Rongeurs
Développement d’un vaccin administré par voie respiratoire contre les infections respiratoires chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour mettre au point un vaccin contre la grippe administré par le nez plutôt que par injection, 522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe leur administre du liquide dans le nez ou dans le pharynx sous anesthésie générale, deux à trois fois à dix jours d'intervalle, puis infecte une partie d'entre elles par plusieurs souches du virus grippal. Le porteur indique que ces administrations peuvent provoquer une gêne respiratoire temporaire et que l'infection peut faire perdre jusqu'à 15 % du poids. Une grille de score fixe le seuil au-delà duquel les souris sont tuées par anticipation, et toutes les autres le sont en fin de procédure pour prélever poumons et ganglions.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer un vaccin contre la grippe administré par voie respiratoire car cette voie induit une forte réponse immunitaire dans les poumons. La plupart des vaccins contre la grippe sont administrés par injection intramusculaire et vont induire une protection contre un nombre limité de souches du virus, car celles-ci évoluent d’une année sur l’autre. D’une part, ce projet analysera la capacité du vaccin à activer le système immunitaire et à induire une mémoire immunologique dans le nez et les poumons des souris vaccinées. D’autre part, ce projet étudiera la capacité du vaccin à protéger ces souris contre une ultérieure infection par plusieurs souches du virus de la grippe. La mise en place d’une mémoire immunologique lors d’une vaccination est un processus complexe qui nécessite l’utilisation d’un modèle souris pour son étude. La souris est un animal qui permet de modéliser de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine respiratoire par le virus de la grippe.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour vocation d’établir un vaccin contre la grippe qui sera administré par voie respiratoire (sans injection) pour induire une mémoire immunitaire au niveau des poumons et qui protégera contre différentes souches du virus de la grippe. Cette stratégie de vaccination pourrait également être utilisée pour la conception de nouveaux vaccins contre d’autres pathogènes respiratoires.
Procédures
Administration dans le nez sous anesthésie générale (2-3 min), 2 fois à 10 jours d’intervalle ou 3 fois pour les souris infectées. 1 prélèvement du sang sur souris vigile (1 min). Administration dans le pharynx sous anesthésie générale (5 min), 2 fois à 10 jours d’intervalle et 1 fois administration dans le nez sous anesthésie générale (2-3 min) pour les souris infectées. 1 prélèvement du sang sur souris vigile (1 min).
Impact sur les animaux
L’administration de liquide dans le nez ou dans le pharynx sous anesthésie générale peut provoquer une gêne respiratoire temporaire. Les anesthésiques seront administrés par injection intrapéritonéale, ce qui est légèrement douloureux pour l'animal au moment de l'injection. Le prélèvement de sang provoque une douleur locale modérée au site de prélèvement. À la suite d'une infection par le virus de la grippe, l'animal peut perdre jusqu'à 15 % du poids qu'il avait avant l’infection.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure car nous avons besoin d’analyser la réponse immunitaire dans plusieurs organes tels que les poumons et les ganglions par des techniques qui précisent le prélèvement de l’organe.
Remplacement
La mise en place d’une réponse immunitaire lors d’une vaccination est un processus complexe qui implique plusieurs acteurs et qui ne peut pas être recréée in vitro. Nous utilisons donc un modèle de souris qui permet l’utilisation de nombreux outils disponibles pour l’exploration immunologique du modèle. De plus, l’infection par voie respiratoire du modèle souris fait intervenir de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine que nous ne pouvons pas reproduire par le biais de techniques in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été calculé sur la base des données existantes dans la littérature et de l'utilisation d'un logiciel statistique permettant d'estimer le nombre de souris par groupe.
Raffinement
L’administration des produits par voie respiratoire sera effectuée sous anesthésie générale (mélange d’anesthésique et d’un antidouleur). Un gel ophtalmique sur chaque œil sera appliqué pour éviter le dessèchement de ceux-ci pendant les anesthésies. Les souris seront placées sur tapis chauffante jusqu’au réveil pour limiter l’hypothermie lors des anesthésies. Le raffinement sera assuré par un suivi clinique des animaux (observation et pesée) deux fois par semaine après administration du vaccin, puis un suivi clinique quotidien après infection pendant la période critique. Ce protocole inclut des points limites qui seront évalues à l’aide d’une grille de score. Si le score limite est atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée.
Choix des espèces
Le modèle souris, largement utilisé en laboratoire, est utilisé pour sa praticité et la bonne connaissance de son système immunitaire. Nous avons les outils necessaires pour l’analyse des réponses immunitaires du modèle. Animaux adultes livrés à 6-7 semaines d’âge, âge constituant un bon compromis entre une maturité suffisante du système immunitaire. Ils seront utilisés à 7-8 semaines (début de procédures).
Étudier le rôle des astrocytes cérébraux dans la régulation du métabolisme énergétique chez le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toutes opérées sous anesthésie pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau et y implanter une fibre optique, 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant cinq jours, un régime riche en gras et en sucre pendant un à deux mois, un jeûne de cinq heures, puis sept prélèvements sanguins en deux heures. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut provoquer des douleurs après l'opération malgré l'analgésie, et que le port de la fibre optique gêne les déplacements. L'objet reste la compréhension du rôle des astrocytes de l'hypothalamus dans le métabolisme énergétique, le porteur espérant seulement que manipuler ces cellules permettrait un jour de contrôler certaines maladies métaboliques.
Objectifs
Le maintien de l'équilibre énergétique est essentiel pour la santé. Le dysfonctionnement de ce processus conduit à une variété de maladies métaboliques pour le cerveau et le corps. Particulièrement, l'hypothalamus dans le cerveau représente un centre de signalisation pour la régulation du métabolisme énergétique du corps. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la signalisation cellulaire dans l'hypothalamus dans le contexte du métabolisme énergétique, est la base pour contrôler les maladies métaboliques. L'objectif de ce projet est d'utiliser des modèles de souris pour comprendre le rôle des astrocytes hypothalamiques dans le contrôle du métabolisme énergétique du corps, via l'angle des interactions entre astrocytes et neurones.
Bénéfices attendus
Comprendre la participation des astrocytes dans le métabolisme énergétique fera progresser nos connaissances sur la façon dont le cerveau régule l'énergie du corps. De plus, ce projet découvrira également de nouvelles voies moléculaires qui pourraient être poentiellement ciblées pour améliorer les syndromes métaboliques. En particulier, nous espérons qu’en manipulant directement ces cellules, nous pourrions contrôler certaines maladies métaboliques.
Procédures
1) L'injection intrapéritonéale d'un médicament chimique sur une partie des animaux vigiles (10 secondes, au maximum 2 fois par jour pendant cinq jours); 2) Procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie générale/locale et analgésie pré et post-opératoire sur tous les animaux (30 min chaque); 3) Expériences in vivo sur une partie des animaux: les souris qui se déplacent librement portent une fibre optique légère pendant 15-20 min pour chaque enregistrement. 4) Alimentation riche en sucre et gras: pour étudier l'adaptation métabolique, les souris reçoivent un régime riche en gras et sucre pendant 1 à 2 mois sur une partie des animaux. 5) mise à jeun: une partie des souris qui subissent des tests de métabolisme sont à jeun pendant 5 heures. 6) Tests métaboliques impliquant une administration (1 gavage ou 1 injection unique) puis 7 prélèvements de faible volume sur une durée de 2h pour une partie des animaux. 7) Euthanasie d'une partie des souris pour prélèvement sous anesthésie et analgésie, durée 20 minutes.
Impact sur les animaux
1) L’administration d’une hormone pour induire le modèle génétiquement modifié peut entrainer des irritations, un stress et une douleur de courte durée au site d'injection. 2) Une intervention chirurgicale sera effectuée pour délivrer des gènes portés par des vecteurs viraux et implanter un système de fibre optique. Cette chirurgie pourra entrainer des douleurs en post-opératoire malgré la prise en charge analgésique. 3) le port d'une fibre optique peut légèrement influencer la liberté de mouvement des souris; 4) Au cours des tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun pendant cinq heures, ils pourront donc ressentir une sensation de faim durant une courte période. Une solution de glucose sera administrée par injection intrapéritonéale ou oralement : un stress lors de la contention et une légère douleur peut être ressentie au point d'injection ou lors de l'introduction de la canule de gavage dans la cavité buccale. 5) Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués pour mesurer la glycémie, une légère douleur peut être ressentie lors du prélèvement de sang. 6) Lors des procédures mentionnées, il existe un risque d'infection au niveau des sites d'injection (par exemple, par la voie sous-cutanée ou intrapéritonéale) et de prélèvement, des risques liés à l'anesthésie, à la chirurgie et à un régime alimentaire riche en graisse.
Devenir
Les souris seront euthanasiées. En effet, les tissus prélevés pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques (analyse de la pathologie, de l'inflammation, changements dans chaque type de cellule) et pour les études moléculaires et génomiques nécessitent l’euthanasie de l’animal.
