Rongeurs
Optimisation de traitements prometteurs pour la stéatose hépatique non alcoolique – Efficacité d’une approche thérapeutique par combinaison du traitement avec un anticorps.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une fausse route lors du gavage, et la souris est observée quelques heures puis tuée si elle ne récupère pas : c'est l'un des points limites de ce projet. 260 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries en permanence au régime riche en graisse pour développer une fibrose du foie, elles reçoivent un anticorps injecté deux fois par semaine pendant huit semaines et un médicament administré chaque jour par la bouche ou par piqûre, avec des prises de sang avant, pendant et à la fin. Le porteur attend des ulcérations aux points d'injection et une irritation de l'œsophage qui gêne l'alimentation, quand le bénéfice annoncé se limite à savoir si son anticorps ajoute quelque chose à deux médicaments dont l'un est déjà sur le point d'être approuvé.
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'efficacité d’une combinaison associant des traitements prometteurs et prochainement approuvés pour la fibrose dans la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) et un anticorps pour une meilleure prise en charge de la NASH. Cette dernière, également connue sous le nom de maladie du foie gras, est la conséquence d’une alimentation trop riche en sucre et en graisse. Ce type d’alimentation va entrainer le stockage et l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui va conduire à une inflammation locale au sein de l’organe. Cette inflammation chronique va entraîner avec le temps le développement d’une fibrose dans 20% des cas. Au stade précoce, la NASH est souvent asymptomatique et est généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, pouvant évoluer vers une cirrhose ou un cancer du foie dans les cas les plus graves. Un premier médicament sera prochainement approuvé (résultat positive dans un essai clinique de phase III) pour le traitement de la fibrose dans la NASH. Cependant, il permet de retarder l’échéance en réduisant la fibrose dans seulement 24% des patients. Un second médicament très prometteur, le Sémaglutide montre une diminution de la fibrose hépatique mais seulement partielle. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser ces traitements. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie et du processus de fibrose hépatique. Cela suggère qu’une combinaison entre notre anticorps et ces traitements prometteurs pourrait améliorer l’efficacité du traitement des fibroses hépatiques. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de la combinaison entre des traitements prometteurs et prochainement approuvé et notre anticorps sur la progression de la fibrose hépatique dans la NASH.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à étudier l’efficacité d’une combinaison thérapeutique associant, des traitements prometteurs et prochainement approuvé pour le traitement de la fibrose hépatique dans la NASH et un anticorps. Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité de cette combinaison afin d’envisager l’utilisation de cet anticorps en combinaison avec l’un de ces traitements prochainement approuvés. Cela permettra une meilleure optimisation thérapeutique chez les patients atteints de NASH et de fibrose hépatique et contribuera à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.
Procédures
Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation. Les animaux recevront un traitement par un anticorps 2 fois par semaine pendant 8 semaines par injection. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux recevront également un traitement oral ou par injection (en fonction du médicament administré) par un médicament, quotidiennement pendant 8 semaines. Les traitements sont réalisés sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisé. Un prélèvement de sang sera réalisé avant et pendant le traitement afin d’évaluer l’évolution de la fibrose hépatique. Avant d’effectuer ces prélèvements de sang, les souris recevront un anesthésiant local puis ces dernières auront une anesthésie générale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ. Les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute. Lors de la 15ème semaine de régime riche en graisse, des prélèvements seront réalisés sur 5 souris. Ces prélèvements seront faits à 0, 6h, 24h, 72h et 7 jours après l’injection de l’anticorps. Cela permettra de mesurer la concentration de l’anticorps dans le plasma et de déterminer sa demi-vie plasmatique. Ces prélèvements seront réalisés sur animaux sous anesthésie locale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ.
Impact sur les animaux
Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Le traitement oral peut entrainer principalement une irritation/inflammation de l’œsophage avec pour conséquence un inconfort de la souris pour se nourrir et donc une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort seront appliquées lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections et au traitement oral. Il sera également prévu une habituation au traitement oral à l’aide d’une sonde trempée dans une solution de glucose. Des points limites spécifique au projet ont également été établis faisant référence aux injections : apparition d’une induration au niveau des sites d’injection du traitement et au traitement oral : fausse route, animal observé dans les heures qui suivent et sacrifié si état satisfaisant non recouvré.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).
Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Une injection intraveineuse sous anesthésie générale, jusqu'à cinq prises de sang à la veine mandibulaire réparties sur douze mois, et cinq séries de cinq tests moteurs et sensitifs : les souris de ce projet portent la mutation d'une neuropathie mortelle et sans traitement chez l'être humain. 1 200 animaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart et modéré pour 180 d'entre eux. Le porteur affirme que le phénotype de la lignée ne diffère pas du modèle sauvage pendant les douze mois d'expérimentation, tout en indiquant ailleurs que les défauts moteurs et sensoriels apparaissent dès trois mois aux tests comportementaux, ces mêmes tests servant à mesurer l'efficacité de la thérapie génique. Les anciens reproducteurs et les animaux au génotype non voulu sont tués, ceux du protocole sont tués pour prélever leurs organes, et une partie de la production part vers les autres projets de l'équipe en utilisation continue.
Objectifs
Ce projet concerne l'élevage d’une lignée de souris modèles d’une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement, et le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour cette pathologie. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme. Précédemment, nos collaborateurs ont développé un modèle souris qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. L’objectif de cette étude est d’élever les animaux nécessaires pour pouvoir évaluer les bénéfices de ce protocole de thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ses bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique rare (50 familles identifiées dans le monde). De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidence des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives
Procédures
Les animaux auront un prélèvement d’un petit fragment de queue pour connaitre leur patrimoine génétique (1min par animal, une seule fois). Une partie des souris recevront une injection intraveineuse (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Une partie des souris auront 5 prélèvements sanguins maximum répartis sur 12 mois (durée : 5mn) au niveau de la veine sous mandibulaire sous anesthésie générale. Ces mêmes animaux réaliseront 5 fois une série de tests comportementaux moteurs et sensitifs (5 tests comportementaux répartis sur 5 jours, durée : entre 30s et 15mn par test) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse, et les prises de sang par la veine sous mandibulaire pourront induire un stress faible chez les animaux et un léger inconfort au site d’injection ou de prélèvement respectivement. Un risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire lors des anesthésies reste possible mais très rare. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modéré. Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact ici sachant que les souris sont maintenues jusqu’à 12 mois au maximum. Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de queue pour connaitre leur patrimoine génétique.
Devenir
les anciens reproducteurs et les animaux porteurs de genotypes non souhaités seront euthanasiés. Les animaux utilisés pour évaluer les bénéfices de la thérapie devront être euthanasiés pour le prélèvement d’organes post mortem pour l’analyse. Une partie des animaux produit sera en utilisation continue dans nos autres projets de recherche.
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire etcellulaire de cette approche. Cette approche thérapeutique nécessite d’être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyser nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet. Les accouplements seront contrôlés afin de générer que les animaux nécessaires pour le projet. Un total de 1200 animaux est prévu pour le projet.
