Rongeurs

864 souris subissent une chirurgie d'environ vingt minutes pour se voir implanter une tumeur dans le cerveau, puis deux séances d'IRM sous anesthésie. Avec les 960 autres, injectées sous la peau, 1 824 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un groupe de 32 porte pendant six semaines un dispositif appliqué en continu sur l'abdomen, et l'ulcération ou la nécrose de la tumeur figure parmi les effets attendus. Le porteur qualifie la majorité des procédures de peu traumatisantes et annonce un vaccin thérapeutique contre le glioblastome, tumeur cérébrale pour laquelle il indique lui-même qu'aucun traitement connu ne fonctionne.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. Le succès récent de l’immunothérapie dans divers cancers a renouvelé l'intérêt pour les vaccins anti-tumoraux. Actuellement aucun vaccin a montré une efficacité dans les cancers, probablement à cause de la faible activation de lymphocytes cytotoxiques capables d’attaquer les cellules du cancer par les formulations vaccinales classiques utilisant aluminium ou émulsions comme adjuvants. Nous avons développé une formulation vaccinale innovante qui permet de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène tumoral. Notre but est de poursuivre le développement de notre formulation afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Devant la résistance du glioblastome à tout traitement connu à l’heure actuelle, la stratégie la plus prometteuse semble être l’association de plusieurs thérapies. Dans ce projet différentes combinaisons thérapeutiques de notre vaccin avec des traitements anti-cancéreux seront évaluées : chimiothérapie, traitements immunomodulants, thérapies qui permettent d’augmenter le passage de molécules thérapeutiques et lymphocytes dans le cerveau.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la validation de l’efficacité de notre vaccin innovant dans un modèle intracrânien de glioblastome et de sélectionner les meilleures stratégies thérapeutiques de combinaison du vaccin avec des traitements couramment utilisés pour le glioblastome (chimiothérapie) et d’autres traitements immunomodulateurs ou potentiellement synergiques avec l’immunothérapie.

Procédures

960 Souris subiront des injections sous anesthésie générale (durée totale de la procédure de 5 minutes) et 864 Souris une intervention chirurgicale (durée de la procédure d’environ 20 minutes). Pour l’administration des traitements, toutes les Souris auront des injections à fréquence variable selon la molécule entre une fois par jour et une seule injection dans toute la durée de l'experience (durée d’environ une minute). Un groupe de 32 Souris sera traité avec un dispositif appliqué au niveau abdominal 24/24h pendant maximum 6 semaines. Afin d’évaluer l’effet des différents traitements sur la croissance tumorale, nous réaliserons 2 IRM aux Souris avec le modèle intracérébral (864 souris). Durée totale de la procédure : environ 30 minutes. 216 Souris seront mises à mort par chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie générale profonde et analgésie. Aucun prélèvement sera réalisé chez l’animal vivant mais toujours après mise à mort.

Impact sur les animaux

Aucune de ces lignées de Souris ne présente de phénotype dommageable à l’état basal. Concernant les injections réalisées sous anesthésie générale (injection de cellules tumorales), les animaux subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie. Un effet indésirable attendu, susceptible d'entrainer une douleur modérée, est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. En ce qui concerne les injections des médicaments, les animaux subiront un léger stress pour la contention et les effets indésirables sont une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection. Les effets indésirables attendus pour le dispositif appliquant un courant sont une rougeur au niveau de la zone d’application du dispositif. Les examens d'imagerie réalisés sont non invasifs et atraumatiques et impliquent l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Néanmoins, le souris subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de limiter la souffrance (selon points limite) et aussi afin de prélever les différents organes et les analyser pour pouvoir comprendre les mécanismes d’efficacité ou échappement du cancer aux traitements.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués. Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Afin de limiter le nombre de souris avec un modèle de tumeur intracrânien, uniquement les stratégies de combinaison thérapeutique les plus prometteuses selon les résultats des modèles sous-cutanées seront évaluées dans ce modèle. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs traitements ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 1824 souris seront utilisées dans ce projet.

