Rongeurs

Cinq injections quotidiennes pour déclencher des polypes intestinaux, puis pour d'autres lots une greffe de polype sous la peau ou une injection de cellules tumorales dans le rectum irrité ou le cæcum : 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce des mises à mort avant l'apparition de gros polypes susceptibles d'altérer la santé, tout en reconnaissant que ces polypes peuvent provoquer un mal-être plus tôt que prévu. Il affirme par ailleurs que ces deux lignées transgéniques ne développeront jamais de cancer, alors que le projet vise à repérer les polypes capables de se transformer en cancer et de métastaser au foie. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever les tumeurs intestinales, et immédiatement si un point limite est atteint.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser de façon très approfondie l'hétérogénéité des polypes (tumeur benigne) intestinaux pré-cancéreux afin d'identifier des marqueurs de prédiction de leur progression ou non en cancer. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris qui développent spontanément des polypes dans l'intestin. Ces modèles sont très pertinents pour la bonne réalisation de notre projet grâce ils représentent très bien ce qu'il se passe chez l'homme. Dans un premier temps, nous caractériserons les différences entre les polypes selon leur localisation et leur taille. Certains polypes seront utilisés pour l'étude de l'expression de gènes, d'autres seront utilisés pour la caractérisation de la présence de vaisseaux sanguins et lymphatiques, de fibroblastes et de cellules immunitaires. Dans un deuxième temps, nous identifierons le profil de facteurs protéiques produits localement par ces polypes ainsi que ceux libérés dans la circulation sanguine. Puis, nous avons pour objectif d'identifier quels sont les polypes qui ont la capacité à se transformer en cancer et à migrer dans d'autres organes vitaux tels que le foie, site préférentiel de métastases dans le cancer du côlon.

Bénéfices attendus

Grâce à la caractérisation approfondie de l’hétérogénéité des polypes intestinaux avec l’identification de signatures géniques, l’infiltration inflammatoire et de facteurs protéiques solubles locaux mais aussi dans la circulation, nous espérons identifier un ou des marqueurs sanguins spécifiques qui permettront de distinguer les polypes qui ont ou non le potentiel de se transformer en cancer. Ce projet est très pertinent en cancérologie puisqu’à l’heure actuelle, il n’y a pas de marqueurs sanguins spécifiques qui permettent de différencier les polypes à faible risque de ceux à haut risque de progresser en cancer du côlon. Si nous arrivons à mettre en évidence un ou des marqueurs sanguins qui permettent de savoir si le patient est en train de développer un adénome qui a le potentiel de se transformer en cancer, cela permettra d’éviter des coloscopies de dépistage inutiles et sûrement une compliance plus importante grâce à ce test de dépistage sanguin, pas seulement par rapport à la coloscopie mais aussi par rapport au dépistage Hemocult. D’après la littérature et les cliniciens, il y a un réel besoin de trouver une méthode alternative de dépistage précoce qui sera rapide, non invasive, peu couteuse et qui pourra être utilisée sur une plus grande population, pour dépister un adénome douteux même chez des patients asymptomatiques.

Procédures

Les animaux trangéniques (nous utilisons 2 modèles différents, 330 animaux au total) vont recevoir des injections d'une molécule à des doses non toxiques afin d'induire le développement de polypes spécifiquement dans l'intestin (durée de l'injection par animal : 10 sec). Les animaux recevront 5 injections au total, 1 par jour pendant les 5 premiers jours. Afin de déterminer le potentiel des polypes à se transformer en cancer et à former des métastases, les souris contrôles vont être soumis à des procédures chirurgicales de quatre types différents : Injection sous la peau de cellules issues de polypes (50 souris, chirurgie de 10-15min), greffe sous la peau d'un polype entier (50 souris, chirurgie de 10-15min), injection de cellules issues de polypes dans le rectum" irrité" (100 souris, chirurgie de 10-15min) et finalement injection de cellules de polypes dans le cecum (100 souris, chirurgie de 10-15min) (25-30min).

