Rongeurs

Chirurgie crânienne de trente minutes, injections répétées, anesthésies quotidiennes une semaine durant puis tous les quinze jours, ponction terminale de liquide céphalorachidien : 5 392 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour une étude histologique du cerveau. Le projet porte sur des modèles de maladies d'Alzheimer et de Parkinson, avec le double objectif déclaré de dépister par anticorps et de tester des composés associés à des nanoparticules. Les animaux circulent entre deux établissements utilisateurs, la chirurgie dans l'un, l'imagerie dans l'autre. Pour un effectif de 5 392 souris, le porteur se borne à évoquer une "approche statistique" et des "tests comportementaux de motricité" dont il ne dit pas lesquels.

Objectifs

Dans le cadre de nos recherches sur les maladies neurodégénératives nous souhaitons développer des modèles rongeurs permettant 1/d’étudier la mécanistique de la mise en place à la progression de la pathologie et 2/ de tester des nouveaux moyens thérapeutiques par le développement de nouveaux composés et selon différentes voies d’administration. Le projet multisite sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les protéinopathies comme entre autres, la Maladie d’Alzheimer (MA) et la Maladie de Parkinson (MP) touchaient respectivement 1 million et 100.000 personnes en France en 2020. L’augmentation des cas tous les ans est notable en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. L’estimation pour la MA est de 1.8 million de cas en 2050, sans traitement efficace à l’heure actuelle. L’objectif est double, le dépistage par des anticorps spécifiques (nanobodies) et les traitements par différents composés associés à des nanoparticules.

Procédures

Chirurgie (30 minutes) Imagerie sous anesthésie gazeuse (5 minutes). Anesthésie courte et répétées (1x/jour pendant une semaine puis tous les 15 jours) (5 minutes). Injections répétées. Prélèvement de liquide céphalorachidien terminal. Les chirurgies seront réalisées dasn l'EU1/2 ainsi que certaines injections et prélèvements. L'imagerie sera réalisée exclusivement sur l'EU2/2 ainsi que les prélèvements terminaux associés

Impact sur les animaux

Elles sont représentées par l’utilisation de la chirurgie (hypothermie pendant la chirurgie, infection de la suture, douleur liée à la plaie). L'expression de la maladie est rare chez la souris exceptée pour un modèle transgénique dans cette étude qui ont quelques déficits visuels à 6 mois et moteur à 8 mois. Dans tous les cas les animaux sont suivis quotidiennement et l’apparition d’un déficit moteur entraînera l’ouverture d’une fiche de suivi du ou des animaux. Concernant les voies d’administration contraignantes, celles-ci sont réalisées sous anesthésie, permettant de limiter le stress des animaux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement des maladies neurodégénératives dans des modèles in vitro. L’impact bénéfique potentiel sur l’accumulation des protéines en cours d’agrégation et donc sur le fonctionnement cérébral et la survie neuronale ne peuvent être évalués que chez l’animal. Néanmoins, toutes les étapes préliminaires pouvant être réalisées in vitro, telles que la validation des constructions moléculaires et les tests de toxicité, le seront sur cultures cellulaires.

Réduction

Le développement de modèles avec un suivi en imagerie, technique non invasive pour les animaux, permet des études au cours du temps et ainsi une diminution du nombre d’animaux utilisés. Nous utilisons des tests comportementaux de motricité, qui sont aussi non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal, limitant le nombres d'animaux utilisé pour chaque étude. Le nombre d’animaux utilisé a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines d'acclimatation permet aux animaux de se familiariser avec leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Interventions : les chirurgies, imageries et prélèvements de liquides céphalorachidiens sont pratiqués sous anesthésie et analgésie afin de réduire toutes douleurs et inconforts et stress. Des points limites stricts spécifiques à la chirurgie, aux prélèvements ou au développement des modèles seront appliqués. Concernant le transport des animaux entre les deux sites, il est réalisé dans une cage dédiée contenant litière, enrichissement, aliments et boisson. La cage est recouverte d’un couvercle filtrant et mise dans un sac pour être à l’abri des regards.