Raffinement
Nos animaux seront hébergés dans une animalerie agréée avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement règlementaire. Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’injection intraveineuse de notre thérapie génique est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voire 1 jour entier est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis et seront respectés pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98 pourcents d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude de caractérisation du modèle utilisé dans ce projet a montré qu’il reproduit pour la première fois les désordres moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients atteints de neuropathies à axones géants, justifiant son utilisation pour valider notre approche de thérapie génique. Les souris seront prélevées pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) pour l’injection. En effet, les premiers symptômes se développant chez l’Homme à 2 ans, il est nécessaire de débuter la stratégie le plus tôt possible afin d’être le plus en amont possible afin de limiter au mieux les symptômes (1 mois) et de la poursuivre jusqu’au stade adulte (12 mois) pour valider notre protocole et évaluer ses bénéfices au niveau comportemental et histologique. Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels (visibles uniquement au moment de tests comportementaux à partir de 3 mois). Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact dans notre projet sachant que nos animaux seront maintenus jusqu’à 12 mois au maximum.
Elevage d’une lignée murine modèle de cancer du tissu mammaire au phenotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt-quatre naissances par mois pendant cinq ans, soit 1 440 souris produites par quatre cages d'accouplement maintenues en continu : cet élevage transmet à la moitié des animaux, 720 individus, un transgène qui leur fait développer spontanément des tumeurs mammaires. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, ce qui couvre la biopsie de queue avant quatorze jours et la goutte de sang prélevée par poinçon de joue à trente jours, sans couvrir le développement tumoral lui-même, que le porteur décrit comme pouvant provoquer douleurs, dégradation physique et mort. La tumeur est palpée puis mesurée une fois par semaine à partir de cinq mois, et l'animal est tué lorsqu'elle atteint un centimètre cube. Les animaux non tués rejoignent d'autres projets en utilisation continue, 144 environ étant tués parce que leur génotype ne convient à aucun protocole ou parce qu'ils ont fini de reproduire, et le porteur affirme que les souris transgéniques sont "l'unique moyen" de suivre les cellules qui l'intéressent dans un "organisme entier".
Objectifs
Le programme de travail repose sur l’observation fondamentale que les cellules myéloïdes, une population du système immunitaire, sont impliquées dans le développement tumoral et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. L'étude de l'impact des thérapies conventionnelles ainsi que les nouvelles immunothérapies sur ces populations de macrophages sont nécessaires pour comprendre comment ces populations interviennent dans les résistances à ces thérapies et donc à la rechute tumorale. La complexité des interactions cellulaires intervenant dans ces processus nécessite l'utilisation de modèles animaux developpant des cancers de manière relativement controlée mais le plus proche de ce que l'on peut observer chez l'homme.
Bénéfices attendus
Le cancer du sein touche plus de 2 millions de femmes dans le monde avec 670.000 décès recensés en 2022. Il touche les femmes sans distinction d'âge et représente donc un enjeu de santé publique majeur. Le besoin de recherche scientifique sur ce cancer est nécessaire. Comprendre le rôle des macrophages dans le developement des cancers et la resistance aux thérapie anti-cancéreuses (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapies) est capitale. Ces thérapies sont actuellement les seules armes que nous possédons pour traiter les patients et pourtant dans encore trop de cas ces thérapies ne font que prolonger la durée de vie et souffrent d'effet secondaires très lourds. Le modèle de souris utilisé est un modèle qui reproduit de façon relativement fidèle, les différents stades de cancer du sein que l'on peut observer chez l'homme. C'est donc un modèle très utile pour tester et developper de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
En raison du developpement pontanée de tumeur de nos modèles transgéniques, nous réaliserons un suivi de croissance tumorale par palpation puis avec pied à coulisse sur animal vigile 1 fois par semaine à partir de 5 mois d'àge : 1min par animal pour mesure de la masse tumorale. Pour assurer l’identification génétique de nos animaux, les animaux subiront une biopsie au niveau de la queue avant 14 jours d'âge - 1 min par animal et un prelevement de sang 1 goutte par poinçon de joue à 30 jours d'âge - 2min par animal sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une biopsie de l’extrémité de la queue et un prélèvement de sang (quelques gouttes) pour génotypage. Ces gestes peuvent engendrer des douleurs légères de courte durée et un stress chez l’animal. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer un hématome dans de rare cas. Les effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement liés à l'apparition spontanée de tumeurs mammaires. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs pouvant amener à la dégradation de la condition physique, du stress, des douleurs et un developpement tumoral pouvant provoquer la mort.
Devenir
Les animaux produit par cet elevage seront utilisés dans le cadre de projet en cours et futurs dans le cadre d'une utilisation continue. Dans quelques cas (animaux du mauvais génotype ne pouvant pas être inclus dans un autre projet de recherche et anciens reproducteurs), les animaux seront euthanasiés. Evalué à 10 pourcent soit 144 animaux
Remplacement
Le modèle animal de cancer du sein permet d'apprehender la complexité des interactions entre les macrophages et l'environnement tumoral en réponse aux thérapies. L'utilisation d'animaux est donc nécessaire. Cependant nous utilisons dans certains cas ce modèle pour des expériences de cocultures in vitro des cellules tumorales, permettant de tester plusieurs conditions à partir d'un seul animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet elevage, nous faisons particulièrement attention aux génotypes des parents afin qu'un maximum des descendants ait le bon genotype. Nous controlons le nombre de couple afin de ne pas générer d'excédent de stock. Les animaux dont le genotype ne correspond pas sont dans la plupart des cas utilisés dans le cadre d'autres projets déclarés afin de ne pas produire d'animaux inutilement. Cette utilisation rentre dans le cadre d'une utilisation continue. Dans l'ensemble 4 cages d'accouplement sont maintenues en continue. A raison d'une porté de 6 par mois, ceci represente au mieux 24 animaux par mois soit sur 5 ans un elevage de 1440 animaux. La présence du transgène chez la femelle induit un phénotype dommageable amplifié par la gestation et donc l’atteinte des points limites (taille de tumeur) ne permet pas d’aboutir jusqu’à la délivrance et sevrage de la descendance. Ainsi, les accouplements se feront uniquement avec des males heterozygote pour le transgène au phenotype dommageable, le genotype dommageable ne touchera que 720 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les animaux sont hébergés conformément à la réglementation avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 6 animaux par cages. Chaque cage contient au moins deux éléments d'enrichissement : nid en carton et bâton à ronger. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. Ce modèle tumoral est sans risque infectieux. Nous mettons en place un point limite et la surveillance de ces derniers dont les critères limite considérablement l'emergence de signe de souffrance liés au developement de la tumeur. En effet, un suivi de la charge tumorale 1 fois par semaine à partir de 5 mois d'âge est mis en place. Lorsque la tumeur atteint 1cm3 critère point limite, l'animal en elevage est euthanasié. Pour diminuer le stress, les conditions globales d'hébergement des animaux ne changent pas outre des conditions de raffinement supplémentaires si necessaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort indépendante du contexte tumoral sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés
Choix des espèces
Nous étudions la mobilisation d'un grand nombre de cellules immunitaires à travers les tissus et l'impact de drogues anti-tumorales sur l'organisme entier. Les souris transgéniques utilisées sont l'unique moyen d'obtenir les outils permettant de tracker les cellules d'intérêts par des techniques d'imagerie dans le modèle de tumeur mammaire spontanné Les animaux sont utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour le génotypage, 1 mois de vie pour le prélèvement sanguin puis dans ce modèle, les tumeurs deviennent palpable entre 6 et 12 mois d’âge.