Remplacement
Dans le présent projet, le remplacement des modèles animaux par des approches in vitro ne permet pas l’étude de l'effet des astrocytes sur le métabolisme du corps. En outre, il est connu que les astrocytes in vitro ont des caractéristiques biologiques différentes de leurs états in vivo, ce qui rend indispensable l'utilisation de modèles animaux pour comprendre l'interaction complexe avec les neurones dans l'environnement natif.
Réduction
L'estimation du nombre d’animaux et les tests statistiques utilisés sont basés sur les études standards dans le domaine du métabolisme. Nous avons minimisé le nombre d'animaux, à un niveau qui permet d'être sûr de répondre aux questions scientifiques proposées de ce projet, et prend également en compte les échecs occasionnels lors des procédures expérimentales. La quantification statistique de nos données a besoin d'au moins 20 animaux par groupe et par condition. De plus, il faut prendre en compte le risque chirurgical en ajoutant 5 souris par lot, ce qui conduit à un nombre total de 300. C’est le nombre permettant d'atteindre des résultats scientifiquement solides statistiquement.
Raffinement
Tout au long du projet, les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne professionnelle, en complément de celle des expérimentateurs. L’anxiété des animaux sera réduite par un maintien en groupe social et par une manipulation régulière de la part de l'expérimentateur. Par ailleurs, les souris seront placées dans des cages avec des enrichissements environnementaux, y compris rouleaux en carton, coton, bûchettes en bois, etc, afin de leur permettre de manifester leurs comportements naturels. Les signes d'anomalie seront renseignés comme l'aspect des souris, un comportement irrégulier, des blessures, ou perte de poids. En outre, une analgésie sera mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Si les souris montrent une souffrance ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale ou physique, une analgésie supplémentaire sera administrée. Les souris ayant atteint un point limite seront euthanasiées. Ces contrôles permettent d'identifier des animaux malades ou blessés et de prendre les mesures appropriées. L'ensemble du suivi se fait en coordination avec la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Il s’agit ici d’études physiologiques et de comportement métabolique qui ne peuvent être reproduites par des systèmes, autres que celui de l’animal vivant. Les effets alimentaires et la régulation métabolique peuvent être étudiés avec pertinence chez la souris en comparaison avec l’homme. La souris permet aussi de manipuler certains gènes permettant d’accéder à la partie plus mécanistique des processus dans un environnement physiologique comparable à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 2 mois) afin que les réseaux neuronaux et astrocytes soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale ou le développement des astrocytes.
Étude des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’addiction aux opiacés chez la souris et des troubles comorbides.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises chaque jour pendant dix jours à des épisodes de défaite sociale face à des mâles agresseurs, opérées au cerveau pour y implanter une fibre optique, puis injectées de morphine de façon répétée jusqu'au sevrage, 2 978 souris vont être utilisées. Toutes sont tuées à l'issue, et toutes relèvent d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur écrit que "bien que les procédures de stress soient sévères, le bien-être animal prime", et annonce des tests comportementaux évaluant les propriétés récompensantes de la morphine et les comportements sociaux sans préciser lesquels. Les cerveaux sont prélevés après les tests, pour des mesures électrophysiologiques ou pour vérifier que les injections virales et les fibres ont été placées au bon endroit.
Objectifs
La forte prévalence des comorbidités entre dépression et addiction aux drogues a un impact majeur sur la santé mentale et les systèmes de santé. En témoigne l'épidémie d'opioïdes touchant les Etats-Unis, où la consommation de drogues est fortement associée à des symptômes de dépression, et a fait chuter l'espérance de vie jusqu’à son plus bas niveau. La comorbidité entre l’addiction aux drogues d’abus et la dépression ainsi que l’impact du stress sur la rechute après sevrage et la dépression, s’expliquent en partie par le fait que des circuits cérébraux communs sont mis en jeu, notamment le circuit dit de la récompense. Ainsi, des recommandations récentes soulignent que les développements thérapeutiques futurs doivent se concentrer sur les comorbidités, plutôt que de traiter chaque maladie indépendamment. Nous avons identifié un mécanisme cellulaire clé au sein du circuit de la récompense qui est constitué d’un réseau de neurones permettant la communication de différentes régions cérébrales entre elles ; ce mécanisme repose sur l’interaction physique au sein des neurones du système de récompense entre deux entités moléculaires appelés récepteurs. Cette interaction entre récepteurs régule les comportements dépressifs et d’addiction. Pour ce projet, nous allons étudier comment cette interaction entre récepteurs modifie l’activité de différents types de neurones au sein de ce circuit de la récompense.
Bénéfices attendus
Nous avons développé des outils qui permettent de cibler très spécifiquement des interactions entre récepteurs au sein du circuit de la récompense. Sur des prélèvements de cerveaux provenant de patients ayant soufferts de dépression et/ou de dépendance aux drogues, nous avons pu détecter des variations dans l’interaction entre ces récepteurs. Le présent projet permettra d’élucider le rôle de ces interactions entre récepteurs dans des modèles de troubles psychiatriques. Ce nouveau mécanisme identifié représente un intérêt thérapeutique permettant de proposer potentiellement un nouveau traitement dans pour les pathologies comorbides telles que l’addiction et la dépression. Ce projet revêt donc un fort potentiel translationnel car il ouvre la porte à de futurs développement thérapeutiques pour traiter à la fois les addictions et la dépression en même temps.
Procédures
Les animaux seront soumis à des épisodes de stress sociale dans les 4 procédures pour une durée maximale de 5 minutes par jour sur une période de 10 jours. Une chirurgie cérébrale est également pratiquée avec implantation de fibre et/ou d’outils génétique pour l’apport de molécule d’intérêt sur une partie des animaux. Les animaux subiront différents tests comportementaux permettant d’évaluer les propriétés récompensantes de la morphine, son sevrage, et les comportements sociaux. Des injections répétées de morphines, anesthésiques, saline seront également réalisées.
Impact sur les animaux
Le projet s’intéresse à la composante addictive de la morphine et la dimension stressante de l’exposition à des stimuli aversifs à l’âge adulte. Ainsi les effets indésirables seront principalement liés à la dérégulation de ces grands systèmes et pourront se manifester à l’échelle comportementale par des traits dépressifs et un ressenti de manque de la substance. Ces stress n’induisent pas des dérégulations profondes des systèmes de la douleur mais provoque des stress psychologiques. Le protocole d’administration de morphine induisant l’apparition de signes de sevrage se manifestant également à l’échelle somatique (tremblements etc…) que nous étudions. Les chirurgies provoqueront des douleurs au niveau du site d'incision cutanée et d'injection par perforation du périoste. Les tests de comportement seront pour la plupart sans douleur et basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone nouvelle ou un nouveau congénère. Certains animaux dans le cas des stress sociaux peuvent ne pas ou peu prendre de poids. Les injections répétés peuvent générer une sensibilité de la zone accrue et un risque d’infection (il est prévu d’alterner les injections entre la droite et la gauche afin de réduire nettement ce risque).
Devenir
Procédure 1 à 4 : Après les tests comportementaux, les souris seront mises à mort pour prélèvement de cerveau dans le but de réalisée des mesures électrophysiologiques ou afin de vérifier la justesse des injections virales et du placement des fibres d’enregistrements.
Remplacement
Notre projet reposant en grande partie sur des approches de physiologie intégrée. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode substitutive qui pourrait remplacer l’utilisation de l’animal dans nos expériences. Les structures étudiées étant très conservée entre l’Homme et la souris, cela en fait un modèle de choix pour notre projet. De même, l’utilisation de virus et de lignée génétiquement modifiée permettent un ciblage précis des structures et récepteurs altérés par le stress ou l’exposition à la morphine.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire dans chaque procédure est calculé au mieux afin d’utiliser le moins d’animaux possible mais de maintenir un niveau de significativité statistique suffisante. Le projet requiert des mâles et des femelles afin d’être le plus représentatif possible de la population et éviter un biais lié au sexe.
Raffinement
Bien que les procédures de stress soient sévères, le bien-être animal prime et par conséquent nous faisons attention à l’enrichissement des cages, à limiter au maximum le stress des animaux en dehors de la procédure, définition et suivi de l’animal adapté à chaque situation. En effet, les risques éventuels de blessures ou de déshydratation sont plus élevés lors de l'exposition à la défaite sociale ou à une chirurgie par exemple. C'est pour cela que la fréquence d'observation des animaux seront proportionnés aux potentiels risques encourus Ainsi, lors des chirurgies, une hydratation sous cutanée pré et post opératoire sera réalisée, de même que l’injection d’analgésique avant et une administration d’antiinflammatoire/analgésique pendant 5 jours post-opération. Un tapis chauffant est placé sous l’animal lors de la chirurgie (régulation via sonde rectale) et également sous les cages de réveil afin de faciliter ce dernier et éviter une hypothermie. Les souris auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Chaque cage possède des bâtons en bois à ronger, un abri et des cotons pour la nidification
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. Elle possède une proximité évolutive, un cycle de vie cours permettant de répéter les expériences afin de s’assurer de la robustesse des résultats, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. C’est un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress et de la morphine d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des effets du stress et de l’addiction, et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie). De ce fait, la souris est un bon modèle pour notre étude. Les CD1 agresseurs sont des anciens mâles reproducteurs de plus de 6 mois.
