Rongeurs

Les souris utilisées ici sont immunodéficientes, choisies pour ne pas rejeter les fragments de tumeurs prélevés sur des patients, certaines portant en plus un système immunitaire humain reconstitué. 13 340 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles subissent une chirurgie de greffe de cinq à vingt minutes, jusqu'à deux mois de traitements par des molécules dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires, et jusqu'à dix prélèvements sanguins. Le nombre d'animaux par groupe, treize, ne repose sur aucun test statistique : le porteur le fixe à partir de son expérience et de la littérature.

Objectifs

Ce projet a déjà obtenu une autorisation de projet qui doit être renouvelée au bout des 5 ans échus. Les cancers sont en progression constante de nos jours et touchent plusieurs organes. Aux stades avancés, ils sont réfractaires à toute thérapie malgré le développement des thérapies ciblées. De nouvelles options thérapeutiques doivent donc être impérativement développées. Depuis plusieurs années, nous avons mis en place une importante plateforme de xénogreffes tumorales issues de patients (PDX Patient-derived xenograft) pour les cancers urologiques dans un premier temps du fait de notre thématique de recherche (mais d’autres domaines pourraient être testés) et de proposer ces modèles pour une évaluation fiable de candidats médicaments. L’objectif du projet est d’évaluer l’effets de candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes de tumeurs issues de patients chez la souris immunodéficiente et/ou humanisée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse ou par voie fixe pour subir une chirurgie pour l’implantation de la tumeur. Ces chirurgies sont courtes et durent environ 5-20 min selon la voie choisie. Des antalgiques seront administrés aux animaux en sous-cutané pour limiter la douleur. Les animaux recevront également des traitements avec des candidats médicaments à tester (traitements pendant 2 mois maximum). Les voies et fréquences sont dépendantes de chaque protocole expérimental. Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront très rapides (environ 1 min) pour diminuer au maximum la contention des animaux et un stress possible. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié (geste qui dure environ 1 min et 5-10 prélèvements maximum). La mesure des tumeurs se fera par palpation de la tumeur et évaluation de sa taille. Ce geste est très rapide (1 minute maximum) et ne provoque pas un grand stress à l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies et chirurgie sur les animaux peuvent provoquer du stress, une douleur, des lésions. De plus, nous greffons une tumeur cancéreuse aux animaux qui croit plus ou moins doucement selon les modèles pouvant entraîner une perte de poids des animaux, une gène…

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de tissus seront réalisés

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de certains cancers. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Les modèles expérimentaux en oncologie préclinique sont: - les lignées cellulaires in vitro et in vivo ; - les tumeurs induites chimiquement ; - les souris transgéniques ; - les xénogreffes tumorales issues de patient (PDX). Ce dernier modèle est reconnu comme le plus pertinent car il reflète l’hétérogénéité tumorale et est décrit dans la littérature. Cette approche est encore peu répandue pour la sphère urologique et la communauté scientifique manque de modèles de PDX pour évaluer les candidats médicaments. De plus, l’approche immunothérapeutique prend une grande ampleur en oncologie, ainsi il est important de développer des modèles de double humanisation (PDX implantés sur des souris humanisées) pour tester ces nouvelles immunothérapies (non réalisé à ce jour dans notre laboratoire mais en forte perspective pour les prochains mois). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer une valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). La mesure de la croissance tumorale se fera via une méthode non invasive de palpation ou à l’aide d’un caliper pour des volumes plus importants. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. De plus, le fait de pouvoir congeler/décongeler des tumeurs issues de la biobanque et de pouvoir l’incrémenter avec des nouvelles tumeurs évite d’avoir toujours les tumeurs à amplifier dans les animaux pour les conserver, diminuant à terme le nombre d’animaux. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et principalement dans ces modèles, les publications scientifiques, 13 animaux seront utilisés par groupe expérimental car c’est le minimum requis pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes).