Choix des espèces

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement decrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge adulte, 8 semaines, afin de travailler sur des modèles cohérents avec la mise en place de phénotypes pathologiques.

Incapables de rejeter un greffon humain parce qu'elles sont immunodéficientes, 250 souris vont recevoir des fragments de tumeurs prélevées sur des patients opérés d'un cancer du rein. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue pour prélèvement de la tumeur. L'opération de greffe dure une dizaine de minutes sous anesthésie générale, puis une échographie est pratiquée tous les sept à dix jours pendant quatre mois au maximum. Ces greffes ne testent aucun traitement : elles amplifient des tumeurs pour constituer un stock de matériel destiné à des projets ultérieurs d'imagerie et d'évaluation thérapeutique, le porteur écrivant que de nouveaux modèles sont "nécessaires".

Objectifs

Ce projet a pour but d’amplifier plusieurs modèles tumoraux de cancer du rein à partir de prélèvements de patients. Les prélèvements sont obtenus à l’issue de la chirurgie des patients et des échantillons choisis avec un anatomopathologiste sont greffés sur des souris immunodéprimées afin de constituer des modèles tumoraux pertinents, permettant de conserver les caractéristiques de la tumeur primaire du patient. Plusieurs modèles de cancer du rein ont déjà été greffés et amplifiés avec succès et conservés. De nouveaux modèles sont nécessaires pour des études scientifiques d’imagerie et d’évaluation thérapeutique ultérieures.

Bénéfices attendus

La plupart des modèles précliniques de cancers du rein utilisent des lignées cellulaires et leur mise en culture pendant des années est probablement à l’origine de modifications génétiques expliquant leur manque de fiabilité. Les modèles in vivo de carcinome rénal ont longtemps été limités à des xénogreffes issues de ces lignées cellulaires, ne permettant pas de prédire des résultats oncologiques en recherche clinique humaine. Les greffes de tissu tumoral dérivées des patients et directement implantées chez la souris ont révélé une plus grande fiabilité pour prédire les réponses aux traitements systémiques. Cela est lié à la préservation des caractéristiques histopathologiques et moléculaires du cancer d'origine, qui permettent d’avoir un modèle plus réaliste des conditions observées chez les patients, mais également d’avoir un potentiel métastatique pour l’étude des carcinomes avancés, indication usuelle des nouveaux traitements systémiques. Les modèles déjà identifiés et conservés nécessitent d’être amplifiés afin de pouvoir être utilisés ultérieurement pour des projets en imagerie moléculaire afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs, et pour l’évaluation de nouveaux inhibiteurs par rapport aux thérapies existantes.

Procédures

Les souris auront une seule procédure chirurgicale pour greffer la tumeur. L’intervention d’une dizaine de minutes sera réalisée sous anesthésie générale. Les souris seront ensuite suivies par imagerie échographique, technique non-invasive et indolore, à raison d’environ 1 échographie tous les 7 à 10 jours pendant un maximum de 4 mois. Pour l’ensemble des procédures, chaque animal est placé sur une table thermostatée, permettant de maintenir sa température corporelle.

Impact sur les animaux

Lors du suivi des animaux post-chirurgie, aucune perte de poids significative n’a été observée (jusqu’à 8% maximum). A ce jour les douleurs post-opératoires ne s’observent plus dès le lendemain et aucun comportement anormal n’a été observé entre les animaux opérés. Les nuisances se limitent donc à la gène modérée générée par la présence de tumeurs (qui sont surveillées par échographie).

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de la tumeur et utilisation future du matériel tumoral pour des recherches contre le cancer.

Remplacement

Le recours aux animaux est indispensable pour reproduire, à partir des prélèvements de patients, un modèle oncologique proche de l’homme et de retrouver tout le microenvironnement tumoral permettant le développement des tumeurs et de se rapprocher au plus près des résultats qui pourront être observées par la suite en recherche clinique. Les modèles ainsi amplifiés, issus de tumeurs de patients, constituent une base de travail tout à fait pertinente à la fois pour des projets précliniques mais également pour des études in vitro pour l’identification de protéines et de biomarqueurs. Pour l'étude en cours, l'organisme entier étant indispensable pour récapituler les communications humorales et cellulaires du micro-environnement tumoral avec le reste des effecteurs de l'immunité, les organoïdes ou d'autres systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D ne sont pas adéquats.