Raffinement

La majorité des expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes (injections sous-cutanées ou intra-péritonéales, traitements par voie orale). La bonne tolérance des formulations vaccinales a été préalablement démontrée dans notre laboratoire. Chez les animaux porteurs de tumeurs sous-cutanées, la croissance tumorale est mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. En ce qui concerne les animaux porteurs de tumeur intracrânienne, l’implantation sera réalisée sous anesthésie locale et générale et après analgésie locale. Afin de prévenir la douleur post-chirurgicale, un traitement analgésique pendant 3 jours après l’implantation sera également administré. Tous les animaux de toutes les procédures font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire, selon les points limite.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souris est bien caractérisé et de nombreux outils pour l’analyse de la réponse immunitaire aux immunothérapies sont disponibles. Les animaux seront âgés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

80 souris femelles au système immunitaire en partie défaillant reçoivent chacune deux greffes de tumeurs humaines, une par flanc, précisément pour qu'il en faille moins. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et seront toutes tuées, pour prélever les deux tumeurs et le maximum de sang. Le protocole prévoit la greffe sous anesthésie, dix jours consécutifs d'injections dans l'abdomen, des pesées et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur annonce que ces travaux valideront le potentiel de certains gènes comme cibles thérapeutiques, la perspective de nouvelles thérapies contre le cancer colorectal restant renvoyée à une étape ultérieure.

Objectifs

Dans ce projet nous souhaitons étudier les mécanismes responsables de l'apparition du Cancer, et notamment du cancer colorectal. Le but est d’observer dans un modèle de greffe tumorale si la perte d’expression des gènes étudiés induit une diminution de la croissance tumorale. Cela mettrait en évidence ces molécules comme de futures cibles pour traiter le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à montrer l’impact de la perte d’expression de gènes sur la croissance tumorale. Cela permettra de valider alors le potentiel comme cible thérapeutique de ces gènes, le but étant de proposer ensuite de nouvelles thérapies curatives contre le cancer colorectal.

Procédures

Greffes de cellules tumorales d'origine humaine, durée de l'anesthésie au réveil environ 5 minutes. Une seule fois durant le protocole. Traitement par voie intra-péritonéale, tous les jours pendant 10 jours consécutifs. 30 secondes par traitement chaque jour. Les souris seront pesées régulièrement, nécessitant le transfert de la souris sur la balance et le retour dans la cage (15 secondes par souris). Les tumeurs seront mesurées régulièrement à l'aide d'un pied à coulisse électronique. Cela va nécessiter le maintien de la souris afin d'effectuer les mesures (environ 30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress modéré lors de la manipulation (pesée hebdomadaire, observation) et lors de l’initiation de l’anesthésie gazeuse. Les animaux pourront ressentir de la douleur lors de la greffe de cellules tumorales humaines ainsi que lors des injections en intra-péritonéale. Risque de plaie ou d’infection au point d’injection.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront mis à mort car nous souhaitons (1) prélever les deux tumeurs et (2) prélever un maximum de sang afin de pouvoir obtenir un maximum de sérum (pour pouvoir réaliser des dosages si besoin sur de nombreux marqueurs sériques).

Remplacement

Notre équipe développe un axe de recherche afin de mettre en évidence des cibles potentielles pour lutter contre le Cancer. Nous possédons une forte expertise dans les méthodes de criblages cellulaires et l’analyse des bases de données afin d’identifier les gènes impliqués. Nous possédons également une forte connaissance des outils de modification cellulaire et de validation in vitro. Toutefois, une fois la validation réalisée sur des méthodes in vitro nous devons alors vérifier nos hypothèses. Dans ce projet nous voulons étudier l'impact de la perte d'expression de protéines impliquées dans la régulation de gènes sur la croissance tumorale en lien avec l'induction de la sénescence cellulaire. Nous ne pouvons donc pas nous passer pour cette phase de notre recherche de modèles complexes comme les modèles murins.

