge adulte, autour de 8 semaines.

1 018 souris vont être utilisées, chacune recevant une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à dix injections de composés, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. L'abdomen est irradié sous anesthésie gazeuse pendant un quart d'heure, ce qui provoque selon le porteur une toxicité et une perte de poids modérée dans les jours suivants, les tumeurs entraînant une gêne et un inconfort qualifiés de modérés. Le projet vise d'abord à installer chez la souris un modèle de chute des lymphocytes après radiothérapie, l'espoir d'un traitement pour les patients étant placé "à plus long terme" et suspendu à d'éventuels essais cliniques.

Objectifs

La radiothérapie fait partie du traitement de près de 60% des patients atteints de cancer, que ce soit dans le cadre d’un traitement ou à des fins palliatives. Un des mécanismes d’action de la radiothérapie est l’induction de dommages létaux au niveau de l’ADN des cellules, et notamment des cellules tumorales. La radiothérapie est délivrée principalement par des accélérateurs externes et les rayons, pour atteindre la tumeur, traversent également des tissus sains et touchent des vaisseaux sanguins. Les lymphocytes sont des cellules très radiosensibles. Un des effets secondaires majeurs de la radiothérapie réside dans la survenue d’une lymphopénie. Il s’agit d’une baisse drastique du taux de lymphocytes après le début du traitement par radiothérapie. La lymphopénie radio-induite (RIL) est un phénomène transitoire qui dure généralement jusqu’entre 3 et 9 mois après la fin du traitement par radiothérapie. Elle peut persister parfois pendant des années après le traitement. La sévérité comme la durée de la lymphopénie radio-induite ont été corrélées à une plus mauvaise survie globale chez les patients traités par radiothérapie. Ce phénomène est encore mal compris. Nous savons aujourd’hui que les lymphocytes sont des acteurs majeurs de la réponse anti-tumorale et cette chute du taux de lymphocytes pourrait concourir à une mauvaise réponse anti-tumorale. Notre projet vise à établir un modèle de lymphopénie radio-induite chez la souris pour avoir un modèle sur lequel tester de nouveaux composés pouvant éventuellement réduire ou abroger cette lymphopénie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. La lymphopénie radio-induite est un effet secondaire majeur de la radiothérapie. Il est actuellement reconnu que les lymphocytes sont essentiels dans la réponse anti-tumorale. De plus, il a été montré que les patients qui subissent cet effet secondaire ont une plus faible chance de survie. Réduire la durée ou la sévérité de la lymphopénie pourrait éventuellement permettre d’améliorer l’efficacité antitumorale du traitement par radiothérapie et d’augmenter les chances de survie des patients traités par radiothérapie. La mise en place d’un modèle préclinique de lymphopénie radio-induite permettra d’obtenir des connaissances sur ce phénomène encore assez peu exploré et permettra de tester si certains composés peuvent réduire ou atténuer cette lymphopénie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender le phénomène de lymphopénie radio-induite mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de nouvelles combinaisons thérapeutiques lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Une injection de cellules tumorales en sous-cutané sera réalisée chez tous les animaux, durée 10 secondes, sous anesthésie locale. L’injection des composés se fera par injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineux (une à 10 injections selon les composés), durée 10 secondes, sous anesthésie locale. Les souris seront anesthésiées pendant l’irradiation (maximum 15 minutes), une fois. Les prélèvements de sang sur les souris seront réalisés sous anesthésie générale, n=3, durée 3 minutes..

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de l’abdomen. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse (maximum 15 minutes). Cela peut générer du stress et de l’anxiété. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore. Elle peut induire de la toxicité qui va se traduire par une perte de poids modérée dans les jours suivants l’irradiation.L’administration des composés par voie intrapéritonéale ou sous-cutané ou intravein eux peut engendrer de la douleur et un stress léger et transitoire (mais les injections seront faites sous anesthésie locale). L’administration des composés per os peut engendrer du stress léger et de courte durée. Les tumeurs peuvent entraîner une gêne et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales aux fins d'analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Il a clairement été mis en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternative permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité. De même, il n'existe pas de sytème permettant de reproduire les interactions entre les éléments du sang, les cytokines, la tumeur et le sytème immunitaire dans sa globalité. La phénomène de la lymphopénie n'a pour l'instant pas pû être modélisé in vitro ou in silico.is

Réduction

Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives au niveau du taux de lymphocytes dans le sang au cours du temps. L’analyse des différences de taux de lymphocytes se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections un anesthésique local sera appliqué sur la peau avant chaque injection. L’irradiation sera réalisée sous anesthésie générale pour réduire le stress induit. Les prélèvements de sang seront réalisés par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis longtemps au sein du laboratoire pour réduire le temps et le stress induit, sous anesthésie locale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.