Modèle expérimental d’hypertrophie bénigne de la prostate chez la souris, traitements chroniques par gavage, évaluation de la fréquence mictionnelle dans les cages métaboliques.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Jusqu'à deux gavages par jour pendant vingt-huit jours consécutifs, trois séjours de 48 heures en cage métabolique et un prélèvement sanguin quotidien de quinze minutes sur les trois derniers jours : 2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale sous sédation pour prélever la vessie et la prostate. Elles vivent avec une obstruction de l'urètre, une rétention urinaire, une fréquence mictionnelle augmentée et des calculs dans la vessie. L'objet est de mesurer l'effet de candidats médicaments sur l'hypertrophie bénigne de la prostate. Les souris utilisées sont transgéniques et surexpriment la prolactine de rat dans le tissu prostatique, et le porteur précise qu'elles seront âgées, la maladie visée touchant l'homme vieillissant.
Objectifs
L’hypertrophie bénigne de la prostate (HBP) est la maladie la plus fréquente de l’homme âgé (90 % d’atteintes histologiques chez les sujets de 80 ans). Au plan clinique, elle se manifeste par des troubles urinaires du bas appareil urinaire. La pathogénèse de l’HBP n’est pas entièrement élucidée. Ce développement débute vers la quatrième décennie pour ne devenir macroscopique que vers la sixième ou septième décennie, c’est-à-dire chez le sujet âgé. Pour ce qui concerne l’épidémiologie, diverses études internationales ont montré des prévalences variées, néanmoins, toutes montrent une augmentation avec l’âge, et des extrêmes de 12 % à 25 % pour des symptômes modérés, et de 2 % à 6 % pour les symptômes sévères. Les patients ayant une HBP symptomatique qui ne relève ni de la simple surveillance, ni d’un traitement chirurgical, sont candidats à un traitement pharmacologique. Quatre classes thérapeutiques peuvent être utilisées dans le traitement de l’HBP : les alpha-bloquants, les inhibiteurs de l’enzyme 5-alpha réductase, les anticholinergiques et la phytothérapie. Toutefois, l’efficacité de ces traitements est assez limitée et en plus associée à de nombreux effets secondaires, à l’exception de la phytothérapie. Il y a donc une forte demande de la part des patients et des urologues pour tester de nouveaux traitements qui soient plus efficaces et ayant très peu d’effets indésirables.
Bénéfices attendus
Le but de notre étude est de quantifier l’effet d'un traitement chronique avec des candidates médicaments sur l’hypertrophie bénigne de la prostate et l’inflammation des lobes de la prostate de souris. Le but ultime est donc d'identifier les candidats médicaments les plus prometteurs , qui seront ensuite testés chez le patients dans les différentes phases cliniques. Cela permettra de trouver de nouveaux médicaments plus satisfaisants pour soigner les patients touchés par les troubles urinaires engendrés par l'hypertrophie bénigne de la prostate.
Procédures
Les animaux feront un maximum de 3 sessions de 48 h en cage métabolique et auront 1 à 2 gavages par jour pendant 28 jours consécutifs. La dureéé de chaque gavage est de 1 minute. Il y aura aussi un prélèvement de sang chaque jour pendant 3 jours, lors des derniers jours du traitement chronique de 28 jours consécutifs. Le temps nécessaire pour effectuer un prélèvement de sang pour chaque souris est de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront sujets aux nuisances typiques de l’hyperplasia de la prostate : obstruction urétrale, rétention urinaire et augmentation de la fréquence mictionnelle ainsi que calculs dans la vessie. Nous ne connaissons pas à l’avance les effets secondaires des molécules à tester sur ce modèle expérimental mais le but de ces études et de trouver des médicaments qui soient capables de réduire les nuisances liées à l’hyperplasie de la prostate, donc les molécules testées pourraient diminuer la fréquence mictionnelle et /ou l’obstruction urétrale et /ou l’hyperplasia prostatique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par disclocation cervicale sous sédation à l'isoflurane, car la vessie et la prostate doivent êtres prélevées.
Remplacement
Le but de notre étude est de quantifier l’effet chronique de molécules ayant des mécanismes d’actions différents sur l’hypertrophie bénigne de la prostate et l’inflammation des différents lobes de la prostate de souris. Entant donner la complexité des mécanismes biologiques, encore mal connus, qui sont responsables de la prolifération du stroma de la prostate, l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro, car les facteurs biologiques responsables de la croissance prostatique sont encore mal connus.
Réduction
Etant donné que les souris peuvent être placés plusieurs fois dans les cages métaboliques, cela réduit considérablement leur nombre. De plus, le nombre de souris utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type à ventilation individuelle en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage d’hébergement, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.
Choix des espèces
Les souris transgéniques utilisées dans notre laboratoire sont caractérisées par une surexpression de la prolactine de rat dans le tissu prostatique. Ce modèle transgénique est similaire à la pathologie humaine car il est caractérisé par une hypertrophie des lobes prostatiques, une hyperplasie stromale, des zones de dysplasie épithéliale et néoplasies intra-épithéliales ainsi que la présence de biomarkers d’inflammation chronique avec des infiltrats de lymphocytes et macrophages. Plusieurs études ont déjà montré que ces souris sont caractérisées par une hypertrophie prostatique importante, une obstruction urétrale, une rétention urinaire et une augmentation de la fréquence mictionnelle. Ce modèle expérimental mime la pathologie humaine à la différence d’autres modèles couramment utilisés. Il est donc un modèle de choix pour l’étude des effets des candidats médicaments visant à réduire l’hyperplasie bénigne et l’inflammation de la prostate. Les souris utilisées en experimentation seront âgées car l'hyperplasie prostatique chez l'homme est une pathologie liée au vieillissement.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments pour le traitement de tumeurs solides
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées de cellules tumorales sur le flanc puis injectées de cellules immunitaires humaines, 2 018 souris immunodéficientes reçoivent jusqu'à trois injections sous-cutanées en trois semaines, huit injections intrapéritonéales ou intraveineuses en quatre semaines, et deux à quatre prélèvements sanguins par voie rétro-orbitale ou jugulaire sous anesthésie. 90 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 928 d'un niveau modéré. Le porteur indique que le transfert de cellules immunitaires humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, avec perte d'appétit, difficulté à boire, atteintes cutanées et prostration, et que six anticorps bispécifiques seront comparés sur trois cibles tumorales avant que les trois meilleurs soient retenus. Toutes sont tuées en fin de procédure, l'évaluation chez l'animal étant présentée comme le passage obligé vers la demande d'essai clinique.
Objectifs
Le développement de traitement anti-cancéreux comporte une phase de développement préclinique permettant de sélectionner le candidat le plus efficace et le moins toxique. Cette phase a pour but de bien caractériser le mécanisme d’action du candidat médicament et de valider son efficacité et son absence de toxicité. Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des tumeurs solides. Nos médicaments sont des anticorps particuliers qui peuvent reconnaître en même temps les cellules cancéreuses et certaines cellules du système immunitaire qui peuvent tuer les cellules cancéreuses. Ces cellules immunitaires, une fois activées par notre médicament, peuvent alors tuer uniquement les cellules cancéreuses. Une pré-evaluation de nos candidats médicaments a déjà été réalisée dans de nombreuses études in vitro et ex vivo (sur des tumeurs fraîches issues de patients notamment). Ceci nous a permis de pré-sélectionner 6 candidats (couvrant 3 cibles tumorales différentes) et de restreindre au maximum le recours à des modèles animaux. L’objectif maintenant est de démontrer l’efficacité de ces candidats chez l’animal, ainsi que de caractériser au mieux leur mécanisme d’action in vivo, nécessaire pour réaliser de futures études cliniques chez l’homme. Le meilleur candidat pour chacune des 3 cibles sera sélectionné, sur la base de son efficacité, dans différents modèles tumoraux, puis sera évalué en combinaison avec d’autres médicaments anti-cancéreux déjà existant. Ces études précliniques chez l’animal sont très importantes car elles serviront à demander l’autorisation d’essai clinique chez l’homme. Nos 3 meilleurs candidats médicaments pourront être utilisés dans le traitement du cancer du poumon, du foie, du colon, de l’estomac, des ovaires ou du sein.
Bénéfices attendus
La démonstration du mécanisme d'action de notre approche in vivo est une phase essentielle dans l'évaluation préclinique de nos candidats médicaments. A l'issue de cette étude, 3 candidats médicaments pourront faire l'objet d'études cliniques chez l'homme pour le traitement de tumeurs solides. Cette thérapie innovante pourrait notamment bénéficier à des patients en seconde ligne de traitement, après une rechute à la suite des traitements conventionnels de première ligne, dans différents types de cancers. De plus, aucun modèle in vivo démontrant ce mécanisme d'action n'a été décrit jusqu’à présent dans la littérature. Les données générées pourront bénéficier à court-terme à la communauté scientifique, au travers de la publication des résultats obtenus avec ce modèle d’étude.