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et administration d’antalgiques avant et après toute chirurgie. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type igloo, morceau de bois, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes pouvant aller jusqu’à un point limite (définition de points limites adaptés). Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Du fait de la perte de poids des animaux possible en fonction de certaines tumeurs, une alimentation humide type Diet gel sera ajoutée dans la cage de ces animaux si nécessaire. Si un animal présentait un symptôme pouvant amener à un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin, soigné et pris en charge en fonction de son état (isolement en dernier recours mais possible selon l’agressivité de ses congénères). Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle expérimental décrit dans ce projet est très bien décrit dans la littérature et nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d’un tissu étranger. L’espèce de référence pour les études en oncologie préclinique est la souris du fait de sa facilité d’utilisation et des nombreux modèles de souris immunodéprimées et humanisées produits. Nous utiliserons des souris jeunes (4-6 semaines à la livraison) pour faciliter la prise de greffe pour les primo-implantations et les tests d’efficacité de candidats médicaments. Pour les études d’immunothérapie, nous utiliserons des souris d’environ 14 semaines, lorsque le système immunitaire humain est bien reconstitué.

Anesthésiées pour recevoir des cellules cancéreuses directement dans la vessie, pesées jusqu'à une fois par jour, traitées jusqu'à trois fois par semaine, puis endormies à l'isoflurane trois fois par semaine pour un suivi de la tumeur en bioluminescence, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une greffe sous la peau pour reproduire une situation métastatique, d'autres subissent des prélèvements de sang ou l'amputation de l'extrémité de la queue, la fréquence de ces gestes dépendant des demandes des clients. Le porteur indique que la croissance tumorale peut rendre les souris incapables d'uriner et de s'alimenter, et que les anesthésies répétées constituent en elles-mêmes une nuisance. Toutes sont tuées à la fin des études pour prélever leurs organes, le modèle ne permettant pas de les réutiliser.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les cancers de la vessie, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses de la vessie soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans la vessie par administration intravésicale. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer le ou les composé(s) à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer la croissance tumorale, les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines et/ou tissulaires du composé d’intérêt. Les mesure de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de croissance tumorale permettra d’évaluer l’efficacité du ou des composé(s). Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires : histologiques, par cytométrie en flux… L’ajout de tumeur ectopique (injection des cellules par voie sous-cutanée) en plus d’une tumeur orthotopique (injection par voie intravésicale) pourra être utilisé pour tester l’efficacité de molécules anticancéreuses dans un contexte de tumeurs métastatiques ; aussi appelé modèle abscopal. L’effet abscopal est la régression de la lésion métastatique (ex : s.c.) après un traitement local de la tumeur primaire (i.e. vésicale). Le suivi de la croissance de la tumeur ectopique s’effectuera par mesure non-invasive par caliper.

Bénéfices attendus

Dans les pays développés, le cancer de la vessie est au 4ème rang par sa fréquence chez l’homme et 9ème chez la femme. En France, chaque année, plus de 11 000 nouveaux cas de cancer de la vessie sont diagnostiqués et les statistiques font état de 4 500 décès annuels. Le traitement du cancer de la vessie repose aujourd’hui principalement sur la chirurgie (exérèse partielle), une ablation totale de la vessie pouvant être pratiquée en cas de cancer infiltrant. La survie nette à 10 ans des patients atteints d’un cancer de la vessie est de l’ordre de 40%. Le taux de récurrence à 5 ans est entre 31 et 78%, ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Inoculation des cellules cancéreuses dans la vessie (1 fois ; 15 min à 30min) sur l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un analgésique injectable • Pesées (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Administration intrapéritonéale (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Suivi de la croissance tumorale par bioluminescence (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 15 min à 1h) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour l’induction et de 1-3% pour l’entretien) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang (30 sec) : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera adaptée en fonction du volume prélevé en accord avec la consigne en vigueur. Les sites seront la veine submandibulaire sur animal anesthésié à l’isoflurane (3-4%) ou veine caudale, ou amputation unique de la queue (coupe < 2 mm sur l’extrémité non inervée de la queue) sur animal vigile. • Injection sous-cutanée de cellules cancéreuses (1 fois ; 1 min) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour la l’induction et de 1-3% pour l’entretien) • Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 1 min) sur animal vigile • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera en accord avec la consigne interne en vigueur. Les voies envisagées sur animal vigile seront les voies (30 sec) : per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse via la veine caudale ou intramusculaire. Les voies possibles sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (pour induction 3-4%, pour maintien 1-3%) seront intradermique (1 min), intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec) ou intravésicale (15 min à 1h).