Réduction

Pour ce protocole nous souhaitons réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. Pour cela nous grefferons deux tumeurs par souris. Des résultats préliminaires nous ont permis de connaitre le pourcentage de prises tumorales dans les conditions que nous souhaitons utiliser. Le volume des tumeurs étant petits nous ne pouvons utiliser qu'une tumeur par technique. C'est cela qui a donc conditionné le nombre de souris que nous devons utliser, soit vingt souris par groupe. Nous utiliserons également uniquement des souris femelles.

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie, à l’âge de 6 semaines, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux expérimentateurs de 7 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine, et observés à la fois par le personnel animalier (une fois par semaine lors du change) et les expérimentateurs (une à deux fois par semaine, hors geste expérimental) dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Une liste précise permettant de scorer les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite qui entrainerait leur mise à mort. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car c'est un modèle classiquement utilisé dans les études de cancérologie, de par son homologie avec le génôme humain. De façon plus spécifique ici les souris possèdent un système immunitaire en partie défaillant. Cela facilite alors la prise de greffes de cellules tumorales d'origine humaine. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte avec une arrivée à l'animalerie à 6 semaines et une greffe de cellules à 7 semaines. A ce stade de développment la prise tumorale est optimale. Avec des souris plus âgées le pourcentage de prise tumorale serait moindre.

Une biopsie de peau, la greffe d'un feuillet d'épiderme humain sous anesthésie, puis six semaines d'isolement en cage individuelle parce que les rats rongent l'implant de leurs congénères. 136 rats nude, dépourvus de défenses immunitaires, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tués et autopsiés, 16 n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique étant réutilisés dans d'autres projets. L'étude est une toxicologie réglementaire, prérequis administratif aux essais cliniques d'un implant cutané destiné aux ulcères de la peau. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable important, tout en prévoyant la mise à mort des animaux en cas de nécrose cutanée, de rejet du greffon ou de douleur sévère, et rapporte l'effectif à des lignes directrices internationales dont il ne dit pas ce qu'elles exigent.

Objectifs

Réaliser une étude de toxicologie réglementaire, chez le rat immunodéficient, d’une greffe de tissu humain avant administration à l’Homme pour traiter les ulcères de la peau, c'est à dire évaluer la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de la greffe de cellules souches pluripotentes humaines.

Bénéfices attendus

L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est le prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III. C’est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet donc de démontrer l’absence de risque du modèle de d’implant avant de le réaliser chez l’Homme. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines) Elle permettra de collecter des données sur la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles permettant d’obtenir toutes ses données. Il permet de récolter des données réglementaires pour la préparation des essais cliniques. En effet, ces études permettent d’augmenter les chances de tester cliniquement un produit dépourvu d’effets toxiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie et analgésie adaptées : une biopsie de la peau est effectuée et d’un greffon de cellules épidermique humain est mise en place sur la zone biopsiée La durée de la chirurgie est d’environ 30 min. Un suivi post opératoire bi quotidien est ensuite réalisé avec administration d’un analgésique pendant 3 jours (doses pouvant être augmenté si nécessaire). Des prélèvements sanguins seront effectués sur l’ensemble des animaux pendant la durée de l’étude (au maximum 26 semaines) : jusqu’à 4 prélèvements, sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’effets indésirables importants lié à l’implant de tissu épidermique chez l’animal en raison d’une procédure d’anesthésie/analgésie mise en place par un vétérinaire, d’une chirurgie de courte durée (environ 30 minutes) effectué par un personnel compétant et un suivi post-opératoire et quotidienne pendant l’ensemble de la durée de la procédure. L’utilisation d’animaux immunodéficients réduits le risque d’inflammation importante et le risque de rejet de l’implant de tissues épidermiques. De plus, les prélèvements sanguins effectués au cours de la procédure sont des gestes peu invasifs et peu douloureux d’autant plus lorsqu’ils sont effectués par du personnel expérimenté selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Cependant, en cas de signes d’infections, de rejet du greffon, ou d’effets toxiques importants liés à l’implant (perte de poids importante, inflammation sévère, nécrose cutanée, douleur sévère) l’animal sera euthanasié afin de procéder à un examen anatomopathologique dans le cadre de l’étude de toxicité réglementaire, selon les recommandations l’ICH/EMA.