Procédures
Dans ce projet, les études seront réalisées sur des souris immunodéficientes, injectées avec des cellules immunitaires humaines (en accord avec notre mécanisme d’action). Pour les gestes techniques tels que l’identification des animaux (10 secondes par animal) ou des injections sous-cutanées, intra-veineuse et intra-péritonéales (15-30 secondes par injection), l’animal reste vigile et est maintenu sous contention manuelle. - Injection sous-cutanée : 3 maximum (1 à 2 par semaine réparties sur 3 semaines) - Injection intra-péritonéale ou intraveineuse : 8 maximum (2 fois par semaine pendant 4 semaines) Des prélèvements sanguins eux seront effectués par voie rétro-orbitale ou intraveineuse (Jugulaire) sur animaux anesthésiés (par isoflurane gazeux 4 %) à raison de 2 à 4 prélèvements de 50 µL sur 2 semaines (20-30 secondes par prélèvement/animal). Le sang sera recueilli dans un tube adapté et analysé au laboratoire
Impact sur les animaux
Certains animaux pourraient subir un inconfort ou une angoisse liée à la manipulation ou aux prises de sang. Une partie des animaux subiront la greffe de cellules tumorales qui aboutira au développement d’une masse tumorale sur le flanc des souris, susceptible d’occasionner une gêne. Certains animaux seront également injectés avec des cellules immunitaires humaines et des cytokines humaines qui pourraient entraîner une maladie du greffon contre l’hôte (GVHD = Graft-versus-Host Disease). Cela pourrait se manifester par une détérioration de l’état de santé de l’animal (par exemple perte d’appétit, difficulté à boire, atteinte cutané ou prostration).
Devenir
Les souris seront mis à mort en fin de procédure expérimentale et des prélèvements post-mortem pourront être réalisés.
Remplacement
Des alternatives à l’évaluation chez l’animal, in vitro et ex vivo ont été explorées, comme des cocultures de lignées de cellules tumorales avec des cellules immunitaires in vitro, des modèles organoïdes 3D ou des essais ex vivo sur tumeurs fraîches de patients. Ceci a permis de sélectionner les candidats médicaments sur des modèles pertinentss en limitant le recours aux animaux. Ces méthodes alternatives ont montré une grande efficacité de notre mécanisme d’action et ont permis de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour les études de pharmacocinétique et d’efficacité anti-tumorale in vivo. En effet, l’essai clinique d’un nouveau traitement chez les patients nécessite une évaluation préalable de l’efficacité et de la dose tolérée sur des animaux, conformément à la directive 2001/20/CE.
Réduction
Ces études sont menées avec des analyses statistiques afin de s'assurer de la significativité statistique des résultats obtenus en fonction du nombre de souris par groupe et du nombre de groupes. Le nombre de souris dans chaque groupe et le nombre de groupes sont importants pour ces analyses. Par exemple, nous utilisons 3 souris par groupe pour certaines études et entre 8 et 10 pour d'autres lorsque nous avons besoin de faire des analyses plus poussées afin de garantir la fiabilité des résultats. C'est le cas notamment pour les analyses de la taille des tumeurs car il existe de fortes différences naturelles entre les souris et cette augmentation du nombre d’animaux nous aide à obtenir des résultats interprétables et précis
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnementà statut sanitaire controlé et spécifique où les conditions sanitaires sont rigoureusement surveillées pour minimiser les risques de contamination et assurer la santé des animaux de laboratoire. A leur arrivée, les animaux seront acclimatés pendant une semaine à 2 semaines après réception, avant le début des études, afin qu’ils se familiarisent à leur nouvel environnement. Les animaux bénéficient de raffinement tels que des carrés de coton, maisonnettes en carton, ou encore batonnets à ronger. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement. Pour les animaux porteurs de tumeur, l’aspect et la taille des tumeurs seront également évalués 2 fois par semaine. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte de points limites.
Choix des espèces
Les études réglementaires requièrent un modèle rongeur et un modèle non-rongeur pour les études de toxicité et de pharmacocinétique. Dans ce projet, nous utiliserons exclusivement la souris comme modèle de petit rongeur pour des études pharmacocinétiques et des études d'efficacités. En effet, la souris est un modèle de choix pour ce type d'études car la majorité des modèles tumoraux sont développés chez la souris et plusieurs modèles de souris immunodéprimées sont disponibles. C'est également un modèle de mammifère dont le profil pharmacocinétique permet une utilisation préclinique. Les animaux seront des jeunes adultes agés de 6 semaines. A cet âge, les animaux sont matures et supportent mieux le transport de l'élevage jusqu'à l'animalerie, ainsi que l'anesthésie. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités car la présence de graisse peut entrainer une modification de la distribution de notre molécule et induire plus de variabilité.
Étude de la protection conférée par la mémoire immunitaire innée induite par les composants de levures.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
14 400 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, chacune subissant au moins un prélèvement sanguin et, pour une partie d'entre elles, un gavage quotidien pendant sept ou quatorze jours d'affilée. 8 460 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 5 940 d'un niveau modéré. Les souris reçoivent du bêta-glucane extrait de la paroi de Candida albicans puis sont infectées par des agents pathogènes qui provoquent poil hérissé, mobilité réduite et perte de poids au bout de sept jours, l'objectif étant de mesurer combien de temps dure la protection conférée par cet entraînement de l'immunité innée. Le porteur qualifie le recours à l'expérimentation animale d'"indispensable" au motif que ses propres travaux in vitro sur cellules humaines n'expliquent toujours pas comment le mécanisme fonctionne "à l'intérieur".
Objectifs
Le système immunitaire des mammifères comprend l’immunité innée et adaptative. L’immunité adaptative n’est plus la seule capable de mémoire ; en effet les cellules de l’immunité innée peuvent répondre plus efficacement à une infection si une agression immunologique a déjà eu lieu auparavant. C’est le « training » des cellules innées, ou entraînement. Nos études du training chez l’humain in vitro ont établi les mécanismes cellulaires impliqués, mais peu de données sont disponibles in vivo. Candida albicans (C. albicans) est une levure commensale des muqueuses à l’origine d’infections locales bégnines, mais également invasives et mortelles dans le cas d’immunodépressions. Ce microorganisme est d’une importance majeure pour l’étude du training, car il induit la protection : une injection d’une faible dose de C. albicans permet une meilleure résistance des souris à une infection sérieuse ultérieure. Le polysaccharide ß-glucan de la paroi de C. albicans est le médiateur du training et de la protection. Le ß-glucan est un sucre facilement isolable de la paroi des levures et non toxique. Nous avons établi que la protection est induite par injection intrapéritonéale de ß-glucan. Il est possible qu’une longue supplémentation orale puisse également protéger. La mémoire immunologique innée est non-spécifique et protège contre un pathogène distinct du premier agent infectieux rencontré. L’objectif scientifique de ce projet se décompose en cinq parties : - Peut-on induire un entrainement avec une approche simplifiée et une formulation du ß-glucan permettant dans le futur des nouvelles voies d’administration ? - Quelle est la durée pendant laquelle le training par ß-glucan est efficace face à une seconde infection ? - Quels acteurs de l’immunité innée sont affectés par le training ? Les souris sont protégées contre des infections locales, systémiques, fongiques, bactériennes ; les facteurs impliqués doivent donc être polyréactifs et largement distribués dans l’hôte. - Quels sont les évènements clés induits suite à l’introduction du ß-glucan dans l’hôte ? Identifier ses effets précoces clés permettront d’envisager d’autre voie d’administrations pertinentes. - La supplémentation orale en ß-glucan pendant deux semaines protège les souris contre une infection. Cette approche serait applicable à l’homme, mais la durée de la supplémentation peut-elle être réduite ?
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer la formulation de la molécule étudiée, les mécanismes et la longévité du training et de la protection face à des infections fongiques et bactériennes diverses, donnant une base solide de travail pour de futures études fondamentales (mécanismes voies d’administration) et cliniques (traitement préventif/combinatoire). Ces données seront obtenues pour les méthodes de training établies et publiées mais aussi avec une nouvelle formulation de la molécule étudiée et enfin une nouvelle méthode par voie orale, qui représente des approches adaptables à l’homme. Notre étude apportera également des nouvelles données cruciales sur les mécanismes physiologiques qui permettent à la molécule étudiée de protéger l’hôte contre différentes infections. Les acteurs immunitaires précoces et tardifs du training de l’immunité innée seront identifiés de manière plus complète, et la dynamique du training sera établie in vivo.