Impact sur les animaux

Le développement de polypes dans l'intestin sera induit chez les souris transgéniques qui seront euthanasiées avant que les souris ne commencent à développer de gros polypes qui peuvent vraiment altérer la santé de l'animal. Mais la présence de ces polypes dans l'intestin peuvent induire chez certains animaux un mal être plus tôt que prévu. La molécule aux doses utilisées n'est pas toxique pour les animaux mais son injection va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les injections de cellules de polypes en sous-cutanée va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les autres nuisances proviendront des actes chirurgicaux : des douleurs pré et post-chirurgicales. Si les cellules de polypes poussent et se transforme en masse ou tumeur, cela peut induire de la douleur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour effectuer les prélèvements nécessaires au projet tels que les tumeurs intestinales. Si un des points limites est observé avant le temps suggéré pour chaque procédure, l'animal sera immédiatement euthanasié. Une grille de scoring pour chaque procédure sera mise en place.

Remplacement

L'utilisation des modèles murins de tumorigenèse intestinale précoce tels que les modèles décrits dans ce projet, est le seul moyen pour répondre au mieux aux questions posées dans ce projet. Il n'existe pas aujourd'hui de modèle in vitro pouvant récapituler l'hétérogénéité et la complexité des adénomes.

Réduction

Le nombre de souris que nous devons inclure dans nos expériences a été calculé rigoureusement pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée. Pour le projet, nous avons besoin de prélever plusieurs adénomes sur la même souris, des adénomes de tailles différentes et surtout à des localisations différentes dans l'intestin dans les 2 modèles animaux transgéniques. Parfois certaines souris développent moins d'adénomes que d'autres ou sont localisées à un certain endroit de l'intestin et moins dans les autres. Pour l'étude de la progression tumorale, nous avons des mises au point à faire pour déterminer quel modèle sera le plus adapté pour étudier la progression tumorale (injection de cellules ou greffe d'adénome en sous-cutanée) et métastatique (caecale ou rectale). Cependant, si nous voyons qu'une procédure fonctionne et est appropriée pour répondre à notre question pour le projet, nous arrêterons les autres procédures et n'utiliserons pas toutes les souris demandées. De plus, pour ce projet, nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.

Raffinement

En plus des bonnes conditions d'hebergement, nous éviterons les animaux isolés et si un mâle doit être isolé, une femelle de compagnie agée sera rajoutée dans la cage. Une grille de scoring avec des points limites adaptés à chaque procédure sera utilisée pour éviter des douleurs inutiles aux animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques (locaux et sous-cutané) en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

Notre projet utilisera deux modèles de souris transgéniques car il sont les plus pertinents pour répondre à nos questions. Dans ces 2 modèles de souris, les animaux vont développer des polypes spécifiquement dans l'intestin et ne développeront jamais en cancer. C'est pour cela que nous avons choisi ces 2 modèles qui sont très proches de ce qu'il se passe chez l'homme pour essayer de déterminer un ou des marqueurs de prognostique de risque à développer un cancer. Les animaux recevront la molécule pour induire les polypes à 8 semaines (quand l'intestin est mature) et seront ensuite utilisées pour le projet 5 mois après l'administration du produit. Concernant les chirurgies, les souris contrôles seront utilisées entre 6 et 8 semaines.