Devenir

Les animaux n'ayant reçu qu'un examen ophtalmologique (non invasif) pourront être réutilisés dans d'autres projets. Les animaux ayant subi la chirurgie sont euthanasiés et autopsiés, comme définit par les lignes directrices ICH/EMA encadrant le déroulement des études de toxicologie règlementaire.

Remplacement

L’étude de toxicologie menée dans le cadre de ce projet est une étude de toxicologie réglementaire selon les guidelines ICH/EMA, prérequise aux essais cliniques de phase I, II et III. Elle vise à définir le profil de toxicité, de tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques, dans les différents organes et tissues. Elle permet d’évaluer la sécurité du médicament, qui est ici l’implant de tissu (un modèle d’épiderme obtenu par culture cellulaire de cellules souches pluripotentes humaines). Les études de toxicologie règlementaire doivent être effectuées sur des modèles animaux selon les guidelines ICH/EMA, il n’est donc pas possible actuellement de remplacer les modèles in vivo par des modèles in vitro ou in silico

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser par groupe est fixé par les lignes directrices ICH/EMA. Il est considéré comme le minimum acceptable des études réglementaires afin de permettre une interprétation scientifique des données et d’évaluation précise des possibles effets toxiques.

Raffinement

Afin de réduire les nuissances liés à la chirurgie, un protocole anesthésie/analgésie est avec une prémédication (qui permet de rendre plus rapide et plus stable l’anesthésie et d’apporter une analgésie), une application d’anesthésique locale avant l’incision et générale en fin de chirurgie et une anesthésie générale gazeuse avec inhalation d’isoflurane sont mis en place pour permettre une chirurgie et un réveil rapide et sans douleur. Le suivi post-opératoire sera biquotidienne, et inclus l’administration d’analgésie injectable (si nécessaire) et par voie orale (dans l’eau de boisson) systématiquement durant 2 à 3 jours. Un hébergement individuel est requis pendant 6 semaines pour éviter tout risque de destruction de l’implant qui a été observé lors des études préliminaires avec hébergement collectif : les rats rongent systématiquement l’implant du congénère lors des 1ères semaines post-opératoires. L’hébergement sera enrichie (object en bois spécifiques pour les rongeurs de différentes formes et tailles, en plus des enrichissements déjà prévus pour une hébergement collectif - tunnel, matériaux de nidification, bois à ronger - et une litière de cellulose favorisant le confort des rats nude) pour maintenir le bien être de l’animal sous supervision de la SBEA. Les animaux seront isolés dès la semaine d'acclimatation, afin d'éviter tout risque de blessures cutanées liées à un jeu ou une bagarre et réduire l'impact de l'isolement au réveil de la chirurgie. Les prélèvements de sang seront réalisés sous sédation par inhalation d’isoflurane, afin de limiter le stress induit par la contention manuelle ou des lésions vasculaires lorsqu’un animal est agité. Enfin, pour réduire les nuissances liés à la greffe et la chirurgie (principalement l'inflammation et le rejet du greffon), une souche de rat immunodéprimé est utilisée. Comme cette souche peut être plus sensibles aux agents pathogènes, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages type III H permettant à l'animal de se redresser (dimension 374x214x185 prévue intialement pour 2 à 4 rats) sous couvercle filtrant , puis en groupe dans des portoirs ventilés. Les salles d'hébergements et de test utilisées seront dédiées à cette souche uniquement avec d'éviter des contaminations croisées et l'ensemble de l'étude se déroulera dans une zone SPF (Specific Pathogen Free). Des points limites ont été définies afin de permettre la mise en place d'actions correctives afin d'éviter tout souffrance.