Conséquences de la dysbiose intestinale liée à l’âge sur les défenses immunitaires contre les infections respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour vérifier si le microbiote intestinal de souris âgées transmet une sensibilité accrue aux infections respiratoires, 1 653 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées. Trois semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, un gavage de matières fécales sur animal éveillé, puis une infection par le pneumocoque ou le virus grippal déposée dans le nez sous anesthésie générale. Le porteur prévoit la mise à mort vingt-quatre heures après le pneumocoque et quatre jours après la grippe, en indiquant que ce calendrier précède l'apparition des signes cliniques, tout en décrivant une perte de poids qui commence dès le deuxième ou le troisième jour. Au-delà de ces délais peuvent survenir prostration, tremblements, respiration laborieuse et hypothermie, et une perte de poids de 20 % déclenche la mise à mort.
Objectifs
Les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Des travaux récents montrent que le microbiote intestinal intervient dans les mécanismes de défense contre les infections, dont les infections respiratoires. Le microbiote intestinal produit de nombreux métabolites qui diffusent dans le sang et activent le système immunitaire dans les poumons. La fonction du microbiote intestinal (dysbiose) chute avec l’âge. Nous proposons que la dysbiose liée à l’âge participe à la susceptibilité des personnes âgées aux infections respiratoires virales et bactériennes. A notre connaissance, cette hypothèse de travail n’a pas encore été étudiée. Afin de valider cette hypothèse, notre premier objectif sera de démontrer que le microbiote intestinal isolé de souris âgées transmet une susceptibilité accrue à l’infection chez des souris receveuses jeunes. Pour cela, des expériences de transfert de flore fécale seront réalisées. Brièvement, des souris dépourvues en flore intestinale ou préalablement traitées avec une large gamme d’antibiotiques (afin d’éliminer le microbiote résiduel) recevront du microbiote (fèces) de souris âgées ou de souris jeunes. Les souris colonisées seront ensuite infectées avec le pneumocoque (première cause de pneumonie bactérienne chez l’homme) ou le viral grippal. Nous déterminerons la charge bactérienne et virale dans les poumons. Nous nous attendons à ce que les souris ayant reçu le microbiote de souris âgées soient plus sensibles à l’infection par rapport aux souris ayant reçu le microbiote de souris jeunes. Nous déterminerons la composition du microbiote et quantifierons les métabolites microbiens (fèces et sang) des souris colonisées. Nous corrélerons ces données avec les paramètres infectieux. Cela nous permettra d’identifier des candidats potentiellement impliqués dans la défense contre l’infection. Les candidats identifiés seront ensuite testés dans nos modèles d’infection. La demande concerne la procédure de colonisation des souris, le suivi des souris colonisées, l’infection des souris avec le pneumocoque ou le virus grippal, la quantification de la charge infectieuse et l’analyse des mécanismes immunologiques sous-tendant la susceptibilité à l’infection. La demande concerne également des procédures expérimentales visant à valider les candidats à potentiel thérapeutique issus de nos recherches. Il pourra s'agir de métabolites dont la production chute massivement chez la souris/individu âgé(e).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre pourquoi les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Ce projet pourrait permettre d’identifier des métabolites microbiens (dérivés du microbiote intestinal) capables, à distance, d’activer certaines cellules du système immunitaire et de favoriser la défense contre les infections respiratoires. Outre l’intérêt fondamental, des retombées thérapeutiques sont attendues de ce projet.
Procédures
Le traitement aux antibiotiques (ajoutés dans l’eau de boisson) durera trois semaines. La colonisation des souris sera réalisée par gavage sur animaux vigiles. Les souris seront infectées deux à trois semaines après colonisation. L’infection sera réalisée par voie intra-nasale sous anesthésie générale. Les souris seront euthanasiées avant l’apparition des signes cliniques liés à l’infection (24 heures près l’infection par le pneumocoque et 4 jours après infection par le virus grippal). Ce choix maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour le traitement, en fonction de la nature du ou des métabolites, ces derniers seront administrés par gavage ou dans l’eau de boisson. Les doses correspondront à des doses physiologiques. Outre les paramètres cliniques, des études de pharmacocinétique et de biodistribution seront menées par prélèvements de sang et dans différents organes.
Impact sur les animaux
Un stress momentané est possible suite à la colonisation (gavage sur animaux vigiles). Dans nos conditions expérimentales, les animaux infectés par le virus grippal commencent à perdre du poids à partir du 3ème jour. Le sacrifice a lieu 4 jours après l’infection, avant l’apparition des signes cliniques. Lors de l’infection par le pneumocoque, les animaux commencent à perdre du poids au 2ème jour. La mise à mort des animaux a lieu 1 jour après l’infection. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Des signes sévères de mal-être post-infection peuvent aussi survenir au-delà de 5 jours (virus grippal) et de 2 jours (pneumocoque) tels que la prostration, tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie, et perte de poids.
Devenir
Les animaux sont euthanisés selon la procédure en vigueur à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les expériences ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par le pneumocoque ou le virus grippal et de l’efficacité des transferts de flore nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. Suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets des transferts de flore fécale ne peuvent être évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Il n’existe pas de méthode de substitution pour étudier les effets physiopathologiques de l’infection par le virus grippal ou le pneumocoque et pour évaluer l’efficacité de médicaments lors de l’infection. Il en est de même pour l’étude du microbiote intestinal et de ces interactions avec les cellules immunitaires du poumon. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’informations. Le modèle souris est particulièrement pertinent pour ce type d’étude.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par (i) la mise au point de procédures rigoureuses, (ii) la formation du personnel, (iii) un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (iv) le recours à des procédures non invasives et non douloureuses. Pour les procédures induisant une douleur, les animaux seront anesthésiés. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant la durée de l’étude. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Tout signe éventuel de détresse (signes sévères) incluant prostration, changement du comportement de l’animal (diminution des soins, animal prostré), tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie fera l’objet d’une attention particulière. Si une perte de poids supérieure à 20% survenait, ou un signe évident de souffrance, les animaux concernés seront euthanasiés selon la procédure en vigueur. Les points limites sont définis selon les directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, hypothermie, problèmes ambulatoires, accès à la nourriture et à l’eau, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou plaie etc. Afin de réduire le stress, le milieu sera enrichi avec du matériel de nidification. Les procédures sont réalisées dans une zone calme différente de la pièce d’hébergement. Les animaux seront manipulés avec délicatesse (de préférence par le même expérimentateur). Outre le respect de la règle des R, ces précautions sont importantes pour éviter tout biais sur les résultats expérimentaux.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix pour modéliser les infections respiratoires. Par ailleurs, même si la composition du microbiote varie entre une souris et un humain, il y a de nombreux points communs sur leur activité métabolique, notamment les produits issus de la fermentation. De nombreux métabolites communs sont retrouvés chez la souris et l’homme.