Greffées de deux tumeurs, injectées trois fois d'un immunomodulateur puis irradiées un quart d'heure sous contention, vigiles, 1 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever le sang et les tumeurs. Le projet cherche à savoir si cet immunomodulateur amplifie l'effet dit abscopal de la radiothérapie sur des métastases situées hors du champ d'irradiation, la retombée pour les patients étant renvoyée au long terme et à d'éventuels essais cliniques. Le porteur reconnaît que la tumeur, en grossissant ou en se nécrosant, peut faire souffrir la souris et gêner ses déplacements, et annonce des points limites "précoces" appliqués strictement, sans dire lesquels.

Objectifs

Notre projet consiste à évaluer l’impact de l’addition d’un immunomodulateur à un traitement par radiothérapie dans le cas de cancers multi-site. Cette voie de recherche est intéressante à explorer. En effet, elle peut contribuer à améliorer de façon significative l’efficacité des radiations ionisantes, sachant qu’aujourd’hui un traitement de radiothérapie est indiqué chez plus de la moitié des patients atteints d’un cancer. De plus, il a été montré que l’irradiation d’une tumeur pouvait engendrer des effets sur des métastases situées hors du champ d’irradiation. Cet effet, nommé « effet abscopal » provient du système immunitaire et serait très intéressant à amplifier grâce à des combinaisons thérapeutiques. Par ailleurs, des combinaisons thérapeutiques combinant irradiation et d’autres immunomodulateurs ont déjà montrées des effets en clinique soulignant le potentiel et l’intérêt de telles combinaison. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire de l’hôte. Suite à l’irradiation, la réponse interféron-gamma puis la sécrétion de cytokines et de médiateurs vont favoriser l’infiltration de cellules immunitaires pro tumorale ou anti tumorales par vagues successives. Certaines réactions vont promouvoir l’effet antitumoral, tandis que d’autres, comme l’infiltration intratumorale radio-induite des lymphocytes T régulateurs vont freiner l’efficacité de la radiothérapie. Ces cellules ont normalement pour rôle de réprimer les réponses immunitaires anormales ou excessives envers des antigènes du soi ou du non-soi pour maintenir l’homéostasie immunitaire. Dans les cancers, elles sont impliquées dans le développement et la progression tumorale car elles inhibent l’immunité antitumorale. Le but de notre projet est de combiner une molécule permettant d’éliminer ces cellules avec la radiothérapie et de voir si cela peut améliorer l’efficacité de la radiothérapie et/ou l’effet abscopal induit par l’irradiation. Il a également été montré que cette nouvelle molécule augmentait l’efficacité de certains traitements dans des modèles résistants . Nous testerons donc dans un second temps le triple traitement avec radiothérapie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de miniiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostique de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet abscopal induit par l’irradiation qui est médié par le système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Deux injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, une fois, durée 1 minute, sous anesthésie locale. L’injection des médicaments durera 10 secondes, sous anesthésie locale (3 administrations au total pour chaque immunomodulateur, une injection tous les 4 jours). Les souris vigiles seront mises dans un système de contention pendant l’irradiation (maximum 15 minutes, une irradiation). Le prélèvement de sang sur les souris dédiées sera réalisé sous anesthésie générale, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété, légers et transitoires. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée, elle induit pas une perte de poids modérée et transitoire. L’administration des immonumodulateurs par voie intrapéritonéale peut engendrer de la douleur (un spray contenant de la lidocaïne sera appliquée avant chaque injection intrapéritonéale). La tumeur quand elle grossit ou quand elle commence à nécroser peut gêner la souris (douleur, difficulté à se déplacer,…). Les souris seront sacrifiées aux points limites pour éviter cela. Pour les prélèvements, les souris seront d’abord anesthésiées pour prélever le sang ce qui peut générer du stress mais ces souris seront sacrifiées juste après le prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures.

Remplacement

Il a clairement été mise en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternatives permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité.

Réduction

Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour détecter des différences significatives de croissance tumorale . L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité du traitement triple combinaison radothérapie avec des immunomodulateurs par rapport aux doubles combinaisons.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections en sous-cutanée et en intrapéritonéale, un anesthésique local sur la peau avant chaque injection. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est pesée tous les jours pendant une semaine, puis placée vigile dans une boîte d'exposition pour un traitement unique par aérosol de 30 à 45 minutes. Aucune n'est infectée, le projet mesurant seulement la tolérance et l'élimination de nouveaux antibiotiques activables par la lumière, l'efficacité étant renvoyée à une autre demande d'autorisation. Le porteur écrit que les études in vitro ne reproduisent pas la complexité du poumon et conclut que l'expérimentation animale reste une étape "incontournable et irremplaçable", tout en annonçant qu'une espèce plus proche de l'humain, le cochon, pourra être utilisée ensuite.