Choix des espèces

Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires in vivo (régies par les lignes directrices ICH M3(R2) et ICH S3A et ICH S6(R1)) qui nécessitent l’utilisation d’au moins une espèce animal. Le rat nude immunodéficient permet d’implanter en sous cutanée l’implant de cellule humaine sans risque de rejet immédiat et il permet l’évaluation de la toxicité, la tumorogénicité et la biodistribution de l’implant de cellules épidermiques chez un organisme entier, en l’absence de méthodes alternatives actuelles avant de faire les essais cliniques chez l’Homme A partir de 6 semaines, selon l’âge recommandé par les lignes directrices ICH/EMA

Mesurer la puissance paralysante de formulations de toxine botulique, destinées au traitement de la spasticité comme à des usages cosmétiques, occupe ici 4 650 souris et 1 550 rats. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous seront tués, par prélèvement intracardiaque, le dernier jour. La toxine est injectée dans le muscle du mollet sous anesthésie, ce qui provoque une paralysie plus ou moins marquée des membres postérieurs, une perte de poids et des difficultés à atteindre la mangeoire, puis chaque animal passe dix à trente tests d'écartement des orteils sur cinq à vingt-cinq jours. Le porteur indique que des cultures de neurones humains ont été proposées comme alternative sans être validées par la communauté scientifique ni par les autorités, et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées depuis près d’un demi-siècle dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Elles sont classiquement utilisées dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs, autant naturels que recombinants. L’objectif de cette étude est de réaliser une évaluation in vivo de l’efficacité de molécules thérapeutiques à base de neurotoxine botulique nouvellement développées ; le protocole expérimental consiste à exécuter le test du score d’abduction des orteils (DAS) chez le rongeur. La puissance d’une préparation de neurotoxine botulique (BoNT) donnée peut être évaluée régulièrement en utilisant le test DAS, qui mesure la réduction de la force musculaire des doigts de la patte après injection de BoNT dans le muscle squelettique de la patte arrière chez les rongeurs. Il est bien connu en littérature que les rats ont des sensibilités différentes aux différentes types de toxines botuliques par rapport à la souris. Selon le type de toxine étudié, il sera donc nécessaire d’utiliser l’espèce animale la plus sensible entre le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Ils sont classiquement utilisés dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs. Nos études vont participer à la recherche et la mise en place de ces nouvelles formulations de toxine botulique et aider dans le futur les patients atteint de ces troubles.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs test DAS (test du score d’abduction des orteils) entre 10 à 30 tests, sur une durée de 5 à 25 jours. La durée d'un test DAS est de 3 minutes. Les animaux seront soumis également à une seule injection en intra-musculaire de toxine botulique sous anesthésie. La durée de cette intervention est de 10 minutes. Et pour finir les animaux seront soumis à un seul prélèvement en intra-cardiaque, le dernier jour d'expérimentation. La durée de cette intervention est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

À la suite de l'injection dans le muscle gastrocnémien, avec la toxine botulique, les animaux vont développer une paralysie des membres inférieures plus ou moins élevées ; les animaux risquent également de présenter une perte de poids, des poils piqués, la présence d'un excédent de porphyrine. Une difficulté à atteindre la mangeoire risque d'être présent, mais pour permettre à l'animal de se nourrir et de boire, une alimentation spécifique sera mise en place.

Devenir

Etant donné la réalisation d'un prélèvement de sang et des muscles, les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'intracardiaque.