Impact sur les animaux

Ces modèles peuvent engendrer une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une perte de poids, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli) et/ou une altération des fonctions normales (impossibilité d’uriner et de s’alimenter). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Les effets indésirables possibles seront systématiquement demandés au client avant tout traitement pour les anticiper. Les animaux seront également soumis à des mesures de tumeur par bioluminesence post-administration des cellules tumorales/potentiels médicaments par voie intravésicale ce qui nécessite des anesthésies répétées. Ces anesthésies répétées peuvent constituer une nuisance notamment au travers de la contention de l’animal pour le placer dans la chambre à anesthésie ou pour l’administration de ketamine/xylazine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Dans le modèle orthotopique, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. Dans le modèle sous-cutané, la croissance sera mesurée par caliper. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié (pour l’imagerie de bioluminescence), là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base principalement sur les données de la littérature complétés d'analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux à l'aide de logiciels spécifiques, généralement basés sur des tests type test de Student bilatéral, afin que les nombres utilisés soient réduits au minimum nécessaire. Il est prévu environ 50 études (10 études par an) et 150 molécules testées au regard du nombre d’animaux utilisés. Chaque étude comportera en moyenne 5 groupes avec 10 animaux par groupe et 3 molécules à tester par étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaire de la directive n°2010/63/UE. Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinels. Les animaux seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations liées à l’étude sur l’animal sera réduit au strict nécessaire ( ex : pesées, bioluminescence).Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles orthotopiques de cancer de la vessie chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la disponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Le stade adulte est utilisé :les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer.

Pour compléter une étude déjà menée, 30 souris vont être rendues neutropéniques par deux injections dans le ventre, infectées par Klebsiella pneumoniae, puis tuées deux heures plus tard afin de mesurer la charge bactérienne de leurs poumons et de leur rate. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. L'infection passe par le nez, sous anesthésie brève, et le porteur la décrit comme un léger inconfort de quinze secondes. Il affirme que de nouvelles options thérapeutiques sont "indispensables" et que ces témoins supplémentaires sont "nécessaires" pour appuyer sa démarche auprès des acteurs publics de la santé.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la charge bactérienne pulmonaire et splénique après 2h d’infection pulmonaire par des souches bactériennes résistantes chez la souris neutropénique. Ce projet est une étude complémentaire. En effet, dans ce modèle, différents traitements ont été testés et ont donnés des résultats très encourageants dans le traitement de ces infections. Cependant, des témoins supplémentaires sont nécessaires pour appuyer cette démarche auprès des acteurs publics de la santé.

Bénéfices attendus

Les pneumonies bactériennes dues à des espèces multi résistantes constituent un challenge pour les professionnels de santé. En effet, ces pathogènes bactériens deviennent de plus en plus difficiles à traiter en raison de leur capacité à produire des mécanismes de résistance. Ces bactéries résistantes sont de plus en plus communes dans les systèmes de santé nord-américains et européens et de nouvelles options thérapeutiques sont indispensables pour traiter ces infections. Ce projet s’inscrit dans la complémentarité d’une autre étude menée où un traitement antibactérien a montré une réelle efficacité contre ces infections et pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique pour lutter contre ces infections. Le bénéfice de ce présent projet serait donc d’appuyer cette théorie en ajoutant comme données complémentaires la charge bactérienne pulmonaire et splénique réelle avant l’initiation des traitements (c’est-à-dire 2h après l’infection).