260 souris vont être utilisées, chacune passant onze échographies cardiaques sous anesthésie entre deux et sept mois, et 120 d'entre elles recevant en plus 75 gavages, un tous les deux jours pendant cinq mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à sept mois, le cœur prélevé lors d'une chirurgie terminale. La lignée utilisée développe à partir de quatre mois une cardiomyopathie dilatée qui évolue en insuffisance cardiaque, avec une cyphose, environ 20 % de perte de poids et une espérance de vie réduite. Le porteur écrit que la complémentation alimentaire testée "ne provoque aucune nuisance" et devrait plutôt être bénéfique, sur des animaux dont la maladie est justement ce qui les rend utiles.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre la contribution d’une voie de signalisation moléculaire à la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée (CMD) et d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques. La CMD se caractérise par une dilatation du ventricule gauche, une réduction de la fonction systolique possiblement associée des arythmies. Malgré l'efficacité des traitements classiques de l'insuffisance cardiaque, la CMD présente un taux élevé d'hospitalisations qui impose une charge financière aux systèmes de santé, liée à l’implantation de stimulateurs cardiaques et/ou des procédures de transplantation. Il est donc nécessaire de poursuivre l’étude des mécanismes physiopathologiques pour identifier des cibles thérapeutiques actionnables afin d’arrêter ou inverser le cours de cette maladie cardiaque. Plusieurs études ont montrées que la modulation la voie de signalisation moléculaire étudiée à l’aide de petites molécules présentent un intérêt croissant pour le traitement de la CMD. Si un nombre important de ces études expliquent les effets bénéfiques par l’activation de voies cellulaires connues, peu d'entre elles ont exploré l'impact de cette voie de signalisation dans la CMD. Des recherches complémentaires sont nécessaires pour comprendre dans quelle mesure cette voie de signalisation moléculaire étudiée joue joue un rôle dans le développement de la CMD. Nous proposons d’identifier l’ensemble des protéines impliquées dans cette voie de signalisation dans le cœur d’un model murin de CDM, d’identifier les protéines d’intérêt et d’étudier le rôle de ces protéines dans la CDM. Pour y parvenir, nous administrerons des molécules régulatrices de cette voie de signalisation par gavage ou injection intraveineuse. La fonction cardiaque des animaux sera évaluée en échographie. Apres traitement nous procèderons à l’analyse protéomique, biochimique et moléculaire des cœurs extrait des animaux traités.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette étude est de mettre en évidence un nouveau mécanisme de signalisation moléculaire impliqué dans le développement de la cardiomyopathie dilatée. L’identification de ce nouveau mécanisme ouvrira la voix à de nouvelles perspectives thérapeutiques qui seront étudiées à la suite de ce projet. La cardiomyopathie dilatée à une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la CMD proviennent d’insuffisance cardiaque (70 pourcent) et d’arythmies (30 pourcent). Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est donc d’un intérêt majeur en matière de politique de santé publique.

Procédures

Evaluation de la fonction cardiaque en échographie. 260 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tout les quinze jours sur animal anesthésié. Soit 11 échographies par animal. Chaque échographie dure environ 5 minutes. Traitement par gavage. 120 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tous les deux jours sur animal vigil. Soit 75 gavages par animal. Chaque gavage dure environ 30 secondes. Injection intra péritonéales. 164 animaux à l’âge de 7 mois sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Injection intraveineuse. 160 animaux, une fois à l’âge de 3-5 jours sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie: 164 animaux à l’âge de 7 mois. Soit une fois par animal. Une chirugie dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable qui débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois. Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Le régime alimentaire des animaux sera complémenté par un composé impliqué dans la voie de signalisation moléculaire d’intérêt. Cette complémentation ne provoque aucune nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux à long terme et devrait plutôt avoir un effet bénéfique. Toutefois, la méthode de délivrance par gavage peut générer un stress et une légère irritation au niveau de l’œsophage. Les injections nécessaires à ce projet peuvent générées un stress et une légère douleur lors de l’injection intraveineuse et en post injection pendant quelques jours.

Devenir

L'ensemble des animaux (260) sera euthanasié pour prélèvements d'organes. Le prélèvement des organes et notamment le cœur est indispensable pour effectuer les analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique abordée dans ce projet.

Remplacement

Les cardiomyocytes adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Les cardiomyocytes adultes se conservent en culture primaire que quelques jours et ne peuvent pas être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). Bien qu’il existe des lignées cellulaires derivée de cellules souches, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. La lignée mutée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux sauvages seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Le fait d'injecter les virus chez des souriceaux entre 3 et 5 jours de vie nous permettra d'exploiter toutes les naissances, quel que soit le jour de la semaine où elles surviennent du fait des accouplements continus (pas d'injection le week-end) et ne pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental. Au total nous utiliserons 260 animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteur) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Les points limites seront évalués régulièrement. Si un animal dépasse ces points limites, il sera euthanasié. Afin de prévenir au maximum l’irritation liée au gavage, nous utilisons des sondes de gavage en plastique souple dont la longueur et le diamètre sont adaptés à la morphologie de l’animale. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous privilégierons les injecterons par voie systémique afin d’éviter une chirurgie cardiaque lourde. Dans le but de limiter au maximum le nombre de manipulations réalisées sur les souriceaux, leur stress ainsi que celui de leur mère pour favoriser leur survie, nous identifierons par tatouage les souriceaux injectés. Pendant tout le temps que durera l'injection d'une portée, les souriceaux seront séparés de leur mère et gardés ensemble dans un peu de litière provenant de leur cage, puis ils seront rendus ensemble à leur mère en les déposant hors du nid. Nous vérifierons qu'ils sont bien repris en charge par la mère et ramenés au nid. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives. Un protocole d’anesthésie/analgésie est mis en place pour tous les animaux impliqués dans la procédure de chirurgie sans réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant la mutation d'intérêt responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. Cette mutation est aussi présente dans notre modèle cellulaire de cardiomyocyte dérivés de cellules souches, ce qui rend comparable les résultats obtenus dans les deux modèles d’études. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des souris à différents stade de la progression de la pathologie étudiée (3, 5, et 7 mois) afin d’avoir une analyse complète du phénomène. De plus nous utiliserons des souriceaux pour l’injection de molécules d’intérêts. Cela présente l’avantage de diffuser ces molécules à l’ensemble des organes de l’animal, de limiter la réponse immunitaire et d’éviter un acte chirurgical lourd dans le cas de l’utilisation d’animaux plus âgés.