Réduction

Au regard de la prise de greffe observée sur les 10 modèles sélectionnés (de l’ordre de 70%), de la croissance tumorale et donc du volume du matériel utilisable après prélèvement, nous avons déterminé statistiquement le nombre nécessaire d'animaux . En deçà de ce nombre, le volume de matériel tumoral de même passage serait insuffisant pour créer de nouvelles cohortes pour des études en cancérologie ultérieures. Les modèles seront uniquement amplifiés au fur et à mesure des besoins des études scientifiques pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les étapes de ce projet ont déjà été validées au cours d’études préalables et les modèles de cancer du rein issus de patients ont été choisis à l’issue d’expérimentations in vitro et in vivo. Les différentes étapes sont optimisées et maîtrisées par un personnel qualifié pratiquant les gestes techniques couramment. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec un anesthésique local au niveau de la peau et dans des conditions stériles bien définies. L’animal est placé sur une table thermostatée permettant le maintien de la température corporelle de l’animal. Une surveillance quotidienne, permettant d’apprécier l’état général des animaux, est faite pendant toute la durée de l’expérimentation. Des points limites précoces ont été définis et seront appliqués pour le bien-être de l’animal. Un enrichissement de l’environnement est prévu tout au long du projet.

Choix des espèces

Toutes les études préalables réalisées sur souris ont confirmé la faisabilité technique du modèle de greffe sur souris avec un taux de greffe élevé, ainsi qu’une grande fiabilité du modèle avec une reproduction fidèle des caractéristiques macroscopiques, immunohistologiques, génétiques et du potentiel métastatique de la tumeur primitive d’origine. Pour ce faire, les souris nécessaires au développement de ces modèles réalistes issus de patients, sont des souris immunodéficientes, âgées de 6 à 9 semaines minimum au début du projet, mâles ou femelles.

Pour étudier le rôle de gènes du métabolisme, 900 souris, dont des souris génétiquement privées d'un gène et nourries ou non d'un régime enrichi en graisses ou en sucre, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes. Pour les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline, les souris reçoivent un gavage de sucre ou une injection d'insuline et restent environ trois heures dans un tube de contention, le temps de cinq prélèvements de sang à la queue. Elles passent aussi 72 heures isolées pour une mesure de calorimétrie, et ces séries peuvent être répétées trois fois en 20 à 30 semaines, avec une évaluation cardiaque sous anesthésie dans certaines études et, depuis un amendement, l'injection d'un colorant dans la veine sous anesthésie terminale. Le régime enrichi fait prendre du poids et peut provoquer des lésions de la peau liées à un toilettage excessif, que le porteur dit traitées localement et vite résolues. Les éventuels médicaments chez l'humain sont renvoyés à plus long terme.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux) Amendement: Pour tester la fuite vasculaire une l'injection en intra-veineuse d'un colorant, sous anestésie gazeuse terminale, sera réalisée.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

Tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, 66 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est maintenue éveillée dans un tube de contention pendant l'irradiation de la patte, l'autre reçoit la même irradiation sous vingt minutes d'anesthésie, l'objectif déclaré étant de vérifier si l'effet protecteur de la radiothérapie FLASH tient encore chez un animal conscient, comme le sont les patients. Suivent trois mois d'observation, avec douleur à la patte, perte de poids et baisse de mobilité pendant trois à cinq jours, puis dépilations, croûtes et parfois ulcérations au point d'irradiation. Le porteur affirme que les mécanismes inflammatoires et vasculaires ne s'étudient que dans un "organisme vivant intégré" et conclut qu'il lui est "indispensable" de développer des modèles animaux.

