Rongeurs

Atteintes d'un syndrome lymphoprolifératif qui les tue vers dix-sept semaines sans signe clinique annonciateur, les souris homozygotes de cet élevage sont tuées au plus tard à quinze semaines pour anticiper les points limites. 37 300 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures déclarées à un niveau de souffrance léger, avec pour seul geste une biopsie sur animal vigile destinée au génotypage. Une partie est expédiée vivante vers le laboratoire demandeur en "utilisation continue", le reste est tué pour la gestion de l'élevage ou le prélèvement de gamètes. L'élevage alimente des essais de composés contre les maladies liées aux immunoglobulines G4, et le porteur écrit que le nombre d'animaux est calculé au minimum tout en précisant qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée".

Objectifs

Les maladies immunitaires sont parfois difficiles à diagnostiquer du fait des signes cliniques variés qui leurs sont associés. Cela rend également leur traitement difficile et le taux de rechutes est important. L’objectif de ce projet est d’améliorer la prise en charge et le traitement des maladies associées aux immunoglobulines G4 (protéines du sang produite par le système immunitaire). Ces maladies sont des troubles fibro-inflammatoires chroniques graves à médiation immune qui se traduisent souvent par des niveaux élevés de protéines dans le sang (immunoglobulines G4), dans les urines et par le développement de masses semblables à des tumeurs touchant plusieurs organes chez l’Homme. Des souris reproduisant ces maladies grâce à des modifications génétiques spécifiques seront utilisées afin d’étudier l’apparition et le développement de ces maladies mais également de tester de nouveaux traitements. Nous mettrons en place un élevage de ces souris afin de générer les animaux nécessaires aux expérimentations.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles de souris, au plus proche de la maladie humaine, sont très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques ciblant les maladies chroniques graves associées aux IgG4. La prévalence exacte de ces maladies n’est pas connue en partie à cause de leur diagnostic difficile à établir et à dissocier des maladies chroniques connues. Actuellement, les traitements reposent sur l’utilisation d’agents anti-inflammatoires et 40% des patients sont en rechute. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques est nécessaire afin d’augmenter les chances de rémission des patients. Ce projet permettra d’évaluer à la fois l’effet des composés thérapeutiques sur l’initiation et le développement des IgG4-RD.

Procédures

Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de déterminer le génotype de l’ensemble des animaux de ce projet. Les souris homozygotes pour les modifications génétiques présentent un phénotype dommageable qui commence 3 semaines après la naissance.

Impact sur les animaux

Les animaux développent un syndrome lymphoprolifératif 3 semaines après la naissance conduisant à leur mort après 17 semaines. Aucun signe clinique laissant présager de l’issue fatal de ce syndrome lymphoprolifératif n’est décrit chez ces animaux. Par ailleurs, une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés pour une utilisation continue vers le laboratoire demandeur, soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (avant l'atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permet une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permet de valider certaines hypothèses et d’obtenir de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire, nos données historiques et les techniques de reproduction assistées (fécondation in vitro, stimulations hormonales…) permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Dans la mesure du possible, la lignée sera maintenue via des croisements générant des individus n’exprimant pas le phénotype dommageable lymphoprolifératif. Lorsqu’il sera nécessaire de générer des individus avec le phénotype dommageable, notamment pour développer la lignée ou pour la production des lots d’intérêt, si cela est possible, nous privilégierons les fécondations in vitro (embryons portés par des femelles pseudogestantes non mutées) car les femelles altérées génétiquement avec le phénotype dommageable ont des difficultés à mener à terme leur gestation. Les animaux avec phénotype dommageable développent un syndrome lymphoprolifératif 3 semaines après la naissance conduisant à leur mort après 17 semaines. Aucun signe clinique laissant présager de l’issue fatale de ce syndrome lymphoprolifératif n’est décrit chez ces animaux. Afin d’anticiper l’atteinte des points limites, ces animaux seront donc euthanasiés, au plus tard, lorsqu’ils auront 15 semaines. Une observation quotidienne sera réalisée pour identifier tout animal qui présenterait des signes cliniques.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les souris sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elles constituent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Les animaux homozygotes avec le phénotype dommageable seront expédiés ou euthanasiés au plus tard à l’âge de 15 semaines.