Deux chirurgies cérébrales à cinq jours d'intervalle, la première pour déclencher une épilepsie, la seconde pour reprogrammer les cellules gliales en neurones : sur 561 souris, 516 passent sur la table stéréotaxique et 378 y reviennent une seconde fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées entre trois jours et huit semaines après l'opération pour le prélèvement du cerveau. Les 327 souris transgéniques reçoivent en plus deux injections par jour pendant deux semaines pour déclencher l'expression de leur transgène, après une biopsie de la queue au sevrage. Le porteur écrit que l'état de mal épileptique qui suit la chirurgie "n'est pas douloureux", que les crises ultérieures ne le sont pas davantage et que les troubles de mémoire et l'anxiété observés n'induisent pas de douleur, tout en déclarant l'ensemble du projet en souffrance modérée.

Objectifs

Le cerveau adulte est incapable de se régénérer, ce qui veut dire que les neurones détruits lors d’une pathologie sont définitivement perdus et les symptômes associés permanents. Dans de nombreuses pathologies, la mort des neurones est associée à la multiplication de cellules non neuronales, les cellules gliales ou glies, qui vont changer d’état et devenir réactives. Récemment, la reprogrammation cellulaire, qui consiste à transformer les cellules gliales en nouveaux neurones, a émergé comme une nouvelle stratégie thérapeutique afin de remplacer les neurones perdus et restaurer les fonctions cognitives. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont déjà démontré qu’il était possible de reprogrammer différentes catégories de cellules gliales en nouveaux neurones en exprimant dans les glies des facteurs de reprogrammation. Plus spécifiquement, nous avons récemment démontré dans un modèle d’épilepsie chez la souris que les cellules gliales qui se multiplient dans les premiers temps de la pathologie peuvent être reprogrammées en nouveaux neurones, dits induits, capables de réduire de moitié les crises d’épilepsie. Ces résultats démontrent pour la première fois l’intérêt de la reprogrammation cellulaire pour le traitement des épilepsies. Cependant, il reste encore beaucoup de choses à comprendre sur les mécanismes impliqués dans la reprogrammation des glies en neurones. En particulier, le type de cellules gliales qui est reprogrammé avec succès reste à ce jour inconnu. Par ailleurs, il est important de comprendre si la multiplication et la réactivation de ces cellules gliales impacte leur capacité à être reprogrammées en neurones. Enfin, il est essentiel d’étudier les changements de l’expression des gènes des cellules gliales permettant l’expression progressive des gènes neuronaux durant la reprogrammation. Notamment le rôle spécifique d’acteurs épigénétiques, c'est-à-dire d’acteurs capables de contrôler l’expression des gènes, dans ce processus reste à être élucidé. Utilisant un modèle murin d’épilepsie, les objectifs du présent projet sont : 1) Déterminer quel type de cellules gliales peut être reprogrammé durant la phase de développement de l’épilepsie. 2) Comprendre comment les gènes des cellules gliales de départ et leur modification impacte la reprogrammation des glies en neurones. Ceci permettra d’identifier ce qui rend certaines glies reprogrammables. 3) Évaluer le rôle spécifique de deux acteurs épigénétiques dans la reprogrammation glie-neurone.