Étude du rôle d’un transporteur de lipides dans la progression du cancer du sein chez la souris (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectées dans la glande mammaire ou dans la veine de la queue avec des cellules de cancer du sein humain, 320 souris Nude sont ensuite mesurées au pied à coulisse trois fois par semaine et transportées dans un autre établissement pour jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever tumeurs et organes. Leur système immunitaire déficient, qui permet à la tumeur humaine de prendre, les rend aussi vulnérables aux infections, et la croissance tumorale peut entraîner nécrose des tissus, difficultés à se déplacer et perte de poids. Le porteur juge la nécrose "peu probable d'après notre expérience sur le modèle" tout en la citant parmi les cas les plus sérieux attendus, et affirme avoir "besoin d'un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités".
Objectifs
Le cancer du sein est le premier cancer en termes d’incidence et en termes de mortalité chez les femmes. Dans le contexte du cancer du sein, le constituant majoritaire de l’environnement entourant la tumeur est le tissu adipeux, dont les adipocytes constituent une majeure partie. Le développement tumoral s’accompagne de besoins énergétiques important et les cellules tumorales disposent de plusieurs sources d’énergie, dont les lipides. Il a été montré une expression importante d’un transporteur d’acides gras par les cellules tumorales mammaires les plus agressives entraînant une captation élevée d’acides gras et augmentant leur agressivité. En exprimant ce transporteur, les cellules tumorales pourraient potentialiser leur capacité à former des métastases en favorisant leur captation d’acides gras apportant une source d’énergie importante permettant à ces cellules tumorales de migrer et survivre à distance de la tumeur mammaire. Cette participation au processus métastatique semble être une caractéristique commune à plusieurs types de cancers et, cliniquement, les chercheurs ont observé que la présence de cellules exprimant ce transporteur d’acides gras était corrélée avec des tumeurs très agressives et un mauvais pronostic. Ces résultats suggèrent donc que ce transporteur d’acides gras est une « signature » des cellules qui ont le potentiel de former des métastases. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette protéine dans la progression du cancer du sein. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de l’indisponibilité de certains équipements d’imagerie dans l’établissement principale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier le rôle d’un transporteur d’acides gras dans la progression tumorale et métastatique mammaire. A travers la compréhension de son rôle et des conséquences de son inhibition sur le développement du cancer du sein nous pourrons mettre en évidence que cette protéine est une cible thérapeutique intéressante dans le cancer du sein, particulièrement dans les cancers les plus agressifs et notamment au stade métastatique. Cela ouvrira de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement du cancer du sein triple négatif. De plus, ce transporteur se retrouve surexprimé non seulement dans le cancer du sein mais dans d’autres cancers également, la compréhension de son rôle dans la progression cancéreuse et comme potentielle nouvelle cible thérapeutique est donc également intéressante et potentiellement applicable dans le cadre d’autres types de cancer.
Procédures
Le modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Injections unique orthotopiques (15 seconde/animal) dans la glande mammaire après traitement hormonale dans l’eau de boisson (15 jours) ou ii) intraveineuse de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine sur animal vigile (2 minutes/animal) iv) Injection intrapéritonéale des traitements sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Transport vers un autre établissement et imagerie sur animal anesthésié (12 séance maximum, 30 min) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : 1) L’immunodéficience du modèle animal réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. 2) Le stress de la nouveauté (néophobie) lors des changements de conditions (traitement dans l’eau de boisson, nouveau régime alimentaire, ou encore lors du transport vers un autre site pour l’imagerie) 3) Le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la glande mammaire suite aux injections des cellules tumorales. 4) Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. 5) Les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) durant l’imagerie.
Devenir
A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=320) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.
Remplacement
Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cultures cellulaires ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe ou d’injection en intraveineux chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.
Réduction
Le projet impliquera un total de 320 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, formation, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, suivi, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce et les cellules injectées pourront proliférer sans être rejetées. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.
Etude de l’effet de dérivés d’hormones sexuelles sur l’inflammation
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans la veine de la queue et une sonde de température implantée sous la peau, 48 subissent une prise de sang sous anesthésie et 133 une prise de sang terminale. Le traitement doit déclencher une inflammation générale et de la fièvre, pour tester si des dérivés d'hormones sexuelles provoquent les crises de la fièvre méditerranéenne familiale, dont les mécanismes restent inconnus. Le porteur écrit que l'analyse in vivo est "indispensable" et que la réponse aux hormones sexuelles n'est modélisable ni en culture cellulaire ni en organoïde, d'où son intérêt pour un "organisme entier".
Objectifs
La pyrine est un composant de l’immunité. Des mutations sur la protéine pyrine causent des maladies inflammatoires, dont la fièvre méditerranéenne familiale. La fièvre Méditerranéenne familiale se caractérise par des épisodes qui se répètent dans le temps de douleur abdominale intense liée à des phénomènes d’inflammation. A ce jour, les mécanismes responsables de ces flambées inflammatoires chez les patients demeurent inconnus. Certaines hormones sexuelles seraient capables de déclencher les crises inflammatoires. Le but de ce projet est de tester cette hypothèse dans un modèle murin où l'inflammation sera suivie dans le temps.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de l'immunité) et cliniques (thérapies pour lutter contre les flambées inflammatoires des patients).
Procédures
Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse, qui durera 30 secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée, qui durera 30 secondes d'une sonde de température. 48 animaux subiront une prise de sang sous anesthésie, l'intervention durera 2minutes environ. 133 animaux subiront une prise de sang terminale sous anesthésie sans réveil, l'intervention durera 5minutes environ.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles ; prélèvements de sang sous anesthésie ; mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Les traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires (baisse de température, anesthésie) et une inflammation systémique qui se traduit par de la fièvre.
Devenir
Procédure 1 : réutilisation des animaux lors de la procédure 2. Procédure 2 : Euthanasie des animaux pour réaliser une deuxième prise de sang (terminale) chez les même animaux (réduction du nombre d’animaux utilisés) Procédure 3 : euthanasie des animaux (prise de sang terminale)
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle pertinence clinique. La réponse physiologique aux hormones sexuelles n’est pas modélisable in vitro, ni dans de systèmes plus évolués tels que les cultures tridimensionnelles ou organoïdes. D’où l’intérêt de travailler sur un organisme entier, sur lequel il est possible d’étudier la réponse inflammatoire globale de l'organisme.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Une réutilisation des animaux est prévue suite à la première procédure pour réduire le nombre d'animaux du projet. Le nombre d'animaux est calculé au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation des souris à la contention (i.e. la manipulation de souris) (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser l'angoisse des souris lors de l'expérience . 2) Anesthésie gazeuse pour chaque acte potentiellement douloureux pour la souris 3) Utilisation d'implants avec une transmission du signal pour prendre la température à distance sans introduction anale répétée 4) Minimisation de la fréquence de manipulation 5) Les animaux dont la température diminue seront placés dans des cages sur portoirs chauffants. Les doses de traitement et la fréquence d’administration des molécules résultent de plusieurs retours d’expériences bibliographiques.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo), avec un fonctionnement immunitaire et hormonal reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain (vertébré Mammifère). La souris en est un modèle idéal du fait des outils disponibles pour suivre l'inflammation et de la possibilité de manipulation génétique qui permet de mieux comprendre les mécanismes. Les expériences débuteront à l’âge de 6-8 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature. L’âge des animaux sera de 8-10 semaines maximum en fin de procédure expérimentale.