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale et une activation efficace du système immunitaire chez des rongeurs. Il s’agit de la thérapie FLASH, qui utilise un fort débit de la dose, ca veut dire les temps d’irradiation sont très courts (< 1 ms) Nous cherchons à améliorer encore la compréhension et utilisation optimale de ce techniques innovantes qui utilisent un fort débit de la dose. Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur . En particulier, l’objectif est de comprendre si la diminution d’oxygénation des tissus irradiés liée à l’anesthésie impacte ou non l’effet de l’irradiation des tissus environnants et évaluer la pertinence du modèle d’irradiation chez l’animal anesthésié alors qu’en clinique l’irradiation est faite sur patient vigile. Il est donc pertinent de réaliser une expérience avec des animaux éveillés afin de vérifier si l’effet FLASH se maintient ou pas du tout dans des conditions de traitement réalistes.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques dans des conditions réalistes qui aideront a établir ou dessiner des essais cliniques de façon moins risquée et qui pourront bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif et pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer l’utilisation de la radiothérapie FLASH et les protocoles de patients futurs

Procédures

Dans un premier groupe, les animaux vigiles seront maintenus en contention en vue d’être irradiés au niveau de la patte (durée du geste inférieure à 3 minutes). Dans un second groupe, les animaux anesthésiés seront irradiés au niveau de la patte (durée de l’anesthésie : 20 minutes). Les deux groupes seront ensuite suivis pendant 3 mois pour évaluer les effets de l’irradiation sur la peau (contrôle visuel).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être (douleur à la patte irradiée)peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours . Les souris seront maintenues dans un tube de contention adapté à l’irradiation de la patte (quelques secondes),

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'outils statistiques pour utiliser le moins d'animaux possibles tout en obtenant des résultats significatifs.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des souris sera mise en place avant toute expérimentation : les souris seront manipulées quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Les souris seront habituées au tube de contention dès la fin de leur acclimatation à leur nouvel hébergement. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de la procédure). Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème apaisante-cicatrisante et des antalgiques seront administrés sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. De plus le modèle utilisé est pertinent pour une translation clinique future des résultats. Si l’anesthésie induit une perte d’effet FLASH, son utilisation sera déconseillée pour les futurs patients. Le modèle de souris est parfaitement adapté pour répondre à cette question. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 8-10 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

Greffées sous la peau avec des cellules tumorales, tondues au flanc, pesées jusqu'à sept fois par semaine, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Aucun médicament n'est évalué à ce stade. Le travail consiste à caler les conditions de greffe, lignée tumorale par lignée tumorale : taille de la tumeur, vitesse de croissance, moment où le traitement pourra commencer. Ces modèles serviront ensuite à tester des radiopharmaceutiques fournis par les clients du laboratoire, et le porteur précise qu'un modèle n'est monté que si le client ne le maîtrise pas déjà en interne.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapie innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (molécules ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Une des approches de notre laboratoire est de caractériser la distribution tissulaire et sanguine, l’élimination de molécules fournies par nos clients dans le contexte de tumeurs sous cutanées. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un élément radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. L'approche suivante est de quantifier l’efficacité thérapeutique de molécules fournies par nos clients couplées à différents radioéléments (=élément radioactif) pour le traitement de différents modèles tumoraux greffés chez la souris en sous-cutanée et ainsi d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression. Ces molécules (=radiopharmaceutiques = molécules couplées à un élément radioactif) doivent viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au radioélément d’y accéder. C’est le rayonnement ionisant de ces derniers qui doit aboutir à la destruction des cellules tumorales. L’objectif spécifique de ce projet est donc de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début de traitement à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne les maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué.

Bénéfices attendus

Le cancer est une des principales causes de mortalité dans le monde. Malgré de nombreuses avancées, le besoin en thérapies innovantes reste majeur. L’utilisation de radiopharmaceutiques (ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Ce projet permettra donc de déterminer les conditions optimales de greffes de tumeurs et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de candidats médicaments aussi bien pour étudier leur biodistribution dans le cadre de souris porteuses de tumeurs sous-cutanées que pour évaluer l'efficacité thérapeutique de candidats médicaments (radiopharmaceutiques).