Objectifs

Ce projet vise à répondre à la pénurie d’antibiotiques restants actifs contre les bactéries pathogènes pour l’homme, en particulier celles responsables d’infections respiratoires. Il s’inscrit dans le cadre de l’appel lancé par l’organisation mondiale de la santé (OMS) pour le développement de nouveaux traitements ciblant une liste de bactéries pathogènes multirésistantes. Pour ce faire, de nouveaux antibiotiques activables par la lumière ont été mis au point et leur intérêt démontré en condition in vitro. Cependant, ces études ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organe tel que le poumon ni de récapituler tous les paramètres d’une infection, des tests sur animaux doivent maintenant être effectués. La nébulisation permet de cibler directement les voies respiratoires et d’y atteindre une concentration élevée tout en réduisant la dose à administrer et ainsi les risques d’intolérance et/ou d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est de déterminer si les nouveaux antibiotiques administrés sous forme d’aérosol chez des animaux non infectés sont bien tolérés et de quelle manière ils sont éliminés. Si une bonne tolérance est mise en évidence, l’efficacité pourra ensuite être évaluée (dans le cadre d’une autre demande d’autorisation de procédure) pour le traitement d’infections respiratoires par des bactéries résistantes aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

Les composés mis au point pourraient avantageusement compléter les antibiotiques actuellement disponibles, lesquels tendent à perdre en efficacité du fait du développement de résistances chez les bactéries. Le mécanisme d’action des nouveaux composés développés est différent de celui des antibiotiques dits classiques. Il repose notamment sur une activation par la lumière causant de nombreux dommages aux bactéries, limitant ainsi leur possibilité d’adaptation et d’échappement au traitement. Au-delà de ce projet, la stratégie envisagée pourrait être adaptée pour traiter divers pathogènes responsables d’infections graves dans différents tissus et organes, en particulier chez les patients atteints de pneumonie, les grands brûlés, ou les personnes hospitalisées contractant une infection au cours de leur séjour dans un établissement de soins. Ce projet a donc le potentiel d’importantes répercussions économiques et sociales, au profit des patients, de leurs proches et plus généralement de la société dans son ensemble.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à un traitement unique par aérosol dont la durée peut varier entre 30 et 45 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus seront : - Lors des pesées : les animaux pourront subir un stress dû à la contention pour procéder à la pesée laquelle sera effectuée tous les jours pendant 7 jours avant le traitement. Ce stress sera d’environ 30 secondes à chaque fois, son intensité étant estimée légère. - Lors du traitement par aérosol : les souris pourront éprouver un stress lors de l’étape d’aérosolisation dont la durée sera d’environ 30 minutes. Le traitement par aérosol est de gravité prospective modérée.

Devenir

Tous les animaux seront sédatés avant d’être mis à mort à différents temps afin de pouvoir procéder aux prélèvements post-mortem.

Remplacement

De nombreuses études préliminaires ont été menées au laboratoire (en condition dites in vitro) afin de s’assurer, autant que possible, que les composés pourront fonctionner en exerçant les effets souhaités chez la souris. Cependant, les études in vitro ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organe tel que le poumon ni de récapituler tous les paramètres d’une infection, l’expérimentation animale (en ayant recours à un modèle pertinent reproduisant la pneumonie survenant chez l’homme) demeure une étape incontournable et irremplaçable.

Réduction

Les études in vitro menées au préalable ont permis de sélectionner des candidats et d’optimiser leur formulation, réduisant ainsi fortement le nombre d’évaluations à conduire chez l’animal. En effet, partant d’une collection de près de 50 composés, 4 composés ont été sélectionnés à ce stade pour être évalués in vivo. En outre, le nombre d'animaux est fixé au minimum en veillant à ne pas mettre en péril l'obtention de résultats exploitables ni compromettre les objectifs et chance de succès du présent projet.

Raffinement

La procédure sera enrichie par une phase d'habituation réalisée avant la nébulisation. Pour cela, une semaine avant le traitement par aérosol, les souris seront chaque jour transférées dans la boite d’exposition pendant 10 à 15 minutes, le temps d’être pesées avant d’être remises dans leur cage d’hébergement. Ceci permettra d’établir leur courbe de croissance avant traitement tout en habituant les animaux à la boite d’exposition. Un renforcement positif (par récompense de nourriture (beurre de cacahuète)) sera effectué après chaque pesée dans le but de réduire le stress pour les animaux. Des points limites ont été définis afin d'observer d’éventuelles nuisances et mettre en place un traitement analgésique approprié.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent en première approche pour cette étude. Des animaux âgés de 8 à 10 semaines (poids 20-25 g) seront utilisés, comme dans d'autres études sur la pneumonie aigue. Les affections respiratoires humaines peuvent affecter des sujets jeunes comme plus âgés. Les effets du vieillissement sur le système respiratoire entraînent une diminution progressive des performances fonctionnelles, notamment une baisse du débit expiratoire de pointe, de l’échange de dioxyde de carbone et d’oxygène, ainsi que de la capacité vitale. Cependant, les jeunes peuvent également être touchés par des infections respiratoires telles que la pneumonie. La pneumonie est l’une des premières causes de mortalité infantile dans le monde. Il est donc essentiel de prendre des mesures pour toutes les tranches d’âge. Par la suite, selon les résultats obtenus avec cette DAP, il pourra être envisagé des expérimentations sur une espèce animale plus proche de l’humain du point de vue de son système respiratoire, en particulier le cochon.