Les souris de cet élevage portent une dystrophie musculaire, une faiblesse et une dégénérescence progressives des muscles qui peuvent apparaître à partir de vingt mois. 1 015 vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, sans autre intervention que le développement spontané de la maladie. Le porteur reconnaît qu'une atteinte musculaire peut réduire leur mobilité et provoquer une douleur qu'il qualifie de modérée, alors que le projet est déclaré en souffrance légère. La plupart de ces souris seront transférées vers d'autres projets d'expérimentation, en "utilisation continue", les anciens reproducteurs étant tués quand leur fertilité baisse.

Objectifs

Des souris à phénotype dommageable sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche : ces souris sont dystrophiques. Les dystrophies musculaires sont un groupe de maladies génétiques qui provoquent une faiblesse progressive et une perte de masse musculaire. Les recherches ciblent le muscle squelettique et en particulier la régénération musculaire. La lignée de souris dystrophique est essentielle pour pouvoir étudier la régénération musculaire dans sa globalité en condition pathologique et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques. L’objectif est donc la génération de lots de souris dystrophiques indispensables pour mener à bien les projets de recherche.

Bénéfices attendus

Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur la régénération musculaire dans les dystrophies musculaires chez l’homme, des maladies qui touchent le muscle et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La régénération musculaire est un processus qui est altéré notamment dans la dystrophie musculaire de Duchenne (la dystrophie la plus fréquente des maladies neuromusculaires chez l’enfant qui affecte l’ensemble des muscles du corps et qui touche un garçon sur 3500 nés) et dans la dystrophie musculaire des ceintures (un groupe de maladies neuromusculaires qui touchent les muscles situés dans la région scapulaire et pelvienne).

Procédures

Les animaux peuvent développer un phénotype dommageable avec dystrophie musculaire, c'est à dire, une faiblesse et une dégénérescence progressive des muscles (à partir de 20 mois de vie). Il n'y aura pas d’autre intervention que le développement spontané du phénotype.

Impact sur les animaux

Si un phénotype se déclare, les animaux pourront avoir une atteinte musculaire légère pouvant induire une mobilité réduite et une douleur modérée.

Devenir

La grande majorité des animaux sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Plusieurs projets sont déjà en cours, d’autres sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Lorsqu'ils ne seront plus en mesure de contribuer efficacement à la reproduction en raison de leur âge avancé ou d'une fertilité réduite, les anciens reproducteurs seront euthanasiés.

Remplacement

Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires participant à la régénération musculaire et à la mise en place des pathologies musculaires. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.

Réduction

Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre de couples afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés. 1015 animaux maximum seront utilisés dans ce projet d'élevage sur une durée de 5 ans.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les animaux sont maintenus sous un statut sanitaire (exempte de pathogènes et d'opportunistes), tout le matériel est stérilisé par autoclavage (enrichissement, cages) et l'eau est osmosée. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Si un phénotype est observé, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire est la souris. Des animaux dystrophiques sont indispensables pour étudier le muscle in vivo dans un système pathologique. En élevage, les animaux seront en reproduction entre 2 et 12 mois de vie, pour favoriser la reproduction. Pour les projets, les animaux seront utilisés entre 2 et 18 mois de vie pour étudier la dystrophie musculaire.

Une souris femelle par étudiant, deux mâles par groupe de seize : ce travail pratique d'enseignement supérieur consiste à tuer les animaux pour récupérer leurs gamètes et réaliser une fécondation in vitro observée au microscope. 270 souris vont être utilisées sur la durée du projet, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles, âgées de quatre semaines et non pubères, reçoivent deux injections hormonales à 48 heures d'intervalle pour déclencher une ovulation abondante. Le porteur écrit que ces injections se font sans protocole d'analgésie parce qu'il accroîtrait le stress de la contention, et justifie l'effectif par le faible taux de réussite des étudiants, quatre à six embryons obtenus sur soixante à quatre-vingts ovocytes.

Objectifs

Le but de ce TP est de réaliser et observer les étapes de fécondation in vitro chez la souris et d’évaluer l’impact du fond génétique sur le nombre d’ovocytes collectés et la qualité de la fécondation. Le TP comprendra une étape pratique (mise à mort des animaux, collecte des gamètes et fécondation in vitro) et une étape d’observation sous microscope. Pour l’étape pratique : 1 souris femelle par étudiant sera utilisée et 2 mâles seront utilisés pour l’ensemble du groupe de TP (soit 16 étudiants). Seul le prélèvement des gamètes mâles et femelles nécessite la manipulation d’animaux. C’est pourquoi les étapes du TP qui suivent la collecte des gamètes ne seront pas mentionnées. Ainsi, dans ce projet, seules seront mentionnés les procédures : i- d’hyperstimulation ovariennes (sur souris femelles) et, ii- de mise à mort des souris mâles et femelles pour la collecte des gamètes mâles et femelles. Aucune manipulation autre que les injections d’hormones et mise à mort ne sera réalisée sur les souris.