Bénéfices attendus

Le cerveau adulte étant incapable de se régénérer, le développement de stratégies thérapeutiques visant à remplacer les neurones perdus en cas de traumatisme ou de maladie cérébrale pourrait avoir à terme un fort impact dans le domaine de la santé. Nous avons précédemment démontré que la reprogrammation cellulaire, qui consiste à convertir les cellules gliales résidant au site de la lésion en neurones induits fonctionnels, permettait de réduire les crises dans un modèle murin d’épilepsie réfractaire aux médicaments. Ces résultats sont très encourageants et représentent une première preuve de concept de l’utilisation de la reprogrammation pour le traitement des épilepsies. Cependant, de nombreuses limites doivent être surmontées avant de pouvoir envisager une thérapie en clinique (ex: identification du type de glies reprogrammées, impact de la prolifération, rôle des facteurs épigénétiques). En nous permettant de comprendre les mécanismes impliqués dans la reprogrammation cellulaire des glies réactives proliférantes, ce projet donnera des pistes essentielles pour dépasser ces limites et envisager des thérapies cellulaires futures pour le traitement des épilepsies pharmacorésistantes. Par ailleurs, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la reprogrammation cellulaire ouvrira la porte vers la généralisation de cette stratégie à d’autres pathologies où la prolifération gliale est limitée.

Procédures

Une partie du projet implique des animaux transgéniques (327 souris) pour lesquels il est nécessaire de déterminer le génotype. Une petite biopsie de queue est réalisée au sevrage afin de mesurer la présence des transgènes par PCR. Elle sera réalisée en moins d’1 min et sous anesthésie locale pour éviter toute douleur. Plusieurs injections d’un produit (2X/jour pendant 2 semaines) sont ensuite nécessaires pour déclencher l’expression du transgène chez ces animaux. Chaque injection est réalisée rapidement (

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une à deux chirurgies stéréotaxiques sous anesthésie générale complétée d’une analgésie locale. Il est nécessaire d’immobiliser l’animal en le prenant par la peau du dos pour injecter les produits anesthésiques et analgésiques. Cette immobilisation entraîne un léger inconfort et du stress pendant quelques secondes. La piqûre d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère très brève. Le traitement de la douleur post-opératoire s’effectue par plusieurs injections d’analgésiques. La piqûre d’aiguille pour l’injection induit une douleur légère très brève. Dans les heures suivant la chirurgie visant à générer le modèle murin d’épilepsie, les animaux sont en « état de mal épileptique » non convulsif, c’est-à-dire que des décharges de pointes sont enregistrées sur un EEG dans leur cerveau. Celui-ci est associé à un arrêt du comportement naturel et à la présence de stéréotypies. Cet état de mal n’est pas douloureux mais les animaux vont moins s’alimenter durant cette période, pouvant entraînant une perte de poids transitoire (48h). Une fois cette période passée, le comportement des animaux est normal malgré la survenue de crises d’épilepsie focales non convulsives dans l’hippocampe. Celles-ci sont non douloureuses mais s’accompagnent de l’arrêt de l’activité de l’animal. Par ailleurs, les animaux épileptiques présentent quelques légers troubles de mémoire et une faible élévation de l’anxiété. Ces légers troubles n’impactent pas le comportement général de l’animal, ni sa capacité à se déplacer et se nourrir. Ils n’induisent pas non plus de douleur. Le génotypage des souris transgéniques sera effectué par biopsie d’un petit morceau de queue sur animal vigile sous analgésie locale. Ceci nécessite l’immobilisation des animaux qui peut entraîner inconfort et stress. Ces animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’un produit permettant de déclencher l’expression du transgène (2X/j pendant 10j). La piqûre d’aiguille pour l’injection induit une douleur légère très brève.

Devenir

Les expériences réalisées dans ce projet nécessitent de prélever le cerveau pour soit (1) isoler les cellules gliales de départ et celles en cours de reprogrammation et analyser quels gènes sont exprimés, soit (2) effectuer des analyses histologiques directement sur tranches de cerveau. Ces différentes analyses n’ont pas d’alternative qui éviterait la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet consiste spécifiquement à étudier, dans le contexte de l’épilepsie, ce qui rend les glies qui se multiplient lors des phases précoces de la maladie particulièrement sensibles à la reprogrammation. De plus, l’environnement cérébral, dont la complexité ne peut pas être reproduite en culture, a un impact sur la reprogrammation glie-neurone. Ceci ne peut donc être étudié que dans le cerveau d’un animal rendu épileptique.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec le nombre minimal d’animaux permettant de garantir des résultats robustes, nombre qui a été déterminé préalablement grâce à des calculs statistiques et basé sur les données de la littérature. Pour déterminer les différences dans l’expression des gènes dans les cellules gliales de départ et au cours de la reprogrammation, nous effectuerons différentes techniques d’analyse sur les mêmes cellules, permettant ainsi de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ces expériences. Par ailleurs, ces expériences permettront de générer un grand nombre de données dont l’analyse s’étendra au-delà de ce projet. Des analyses comparées de ces données avec d’autres présentes dans la littérature devraient permettre d’étudier un certain nombre de questions sans passer par l’utilisation de nouveaux animaux. Enfin, nous avons défini des points d’arrêt à différentes étapes du projet nous permettant d’évaluer si nous devons procéder ou non à la suite des expériences en fonction des résultats déjà obtenus. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant.