Etude de l’hypoxie chez un modèle de souris mutante
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant jusqu'à trois prélèvements sanguins pouvant atteindre un quart de son volume sanguin total et deux semaines enfermée dans une atmosphère à 10 % d'oxygène. Un premier lot de vingt souris avait déjà été saigné avant qu'une panne de l'appareil d'hypoxie n'interrompe les expériences, et le porteur génère un second lot de vingt animaux pour respecter la fenêtre d'âge de dix à douze semaines. Les prélèvements et l'échographie cardiaque se font sous anesthésie gazeuse, avec une mise à mort possible si l'animal récupère mal, puis une nécropsie pour prélever cœur et poumons. Le porteur affirme que l'exposition à l'hypoxie n'est pas nuisible dans les conditions appliquées, et renvoie le traitement des maladies humaines liées à l'hypoxie à un horizon lointain, l'objet immédiat étant de savoir si le facteur ELK3 joue un rôle chez la souris.
Objectifs
Nos cellules utilisent l'oxygène pour générer de l'énergie efficacement et, lorsqu'elles manquent soudainement d'oxygène, en cas d'hypoxie, des dommages irréversibles et rapides peuvent survenir aux organes. L'hypoxie chronique a également des conséquences, plus particulièrement dans les tumeurs, qui peuvent contribuer à des métastases et au décès. Il existe des mécanismes qui permettent aux cellules de s'adapter à l'hypoxie, dont l'élément-clé est la voie sensible à l'oxygène qui implique le facteur de transcription HIF-1. Ce mécanisme de base est une découverte fondamentale et un élément central dans la compréhension de la détection de l'oxygène dans le corps. Plusieurs composantes supplémentaires ont été découvertes plus récemment, notamment des modificateurs de la structure de l'ADN, des régulateurs des signaux de dégradation, et des facteurs impliqués dans la détection aiguë de l'oxygène. Cependant, il reste de nombreuses autres composantes qui interviennent dans le traitement des conséquences de l’hypoxie et qui restent à étudier, dont le facteur de transcription ELK3. ELK3 intervient dans des voies de signalisation conduisant à la transcription de l'ADN, et joue un rôle dans la migration cellulaire, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins (l'angiogenèse) et l'intégrité vasculaire. De plus, il a été démontré qu'il joue un rôle dans la régulation des gènes sensibles à l'hypoxie, la protéine ELK3 étant elle-même dégradée dans des conditions de faible teneur en oxygène. La plupart des mécanismes de signalisation induits par l'hypoxie impliquant les deux protéines ELK3 et HIF-1 sont distincts, mais liés. On s'attend ainsi à ce que ELK3, tout comme HIF-1, soit impliqué dans l'angiogenèse, des études in vitro en culture cellulaire ayant notamment montré qu'ELK3 est préférentiellement exprimé dans les cellules endothéliales qui tapissent la paroi des vaisseaux sanguins, mais aussi dans le mélanome. Cependant, il reste à élucider si ELK3 est impliqué dans la réponse physiologique à l'hypoxie. Dans ce contexte, nous souhaitons étudier les conséquences de la perte totale d’ELK3 dans le modèle souris, dans des conditions d’hypoxie, sur la fonction cardio-vasculaire et le remodelage vasculaire pulmonaire.
Bénéfices attendus
L'hypoxie joue un rôle important dans les causes de mortalité, notamment le cancer, l'ischémie myocardique et les maladies métaboliques, du cœur et des reins, ainsi que dans les maladies de la reproduction telles que la prééclampsie et l'endométriose. Il existe de nombreuses preuves provenant de systèmes in vitro selon lesquelles un ou des facteur(s) de transcription, joue(nt) un rôle essentiel dans la réponse hypoxique. Pour utiliser ces connaissances pour comprendre et finalement traiter les pathologies liées à l’hypoxie, nous devons étudier les rôles de ces facteurs dans un modèle animal. Les expériences prévues devraient apporter une preuve convaincante de son importance physiologique dans l’hypoxie, et nous permettre d’exploiter notre boîte à outils, notamment les molécules que nous avons développées ciblant l'un de ces facteurs de transcription, pour traiter à terme les pathologies associées à l’hypoxie.
Procédures
AMENDEMENT : un prélèvement sanguin a été effectué sur un 1er groupe de 10 mâles KO + 10 mâles contrôles à 8 semaines d’âge. Ce prélèvement a duré environ une minute. Les animaux reçoivent une injection de NaCl 0,9% d'un volume équivalent au volume de prélèvement et sont placés quelques minutes sur plaque chauffante. Après le prélèvement de sang, nous avons rencontré un problème matériel pour le test d'hypoxie et ce malgré le test préalable de l'appareillage. Les délais de livraisons des pièces et la réparation ayant été très long, la suite des expérimentations n'a pas pu se réaliser sur ce lot de souris. Afin de maintenir l’âge requis des animaux pour cette étude (à 10-12 semaines environ, où l’arborescence et la structure des vaisseaux sanguins seront matures), nous devrons générer un 2ième lot de souris (10 mâles KO ELK3 et 10 mâles contrôles WT). Les 20 animaux du nouveau lot seront soumis à 3 prélèvements sanguins (même conditions que décrit précédemment), à 2-3 semaines d'intervalle et à une échographie (durée environ 20 minutes). Ils seront soumis par ailleurs à des conditions hypoxiques (10% oxygène) pendant 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins, ainsi que l'échographie pour explorer la fonction cardiaque peuvent entrainer un léger stress ou une douleur chez les animaux. Ils seront effectués sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les souris seront exposées à des conditions hypoxiques pouvant également entrainer un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées.
Devenir
A la fin de la procedure, toutes les souris seront mises à mort pour réaliser une nécropsie et prélever des organes (coeur, poumons) en vue des analyses post-mortem
Remplacement
Le rôle de la protéine d'intérêt ELK3 dans le processus d'hypoxie a été étudié par des approches cellulaires dans notre laboratoire, mais pour analyser les effets globaux de cette protéine sur le muscle cardiaque, les vaisseaux sanguins et les poumons, le modèle souris nous semble nécessaire pour nous rapprocher au mieux de la pathologie humaine.
Réduction
Pour chacun de nos tests, nous comparerons le groupe contrôle sauvage et le groupe mutant Homozygotes ELK3. Approche statistique: grâce aux études précédentes et les données collectées sur les animaux contrôles sur plusieurs années, et en tenant compte des tests réalisés au cours de cette étude, nous savons que le nombre de 10 animaux par génotype est suffisant pour détecter des phénotypes spécifiques s’ils existent.