Procédures
Certains animaux auront selon les procédures: - une ou deux injections intrapéritonéale (quelques secondes) - une injection intraveineuse (1 minute) sous anesthésie gazeuse - une inoculation orale (deux minutes) tous les jours pendant 7 ou 14 jours Tous les animaux auront un prélèvement sanguin (quelques secondes) une seule fois
Impact sur les animaux
Une nuisance légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l’état général des animaux sera associée au gavage et aux injection intrapéritonéale et intraveineuse. Les dommages escomptés dans ces expériences sont liés à l’objectif visant à comprendre les mécanismes induisant une protection contre des agents infectieux. Des agents infectieux de classe 2 seront inoculés aux souris et induiront des signes cliniques d’infection (poil hérissé, mobilité réduite, perte de poids) après 7 jours d’infections.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable, car bien que nous ayons largement étudié in vitro les mécanismes de mémoire de l’immunité innée avec des cultures de cellules humaines, nous ne comprenons toujours pas comment cela fonctionne « à l’intérieur », dans la vie réelle, ce qui est essentiel pour envisager des traitements préventifs/curatifs. De plus, comprendre les mécanismes in vivo d’entraînement nécessite l’utilisation de mammifères au système immunitaire inné complexe (inné et adaptatif, multiples cellules hématopoïétiques, origine embryonnaire et moelle osseuse), ce qui exclut l’utilisation d’insectes possédant un seul type cellulaire et dépourvus de système immunitaire adaptatif et de moelle osseuse. Ce travail viendra renforcer les connaissances acquises in vitro.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à ce projet est évalué à 14400 sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé après consultation d’une biostatisticienne et analyses statistiques préalables permettant de déterminer à partir de combien de sujets une mesure est exploitable scientifiquement, et ce dans le souci de n’utiliser que le strict nécessaire d’individus tout en récupérant le maximum d’information par animal. Nous observons une protection tant chez les femelles que chez les mâles. Afin de réduire le nombre d’individus tout en maintenant une mesure exploitable scientifiquement, nos expériences seront principalement menées sur des femelles dans la continuité des travaux similaires publiés pour ce type d’étude, mais les résultats clés seront confirmés chez les mâles. Dans le cas spécifique de la durée de la protection induite par le training, des temps de plus en plus longs seront testés entre l’inoculum protecteur et l’inoculum infectieux. Dès que la protection sera perdue, les expériences incluant des temps encore plus longs seront annulées afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à notre étude. De même, dans le cas spécifique de l’étude de la formulation soluble de l’inoculum protecteur, si celui-ci ne présente pas les effets protecteurs escomptes, il sera exclu des autres procédures afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à notre étude.
Raffinement
Le suivi des animaux selon une liste de signes cliniques permettra d’attribuer un score quantitatif de bien-être des animaux tel que décrit par la SBEA. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal dépasse le score limite, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle souris a été décrit dans la littérature et est le seul existant pour étudier l’entraînement de l’immunité. De plus les souris présentent des procédures expérimentales mieux codifiées par rapport à d’autres rongeurs, de multiples outils existent et les expérimentateurs ont de l’expérience sur ces animaux. Les souris utilisées seront adultes, entre 7 et 11 semaines d’âge. Le choix de ce stade de développement permet d’avoir des souris dont le système immunitaire est complètement développé, à savoir une hématopoïèse adulte et des macrophages résidents dans les tissus pleinement développés.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux traitements sur le confort et la sensibilité viscérale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Le test s'arrête quand le rat courbe le dos, hérisse les poils et présente une crampe abdominale visible à l'œil nu. 1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 500 d'entre eux, modéré pour 800 et sévère pour 300. Chaque animal reçoit des gavages, des injections et des instillations qui provoquent une colite, et subit jusqu'à six distensions du côlon par un ballonnet gonflé sous anesthésie, à 48 heures d'intervalle, pour tester des molécules candidates, des probiotiques et des stratégies nutritionnelles contre la douleur intestinale. Le porteur qualifie la distension colorectale de technique "non invasive" et l'observation de la douleur d'étude "uniquement comportementale", tout en classant la colite qu'il induit en souffrance sévère.
Objectifs
La douleur intestinale est un symptôme commun dans la population générale et chez les patients atteints du syndrome de l’intestin irritable (SII), chez qui elle est associée à une hypersensibilité viscérale. Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est un trouble fréquent, il est la cause de 30 à 50% des consultations auprès d’un gastroentérologue et toucherait de 10 à 15% de la population des pays occidentaux. Les symptômes sont invalidants pour les patients et sont caractérisés par des périodes de diarrhée et /ou constipation. Les causes du SII ne sont pas clairement identifiées mais seraient liées au mode de vie, à l’alimentation, à la dépression, à l’anxiété et aux infections rendant la prévention du SII difficile. Le SII d’origine infectieuse peut également entraîner une inflammation et altérer la barrière intestinale. En effet, une apparition de ce syndrome est souvent observée suite à un épisode de gastroentérite. Chez les patients atteints de SII, une modification de la flore bactérienne a été observée. Dans le laboratoire nous avons mis en évidence les effets analgésiques de probiotiques spécifiques (bactéries et levures) dans le modèle de distension colorectale chez le rat qui permet d’évaluer les seuils de la douleur viscérale . Des études plus récentes ont également montré que l’ingestion d’aluminium, que l’on retrouve dans notre alimentation quotidienne, induit également des phénomènes d’hypersensibilité viscérale. Du fait de la complexité des mécanismes impliqués dans la nociception, aucun traitement efficace n’existe. Le but de ces études est donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique de composés de synthèse (médicaments « candidats ») mais également de micro-organismes ou de stratégies nutritionnelles.
Bénéfices attendus
Pouvoir selectionner des molécules candidates qui pourront être passées en test de toxicité avant une étude clinique et ainsi pouvoir approfondir la connaissance des mécanismes d'action dans la physiopathologie des maladies inflammatoires digestives.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gavages et injections pour l'administration des molécules candidates. Ils seront anesthésiés durant quelques minutes à l' isoflurane pour la l'insertion du ballonnet. Aucun prélèvement sur animal vigile ne sera effectué et il n'y aura aucune procédure chirurgicale. Les prélèvements sur les rats ne se feront que post mortem.
Impact sur les animaux
Il est à préciser que le modèle de distension colorectale est une technique non invasive qui permet d’évaluer le seuil de douleur chez le rat utilisant le gonflement d’un ballonnet inséré dans le côlon de rats qui est une application de l’examen de manométrie rectale réalisé en clinique humaine. L’observation de la douleur viscérale est une étude non invasive et uniquement comportementale. Les animaux auront des gavages, des injections, des instillations induisant une colite. Lors de ces gestes, les animaux auront un certain inconfort. Il en est de même lors de la pose du ballonet en intra-rectal. Ces gestes sont de classe légère. La colite induite sera de classe sévère.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animeaux seront mises à mort à des fins de prélèvements d’organes
Remplacement
Il n’est pas possible de modéliser in vitro un processus aussi complexe que celui de la sensibilité viscérale qui fait intervenir le système nerveux entérique et d’autres composantes du tissu intestinal ainsi que de nombreux types cellulaires comme les cellules entérochromafines, les mastocytes, les éosinophiles. De plus, les stratégies nutritionnelles nécessitent l’ingestion des composés à tester afin qu’ils agissent au « bon endroit » sur leur cible. L'évaluation de l'effet thérapeutique dans le domaine de la douleur nécessite des études in vivo permettant de mettre en évidence la fonctionnalité des composés rigoureusement sélectionnés in vitro.
Réduction
Les modèles permettant d'évaluer les seuils de douleur viscérale ont été décrits (Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2018 Sep 20;7(1):185-196)chez le rat et permettent d'évaluer ce paramétre de façon non-invasive s'inspirant d'une technique utlisée en clinique humaine (manométrie rectale). Le modèle rat est largement décrit, validé et reproductible ce qui permet de réduire le nombre d'animaux à utiliser pour évaluer les propriétés analgésiques de composés car il ne nécessite aucune mise au point. Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 10, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes).
Raffinement
1) En dehors du test d’évaluation de la douleur - une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure, stresss) - une perte de poids supérieur à 20% 2) pendant le test d’évaluation de la douleur en plus des points limites cités ci-dessus - le réflexe de retrait qui se caractérise par une contraction forte qui provoque une courbure du dos, le hérissement des poils et une crampe abdominal visible à l’oeil nu. Ce signe entraîne l’arrêt immédiat du test (dégonflement instantané du ballonnet induisant une perte instantanée de la douleur). Dispositions prises pour limiter la douleur Le ballonnet est inséré dans le colon des rats sous anesthésie. Le ballonnet est dégonflé immédiatement suite à l’observation du comportement caractéristique de douleur viscérale de façon à ce que ce temps soit d’une durée la plus limitée possible. Pour les rats qui sont évalués à différents temps (cinétique d’efficacité du produit testé), un temps minimal de récupération de 48h est appliqué entre 2 évaluations. Un maximum de 6 évaluations est réalisé par rat. Ces paramètres ont été établis lors d’études préliminaires et à partir de données bibliographiques montrant que chez les rats contrôles le seuil de douleur ne variait pas non plus dans un intervalle de 48h, indiquant que 48h sont plus que suffisantes pour la récupération de l’animal.