Bénéfices attendus

La fécondation in vitro chez la souris est une pratique courante de laboratoire. Pour cette raison, les étudiants doivent mettre en pratique cette technique pour être confronté aux problèmes et limites de celle-ci. De plus, les étapes qui caractérisent la fécondation et les premiers stades de développement embryonnaires sont très proches de ce qui est observé chez l’Homme. A ce titre, il apparaît important d’un point de vue pédagogique que l’étudiant puisse être confronté pratiquement à ce mécanisme cellulaire.

Procédures

Pour induire l'ovulation et permettre la collecte en nombre suffisant d'ovocytes, les souris femelles reçevront deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle. L'injection se fera par voie intra péritonéales et durera 10 secondes (préhension plus injection)

Impact sur les animaux

Aucune nuisance connue de l’injection des hormones, hormis le stress et la douleur Induite par la contention et l’injection. Toutefois, si des signes de douleurs précoces sont observés (prostration ou vocalises, absence de recherche de contact avec ces congénères…) et qui pourrait être lié à une injection ectopique, l’animal sera immédiatement euthanasié.

Devenir

La découverte des appareils reproducteurs mâles et femelles chez la souris ainsi que la collecte des gamètes mâles et femelles nécessite la mort de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives ne nécessitant pas l’animal pour réaliser une fécondation in vitro chez les Mammifères. Le choix du modèle murin s’impose pour deux raisons: c’est le modèle le plus proche et accessible pour reproduire une fécondation in vitro proche de l’Humain en terme biologique et, d’autre part, il permet de confronter des étudiants se spécialisant en Reproduction Mammalienne de pouvoir réaliser des prélèvements des gamètes mâles et femelles in vivo.

Réduction

Pour un groupe de TP (16 étudiants), nous envisageons 16 femelles et 2 mâles. Trois groupes de TP sont prévus, correspondant à 48 femelles et 6 mâles au total par an soit 270 animaux au total sur l’ensemble du projet. - Le nombre de souris femelles est justifié par le nombre d’ovocytes collectés/femelles qui doit être suffisant pour obtenir des embryons aux premiers stades de clivage embryonnaire (ie stade 2 cellules). Sur 60-80 ovocytes collectés à partir de 8 femelles seuls 4 ou 6 atteindront le stade 2 cellules (faible taux de réussite lié au manque d’expérimentation des étudiants). Cette faible réponse devra être observée et expliquée par l’étudiant et des tests statistiques devront être réalisés pour évaluer les différences entre fonds génétiques. - Le nombre de souris mâles est justifié pour des raisons pratiques afin de collecter les spermatozoïdes de meilleure qualité en fonction du timing de collecte des ovocytes. Nous avons choisi un fond génétique de souris non consanguine pour augmenter le nombre de spermatozoïdes prélevés (10 millions de spermatozoïdes par souris en moyenne en condition TP, 200 000 spermatozoïdes sont utilisés par étudiant).

Raffinement

Les injections à 48 heures d’intervalle d’HCG et de PMSG peuvent conduire à un stress lié à la préhension et la contention de l’animal plus qu’à la douleur induite par l’injection. Pour ces raisons, les injections intra-péritonéales doivent être réalisées par une personne expérimentée, limitant le temps de préhension sans protocole d'analgésie/antalgie pré et post injection pouvant accroitre le stress de l'animal. Afin de limiter le stress, les animaux sont stabulés en présence d'enrichissements dans la cage (tunnel et coton). D’autre part l’animal sera surveillé par l'expérimentateur pour identifier les point-limites quotidiennement pendant 5 minutes pendant la toute durée de l'experimentation (3 jours). Cette surveillance ce fera spécifiquement dans les 5 minutes après injections les jours d'injections (Jour 0 et jour 2). Les point-limites seront identifiés par observation de l'animal et si un de ces point est caractérisé, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées car la technique de fécondation in vitro chez la souris est bien décrite et proche de l’Homme Souris femelles de 4 semaines. Cet âge est choisi car ce sont des souris prébubères (non reproductives) dont le stock d'ovocytes est maximal et où les follicules sont sensibles aux gonadotropines. Souris mâles de 10 semaines. Cet âge est choisi pour récupérer un nombre et une qualité maximale de spermatozoïdes.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection unique de vecteurs viraux dans la veine de la queue à l'âge de six semaines, puis sont tuées quatre semaines plus tard pour analyse du cerveau. L'enjeu se limite à repérer lequel des vecteurs franchit la barrière hémato-encéphalique, l'évaluation d'un effet thérapeutique sur le syndrome de Rett étant renvoyée à une autre demande d'autorisation. Le porteur indique que la sélection préalable se fait sur des neurones issus de cellules de patients et sur des organoïdes cérébraux, puis affirme que le modèle souris "reste indispensable et nécessaire" pour juger à l'échelle de "l'organisme entier".