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 secondes) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 secondes) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 secondes)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous-cutanées ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; douleur légère liée à la pousse tumorale

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organes ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser un modèle tumoral maîtrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. Il n’est donc pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro et l’animal reste encore le modèle le plus fin et le plus pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Les études menées dans le cadre de ce projet permettront ainsi de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne le maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Les souris utilisées ici sont immunodéprimées par construction, seule condition pour que des tumeurs humaines prélevées sur des patients puissent pousser dans leur corps. 6 220 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une durée pouvant atteindre huit mois par animal. Les greffes se font sous la peau, dans l'os par injection intra-osseuse, ou dans la capsule du rein après ouverture chirurgicale, et une partie des souris est castrée pour les cancers hormono-dépendants. Toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus, quatre souris étant greffées par prélèvement de patient afin de compenser un taux de prise que le porteur situe entre 30 et 35 %.

Objectifs

Le développement des modèles proposés dans ce projet va nous aider à mieux comprendre pourquoi certains traitements contre le cancer échouent chez les patients. Dans notre équipe, nous utilisons des techniques de pointe pour étudier ces mécanismes sur des modèles de souris, qui portent des tumeurs humaines. Lorsque nous ne pouvons pas réaliser ces analyses directement sur les patients, nous utilisons les données obtenues à partir de ces modèles. Ensuite, nous développons des cultures de cellules ou des mini-organes à partir de ces tumeurs pour des études plus poussées. Ces recherches nous permettent de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses résistent aux traitements. Cela peut aider à améliorer les soins pour les patients atteints de cancer

Bénéfices attendus

Nos modèles seront disponibles pour d'autres chercheurs, ce qui leur permet de tester de nouvelles idées pour traiter le cancer. Par exemple, nous avons pu valider de nouveaux médicaments qui ont ensuite été testés chez des patients. En résumé, notre travail sur ces modèles nous aide à comprendre et à vaincre la résistance aux traitements du cancer, ce qui pourra conduire à de meilleurs traitements pour les patients dans le futur.

Procédures

Chirurgies : Greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale, une seule, durée 15 minutes. Castration des souris, une seule, durée 5 minutes sous anesthésie générale. La majorité des modèles seront établis par injection sous-cutanée, sauf pour les échantillons osseux qui seront greffés dans l'os. Injection sous-cutanée, durée 2 minutes, sous anesthésie générale, nombre de 1 à 2. Injections intra-osseuses : durée 8 minutes, une seule sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie gazeuse dans des conditions stériles. La greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale peut causer un stress et une douleur légère, mais ces effets sont temporaires et sont atténués par l'anesthésie et des analgésiques. Castration des souris : pratiquée uniquement pour certains types de cancers, cette chirurgie brève sous anesthésie générale peut causer une douleur légère, atténuée par des analgésiques. Injections sous-cutanées ou injection de cellules: pratiquées sur la majorité des souris, cette méthode est la moins invasive. Les effets sont temporaires, légers et sont atténués par l'anesthésie et par des analgésiques. Greffe intra-osseuse : réalisée sur des échantillons osseux pour reproduire l'environnement tumoral. Elle peut causer une douleur modérée, elle sera faite sous anesthésie suivie d'un traitement analgésique et d'une alimentation adaptée.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour études sur les tissus et organes des animaux (anatomie pathologique, biochimie, métabolomique, protéomique, génomique).

Remplacement

La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et les interactions entre différents systèmes biologiques peuvent être difficiles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils peuvent souvent mieux représenter les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques. Pour l'étude en cours, l'organisme entier est indispensable pour récapituler les communications humorales et cellulaires du micro-environnement tumoral avec le reste des effecteurs de l'immunité, les organoïdes ou d'autres systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D ainsi que les systèmes de modélisation mathématique et informatique ne sont pas adéquats.