Choix des espèces
Les modèles permettant d'évaluer les seuils de douleur viscérale ont été décrits chez le rat et permettent d'évaluer ce paramétre de façon non-invasive s'inspirant d'une technique utlisée en clinique humaine (manométrie rectale). Le modèle rat est largement décrit, validé et reptoductible ce qui permet de réduire le nombre d'animaux à utiliser pour évaluer les propriétés analgésiques de composés car il ne nécessite aucune mise au point. Des rats adultes mâles pesant de 150g-200g seront utilisés afin de se conformer aux protocoles validés
Mise au point d’un modèle d’infection cutanée chez la souris et évaluation de l’efficacité d’un composé antibactérien
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Mettre au point pour un industriel un modèle de plaie infectée conduit à utiliser 35 souris, toutes tuées à l'issue, dont 14 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 21 un niveau modéré. Chaque souris reçoit deux biopsies cutanées sous anesthésie et la pose d'attelles destinées à empêcher la peau de se contracter, avant l'infection des plaies par Staphylococcus aureus. Le porteur attend une douleur liée aux deux plaies et à l'infection, ainsi qu'un stress supplémentaire pour les souris isolées après arrachage des pansements. La souche DBA/2 a été retenue par l'industriel pour sa sensibilité particulière à cette bactérie, afin de se rapprocher des conditions d'un patient fragile.
Objectifs
Staphylococcus aureus (S. aureus) représente la cause la plus courante d’infection bactérienne de la peau et des tissus mous. Cette bactérie infecte généralement la peau d'individus en bonne santé à la suite d'un traumatisme, de brûlures ou d'interventions chirurgicales, ainsi que la peau de patients atteints de maladies chroniques caractérisées par des démangeaisons (dermatite atopique) et le diabète. Les bactéries du genre Staphylococcus sont très efficaces pour créer des amas structurés adhérent à une surface. Cette formation appelée biofilm, leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles et les rend plus résistantes à la réponse immunitaire de l’hôte ainsi qu’aux traitements antibactériens. On retrouve une prévalence de 78,2 % des biofilms dans les plaies chroniques. Un nombre croissant de preuves établissent que l'infection par biofilm est une cause majeure de retard de cicatrisation des plaies. Ce projet vise à mettre au point un modèle d’infection cutanée à S.aureus chez la souris dans l’objectif de tester l’efficacité d’un composé antiobiofilm.
Bénéfices attendus
Il est attendu que le nouveau composé antibacterien testé montre une efficacité antibiofilm et améliore la cicatrisation des plaies. Ce nouveau traitement pourrait recouvrir de futur pansement améliorant la guérison des plaies.
Procédures
- 1 ou 2 injections intrapéritonéales (anesthésie +/- mise à mort) : 3 sec - 6 injections sous cutanées (analgésie) : 3 sec - 1 procédure chirurgicale correspondant à 2 biopsies cutanées et à la pose d’attelles de protection sous anesthésie : 10 min
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue sera une douleur liée à la création des deux plaies cutanées et au développement de l’infection sur ces plaies. Les animaux subiront également deux anesthésies générales par injection intrapéritonéale. La préhension et l’injection peuvent entrainer un stress chez la souris. Les 2 attelles positionnées pour éviter les contractions de la peau peuvent également créer une gêne. Durant la phase de mise au point, les animaux seront hébergés à 2 par cage. Dans ces conditions, des évènements d’arrachage de pansement ou d’attelles peuvent être observés et abimer les plaies (augmentant la douleur des animaux) au point de fausser les résultats de notre étude. Dans ce cas les animaux seront isolés tout au long de l’étude ce qui peut également causer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les plaies sur lesquelles seront réalisées des analyses histologiques (étude des tissus) et bactériologiques.
Remplacement
Le nouveau composé antibactérien a déjà été testé in vitro. Toutefois son efficacité ne peut être confirmée que dans un modèles pré-clinique, notamment pour évaluer les aspects de cicatrisation, impliquant différents tissus et différentes cellules en interaction.
Réduction
L’analyse histologique et bactérienne des plaies a été optimisée pour réduire au maximum le nombre d’animaux. En effet chaque plaie sera scindée en deux afin d’apporter 2 résultats histologiques (½ plaie droite et ½ plaie gauche) et deux résultats de charge bactérienne par animal divisant ainsi le nombre nécessaire d’animaux par deux.
Raffinement
L’acte chirurgical d’excision cutanée sera réalisé sous anesthésie générale. Une couverture analgésique sera mise en place 30min avant la chirurgie et pendant 72h. Les animaux seront suivi quotidiennement et à ces occasions les pansements renouvelés. Les animaux seront hébergés par deux s’il n’est observé aucun comportement d’arrachage mutuelle de protections des plaies. Pour éviter ces comportements, les cages seront enrichies de jouets et de matériaux de nidation. Des critères d’arrêt de l’étude ont été mis en place pour assurer le bien-être animal.
Choix des espèces
4 espèces animales sont couramment utilisées comme modèle de plaie cutanée dans la littérature : la souris, le rat, le lapin et le cochon. Le choix de l’industriel s’est porté sur la souris DBA/2 qui montre une sensibilité particulière aux infections à S. aureus, le but étant de se rapprocher des conditions d’un patient fragile (immunodéprimé, diabète, pathologies multiples). Des souris adultes (8 semaines) seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 22-25g et un système immunitaire mature.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 828
4 140 souris et 828 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie injecte un vecteur viral directement dans le nerf sciatique ou le nerf trijumeau, une deuxième comprime le trijumeau, une troisième serre le nerf facial, une quatrième provoque une neuropathie traumatique, et tous les animaux passent ensuite une électrophysiologie sous anesthésie puis des tests comportementaux tous les quinze jours. Le porteur annonce des douleurs post-opératoires de quatre jours, des douleurs neuropathiques et une baisse de mobilité de six à dix semaines, ainsi qu'une obésité et une hyperglycémie chez les animaux rendus diabétiques. Les bénéfices, eux, sont datés : premiers essais cliniques entre 2027 et 2029, mise sur le marché entre 2029 et 2032.
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé dans les patte arrières permettant à la fois de les faire bouger et de ressentir des sensations perçues au niveau des pattes (toucher, douleur, température...). Le nerf trijumeau va permettre de faire bouger le visage (mordre, mâcher, ...) et de recevoir les informations proprioceptives (toucher, douleur...). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une membrane autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP a pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. La dégradation des axones et la démyélinisation sont réversibles. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire), comme les maladies de Charcot-Marie-Tooth ou l’hypersensibilité à la pression ou bien acquises, comme les neuropathies (maladie des nerfs) traumatique (causée par une blessure) ou diabétique (causée par le diabète). Il n’existe aucun traitement. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L'objectif du projet est de valider notre approche thérapeutique, basée sur une thérapie génique qui utilise des vecteurs viraux, pour introduire dans les cellules des nerfs des patients, des candidats médicaments au potentiel anti-démyélinisant pendant plusieurs années lors desquelles les troubles moteurs existants et la progression de la maladie seront diminués. Ces vecteurs viraux sont les plus utilisés et ont été cliniquement et commercialement validés. Afin de savoir si nos traitements seront efficaces aux stades précoces et tardifs de la maladie, nous administrerons les traitements soit en amont, soit après l'apparition des premiers symptômes dans des modèles de rongeurs de ces maladies. D'autre part, nous analyserons les nerfs prélevés sur les animaux à la fin de chaque procédure afin d'évaluer l'effet des candidiats médicaments sur l'état de myélinisation des nerfs malades.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme : - démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - sélectionner les produits efficaces pour de futurs essais cliniques. - créer une banque de tissu. - publication des résultats. Avantages à long terme : - Administration chez l’homme d’un traitement stable (>10 ans d’après la durée d’efficacité des vecteurs viraux selon les études précédentes) et non toxique. L’injection locale envisagée n’abîme pas le nerf et évite une dissémination des vecteurs dans tout l’organisme. - diminution des symptômes existants - arrêt de l’évolution et possible réversion de la maladie. Premiers essais cliniques chez l'homme entre 2027 et 2029 et l'approbation pour une mise sur le marché entre 2029 et 2032.