Objectifs

Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. La pathologie touche essentiellement les filles, les garçons étant très rares et mourant généralement au stade néonatal d'une encéphalopathie néonatale sévère Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi que des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse, visant à corriger le gène muté responsable de la pathologie. Dans ce but, on utilise souvent des vecteurs viraux comme des transporteurs pour délivrer le matériel génétique visant à corriger la pathologie. Ces vecteurs présentent une innocuité et une expression à long terme des gènes thérapeutiques dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Une injection directe dans le cerveau ne permet cependant qu'une correction localisée des cellules portant la mutation au site d'injection. Par ailleurs, les injections dans des sites multiples dans le cas des troubles neurodégénératifs peuvent potentiellement augmenter la survenue d’effets indésirables. L'objectif est ainsi de développer des vecteurs viraux pouvant être injectés par voie intraveineuse périphérique et qui soient capables de passer la barrière hémato-encéphalique. Dans le cadre de ce programme, différents types de vecteurs viraux vont être générés, évalués in vitro sur des cellules et des organoides cérébraux, puis in vivo dans un modèle de souris, afin de valider leur capacité à passer la barrière hémato-encéphalique de manière efficace, de vérifier le tropisme cérébral et l'absence de distribution dans d'autres organes. Après identification du vecteur viral présentant les caractéristiques optimales répondant à ces critères, celui-ci sera évalué dans un modèle de souris du syndrome de Rett, portant des mutations dans le gène muté responsable de la pathologie, afin de valider l'effet thérapeutique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).

Bénéfices attendus

L'identification de vecteurs viraux permettant de passer de manière efficace la barrière hémato-encéphalique ouvrira la voie à de nombreuses applications de thérapie génique dans le cadre des pathologies du système nerveux central, dont ici en exemple le syndrome de Rett pour lequel aucune thérapie n'existe à ce jour.

Procédures

Injection des vecteurs viraux par voie intraveineuse caudale (durée 2-3 minutes), en une administration unique, à l'age de 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés à l'injection des vecteurs viraux par voie intraveineuse, tel que des saignements au site d'injection.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après l'administration des vecteurs pour procéder aux analyses postmortem (histologiques et de biologie moléculaire)

Remplacement

L'objectif de cette étude est d'identifier le vecteur viral qui permet de passer la barrière hémato-encéphalique avec efficacité, dans la perspective de traitement par thérapie génique de pathologies du système nerveux central. La librairie de vecteurs viraux sera d'abord évaluée in vitro en culture de cellules neuronales, dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) de patients et dans des organoides cérébraux. Seuls les variants qui permettent d'obtenir les résultats in vitro les plus prometteurs seront évalués in vivo dans le modèle souris, modèle animal qui reste indispensable et nécessaire pour évaluer l'efficacité de transduction des vecteurs viraux à l'échelle de l'organisme entier, notamment dans le cadre de l'étude du passage de la barrière hémato-encéphalique