Réduction

En parallèle du développement de modèles de tumeurs dérivées de patients, et afin de réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation, nous développons des organoïdes et des lignées cellulaires. Ces modèles in vitro permettent des études mécanistiques et un large criblage de médicaments, limitant ainsi l'utilisation d'animaux en validant les résultats in vitro avec des modèles plus proches de la biologie humaine. Étant donné que le matériel provient de biopsies, nous greffons 4 souris par prélèvement, ce qui est très peu mais suffisant pour obtenir un modèle selon nos données antérieures indiquant un taux de prise de 30-35 % lors de la primo-implantation. L'utilisation de 4 souris assure une quantité adéquate de matériel pour caractériser et préserver les tumeurs . Le nombre d'animaux prévu au projet est un nombre maximal qui va dépendre du nombre de tumeurs de patients accessibles sur la durée du projet.

Raffinement

Après l'arrivée des souris, nous les laisserons une semaine en acclimatation pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Pendant les opérations chirurgicales comme les greffes sous-cutanées, l'ajout de pellets de testostérone, ou les greffes dans la capsule sous-rénale et dans les os, les souris sont anesthésiées par anesthésie générale et reçoivent un médicament contre la douleur. L'examen clinique est quotidien. Cette observation permet de vérifier si l’animal est en bonne santé, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Pour les animaux avec une greffe dans la capsule rénale, une délicate palpation deux fois par semaine est réalisée au niveau du rein. Les animaux avec greffe osseuse sont suivis en vérifiant régulièrement leur état ainsi qu’en procédant à une palpation de la greffe au niveau de l’os en mesurant la largeur de l’os. Des points lmites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris participant à l'étude restent pendant au maximum 8 mois. Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental (maisons, tunnels, sizzlenests) et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant actifs.

Choix des espèces

L'utilisation de souris est justifiée: par l'état de l'art des modèles murins pour le développement préclinique en oncologie et par la nécessité d’utilisation de modèles immunodéprimés afin de permettre la croissance tumorale de tumeurs humaines. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Le test de molécules fournies par des clients passe ici par 900 rats immatures de 4 à 5 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour la collecte de tissus. Deux injections intraveineuses déclenchent une néphrite de Heymann, maladie rénale qui provoque œdèmes et insuffisance rénale, puis les composés sont administrés jusqu'à six semaines, parfois par pompe osmotique implantée sous la peau du cou. Chaque animal passe deux fois par semaine vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme et subit jusqu'à deux prises de sang hebdomadaires. Le porteur reconnaît ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles des molécules testées, et indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les effectifs, arrêtés à douze animaux par groupe sur la base de son expérience.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester des candidats médicaments pour leur efficacité sur la protéinurie induite par le développement d’un modèle de néphropathie.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de ce syndrome.

Procédures

Les animaux auront 2 administrations intraveineuses pour l’induction de la pathologie, des administrations de composés pendant 6 semaines maximum. Ces gestes sont rapides (environ 1 min) pour limiter au maximum le stress des animaux. Les animaux pourront également avoir une pompe osmotique implantée en sous-cutané au niveau du cou. Les animaux seront mis dans des cages à métabolisme pendant 24H (2 sessions par semaine maximum) et seront donc isolés de leurs congénères pendant cette période. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile au cours de l’expérience (maximum 2 prélèvements par semaine, durée du geste 2 min) et un prélèvement terminal plus important sur animal vigile ou anesthésié.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur. De plus, la récolte des urines se fait via l’utilisation de cage à métabolisme individuelle. Les animaux seront donc séparés temporairement de leurs congénères pouvant provoquer un certain stress. De plus, ce modèle mimant une néphropathie, les animaux pourront donc être gênés par les différents symptômes de cette pathologie à savoir des œdèmes, insuffisance rénale.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et des tissus seront collectés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la néphropathie passive de Heymann. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience sur ces modèles et les publications scientifiques, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) notamment pour le suivi mictionnel via l’utilisation de cages à métabolisme. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (tunnel, morceau de bois). En accord avec la règle de raffinement, les procédures sous anesthésie seront réalisées avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et des antalgiques seront administrés. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure... Si un animal présentait un symptôme pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle de néphropathie passive de Heymann permettant de mimer le cadre clinique de la néphropathie glomérulaire chez l’Homme est décrit dans la littérature chez le rat immature de 4-5 semaines.