Remplacement

A ce jour, à cause de la complexité de la structure protéique de la toxine botulique, il n’y a pas de test in silico validés pour effectuer un criblage des effets paralysant des différentes toxines botuliques et de ses dérivés. Afin de tester un grand nombre de dérivés de la toxine botulique, des modèles in vitro alternatif à l’expérimentation animale ont été proposé par le passé, en utilisant des cultures cellulaires de neurones humains. Toutefois ces modèles in vitro ne sont pas encore validés par la communauté scientifique ni par les autorités régulatoires, car ne sont pas capables de prédire exactement les effets des toxines botulique chez l’homme ou l’animal, donc l’étude ne peux se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 6 à 10 animaux, étant donné la variabilité interindividuelle que nous pourrions rencontrer. Le nombre de groupes est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 5 à 31 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupes égal à 6 à 10) seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour déterminer le chiffre exact d’animaux par groupe, cela dépendra des premiers résultats des premiers animaux, le chiffre 10 ne sera pas dépassé. Nous utiliserons les tests statistiques les plus appropriés afin d'analyser nos données.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type IVC (cage individuelles ventilée pouvant contenir plusieurs animaux par cage) en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage pour les souris et 2 ou 3 par cage pour les rats, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos, des tunnels et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Après les intra-musculaires, quelques croquettes d'aliment seront placées dans le fond de la cage et de la pâté humide sera également donnée, au cas où les animaux n'arrivent plus à s'alimenter et la taille des tétines des biberons seront ajustées en conséquence. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la durée des anesthésies et les réveils des animaux. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.

Choix des espèces

Les rongeurs sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour les études utilisant de la toxine BONT/A, dans le cadre d’amélioration de la contractibilité musculaire. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés aux problèmes de contractilité musculaire sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats et les souris seront utilisés, car ces espèces sont largement utilisées pour ce type d’étude (nombreuses références bibliographiques). D’autres modèles expérimentaux, notamment, le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Adultes, entre 6 et 12 semaines ; car les adultes possèdent des membres inférieurs plus gros et cela permet une meilleure visualisation de la patte et donc le résultat du DAS est plus optimal. Les animaux adultes sont aussi plus résistants face à la perte de poids et aux différents signes cliniques.

Un rat qui cumule hypothermie, prostration et plus de 20 % de perte de poids sur plusieurs jours est tué. 600 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour récupérer tissus et sang. Rendus obèses et diabétiques par un régime hypercalorique servi de la sixième à la trente-deuxième semaine de vie, ils reçoivent des composés une à deux fois par jour, subissent cinq prises de sang précédées chacune de six heures de jeûne, l'implantation d'un cathéter dans la veine fémorale, puis une perfusion continue de 210 minutes appelée clamp. La société qui porte le projet dispose déjà d'une plateforme in vitro pour ce type d'étude, mais affirme que ces modèles ne sont pas un miroir assez fiable de la complexité de l'organisme.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, les animaux rendus obèses par l’ingestion d’un régime gras sur plusieurs semaines constituent le meilleur modèle préclinique pour valider ces thérapies. En effet, l’ingestion d’un régime gras chez la souris ou le rat se traduit par la mise en place d’une résistance à l’insuline. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique la plus précise reste la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant de la radioactivité. Ainsi, au cours de ce projet, des rats seront rendus obèses puis traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra d’éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez le rat, un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 120 minutes. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. L’implantation d’un cathéter à demeure dans la veine fémorale : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – Un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines), cela va induire une obésité et un diabète de type 2. Les animaux se déplacent un peu moins mais ils gardent un bon état général. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 - Pour mesurer les consommations alimentaire et hydrique, les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant la durée du traitement, cela est impactant pour les rats qui ont un caractère grégaire. 4 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 5 –La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. 6 – La chirurgie (implantation du cathéter fémoral) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7 – Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress. 8- Nous mesurerons de nombreuses fois la glycémie par microprélèvement en bout de queue, l'extrémité de la queue sera désinfecté à la vétédine en fin de manipulation. Cependant, du fait du diabète, certains animaux peuvent avoir des complications (queue hypersensible, infection).