Raffinement
Durant toute l'étude, y compris en cages d'hypoxie, les souris sont hébergées à raison de 3 souris par cage afin d'éviter le stress lié à l'isolement et de maintenir les interactions sociales. Afin de limiter la gêne qui pourrait survenir suite à la baisse de la concentration d’oxygène celle-ci se fera progressivement (en 3 heures). L’exploration cardiaque est indolore, mais une anesthésie sera mise en oeuvre chez la souris afin d'éviter le stress lié à la manipulation, en particulier lors de l'épilation et de l'échographie. L'anesthésie facilitera en outre l'exploration en limitant les mouvements de l'animal. En cas de ralentissement du rythme cardiaque sévère lié à l'anesthésie, la procédure sera arrêtée et les animaux surveillés jusqu'au réveil dans les minutes suivant la procédure Si les animaux présentent une faiblesse trop marquée suite à l'anesthésie, une euthanasie pourra être pratiquée. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sera limité à un volume de 25% du volume sanguin total de l'animal. Pour compenser la perte de volémie, nous injecterons par voie sous-cutanée un volume équivalent de solution saline (NaCl 0.9% chauffé à 37°C) après le prélèvement sanguin.
Choix des espèces
La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette espèce ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt specifiquement. Les souris auront 10-12 semaines environ (stade adulte), où l’arborescence et la structure des vaisseaux sanguins seront matures.
Rôle de l’inhibition de TREM-1 sur la prévention et le traitement du carcinome hépatocellulaire sur cirrhose métabolique EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Génétiquement privées du récepteur TREM-1, des souris mâles reçoivent un antibiotique injecté deux jours après leur naissance puis un régime riche en graisse qui les fait passer du foie gras à la cirrhose puis au cancer du foie. 104 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit selon son groupe de 4 à 40 injections dans le ventre sur animal éveillé, trois anesthésies gazeuses et deux aller-retours entre l'animalerie et un service d'imagerie situé à cinq cents mètres. La mise à mort intervient entre la vingtième et la vingt-deuxième semaine de vie, une fois le cancer installé, et le porteur qualifie d'indolore cette évolution provoquée par l'alimentation.
Objectifs
Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.
Impact sur les animaux
- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.
Remplacement
A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.
Réduction
Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.
Raffinement
Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.
Choix des espèces
Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.
Hydrogenotherapie et arythmies cardiaques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Une artère coronaire obstruée pendant cinq à quarante minutes, puis rouverte : 300 rats subissent cette chirurgie de moins de deux heures sous anesthésie générale et ventilation assistée, et sont tués avant tout réveil. Le porteur attend que les animaux développent des troubles du rythme, et indique qu'une arythmie trop sévère peut provoquer leur mort immédiate sur la table. Le cœur est prélevé à la fin de l'intervention pour tester si l'hydrogène gazeux protège du trouble du rythme, trente rats étant d'abord utilisés pour l'apprentissage du geste chirurgical. Rien n'est dit sur la proportion d'animaux qui meurent en cours de procédure, et la partie raffinement se limite à l'agrément de l'établissement, aux formations réglementaires et à l'hébergement enrichi, sans rien de propre à cette chirurgie.
Objectifs
L'hydrogène (H2) est un candidat médicament très intéressant dans le traitement des maladies cardiovasculaires. Il est connu pour protéger le coeur lors d'un phénomène d'ischémie-reperfusion (IR) cardiaque. Un phénomène qui survient par exemple lors d'une crise cardiaque. L'ischémie est la diminution de l'apport en sang d'un organe tandis que la reperfusion correspond à la restauration de l'apport normal en sang. Lors d'une IR il est fréquent que le coeur entre en arythmie. Le coeur bat alors de manière irrégulière ce qui peut provoquer une mort subite. Ce type d'accident cardiaque est responsable chaque année de la mort de 5 millions de personnes dans le monde. Prévenir l'apparition de troubles du rythme est donc capital dans la prise en charge des patients présentants une IR. L'H2 a été démontré comme protecteur cardiaque, nous pensons que l'H2 possède également un effet anti-arythmique. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier la capacité de l'H2 à empêcher l'apparition de troubles du rythme au cours d'une IR.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer un potentiel effet anti-arythmique de l'H2. Ce travail doit fournir les premières données vers une utilisation de l'H2 pour réduire l'apparition de troubles du rythme chez les patients hospitalisés pour IR.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une procédure chirurgicale de moins de deux heures sous anesthésie générale et ventilation assistée. Au cours de cette procédure l'animal subira une période d'ischémie (obstruction d'une artère irriguant le coeur) de durée variable (5-40 minutes) suivie d'une période de reperfusion (10-60 minutes).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de détresse respiratoire ou des hémorragies. Il est attendu que les animaux développent des arythmies au cours de la procédure, si l'arythmie est trop sévère cela peut engendrer la mort immédiate de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'intervention chirurgicale afin de récupérer le coeur pour analyses biologiques.
Remplacement
La présente étude a pour objectif de fournir des données précliniques sur le potentiel anti-arythmique de l'H2. Actuellement, il est impossible de remplacer la compléxité du corps humain et du système cardiovasculaire par des modèles n'utilisant pas d'animaux, d'où la nécessité de leur utilisation dans ce projet.
Réduction
Le projet prévoit l'utilisation de 300 animaux. 30 rats seront utilisés afin d'apprendre la technique de chirurgie et de déterminer les conditions d'expérimentation des procédures suivantes, cela permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés lors de ces procédures. Parmi ces 30 rats, certains pourront être réutilisés d'un projet précédent à condition qu'ils aient pleinement retrouvé leur état de santé et de bien-être général. Les deux autres procédures comprendront 18 groupes de 15 rats. Ces 18 groupes réunissent les conditions nécessaires à l'obtention de résultats exploitables. Le nombre de 15 animaux par groupe a été déterminé sur la base des conventions de Lambeth (conventions déterminant les bonne pratiques expérimentales pour l'étude des troubles du rythme en préclinique).
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. L'ensemble des personnels impliqués est à jour des formations réglementaires exigibles pour la manipulation et la chirurgie sur des animaux vivants. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé et enrichi. Les animaux sont observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. L'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les similitudes d'anatomie et de physiolgie entre le rat et l'Homme permettent d'obtenir une comparaison fiable des résultats obtenus. De plus l'utilisation du rat pour établir le modèle d'ischémie-reperfusion myocardique est un modèle maîtrisé par le laboratoire. Nous utiliserons des rats adultes mâles de minimum 7 semaines (correspondant à un poids corporel supérieur à 300g). A ce stade de développement les animaux sont sevrés et d'un poids supérieur à 300g facilitant la chirurgie.
Evaluation de nouveaux outils radiothérapeutiques ciblant le noyau des cellules cancéreuses – EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
2 480 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau, une injection radioactive dans la veine de la queue, jusqu'à six anesthésies chacune et des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage à partir de l'injection radioactive. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel provoque un sentiment d'isolement et une absence de liberté d'expression, et attend aussi des lésions au point d'injection, de la fatigue et des troubles digestifs. L'objectif immédiat reste de compter la radioactivité organe par organe sur les cadavres, la phase I chez l'être humain étant renvoyée à la fin de l'étude, et le porteur conclut que l'expérimentation animale est "requise" parce que les données précliniques sont "imposées par les autorités".