Réduction

Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 5 souris par vecteur viral et par dose. L'efficacité de transduction dans le cerveau, et donc de passage de la barrière hémato-encéphalique, sera évaluée par quantification du génome viral, et par analyse de la fluorescence sur 10 coupes sagittales de cerveau. Ce nombre de souris et de coupes sera suffisant pour définir le vecteur viral présentant le meilleur tropisme pour le cerveau, et ce de manière qualitative / semi-quantitative, par dénombrement des cellules transduites fluorescentes. Concernant l’analyse de la fluorescence, il s’agira d’une analyse qualitative. A partir du moment où on voit un signal fluorescent dans le cerveau, cela signifiera qu’on a franchi la barrière hémato- encéphalique. On pourra affiner en faisant un score semi-quantitatif (rare cellules, quelques cellules, beaucoup de cellules).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Après les injections des vecteurs viraux par voie intraveineuse, les animaux seront observés pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de saignement au niveau du site d'injection. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est nécessaire pour évaluer la capacité des vecteurs viraux à passer la barrière hémato-encéphalique, dans la perspective de traitement par thérapie génique de pathologies du système nerveux central. De plus, il existe des modèles de souris du syndrome de Rett, portant des mutations dans le gène muté responsable de la pathologie, ces modèles étant utilisés dans un 2è temps pour évaluer l'efficacité thérapeutique du vecteur viral optimal. L'injection par voie intraveineuse sera réalisée sur des animaux de 6 semaines, où le passage de la barrière hématoencéphalique serait le plus efficace d'après la littérature. Il s'agit aussi de l'age qui sera indiqué dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des vecteurs viraux dans les modèles de souris du syndrome de Rett (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptomes du syndrome de Rett).

Des candidats médicaments sont administrés en une fois ou chaque jour pendant quatorze jours, puis les animaux sont tués pour prélever leur cerveau. 612 souris et 408 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Il s'agit de mesurer comment les molécules se répartissent dans l'organisme et de choisir la voie d'administration la plus adaptée pour de futures études sur des modèles de maladies neurodégénératives. Le porteur annonce des points limites déclenchant la mise à mort sans en nommer un seul, et justifie six échantillons par groupe pour l'analyse par spectrométrie de masse sans expliquer comment on arrive à 1 020 animaux.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de générer des échantillons biologiques pour déterminer comment évolue la concentration, et la répartition de candidats-médicaments dans l'organisme en fonction du temps. Ce projet permettra également de déterminer la voie d’administration la plus adapté pour un candidat-médicament, pour de futures études d'efficacité dans des modèles pré-cliniques de maladies neurodégénératives.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour des maladies neurodégénératives. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats-médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

Les animaux subiront des administrations de candidats médicaments, une seule fois ou quotidiennement sur 14 jours. Les stratégies d'anesthésies et d'analgésies impliquent des injections intra-péritonéales et souscutanées, ce qui peut induire à stress, juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les administrations de candidats-médicaments ou d'anesthésiques peuvent engendrer un stress lors de l’acte, notamment lors administrations chroniques. L’administration chronique de composé peut induire des nuisances en cas d’effets néfastes, pour cette raison, les animaux seront suivis quotidiennement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. La mise à mort est nécessaire pour collecter les cerveaux.

Remplacement

Le profil de distribution tissulaire des candidats-médicaments dépend de plusieurs facteurs, tels que la diffusion au sein du liquide céphalorachidien, sa capture par différents types cellulaires et son élimination. Ces variables impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux a été déterminé pour minimiser le nombre d'animaux, en lien avec le laboratoire d'analyse qui traitera les échantillons biologiques. L'analyse par spectrométrie de masse sera réalisée avec 6 échantillons par groupe. Pour maintenir les relations sociales et limiter le stress, les animaux seront hébergées à plusieurs par cage (entre 2 et 4), et auront accès à des objets d'enrichissements

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les rats seront hébergés par 2, et les souris seront hébergées, au minimum par 2, et, au maximum par 4, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales utiliseront soit des souris, soit des rats. Le choix de l'espèce est motivée par la nature du projet et de la suite éventuelle en cas de résultats significatifs (pour évualier l'efficacité du composé, des modèles précliniques basés sur des souris ou des rats pourront être utilisés). Le type d'échantillons à collecter (ex. le volume de liquide céphalorachidien est plus important chez le rat, en comparaison avec la souris) pourra également orienter le choix du modèle. Les rongeurs, dont les souris et les rats, possèdent un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. Les rongeurs sont donc des modèles appropriés permettant l'étude de la distribution des candidats-médicaments dans le système nerveux central. Nous disposons d'équipements dédiés aux études impliquant des souris ou des rats. Les candidats-médicaments visent à traiter des maladies humaines apparaissant à l'âge adulte. Les rats seront âgés de 8 à 10 semaines, et les souris seront agées de 8 semaines, ce qui correspond à un stade de développement adulte.