Procédures
- Quatre types de chirurgies o La première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent et consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques ou le nerf trijumeau. Elle durera 15-30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisé. o La deuxième chirurgie de compression unilatérale du nerf trijumeau sera effectuée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris et 184 rats au maximum. Elle durera 10 à 15 minutes. o La troisième chirurgie de constriction unilatérale du nerf facial sera effectuée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 1504 souris et 184 rats au maximum. Elle durera 10 à 15 minutes. o La quatrième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 20 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
Nuisances :Chirurgies d’après les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours) traitées par des analgésiques puissants - Maladies : douleurs neuropathiques, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines) qui ne sera mise en évidence que dans les tests comportementaux-Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour). Nuisances associées au diabète: obésité et hyperglycémie (6 à 10 semaines, évolution progressive).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons leurs nerfs pour étudier l’effet du traitement sur leur pathologie.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude, qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent, rend difficile la modélisation in silico et la reproduction complète du système in vitro. Il existe des méthodes pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il a été montré que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
En nous basant sur la littérature et nos données internes, nous avons réalisé des tests statistiques afin de déterminer le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental et limiter ainsi le nombre d’animaux aux stricts besoins des procédures en place. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Afin de réduire le nombre d’animaux, ils proviendront de fournisseurs ou si possible générés par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
- Les rongeurs auront une période d'acclimatation d'une semaine lors de laquelle une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée tous les jours durant une minute par les expérimentateurs en vue de diminuer le stress. - Les conditions d'hébergement des rats et souris respecteront les bonnes pratiques en matière d'hébergement (matériel de nidification, copeaux, frisottis et cello dome). Pour les femelles gestantes isolées : ajout de matériel de nidification à leur arrivée, une séparation (portée non entière) avec les nouveau-nés limitée au strict minimum. - De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons des souris diabétiques. - La méthode d'injection locale des vecteurs viraux est un raffinement par rapport à l'injection systémique (diminution de leur dissémination et des effets secondaires). - Observations quotidiennes des animaux par du personnel formé et compétent. - Fiche individuelle de suivi de pré- per et post-chirurgie - Evaluation post opératoire de l'état clinique des animaux (un scoring corrélé à l'intensité de la souffrance), à l'aide de plusieurs fiches adaptées aux besoins spécifiques des lignées, aux nouveau-nés et au suivi post-opératoire. Selon les scores des animaux, il y aura une discussion avec le vétérinaire et/ou la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) pour décider des soins à apporter. Si le score cumulé atteint 10, ou si un paramètre scoré à 5 est observé, une euthanasie de l'animal sera faite immédiatement. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple en cas de déshydratation : apport d'eau gélifiée ou injections sous-cutanées d'une solution isotonique d'électrolytes. o En cas de perte de poids ou d'état affaibli : nourriture humide et d'eau gélifiée sur le sol de la cage - Sédation préalable des souris et des rats avant leur euthanasie.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de rongeurs, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements soit au début de l’apparition des symptômes pour prévenir la démyélinisation pathologique ou la dégénération axonale (stade précoce), soit une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin bloquer la progression de la maladie ou de favoriser la régénération. Rat/souris : mâle et femelle juvéniles et adultes Nouveau-nés : J1 à J4 pour les souris, J6 à J7 pour les rats Femelles gestantes pour fournir les nouveau-nés: elles arrivent pendant le dernier tiers de gestation et sont gardées jusqu’au sevrage de leur portée.
Caractérisation du rôle des évènements de signalisation impliquant Rap1 dans les ostéoclastes et sur le développement de l’os chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une biopsie d'oreille au sevrage, puis pour une partie des femelles l'ablation des ovaires sous anesthésie : 2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 000 d'entre elles et modéré pour 1 200. Les femelles opérées à six semaines sont tuées six semaines plus tard, après un prélèvement de sang réalisé sous anesthésie, sans réveil. Le projet cherche des cibles pharmacologiques contre l'ostéoporose en invalidant des protéines des ostéoclastes, les cellules qui dégradent l'os. Le porteur écrit qu'aucun ou peu d'effets indésirables sont attendus, tout en décrivant une douleur modérée de deux à trois jours après l'ablation des ovaires, un risque d'hypothermie, de déshydratation et d'infection de la cicatrice.
Objectifs
Les os subissent un remodelage constant tout au long de notre vie. Ce remodelage est un processus complexe qui implique l’action coordonnée de deux types de cellules : les ostéoblastes qui fabriquent la matrice osseuse, et les ostéoclastes qui dégradent l’os. Avec l’âge et dans certaines maladies inflammatoires, l’activité des ostéoclastes domine et l’os devient plus fragile. C’est le cas de l'ostéoporose qui affecte des centaines de milliers de personnes en France. Les traitements actuels affectent la viabilité des ostéoclastes, ce qui a malheureusement des effets néfastes sur les ostéoblastes et donc la formation de l’os. Dans ce contexte, il est impératif de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la perte osseuse et d'identifier des facteurs spécifiques aux ostéoclastes, qui pourraient représenter de nouvelles cibles pharmacologiques pour traiter l’ostéoporose. Nous utilisons des souris avec des mutations pour étudier in vivo les conséquences de l’invalidation des protéines candidates sur la formation des ostéoclastes et le développement des os en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie qui mime la ménopause par la chute des oestrogènes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) caractériser le rôle de protéines candidates susceptibles de réguler la formation des ostéoclastes et leur activité de dégradation de l'os ; (ii) mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement de l'os ; (iii) valider le nouveau concept consistant à cibler la formation et/ou la fonction des ostéoclastes tout en préservant leur viabilité et, par conséquent, la formation osseuse par les ostéoblastes, plutôt que l'induction de la mort des ostéoclastes par les traitemenst actuels ; (iv) identifier de nouveaux points d'intervention thérapeutique.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles sont limités uniquement à une biopsie pratiquée sur l'oreille (moins de 2 minutes) au moment du sevrage, afin de déterminer le génotype des animaux. Nous prélevons un échantillon de sang (moins de 5 minutes) sous anesthésie générale juste avant la mise à mort des animaux sans phase de réveil. La souris ovariectomisée reste le modèle de référence pour l'ostéoporose post-ménopausique induite par la chute des estrogènes. Nous procédons à l'ablation des ovaires par chirurgie (moins de 20 minutes) sur des souris femelles âgées de 6 semaines. Les animaux contrôles sont également opérés mais sans ablation des ovaires. Le phénotype osseux est examiné 6 semaines après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Le prélèvement d'une biopsie et la pose d'une bague à l'oreille sont susceptibles de générer une douleur d'intensité légère qui peut durer au maximum 1 à 2 heures. Acun voire peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux. Parfois de légères altérations de l'aspect de l'oreille peuvent être observés avec les signes d'une inflammation locale et transitoire. Le prélèvement de sang, bien que réalisé sous anesthésie générale des animaux qui sont ensuite mis à mort sans phase de réveil, peut toutefois s'accompagner d'une douleur d'intensité légère. La profondeur de l'anesthésie et de l'analgésie est vérifiée régulièrement par l'absence complète de réflexes en réponse au pincement de la patte. La chirurgie nécessaire à l'ovariectomie sont susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Ces nuisances d'intensité modérée peuvent s'étendre jusqu'à 2-3 jours après la chirurgie. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie en phases pré- et post-operatoires. Les souris présentent alors un risque d’hypothermie et de déshydratation, c’est pour cela qu’elles sont maintenues sur tapis chauffant pendant toute la durée de la chirurgie et qu’elles recoivent de la solution saline tiède toutes les heures. Après la chirurgie, un risque d'infection au niveau de la cicatrise étant possible, les animaux sont suivis quotidiennement jusqu’à la cicatrisation de la plaie selon la grille de scoring.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure visant à analyser le phénotype osseux en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie.
Remplacement
Notre projet vise à caractériser les processus moléculaires qui orchestrent la formation des ostéoclastes et le développement des os en condition normale et aussi dans le contexte d’une perte osseuse induite par une ovariectomie. Notre étude nécessite l'interaction de divers organes et systèmes biologiques que l'on retrouve uniquement chez les animaux vivants et qui ne sont pas reproductibles in vitro.
Réduction
Chaque protocole a été basé sur un examen attentif des possibilités réductrices et une étude approfondie de la littérature. Notre équipe possède un grand savoir-faire en expérimentation animale, ce qui garantira que le nombre d'animaux utilisés dans les études sera maintenu au minimum, tout en préservant la puissance statistique pour garantir des conclusions interprétables. En fonction des résultats obtenus à certaines étapes clés du projet, nous poursuivons ou arrêtons certaines expériences pour ne réaliser sur les animaux vivants que les expériences indispensables.
Raffinement
Tous les animaux reçoivennt les soins vétérinaires nécessaires et appropriés pour minimiser leur inconfort. Ils sont manipulés avec ménagement et calme, et par du personnel compétent, pour réduire leur stress. Ils ne sont jamais isolés dans une cage au cours de la procédure et bénéficiront d’un environnement enrichi (tuyau, cubes de bois). La chirurgie nécessaire à l'ovariectomie est susceptible de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Cette étape est réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie en phases pré- et post-opératoires. Les animaux sont suivis quotidiennement après l’opération. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux sont pris en compte à chaque observation grâce à une grille de scoring détaillée. Les animaux observés en détresse ou présentant des signes de souffrance sont immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle de choix pour réaliser notre étude en raison de : (i) la facilité à mettre en oeuvre la manipulation génétique ; (ii) la littérature abondante concernant des études similaires pour éviter des expérimentations inutiles ; (iii) l'excellente caractérisation des fonds génétiques ; (iv) le fort degré de convergence des paramètres osseux chez l'homme et chez la souris ; et (v) la bonne caractérisation du modèle d’ostéoporose induite par une ovariectomie. Nous utilisons les souris à 12 semaines d'âge pour évaluer le phénotype osseux au stade adulte. La croissance et la maturation relativement rapides des souris se poursuivant jusqu'à environ 10-12 semaines d'âge, cela nous permet d'analyser les défauts osseux accumulés au cours du développement et de s'affranchir d'éventuelles manifestations d'effets liés à l'âge. Les conséquences de l'ovariectomie sur l'activité des ostéoclastes se manifestent par une dégradation osseuse qui est visible dans un délai de 5-6 semaines. Ainsi, la chirurgie pour l'ablation des ovaires est réalisée à 6 semaines d'âge et le phénotype osseux est analysé 6 semaines plus tard, c'est à dire à 12 semaines d'âge également.