Raffinement

Toutes les chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale et analgésie locale renforcée pour éviter toute douleur ou souffrance durant l’opération. Pour éviter toute douleur postopératoire, les animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’analgésique. Une surveillance sera mise en place en postopératoire avec un suivi renforcé dans les 72h post-chirurgie. Les animaux seront scorés selon une grille d’évaluation clinique adaptée à notre étude. En cas de signes de douleur, les animaux recevront une analgésie supplémentaire. Les animaux pourront également se voir présenter de la nourriture liquide et supplémentée afin de faciliter leur récupération après l’opération. L’interruption des expériences pourra intervenir pendant la chirurgie ou en postopératoire dans le cas d’apparition de signes indicatifs de gêne/douleur sévères. Raffinement des conditions d’hébergement : Une fois que les animaux ont récupéré de la chirurgie, ils sont regroupés avec leurs congénères. Les animaux bénéficient d’un milieu d’hébergement enrichi (nid en fibres de coton, tunnels en carton, igloos teintés en polycarbonate). Cas des animaux transgéniques : Le déclenchement de l’expression du transgène pourra se faire par gavage oral (3X, tous les 2j) pour réduire l’inconfort des animaux si cela s’avère aussi efficace que les injections répétées.

Choix des espèces

Ce projet fait suite à un projet précédent réalisé dans un modèle d’épilepsie chez la souris et vise à déterminer (1) les mécanismes impliqués dans la reprogrammation des glies se multipliant dans la phase précoce de la maladie et (2) l’impact de la modulation de deux facteurs épigénétiques sur l’efficacité de reprogrammation glie-neurone dans le contexte de l’épilepsie. Ce projet doit donc être réalisé dans le même modèle afin que les résultats obtenus soient directement comparables aux données précédemment générées Ce modèle d’épilepsie généré chez la souris que nous utilisons reproduit la plupart des aspects de la pathologie humaine et a été amplement validé. Les injections intracérébrales seront réalisées chez des souris adultes d’au moins 8 semaines afin de rester dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées dans les études précédentes, pour permettre une comparaison directe entre les résultats obtenus dans nos précédentes études et les résultats générés lors de ce projet.

Quatre mesures de débit de filtration glomérulaire de quarante-cinq minutes chacune, six prélèvements de sang à la queue, six prélèvements d'urine, une irradiation du corps entier et une chirurgie de clampage de l'aorte rénale : 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est transportée entre deux établissements pendant le protocole. L'objet du projet est de comprendre le rôle d'une protéine, CD99, dans l'insuffisance rénale aiguë et chronique, repérée d'abord dans les urines de patients opérés du cœur. Les souris sont tuées à la fin de la procédure pour le prélèvement de leurs reins, ou avant si elles perdent plus de 25 % de leur poids ou restent prostrées au-delà de vingt-quatre heures.

Objectifs

Récemment, nous avons identifié un peptide CD99 prédictif du développement d'une insuffisance rénale aigue (IRA) dans les urines obtenues 4h après un pontage cardiaque provenant d’une cohorte humaine. CD99 est une protéine principalement identifiée sur la membrane des cellules endothéliales et immunitaires. Dans la cohorte de patients utilisée pour identifier le ratio CD99 (peptide/protéine entière) comme nouveau biomarqueur de l'insuffisance rénale aiguë, l'expression du CD99 sur les cellules immunitaires circulantes (monocytes, neutrophiles, cellules B, cellules T) était similaire chez les patients ayant développé ou non une insuffisance rénale aiguë. Il est donc nécessaire de caractériser la façon dont les CD99 endothéliales et immunitaires modulent le risque de développer une insuffisance rénale aiguë avant de mettre en œuvre une approche thérapeutique ciblant les CD99. Ce projet est un projet multisite qui se déroule sur deux EU (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Mieux caractériser le rôle respectif de CD99 endothélial et immunitaire dans le développement d’une insuffisance rénale aiguë et chronique afin de développer ensuite une approche thérapeutique ciblant CD99.