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Le bout de la queue des rats sera observé de près car le diabète peut induire des complications au niveau de la cicatrisation. De la vétédine sera appliquée après chaque fin de manipulation. Après la chirurgie, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites suivants sur plusieurs jours : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée (5 ou 10mL/kg). En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Des mises au point de chirurgie "double cathétérisation" permettant d'éviter les multiples mesures de glycémie à la queue sont en cours de discussions.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat Sprague-Dawley : Sans régime gras, cette souche de rat possède un poids corporel important et est plus à même à développer une obésité marquée lorsqu’elle est placée sous régime gras. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Les animaux sont mis sous régime à partir de 6 ou 8 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Trente minutes de nage forcée dans une piscine réparties sur deux jours, puis treize jours d'un test d'apprentissage : 45 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Elles subissent quatre tests de mémoire étalés sur six semaines, mémoire spatiale, reconnaissance d'objets, olfaction et apprentissage d'une tâche, le porteur indiquant que la nage peut provoquer une légère hypothermie. L'objet déclaré est de savoir si la perte d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau modifie la mémoire, dans le cadre d'une forme de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence. Le choix de la souris tient à l'existence de tests comportementaux déjà établis chez elle, et l'effectif de 45 est présenté comme le minimum fixé par des consignes internationales de la discipline.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones (cellule nerveuse spécialisée dans la commande des mouvements) et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA ont une cause non-identifiée, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), on appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été identifiées comme étant impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT et donc à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront transportés de l’établissement d’élevage à l’établissement utilisateur à l’âge de 2 mois. Dans l’EU les souris réaliseront 4 tests de comportement répartis sur 6 semaines, à partir de l’âge de 4 mois. Ces tests permettent de tester la mémoire des souris Le premier test permet d’évaluer la mémoire spatiale des souris et nécessite 30 minutes par souris répartis sur 2 jours. Le second test permet d’évaluer la capacité à reconnaitre et mémoriser des objets et dure 10 minutes par jour pendant 4 jours. Il est suivi par un test d’olfaction qui dure 20 minutes sur une journée. Le dernier test permet d’évaluer l’apprentissage d’une tâche, puis la mémoire spatiale, et dure 30 minutes réparties sur 13 jours (soit 1 habituation d’1min + 4 répétitions de 1 minute par jour pendant 7 jours + 2x 1 minute dernier jour). Les tests seront espacés d’au moins 4 jours pour éviter de stresser les animaux. Ces 4 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer différentes formes de mémoire des souris. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées par une méthode règlementaire, et les tissus d’intérêts sont prélevés après vérification de la mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent induire un stress et angoisse chez l'animal. L’un des tests consistera à faire nager les animaux dans une piscine ce qui pourrait induire une légère hypothermie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées pour prélever des tissus d’intérêts.

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce projet, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules immunitaires du cerveau (microgliales) avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (réaction en réponse à une molécule stimulante). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtile in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible chez l’animal.

Réduction

Pour les tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype avec 3 génotypes étudiés soit 45 souris au total. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Comme les quatre différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous utiliserons les mêmes souris pour ces 4 tests, avec au moins 4 jours de repos entre chaque test, pour en utiliser le moins d'animaux possible

Raffinement

Les souris seront transférées de l’EU d’élevage à l’EU d’expérimentation. Elles seront mises dans une boite de transport adaptée, entre congénères (1boite par cage). Le transfert sera rapide (moins de 1h), car les deux EU sont géographiquement très proches. Les conditions d’hébergement sont agréées. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et un enrichissement correspondant à leurs besoins. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons du coton, permettant de faire des nids dans chaque cage, et des bâtonnets à ronger. Les animaux seront hébergés entre fratrie autant que possible, mais pourraient être séparés en cas de bagarre. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Avant la réalisation des tests comportementaux, une habituation à l’expérimentateur sera réalisée par manipulation des animaux pendant une semaine tous les jours. De plus, avant chaque session de test il y aura une habituation à la pièce pour les animaux en déposant les cages dans la salle d’expérimentation 30min à 1heure avant le début de l’expérimentation. Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant les tests comportementaux. Nous respecterons une période de repos au moins 4 jours entre chaque type de test comportemental et nous réaliserons les tests du moins au plus stressant. Pour le test nécessitant de faire nager les animaux, à la sortie de l’eau ils seront séchés à l’aide d’un torchon avant d’être replacés dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central de mammifère. Par conséquent, nous avons besoin d’un système complexe pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie (cellules immunitaires du cerveau) peut influencer le comportement chez la souris. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois).