Rongeurs

4 085 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour la quasi-totalité, une partie dès le sevrage parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché. À dix jours, chacune subit le prélèvement d'un millimètre de queue pour génotypage. Les souris retenues reçoivent ensuite un produit par injection intrapéritonéale ou par gavage, une fois par jour pendant quatre à cinq jours, puis passent trois tests comportementaux étalés sur trois semaines, portant sur l'intérêt social, la coordination motrice et la mémoire. Le porteur indique que le rôle de la protéine étudiée a déjà été caractérisé sur des cellules en culture, et conclut qu'il est "essentiel" de passer à l'animal pour observer la myéline en place et mesurer l'effet sur le comportement.

Objectifs

Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon acheminement de l’information nerveux, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacent de façon coordonnée. L’objectif de ce projet est de permettre la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la formation des gaines de myéline. La myéline étant une structure modulable tout au long de la vie, l’identification de cibles moléculaires permettant d’actionner cette dynamique au cours du développement et chez l’adulte, représente un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Il a été démontré qu’une protéine, que nous appellerons protéine A, exprimée dans l’oligodendrocyte, contrôle la formation de la myéline dans des oligodendrocytes mis en culture. Nous souhaitons donc étudier en profondeur le rôle de cette protéine dans le déclenchement de la formation de la myéline chez l’animal, in vivo, au cours du développement et à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation au cours du développement et à l’âge adulte et de la remyélinisation permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la formation de myéline. En effet, en identifiant les conséquences de la suppression de l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline, nous apporterons une meilleure compréhension de comment est régulée la formation de la myéline.

Procédures

Afin de connaitre le génotype des animaux générés pour cette étude (animaux dont trois gènes ont été modifiés pour supprimer l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes à l’âge adulte), un petit bout de tissu de 1mm sera prélevé sur chaque souris, une seule fois au niveau de la queue. Ce geste sera effectué sur des souris âgées de 10 jours (moins d’une minute par animal). De jeunes souris en développement ou adultes seront injectées par voie intrapéritonéale (dans le péritoine au niveau du ventre) ou administrées par voie orale par gavage (avec un produit conçu pour induire la délétion de la protéine A dans les oligodendrocytes), une fois par jour pendant quatre ou cinq jours consécutifs maximum, 1-2min/animal. Les tests comportementaux auxquels seront soumises les souris (pour apprécier l’intérêt social, la coordination motrice et la mémoire/flexibilité cognitive) sont non invasifs et seront effectués du moins au plus stressant, espacés d’une semaine entre chaque test. Chaque test dure au maximum 1 heure, entre le moment où la souris est sortie de sa cage et le moment où elle y retourne. Les animaux seront soumis à 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 3 semaines. Le 1er test sera réalisé une fois par jour pendant 5 jours, chaque animal réalisera 3 essais, et le test durera 1h par animal maximum. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le 2ème test qui sera réalisé 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (maximum 5 jours. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le dernier test composé de trois jours d’apprentissage et un jour de test (total 4 jours). Le placement de l’animal dans l’espace de test peut être une source de stress. En fin d’expérience, les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux âgés de 10 jours ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique (1mm de tissu).Un stress et/ou douleur de courte durée peut être observé chez les souris à la suite de la contention (prise de la souris dans la main de l’expérimentateur) et à l’injection d’un produit permettant d’induire la délétion de la protéine A dans les oligodendrocytes en intrapéritonéal (piqure) ou par gavage (avec une paille en métal ou en plastique). Ce traitement aura lieu quotidiennement pendant cinq jours. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire : - Soit au moment du sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt. Soit à des fins expérimentales nécessitant le prélèvement des cerveaux pour une étude structurelle et développementale de la myéline (A noter que lorsque cela est possible, les animaux non porteurs du génotype d’intérêt seront proposés aux autres équipes de recherche de l’institut.

Remplacement

La gaine de myéline est une structure en trois dimensions : c’est une extension de la membrane de l’oligodendrocyte qui s’enroule autour d’un axone (bras du neurone). Suivant le principe de remplacement, le rôle de la protéine A a bien été caractérisé sur des cellules mises en culture. Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le système nerveux central et surtout l'activité électrique des neurones. De plus, afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles et physiques, nous voulons analyser l’impact sur le comportement cognitif de l’animal.

Réduction

Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux (4085). En raison de l’inclusion de l’élevage et des aléas inhérents aux aspects zootechniques et au fait que nous étudions séparément les mâles et les femelles (la répartition des naissances n’étant pas contrôlable et pas toujours équivalente entre les deux sexes), notre calcul d’effectif doit comprendre une marge. Nous produirons et utiliserons uniquement le nombre strictement nécessaire d’animaux pour générer les lots expérimentaux. Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillerons en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés.

Raffinement

L’animalerie est agréée : les conditions d’hébergement (stabulation en portoirs ventilés dans des conditions de température, hygrométrie, éclairage et espace maintenus dans les références recommandées) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (matériel de nidification et à ronger adaptés aux besoins des aniamux), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale. Toutes les injections seront faites par des personnes compétentes. Des points limites sont mis en place et respectés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement par l’équipe de zootechnie et deux fois par semaines par notre équipe, pesés régulièrement au cours de leur procédure. Si les animaux présentent des signes de souffrance (plaie, amaigrissement, posture anormale, poil non soyeux, prostration, signes de douleur, zone d’injection gonflée ou indurée, petits exclus de la nichée, non pris en charge par sa mère), l’avis du vétérinaire référent sera immédiatement demandé et les traitements nécessaires seront appliqués. Si besoin pour éviter toute souffrance, l’animal pourra être euthanasié.

Choix des espèces

La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes recherchés présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. Dans un premier temps, nous avons choisi d’induire la délétion de la protéine A très tôt au cours du développement (à partir du jour 1 ou 14 post-naissance). Ainsi nous pourrons étudier dans le temps les conséquences de la perte de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline au cours du développement. Nous avons pour cela choisi 5 stades à étudier : 21 jours de vie et 30 jours de vie (différenciation oligodendrocytaire et myélinisation intenses), 60 jours de vie (jeunes adultes, fin du développement), 120 et 180 jours de vie (souris adultes âgées). Un âge avancé nous permettra de vérifier les modifications de la myéline induites par la modification génétique. Dans un second temps, nous induirons la délétion de la protéine A à 60-90 jours de vie, donc chez l’adulte, un stade où le paysage myélinique est globalement formé. Ainsi, nous pourrons évaluer l’impact sur la myéline de la perte de la protéine après 1, 2 et 3 mois post-induction du modèle afin d’évaluer si les voies protéiques contrôlées par A sont indispensables au maintien des gaines dans le temps, mais également les conséquences sur le comportement des souris.

Deux injections par semaine pendant dix semaines, chacune précédée d'une incision de deux millimètres au bout de la queue pour prélever une goutte de sang : 90 souris sur les 133 utilisées suivent ce protocole, après un régime enrichi en lipides et en sucre. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour prélever leur foie et leurs autres organes. L'objectif est de tester la combinaison d'un peptide médicament et de molécules issues de cellules souches contre la stéatohépatite non alcoolique. Sur les atteintes attendues, le porteur décrit ce que produit la maladie chez le chat et chez l'être humain, note que ces symptômes n'ont pas été décrits chez les rongeurs, et ne dit pas ce que les souris elles-mêmes vont ressentir.

Objectifs

La maladie du foie gras encore appelée NAFLD est une pathologie hépatique couramment retrouvé chez l'Homme, sans qu'il y ait eu d'abus d'alcool. La forme la plus grave correspond à l'accumulation de graisses associée à un dépot excessif de substances cicatritielles dans le foie, que nous résumerons sous le terme de NASH. La NASH, corrélée à l’obésité et au diabète, représente un problème majeur mondial de santé. Environ 20 % des personnes atteintes de foie gras évoluent vers la NASH, qui dans les cas les plus graves, évolue vers une cirrhose voire, vers un cancer hépatique. Acctuellement, la transplantation hépatique est le seul traitement efficace. Notre objectif principal est de combiner deux traitements pharmacologiques : un peptide médicament et de molécules bioactives (MB) issues de cellules souches. Nous prévoyons que ces deux traitements exerceront un effet complémentaire pour limiter la progression de la NASH, réparer le tissu hépatique et le rendre de nouveau fonctionnel. Ensemble, cette combinaison vise à traiter les causes profondes de la maladie en amont de la cicatrisation exacerbée, offrant ainsi une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour prévenir la progression de la NASH. Les modèles de souris reproduisent les conditions cliniques pour une compréhension intégrative de la maladie et des complications associées dans les autres organes. Ceci rend difficile de simplifier l'étude par des systèmes cellulaires. Notre modèle murin nourri avec un régime enrichi en lipides/ sucre, se rapproche de la pathologie humaine et de son évolution et sera moins de nuissances que les modèles déjà décrits dans la littérature où une perte de plus de 20% du poids corporel est décrite associée à un effet hépato-toxique. Le peptide médicament utilisé,est aujourd'hui testé chez le patient pour une autre pathologie. L'absence d'effets secondaires, observée dans ce dernier cadre tant chez l'homme que chez la souris, en fait une molécule sure pour notre étude sur la NASH. L'injection MB a été décrites dans la littérature comme ayant des effets secondaires limités chez l'homme et l'animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont importants. D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes pathologiques et notamment inflammatoires dans la NASH et leur potentiel résolution. D’un point de vu clinique, cette étude permettrait d’apporter des données majeurs et solides pour l’utilisation de cette thérapie combinée chez les patients atteints de NASH et pourrait s’avérer être une alternative efficace aux futurs traitements en cours de développement.