Objectifs
Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un élément radioactif à une molécule, ou vecteur, capable de se lier de manière spécifique à une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que le vecteur puisse diriger et concentrer l’élément radioactif dans les cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur par imagerie nucléaire ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Ces rayonnements détruisent l’ADN des cellules cancéreuses, ce qui mène à la destruction de la tumeur. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Plusieurs types de vecteurs capables de se lier spécifiquement à la protéine N ont été développés. A la différence de nombreuses autres protéines exprimées par les cellules cancéreuses, la protéine N est capable de transporter les vecteurs qui s’y lient jusqu’à son noyau cellulaire qui contient l’ADN. En rapprochant l’élément radioactif de l’ADN, il est possible de potentialiser l’effet de la thérapie, tout en diminuant sa toxicité pour les cellules saines. Nous avons sélectionné deux vecteurs se liant à la protéine N de manière différente afin de maximiser les chances d’identifier un système efficace. Comme il existe plusieurs types d’élément radioactif avec des propriétés très différentes, il est nécessaire de comparer l’efficacité de plusieurs combinaisons vecteur-élément radioactif afin d’identifier le couple le plus efficace. Alors que certains de ces éléments radioactifs émettent des rayonnements ionisants capables de détruire les cellules cancéreuses, d’autres peuvent être utilisés pour détecter les tumeurs par imagerie, ce qui permettra dans un premier temps de vérifier que les vecteurs s’accumulent bien dans la tumeur chez la souris. Dans un second temps, l’imagerie permettra de sélectionner les patients dont les tumeurs expriment la protéine N et qui seront donc éligibles à la thérapie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels par radiothérapie interne vectorisée sont presque systématiquement accompagnés d’effets secondaires graves dus aux dommages provoqués aux cellules non-cancéreuses. En dirigeant les éléments radioactifs de manière spécifique au noyau des cellules cancéreuses, la stratégie de ce projet a pour but d’augmenter l’efficacité de ces thérapies tout en diminuant leur toxicité. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l’Homme à la fin de l’étude
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - 1 Injection en sous-cutané au moment de la greffe de cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum). - 1 injection de produit en intraveineuse dans la veine de la queue lors des expérimentations d'imagerie ou de traitement (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum). - Anesthésie à l'isoflurane réalisée lors de la greffe des cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum), lors de l’injection intraveineuse des produits (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ou au moment de la mise à mort (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ainsi que pendant l’acquisition des images (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). Il y aura au total 6 anesthésies au maximum pour chaque animal. - Imagerie à l’aide d’un scanner dans les procédures d’imagerie (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). - Mesures du poids et de la taille des tumeurs dans les procédures d’imageries et d’évaluation de l’efficacité des traitements (réalisée dans l'établissement 2, 1 min maximum).
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : - douleurs générées lors de la greffe des cellules tumorales, lors de l’injection des agents d’imagerie ou de thérapie. - lésions locales au site d’injection dû à la rétention du composé radiomarqué. - gêne ou douleur provoquée par la croissance des tumeurs - fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines ou troubles digestifs dans les jours suivant l'injection du traitement radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. - stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. - sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie et de biodistribution.
Devenir
Les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris incluse dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficacité thérapeutique.
Remplacement
Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. La procédure d’imagerie permet d’observer la localisation du vecteur au cours du temps sans avoir mettre l’animal à mort (suivi longitudinal), ce qui permet de maximiser les informations recueillies en minimisant le nombre d’animaux mis à mort. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées.
Raffinement
Méthodes utilisées pour réduire la douleur : Raffinement des conditions d'hébergement : - Dans les procédures 1 et 2, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection du vecteur radiomarqué et de permettre un contact visuel des animaux. Chaque boite sera également enrichie d'un igloo et d'une roue en polycarbonate. - Dans toutes les procédures, des croquettes mouillées seront rajoutées dans les cages des souris souffrant de fatigue ou de faiblesse. Dans les procédures 3 et 4, des croquettes mouillées seront ajoutées systématiquement la première semaine suivant l’injection des vecteurs radiomarqués. - De la litière de cellulose sera utilisée pour limiter l’apparition de plaie chez les souris porteuses de tumeurs. - Le transport des animaux de l’EU1 à l’EU2 sera réalisée à l’aide de cages opaques à couvercle filtrant. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés lors de la greffe des tumeurs (5 min maximum), lors de l'injection intraveineuse des composés (5 min maximum), lors des acquisitions d'image (45 min maximum) et lors de leur mise à mort (5 min maximum). Analgésie: en cas d'apparition de douleur, des analgésiques seront administrés aux animaux. Des points limites spécifiques à ce projet ont été mis en place pour limiter la souffrance des animaux au minimum. Ces points limites seront appliqués de manière stricte.
Choix des espèces
Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux humains est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de tumeurs humaines car celles-ci se caractérisent par l'absence d’un organe (le thymus), ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge, et ils sont plus résistants aux radiations.
Comparaison de trois méthodes d’administration d’une molécule permettant d’induire l’expression de modifications génétiques ciblées dans le cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'âge de deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie d'oreille entre douze et quinze jours, puis une injection quotidienne pendant cinq jours, le porteur indiquant que le produit injecté peut provoquer une inflammation et que les points d'injection sont changés d'un jour sur l'autre. À deux mois, elles sont profondément anesthésiées pour une perfusion intracardiaque, tuées, puis leur cerveau est prélevé et leur corps disséqué pour repérer les effets secondaires aux sites d'injection. Comparer trois voies d'administration afin de retenir la moins traumatisante est présenté comme un raffinement, et le porteur écrit que l'usage d'animaux vivants y est "incontournable".
Objectifs
Les lignées de souris génétiquement modifiées constituent des modèles précieux pour comprendre le fonctionnement du cerveau chez les mammifères. Dans certaines de ces lignées, il est possible de choisir le stade de développement à partir duquel une modification génétique sera exprimée dans le cerveau. Ces modèles inductibles sont très utiles, par exemple pour modéliser des pathologies qui surviennent chez l'adulte, alors que le cerveau n'a pas eu de problème particulier au cours du développement. En pratique, l'induction de l'expression d'une mutation à un moment donné est souvent réalisée par injection d'un produit dans le ventre des souris. Plusieurs études ont montré que cette voie d'administration pouvait occasionner des dommages dans l'abdomen des souris. Récemment, plusieurs équipes ont testé l'administration de la même molécule par la voie sous-cutanée, a priori moins invasive. Des résultats très probants ont été obtenus pour induire l'expression de modifications génétiques dans divers organes tels que le foie, le rein et l'intestin. De plus, une équipe a également rapporté l'efficacité de l'administration de la même molécule par voie orale (ingestion spontanée par la souris d'un liquide présenté goutte à goutte). Dans un objectif de raffinement de nos pratiques expérimentales, nous souhaiterions tester les voies orale et sous-cutanée sur nos modèles. Cependant, il n'est pas démontré si ces voies administration sont efficaces pour induire l'expression de modifications génétiques spécifiquement dans le cerveau. Le cerveau est un organe très protégé de la circulation sanguine. Cette protection est utile contre les agressions (maladies notamment), mais elle pose souvent problème quand il s'agit de faire entrer des médicaments dans le cerveau. De fait, l'induction de l'expression de modifications génétiques à partir d'un moment choisi est beaucoup moins efficace dans le cerveau que dans les autres organes. Pour cette raison, il est primordial de vérifier que le choix de la voie sous-cutanée ou de la voie orale ne réduira pas l'efficacité de l'induction. Notre projet est donc de tester l'efficacité de ces deux voies d'administration pour induire l'expression d'une modification génétique dans le cerveau chez la souris.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu concerne le raffinement des méthodes expérimentales : si les injections sous-cutanées ou l'administration par voie orale s'avèrent aussi efficaces et moins traumatisantes que les injections dans l'abdomen pour induire l'expression de mutations conditionnelles dans le cerveau, la méthode la moins traumatisante sera adoptée immédiatement par notre équipe. Les résultats seront divulgués à toute la communauté scientifique utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées pour étudier le cerveau.
Procédures
Une biopsie d'oreille sera réalisée entre 12 et 15 jours d'âge dans le but de réaliser des analyses génétiques. Entre 21 et 25 jours d'âge, certaines souris recevront une injection chaque jour (durée de chaque injection < 10 secondes). A l'âge de deux mois, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.
Impact sur les animaux
La biopsie d'oreille induit une douleur temporaire. La contention des animaux pour l'administration des traitements entraîne un stress temporaire. Les injections répétées quotidiennement pendant 5 jours induisent une douleur temporaire au point d'injection. De plus, le produit injecté est susceptible d'induire une inflammation.
Devenir
Il est nécessaire de mettre à mort les souris de ce projet, car nous devrons prélever le cerveau pour pouvoir évaluer l'efficacité de l'induction de l'expression de la modification génétique souhaitée. De plus, les corps des souris ayant reçu des injections seront disséqués pour évaluer les effets secondaires potentiels au niveau des sites d'injection (sous la peau et dans l'abdomen).
Remplacement
L'objectif de cette étude étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection, il n'est pas envisageable d'utiliser une méthode alternative. L'utilisation d'animaux vivants est incontournable pour répondre à la question.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en fonction de notre connaissance du modèle, en tenant compte de la probabilité de transmission d'un transgène d'une génération à la suivante, ainsi que du risque de perte de matériel biologique pendant l'expérience (mort inexpliquée d'un animal avant la fin de l'expérience ou problème lors des analyses post mortem). De plus, nous avons choisi la lignée de souris de manière à ce qu'une partie du matériel biologique collecté dans ce projet puisse être utilisé pour compléter une étude en cours dans le cadre d'un projet précédemment autorisé. Cette mutualisation des animaux permettra de réduire le nombre total d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée de l'étude. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. La formulation du produit injecté aux souris a été récemment améliorée pour éviter tout dommage sur les souris. Afin de limiter la douleur, les points d'injection seront changés d'un jour sur l'autre, pour la série de 5 injections quotidiennes. A la fin de l'étude, les souris recevront un antalgique et seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée à la perfusion intracardiaque du produit permettant une bonne conservation du cerveau.
Choix des espèces
L'objectif du projet étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection d'un produit, il ne serait pas pertinent de réaliser cette étude sur une autre espèce. Les souris seront incluses dans ce protocole dès l'âge de 7 jours, car il sera nécessaire de connaître leur génotype précocément. Le produit permettant d'induire l'expression d'une modification génétique sera administré pendant la 4ème semaine d'âge et les souris seront mises à mort à l'âge de 2 mois, lorsque le cerveau aura acquis ses caractéristiques adultes, car les travaux que nous menons actuellement portent sur le développement du cerveau après la 3ème semaine de vie.
Etude de l’immunosénescence au cours de l’Insuffisance rénale aigue
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 480 un niveau modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée, soit par des injections dans chaque patte répétées jusqu'à trois fois, soit par une chirurgie en deux temps espacés d'une semaine, soit par l'injection d'une substance dans l'abdomen, avec une boiterie possible pendant vingt-quatre heures. Elles passent ensuite quarante-cinq minutes sous anesthésie, un capteur fixé sur le dos, pour la mesure de leur fonction rénale. Le porteur justifie le choix de la souris par le nombre de données déjà publiées et par la disponibilité de lignées mutantes, et écrit que cette espèce "permet d'utiliser le moins d'animaux possible" pour atteindre les objectifs du projet.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë (IRA) est une pathologie fréquente et grave, en partie à cause de son association avec une augmentation de la mortalité à court et à long terme et un risque accru de développer une insuffisance rénale chronique (IRC). Actuellement, il n'existe pas de traitement pour l’IRA, au-delà de la thérapie de remplacement rénal et de l'espoir d’une guérison spontanée. L'incidence de l'IRA ainsi que la mortalité associée augmentent fortement avec l'âge. Il a été montré que l’immunosénescence, qui fait référence aux changements du système immunitaire induits par le vieillissement, était accélérée chez les patients atteints de IRC. Nous avançons l’hypothèse que l’immunosénescence survient également au cours de l'IRA et que sa détection précoce et son contrôle ont un impact sur le pronostic rénal. Nos objectifs sont donc d’étudier, chez l’animal la présence de cellules immunitaires sénescentes pendant l'IRA et de déterminer si un blocage des processus d’immunosénescence peut réduire l’IRA et empêcher sa transition vers la MRC.
Bénéfices attendus
L'insuffisance rénale aiguë est une pathologie fréquente et grave, qui concerne 13.3 millions de personnes dans le monde, et est responsable de 1.7 millions de décès par an. Avec le vieillissement de la population, l'incidence augmente chaque année, engendrant des coûts élevés, une mortalité importante, et une détérioration de la qualité de vie, surtout pour les patients qui vont évoluer vers l'insuffisance rénale chronique. En cas d'IRC sévère, le recours à la dialyse est nécessaire de manière inexorable et définitive pour les patients âgés non éligibles à la greffe rénale. Ainsi, toute identification de nouveaux mécanismes permettant d'atténuer l'IRA ou son évolution vers l'IRC aura un fort impact en termes de santé publique et individuelle. A ce jour il n'y a pas de traitement préventif de la transition IRA vers IRC, en particulier chez le sujet âgé. Ce projet apporte l'espoir de pouvoir freiner l'insuffisance rénale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une insuffisance rénale aigue soit par injection intramusculaire (une injection dans chaque patte, répétée au maximum 3 fois par animal, durée maximale de 10 secondes par injection sous anesthésie gazeuse et analgésie), soit par intervention chirurgicale (sous anesthésie gazeuse et analgésie), soit par injection intrapéritonéale de drogue (durée maximale de 10 secondes).. Dans une procédure, les animaux seront soumis à une chirurgie qui se déroule en deux étapes opératoires séparée de 1 semaine, sous anesthésie gazeuse et analgésie, chaque intervention dure 15 à 20 minutes. Tous les animaux seront soumis à des mesures de leur fonction rénale (2 à 3 mesures par animal) : sous anesthésie gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 45 minutes et une molécule est injectée. Les prélèvements de sang à la queue seront faits sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Lors des interventions chirurgicales, les animaux peuvent ressentir du stress, l'anesthésie est associée à une analgésie pour pallier aux douleur pour pallier aux douleurs de l’intervention. Des complications chirurgicales sont possibles et surveilllées. Stress possible lors des injections de substance. Boiterie possible pendant 24h dans une des procédures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (Ex : cultures cellulaires).
Réduction
Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 520 souris. Nous utilisons une technique de bologie moléculaire très sensible permettant de réduire le nombre d’animaux utilisé car la variabilité des résultats est faible.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie et des points limites ont été définis. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.