Procédures

1/prélèvements sanguins à la queue (sous anesthésie) avant chirurgie et avant mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal (anesthésie et prélèvement compris) 2/prélèvement d'urine lors de la contention de l'animal avant chirurgie et avant la mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal. 3/Mesure du Débit de Filtration Glomérulaire avant chirurgie et avant sacrifice (placement du capteur et injection en retro-orbitaire sous anesthésie) (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 4 mesures seront réalisées (J0, J7 ou J14 J21 et M1). Chaque mesure dure environ 45min par animal (placement du capteur, injection en retro-orbitaire sous anesthésie et mesure) 4/irradiation (EU2). Une seule irradiation par animal est réalisée, la totalité de la procédure ne dépasse pas 2h (mise en cage, irradiation et retour en cage animalerie) 5/Induction d’une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) (EU1). Une seule chirurgie est effectuée par animal, la procédure dure entre 30 et 45min (anesthésie, chirurgie, clampage d'aorte rénale (le temps varie en fonction du sexe et de la souche) et souture).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront : 1/Une irradiation

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ou si l'un des points limites était atteint. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever de l’urine, du sang et différents organes (dont le rein) en vue de leur analyse.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë est impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 960 Souris.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 25% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’agression rénale ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront mis à mort. Concernant le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, il sera effectué sur des animaux aptes à supporter le voyage qui sera effectué dans des conditions telles qu'ils ne puissent être blessés ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué par une société agrée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU2 et l'EU1.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes

930 souris vont être utilisées, chacune recevant cinq injections en dix jours puis deux par semaine pendant dix semaines, avec un prélèvement de sang au coin de l'œil sous anesthésie chaque semaine du traitement. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, pour l'analyse de leur système immunitaire et de leurs organes. La plupart développent spontanément un lupus, avec des atteintes rénales possibles dans les formes avancées, un autre groupe recevant une injection d'huile pour déclencher la maladie. Le porteur indique que le nombre d'animaux nécessaire à la puissance statistique est de dix par groupe, sans expliquer comment il parvient à 930.

Objectifs

Pour qu'un cancer puisse se dévelloper les cellules tumorales doivent produire des composés inhibant le système immunitaire. Partant de ce constat notre équipe a réussi à isoler, à partir de secretion de cellule tumorale, des composés ayant des capacités inhibitrice de l'immunité et permettre de trouver de nouveau outils thérapeutiques dans les maladies caractérisé par un excés d'activation de l'immunité contre son hote, les maladies auto-immune. Un composé a démontré une efficacité particulierement efficace dans des systèmes simplifié de l'immunité notamment sur les lymphocytes B. Le but de se projet et de montrer l'efficacité de cette molécule dans des modèles plus complet récapitulant toute la complexité du système immun. Afin de mieux comprendre les mécanismes d'actions de ce composé les souris seront vacciné contre différentes substance, le but étant d'induire différent type de réponse vaccinal et voir quelles types de cellules sont impactés par ce composé et comment est modulé la réponse vaccinale. Du fait de son potentiel sur les lymphocytes B nous allons nous concentré sur le lupus qui est une maladie auto-immune ou l'implication des lymphocytes B n'est plus a démontré. Le lupus étant une maladie complexe dépendant d'énormément de facteur nous allons utilisé différent modèle murins de lupus permettant de modéliser different aspect de la maladie et essayer de les traiter avec notre composé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront d’une part de comprendre les mécanismes par lesquelles les cellules tumorales peuvent inhiber le système immunitaire et proliférer et potentiellement développer de nouvelle thérapeutique afin de lever cette inhibition. D'autre part la description des ces mécanismes permettront de dévellopé de nouveaux outils thérapeutiques pour pathologies avec un excès d'activation du système immunitaire tel que les pathologies auto-immunes. En effet les thérapies actuellement disponibles, non spécifiques ou spécifiques du lymphocytes B vont engendrer de sérieux effets secondaires mais ont aussi un coût socio-économique non négligeable. Il y a donc une nécessité à développer de nouvelles voies thérapeutique à cibler.