Procédures

Sur les 133 souris ulisées, 111 souris seront soumis à un régime enrichi en lipides/sucre. Parmi ces dernières, 90 seront soumis au traitement anti-NASH avec le peptide médicament ou avec du liquide physiologique et/ou avec les MB., sur une durée de 10 semaines à raison de 2 injections hebdomadaires (100 µL maximum). Avant chaque injection, un prélèvement sanguin ( 1min max) de 10 µL au niveau de la queue (incision 2 mm) sera réalisé pour controler le niveau du sucre dans le sang.

Impact sur les animaux

Chez le chat, la NAFLD est associé à un jaunissement et une perte de poids sévère et à des vomissements. Ces symptomes n'ont pas été décrits à notre connaissance dans la littérature chez les rongeurs. Selon les données cliniques, la NASH ne présente pas de symptômes chez l'homme. Dans quelques rares cas, un état d’inconfort dans l’abdomen au niveau du foie, de la fatigue, une sensation générale de malaise et un vague inconfort sont décrite. Une diminution progressive de la fonction hépatique pourrait potentiellement être à l’origine de l’apparition d’un jaunissement, d’un œdème. Un état d'incofonrt de la locomotion expliquée par la prise régulière du poids de la souris pourrait etre observée. Une douleur légère de courte durée de la piqure de l'aiguille sera ressenti lors de l'evaluation de la glycémie hebdomadaire.

Devenir

A la fin de chqcune des 2 procédure les animaux seront anesthésiés avant d'être euthanasiés afin de prélever leur tissus et leurs organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses moléculaires.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins est indispensable en raison de la complexité de cette maladie qui implique plusieurs organes comme la rate, le foie, le tissu adipeux, etc. Notre stratégie thérapeutique repose sur la modulation 1- du système immunitaire pour atténuer la progression de la NASH, 2- d’une réduction de l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui rend indispensable l'étude de ces interactions complexes. A ce jour, il n'existe aucun modèle in vitro fiable et adapté pour une telle étude intégrative. Cependant, nous avons réalisé des tests in vitro sur une lignée cellulaires cultivées en milieu enrichi en graisses, où nous montrons un effet protecteur du peptide médicament, et un effet réparateur des MB. Ces essais nous rendent confiants sur l'efficacité combinée du peptide et des MB sur notre modèle murin mimant la NASH. Les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète de la maladie et de l'effet de la modulation immunitaire sur son évolution ce qui rend difficile de simplifier l'étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d'analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n'existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement, statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n= 7 souris (procedure 1) et de n = 15 souris (procedure 2). Elle a été calculée, en tenant en compte du risque de décès prématurés et en utilisant un logiciel statistique adapté. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, les procédures seront interrompues pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Pour la procedure 2; l'expérimentation sera réalisée en 3 fois afin que scientifiquement nous ayons 3 expériences indépendantes (soit 5 animaux/groupe/ période expérimentale). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant 1- qu'en cas des points limites atteints, d'arreter la procedure, de la revoir (i.e. temps d'injection, quantité injectée du peptide, age des souris...) après discussion avec le comité d'éthique... voire de stopper définitivement la procedure; 2- qu'en cas d'obtention de résultats statistiquement significatifs apres le 1er et/ou le 2e essais, les essais suivants (2 et 3, respectivement) pourront alors ne pas avoir lieu. Les variables quantitatives seront analysées par des tests statistiques. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d'animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d'autres projets en cours ou futurs.

Raffinement

La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de production d'urine excessive des souris NASH (valable surtout en fin de procédure pour les souris NASH non traitées). Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux du même sexe seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte, 30 minutes maximum) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées lors de certaines méthodologies (injections) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention (prise de sang). Cela devrait réduire le stress au minimum. Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de gain de la masse corporelle) ou d'un taux élevé de sucres dans le sang (> 6g/l ) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de l'euthanasie de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases des injections, des anesthésiques généraux seront administrés. Une grille de score définie nous permettra d'évaluer l’état dans lequel se trouvent les individus. Afin de limiter les perturbations locomotrices, l'age de 2 mois post-natals des souris pour le début du traitement et la durée de 10 semaines (pour le traitement) ont été choisis afin que le phénotype dommageable ne soit pas atteint. Ainsi cette nuisance devrait être limitée dans la durée de la procédure (10 semaines). Au moment de l'euthanasie, de part l'expérience que nous avons de ce modèle nous estimons que les souris non traitées ne devraient pas atteindre le phénotype dommageable (e.i poids >40 g). Si c'est le cas avant la date d'euthanasie, initialement déterminée, alors nous interromprons l'ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors euthanasiées pour l'analyse tissulaire.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et le meilleur compromis entre les besoins expérimentaux et le respect du critère de choix de l’espèce. Deux souches seront nécessaire à l'étude, les souris obèses qui subiront les traitements et des souris controles non diabétiques, non obéses, non traitées qui représenteront le témoin négatif et la référence de poids normal. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation des procédures.

Une lésion démyélinisante créée par injection dans la moelle épinière, sous anesthésie, en une heure d'opération au plus : c'est la principale procédure infligée à une partie des 2 084 souris de ce projet. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 044 d'entre elles et modéré pour 1 040. Les autres reçoivent cinq injections quotidiennes dans le ventre pour supprimer une protéine dans leurs oligodendrocytes, puis une partie passe huit semaines seule en cage avant un test de sociabilité de cinquante minutes, l'objet étant de comprendre comment la myéline se reforme. Le porteur décrit la souris comme un animal grégaire entretenant de fortes interactions sociales, et en isole certaines pendant huit semaines pour mesurer ce que cet isolement fait à leur myéline.

Objectifs

Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon transport de l’information électrique, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacement de façon coordonnée. Ces gaines de myéline sont formées au cours du développement post-natal mais sont dynamiques et modifiées tout au long de la vie afin d’assurer l’adaptation du circuit cérébral à l’environnement. Certaines pathologies, telles que la sclérose en plaque, sont caractérisées par une perte de ces gaines, menant à une perte de l’axone et un défaut cognitif et/ou moteur en fonction du site de la perte myélinique. Il a été démontré que la gaine de myéline peut parfois se reformer spontanément, mais les mécanismes à l’origine de cette remyélinisation ne sont pas bien compris. Il a été démontré qu’une protéine A, présente dans les oligodendrocytes, est essentielle à la formation de ces gaines de myéline, de par son action sur le « cytosquelette d’actine », un des échafaudages de la cellule lui permettant d’adopter plusieurs morphologies. Une première étude de cette protéine A chez la souris a permis de valider son rôle dans la myélinisation du cerveau au cours du développement. L’objectif de ce projet est de continuer l’étude du rôle de la protéine A dans la formation des gaines de myéline chez la souris afin de mettre en évidences de nouvelles cibles thérapeutiques. En effet, nous voulons étudier en profondeur les effets la protéine A sur (1) la modulation des gaines de myéline à l’âge adulte et (2) la réparation de la myéline (remyélinisation). La validation potentielle de la protéine A en tant que cible moléculaire permettant d’actionner cette dynamique chez l’adulte représente ainsi un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Selon nos résultats préliminaires la protéine A est un excellent candidat à cibler pour exercer l’un de ces rôles, voire éventuellement les deux. En effet, puisque cette protéine régule la myélinisation développementale, il est possible qu’elle contrôle également la myélinisation adaptative et, ou la remyélinisation.

Bénéfices attendus

A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation adaptative (myélinisation adulte) et de la remyélinisation permettra de mettre en avant de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la myélinisation et sa réparation.

Procédures

Pour obtenir les souris porteuses du génotype d’intérêt permettant cette étude, nous devons générer des accouplements de souris. Les petits issus de ces croisements seront identifiés génétiquement à un stade juvénile (prélèvement d’un petit bout de queue par une personne compétente une seule fois sur animal vigile en moins de 2 minutes). Cela permettra de sélectionner les bons animaux qui sont porteurs des gènes d’intérêt. L’ensemble des souris génétiquement modifiées, porteuses du génotype d’intérêt seront sujettes à une injection en intrapéritonéal (injection à l’âge adulte sur animal vigile, 60 jours de vie, sur cinq jours consécutifs), cela permettra de supprimer la présence de la protéine A dans les oligodendrocytes de ces souris. Puis, une partie de ces souris sera inclue dans une expérience de sociabilisation (hébergement groupé ou isolé pendant huit semaines, puis à l’issue de ces huit semaines, évaluation de la sociabilisation par un test non invasif de 50 minutes au total). Une autre partie des souris sera sujette à une chirurgie à 90 jours de vie afin de créer une lésion démyélinisante et observer comment l’absence de la protéine A affecte les capacités de la souris à remyéliniser cette lésion. Cette chirurgie sera effectuée une seule fois (une heure au total au maximum), par une personne compétente sur souris anesthésiées et analgésiées avant, pendant et après l’opération. Elles seront suivies de près en postopératoire afin de détecter au plus tôt les signes de souffrance ou d’infection potentielle. Une partie de l’étude sera effectuée sur souris sauvages, non génétiquement modifiées. Ces souris recevront un traitement thérapeutique quotidien par voie orale pendant 6 semaines. L’euthanasie des animaux sera effectuée en fin de période de maintien par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de peau sur l’extrémité de la queue (1mm) pour le génotypage au stade juvénile de la souris. Un stress peut être observé chez les souris transgéniques suite à la contention et à l’injection d’une molécule en intrapéritonéal (but de ce traitement : supprimer l’expression de la protéine A dans les cellules d’intérêt. Mais les principales nuisances attendues sont liées à l’acte chirurgical lors de l’étude de la remyélinisation : injection au niveau de la moelle épinière sous anesthésie générale de la souris (risques d’hypothermie, douleur au point d’injection, hématome, risque anesthésique, saignement, infections). De plus, il est possible que les animaux soient stressés suite à l’étude en condition d’isolement. Enfin, de façon générale, les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés : -Soit avant le sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt -Soit à des fins expérimentales pour une étude structurelle de la myéline -Soit s’ils sont devenus trop vieux pur être utilisés comme reproducteurs

Remplacement

La myéline est une structure en trois dimensions : une extension de la membrane des oligodendrocytes qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous avons déjà étudié en détail le rôle de la protéine A de manière in vitro (sur des cellules). Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo (chez la souris) de la mutation afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau. D’autant plus que nous voulons étudier le rôle de la protéine A sur la modulation de la myéline à l’âge adulte (myélinisation dite ‘adaptative’, modulée par l’expérience sociale) et sur la remyélinisation. Les interactions sociales et leurs impacts ne peuvent être observées que sur un animal complexe susceptibles d’interagir avec des congénères.

Réduction

Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux (2084 souris). Ainsi, le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Toutes les expériences seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillerons en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés (taille des effectifs calculés avec un calcul de puissance, test statistiques fiables pour une bonne interprétation des résultats).

Raffinement

L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (coton, bâtonnet à ronger), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour ne pas stresser l’animal. Les animaux seront suivis régulièrement (deux fois par semaine de façon générale, tous les jours pendant une semaine après la chirurgie) et de manière adaptée aux différentes procédures par notre équipe et la zootechnie, ainsi que par notre vétérinaire. Pour la condition expérimentale d’animal hébergé de façon isolée, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage (papier kraft, maison en carton). Les injections de cette étude seront toutes faites par des personnes compétences. La lésion de démyélinisation (chirurgie) sera pratiquée sous analgésie et anesthésie, et reste localisée pour éviter les conséquences d’une démyélinisation plus globale. Des points limites sont mis en place et respecter pour éviter toute souffrance, sans décision ou prise en charge rapide des animaux.

Choix des espèces

De toute évidence, l’étude de la myéline nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. En effet, seuls les systèmes nerveux de vertébrés sont myélinisés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire spécifique dans l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette dite voie moléculaire avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la voie étudiée présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. La plasticité de la myéline, similaire à celle retrouvée chez l’Homme, a été bien établie chez la souris, ce qui nous permet de mener à bien nos expériences de plasticité et de sauvetage de la myéline à l’âge adulte. Les souris entretiennent de fortes interactions sociales (animal grégaire) qui vont être le étudiées ici (hébergement isolé versus hébergement en groupe). Pour la génération de lignée de souris transgénique, les souris seront mises en accouplement à partir de 8 semaines (âge de maturité sexuelle). Pour l’étude sur la myélinisation adaptative, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A chez le jeune adulte (à 60 jours de vie) et étudierons les conséquences de cette délétion plus tard, à 120 jours de vie. Ainsi, nous pourrons étudier comment l’absence de la protéine A influence le cerveau déjà formé (le cerveau adulte). Pour l’étude de la remyélinisation, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A (ou bien nous modulerons l’activité de cette protéine) chez le jeune adulte (à 60 jours de vie. Nous effectuerons la lésion démyélinisante un mois après (donc à 90 jours de vie). L’étude des animaux sera ensuite effectuée à quatre stades post-chirurgie (4, 7, 14 et 30 jours après la lésion démyélinisante), afin d’observer successivement l’évolution des différents stades mis en jeu dans la remyélinisation.

La cornée abrasée sous anesthésie puis exposée à des molécules inflammatoires, ou les glandes lacrymales retirées en quinze minutes de chirurgie : 1 600 souris mâles subissent l'un de ces deux modèles de douleur oculaire. Toutes sont tuées pour prélèvements et analyses post-mortem, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 un niveau léger. Le porteur attend les mêmes sensations que chez les patients humains, picotements, démangeaisons, brûlures, impression de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière, et fait passer aux souris des tests de sensibilité cornéenne sur animal éveillé, une à quatre fois selon le modèle. L'effectif de 1 600 est présenté comme le fruit d'un calcul de puissance, sans que le nombre de groupes ni la répartition entre les deux modèles ne soient donnés, et rien n'indique combien de souris subissent l'ablation des glandes lacrymales.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous-jacents. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués est un des enjeux cruciaux pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.

Bénéfices attendus

Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice de ce projet est d’aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués, principalement inflammatoires et neurogènes, qui sont des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire.

Procédures

Deux modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle de douleur inflammatoire est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois -10 minutes) associé à l’instillation de molécule inflammatoires le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, d’imagerie de la cornée, avant, durant et après la mise en place des modèles mimant ces douleurs. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. Ils seront réalisés 2 fois chez les souris modèles de douleur inflammatoire, 4 fois chez les souris modèles de sécheresse oculaire. - Test de sensibilité cornéenne : animal vigile (pas d’anesthésie), durée du test : 1 minutes/session - Imagerie de la cornée par biomicroscopie : animal anesthésié, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3 minutes. - Imagerie de la cornée par imagerie confocale in vivo : animal anesthésié, durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une immobilisation complète de l’animal et qui seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie en vue des différents prélèvements pour analyses.

Impact sur les animaux

Des contentions de courtes durées et les injections sur animal vigile nécessaires aux anesthésies pourront être sources de stress ou d’inconfort pour l’animal. Les nuisances attendues dans les modèles de sécheresse oculaire sont celles observées chez l’Homme à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui est liée. La complexité et l’interaction du circuit mis en jeu (cornée, ganglions trigéminés et cerveau) et activité du système immunitaire inné ne peuvent également être étudiés et remplacés par un modèle vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiologiques mis en jeu dans cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 1600 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux,) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ces effectifs ont été établis grâce à une calcul de puissance statistique.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à température règlementaire et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d'euthanasier l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Les tests d’imageries qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.

Choix des espèces

Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Ce projet nécessite l’utilisation de souris mâles adultes sauvages C57BL/6J, de souris mâles adultes issus des lignées transgéniques. Ces animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7 semaines (poids environs 20-25g) afin de respecter une semaine d’acclimatation et seront utilisés à l’âge de 8 semaines (âge de la maturité sexuel). Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 3 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 19 semaines en sortie de procédure.