Propriété anti-cancéreuse de produits de thérapie cellulaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à neuf injections par animal pour 390 d'entre elles : 980 souris au système immunitaire affaibli vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prélevées sur des patients atteints de cancer du poumon, du foie, des reins, du côlon ou du pancréas, puis des produits de thérapie cellulaire dont l'effet antitumoral est mesuré. Le porteur attend une perte de poids, des troubles de la mobilité et des troubles du comportement liés à la croissance de la tumeur. Il retient des souris immunodéficientes pour éviter le rejet des cellules humaines, en présentant cette absence de rejet comme épargnant aux souris un choc cytokinique.
Objectifs
La chimiothérapie, la radiothérapie, les anticorps et depuis peu les thérapies cellulaires font partie de l'arsenal thérapeutique actuel pour traiter le cancer. Les thérapies cellulaires sont composées de cellules humaines capables de cibler puis détruire les cellules cancéreuses. Il est possible d'améliorer leur effet en les associant avec des anticorps. L’objectif de ce projet est d'évaluer l'effet anti-cancéreux de ces produits. Des cellules cancéreuses collectées chez des patients atteints de cancer du poumon, du foie, des reins, du colon ou du pancréas seront greffées chez la souris. La capacité des produits à cibler et détruire ces cellules ainsi que leur non toxicité seront évalués.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont scientifiques et humains. Premièrement, les résultats obtenus seront diffusés à la communauté scientifique. Par conséquent, ils permettront d'améliorer les connaissances scientifiques dans le domaine des thérapies cellulaires. Si les résultats sont positifs et que nos produits sont efficaces comme attendu, ces données permettront de poursuivre leurs développements afin de pouvoir, dans le futur, proposer de nouveaux traitements efficaces et non toxiques aux patients atteints de cancer.
Procédures
135 animaux seront soumis à 1 injection (la durée de l'injection est d'1 minute). 455 animaux seront soumis à 2 injections (la durée de chaque injection est d'1 minute). 390 animaux seront soumis à 9 injections (la durée de chaque injection est d'1 minute). Pas de chirurgie ou de prélèvements, seulement des prélèvements post-mortem (après anesthésie puis euthanasie).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés au stress lors des injections ainsi que de potentielles douleurs ressenties au site d’injection. Les animaux greffés avec des cellules humaines cancéreuses seront également sujets à des effets pouvant être induits par la croissance de la tumeur. Ces effets sont connus allant de la perte de poids jusqu’à des problèmes de mobilité ou encore des problèmes comportementaux. Dans tous les cas, les animaux seront étroitement suivis et examinés tout au long des expériences selon notre fiche de suivi clinique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure (toutes les procédures) afin de réaliser les analyses et les prélèvements d'organes.
Remplacement
L’alternative non animale, pour étudier les nouveaux traitements contre le cancer, consiste à les tester sur des cellules en culture. Cependant, cette méthode reste artificielle et loin des effets pouvant être observés chez un animal. En effet, par cette méthode, les produits anti-cancer sont mis en présence de cellules cancéreuses sans autres paramètres extérieurs (pas d’autres cellules, pas de barrières à traverser, pas d’organes et tissus dans lesquels migrer …). Il est donc reconnu et validé par la communauté scientifique, que même si l’utilisation d’animaux doit être réduite et si possible évitée, celle-ci reste une étape obligatoire dans le développement des produits contre le cancer. Les modèles de cancer chez la souris sont donc les seuls aujourd’hui permettant d’évaluer l’efficacité de ces nouveaux traitements.
Réduction
Ce projet, d’une durée maximale de 5 ans, impliquera l’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli (nombre total maximal d’animaux = 980). Ce nombre d’animaux est le nombre maximal que nous envisageons d’utiliser. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons décidé de commencer par des études préliminaires avec le plus faible nombre d’animaux possible. Ces études permettront non seulement de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour les études suivantes mais également, de s’assurer des conditions expérimentales optimales pour les réaliser.
Raffinement
A réception des animaux, une première phase d’acclimatation et d’habituation à la manipulation (1 semaine), permettra d’atténuer tout stress lié au transport et de s’assurer du retour à l’état normal de l’animal. Cette période servira également pour habituer les animaux à la méthode de distribution des aliments et de l’eau et à leur nouvel environnement. Le fait d’habituer les souris à être manipulées permettra également de réduire les répercussions nuisibles de la manipulation. L’observation des animaux et de leur environnement se fera quotidiennement (pendant la période d’acclimatation et pendant les différentes études) afin d’évaluer leur santé et leur comportement. Un score clinique complet sera calculé pour déterminer la conduite à tenir. Toute souris présentant un score cumulé supérieur à 6 ou une perte de poids supérieure à 20% sera mise à mort. Pour toute souris présentant des blessures ou dont le score cumulé est supérieur à 3, elle sera isolée et nous procèderons à un enrichissement de la cage.
Choix des espèces
Pour tester l'effet d'un nouveau traitement contre le cancer, la greffe de cellules cancéreuses chez la souris est l'expérimentation standard et la plus pertinente. L’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli garantira l’absence de rejet des cellules cancéreuses humaines greffées et l’absence de souffrances associées pour les souris (choc cytokinique, inflammation au site d’injection, …). Souris adultes (6 - 7 semaines à la réception pour une entrée dans l’étude à 7 - 8 semaines) – âge standard pour 1- greffer des cellules cancéreuses et 2- évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anti-cancer
Etude des effets du récépteur aux oestrogènes ERa membranaire dans les effets métaboliques et prolifératifs des oestrogènes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Une souris qui montre des signes comportementaux de douleur importante est mise à mort. 672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 576 d'entre elles et léger pour 96. L'ablation des ovaires ou des testicules puis la pose d'un implant hormonal sous la peau concernent 576 souris, et 480 subissent sept prélèvements de sang à la queue à quinze minutes d'intervalle, à deux reprises. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement" pour étudier l'action d'un récepteur aux œstrogènes sur le métabolisme et la prolifération cellulaire.
Objectifs
Les œstrogènes, et principalement le 17β-estradiol (E2), jouent un rôle crucial dans la physiologie de la reproduction. Leur administration après la ménopause confère aussi des bénéfices fonctionnels (symptômes du climatère), osseuse, cardiovasculaire et métabolique. Cependant, les effets des œstrogènes sur d’autres tissus (foie, sein) s’avèrent néfastes et une optimisation du Traitement Hormonal de la ménopause (HT) reste un enjeu majeur pour la santé de la femme. Le récepteur aux œstrogènes alpha (ERa), le principal récepteur des œstrogènes chez les mammifères, a des actions nucléaires et membranaires mais le rôle des actions membranaires restent inconnu dans la protection métabolique et les effets prolifératifs des oestrogènes. Ce projet a donc pour objectifs : 1) d'analyser les effets métaboliques des effets membrnaires de ERa ; 2) étudier le rôle des effets membranaires de ERa dans la prolifération utérine et mammaire. De plus, sachant qu'il existe deux mutants des effets membranaires de ERa présentant des phénotypes différents selon la dose d'oestrogènes utilisés, il est nécessaire de comparer ces deux mutants, ainsi que de tester différentes dose d'oestrogènes représentant les différentes doses physiologiques retrouvées au cours du cycle oestral.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer le rôle des effets membranaires de ERa dans la prolifération et la protection métabolique oestrogeno-dépendante, ce qui pourrait avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause. En effet, cette signalisation oestrogénique représente un levier thérapeutique relevant pour limiter, prévenir et/ou traiter les dysfonctions métaboliques ainsi que le développement de certains cancers hormono-dépendants chez les femmes menopausées. Ainsi le bénéfice attendu de ce projet est d'améliorer le rapport bénéfice/risque du Traitement Hormonal de la ménopause.
Procédures
Certains animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée: - Chirurgie de classe modérée : ovariectomie (incision de la peau et du péritoine) (10 à 20min) = 576 animaux -Chirurgie de classe modérée : pose de pellet hormonal en sous cutanée (incision de la peau) (5 à 10min) = 576 animaux - Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale (test de tolérance au glucose et à l'insuline réalisé à une semaine d'intervalle ): 7 gouttes de sang seront prélevées par procédure à 15 min d'intervalle = 480 animaux
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides) ou de classe légère et modérée (jeûne, ovariectomie, orchidectomie, pose de pellet). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Le régime riche en lipides peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements. - Les prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère. - La mise à jeun de 6h peut entrainer du stress. - L’ovariectomie, l’orchidectomie et la pose de pellet ont pour effet attendu une douleur modérée liée aux effets de la chirurgie soulagée par des analgésiques et un stress modéré lié aux manipulations. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué : si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un morphinique sera administré à visée antalgique. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera mise à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes et réaliser des analyses moléculaires.
Remplacement
Les effets multiples des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques des oestrogènes. Alors qu'une approche in vitro est utilisée pour définir les mécanismes moléculaires de ces signalisations, l'étude des effets physio(patho)logiques des oestrogènes ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles pour l'étude des traitements oestrogéniques car cette partie du projet rentre dans le cadre de la mise au point d’un traitement de la ménopause et s’applique donc uniquement au sexe féminin. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs e. Les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton, sizzlenest, battons et balle de boie) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel a été générée l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.