Procédures

L'injection dans le ventre, dite intra-péritonéal est un moyen efficace pour diffuser un produit dans le système de la souris en n'entrainant quasiment pas d'incomfort et peut donc être effectué sur souris vigile. C'est cette voie qui est prévilégié pour toutes les injections dans nos différentes expériences. Pour la partie vaccination, les souris seront injecté 1 fois avec le vaccin et traité avec 5 injections pendant 10 jours. La majorité des souris vont dévellopé spontanément un lupus, cependant l'un des modèles va nécessiter une fois l'injection d'une huile pour induire un lupus. Les souris seront traité par notre composé par 5 injections pendant 10 jours puis 2 fois par semaines pendant 10 semaines. De plus afin de suivre l'évolution de la maladie le sang des souris sera prélévé 1 fois par semaine pendant toutes la durée du traitement. Ce prélévement se faisant au niveau du sinus au coin de l'oeil et pouvant être désagréable pour les souris, ils seront effectué sur souris sous anethésie générale par des professionnels formés. De plus afin de limité toutes séquelles sur l'animal une altéranance d'oeil gauche-droite sera effectué.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent entraîner une legère douleur de courte durée. Les modèles murins de lupus vont modéliser différents aspects de la maladie avec des degrés de sévérité variables en fonction des modèles. Dans les cas les plus avancé de la pathologie les souris peuvent dévelloper des atteintes rénales. Les souris seront prélevées une fois par mois pour l'urine sur la souris vigile et pour le sang par prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale. Ce geste peut entraîner une legère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasié afin de permettre d'une part une analyse détaillé du système immunitaire et évaluer l'inflammation ainsi que l'activité de la maladie et les atteintes d'organes.

Remplacement

Des études préliminaires de culture cellulaire in vitro ont été mises en place afin de minimiser au maximum l’utilisation de souris. Cependant seuls des modèles in vivo permettront d’une part d’étudier l’effet de ces nouvelles thérapeutique sur un organisme complet. D’autre part seuls des modèles in vivo permette de récapituler la dérégulation d’un système immunitaire complet ainsi que le phénotype délétère des pathologies auto-immune et donc de pouvoir d'évaluer l’intérêts thérapeutiques de ces nouveaux outils.

Réduction

Les test statistiques approprié seront utilisé pour comparer les différents groupes. et le nombre d’animaux nécessaires pour avoir la puissance statistique necessaire est de 10. La cinétique des réponses immunitaires ainsi que les modèles murins de lupus présentent de la variabilité expérimentale, elles seront répétées pour renforcer l'approche statistique. Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux à utiliser afin de pouvoir conclure avec une confiance suffisante. Afin d’éviter tout biais expérimentaux les cohortes seront randomisées et afin d’éviter les effet cage les animaux d’une même cage recevront des traitements différents en fonction des groupes expérimentaux. De plus afin de réduire le plus possible le nombre d’animaux tous les organes d’intérêt seront recueillis à chaque fois et utilisé ou congelé.

Raffinement

Le principe de raffinement décrit au second de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime sera appliqué. Le bien-être des souris sera prise en compte tout au long de la procédure expérimentale. Les souris seront hébergées dans des cages de 2L à 5 animaux par cage. Chaque cage recevra un enrichissement du milieu de type nids de woodwoll. Pour réduire la douleur et la souffrance, les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel habilité et chevronné. De plus tout le long des procédure l’état générale des animaux sera évalué selon une grille de score objective permettant d’évaluer le stress et la détresse des animaux.

Choix des espèces

Les modèles murins de lupus sont les seuls disponibles permettant de récapituler certains aspects de la physiopathologie humaine. De plus, les modèles murins offrent le meilleur équilibre entre la capacité de produire des résultats satisfaisants et la susceptibilité à induire de la douleur, du stress ou des dommages durables. Les stades de développement ont été choisis afin de modéliser différents moments dans l'évolution de la maladie. Ainsi, dans certains cas, des souris jeunes seront utilisées afin de modéliser l'apparition de la pathologie, tandis que pour modéliser des états plus avancés de la pathologie, nous utiliserons des souris âgées.