Procédures

Les souris recevront deux injections intrapéritonéales (de 5 secondes) à J-4 et J-1 avant infection. L’infection se fera par voie intranasale par l’injection de 50µL (2 secondes) à l’aide d’une pipette et sous une courte anesthésie volatile.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue est l’injection intrapéritonéale pour l’immunodépression des souris. Ce geste entraine une légère douleur au moment de la piqure mais dure moins de 5 secondes et l’animal retrouve sa mobilité. Ce protocole est bien défini et n’entraine aucune autre nuisance. L’administration intranasale de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté. Cette intervention entraine un léger inconfort de courte durée (temps d’infection 15 secondes).

Devenir

Tous les animaux (30) seront mis à mort 2h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.

Remplacement

A ce jour, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique. En effet, Dernièrement, des études ont démontré une activité intéressante de cet antibiotique couplé à une molécule contre ces multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est de 10 souris par groupe ce qui permettra d’effectuer une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons par une analyse statistique.

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée et risquerait même de faire flamber l’infection. L’infection sera réalisée sous anesthésie. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 10 par cage. S’agissant d’une étude très courte (2h) aucun sepsis n’est attendu, et les souris seront surveillées tout au long de cette expérience.

Choix des espèces

Les souris CD1 représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée dans l’étude précédente ayant montré des résultats encourageants. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

Le poids, le comportement et l'apparence des souris porteuses de tumeurs sont contrôlés chaque jour pour décider du moment de leur mise à mort. 4 011 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un groupe de 2 100 subit une injection puis un unique prélèvement sanguin sous anesthésie terminale, un autre de 1 001 reçoit une incision du flanc, une greffe de cellules cancéreuses dans la glande mammaire, huit injections du produit testé puis, deux fois par semaine pendant quatre mois au plus, une injection de luciférine suivie d'un examen d'imagerie sous anesthésie. L'objet du projet est de comparer des nanoparticules ciblant HER2 selon leur taille et leur composition, et les souris chez qui la tumeur n'a pas pris sont tuées elles aussi, parce qu'elles ont reçu des cellules tumorales.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs. Les animaux concernés par l’étude de la dose maximale tolérée et de toxicité et de pharmacocinétiques seront réceptionnés, hébergés, injectés et sacrifiés dans l'EU1. Dans le cadre de l’étude de biodistribution ; la réception, hébergement, la greffe et la pousse tumorale se fera dans l'EU1, puis les animaux seront transférés dans l'EU2 pour l’injection des formulations et le suivis jusqu’à euthanasie. L’ensemble des animaux de l'étude d’efficacité thérapeutique sera réalisée dans l'EU2 (réception, hebergement, greffe/pousse tumorale, injection des formulations).

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale. Pour le transport des animaux, ces derniers seront installés dans des boites spécifiques assurant leur confort et leur sécurité (isolation thermique, filtre sanitaire, chaufferette) pour un temps de transport estimé entre 5 à 10 minutes. Une période d’acclimatation de 12 à 24h minimum sera observée suite à leur transferts.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

Une constriction du nerf sciatique sous anesthésie, une injection d'adjuvant de Freund dans le coussinet plantaire, des plaques à 4 et à 55 degrés, huit séries de filaments de von Frey : les procédures de ce projet consistent à provoquer de la douleur puis à la mesurer. 342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses cellulaires et moléculaires. Le porteur indique que l'injection dans la patte peut entraîner des douleurs modérées et persistantes, des difficultés à se mouvoir et des automutilations, et que la chirurgie s'accompagne de risques de destruction des sutures, de cannibalisme et de décès au réveil. Le niveau de souffrance déclaré reste modéré pour l'ensemble, alors que le protocole retient la constriction du nerf sciatique comme le modèle admis des douleurs neuropathiques chroniques chez l'être humain.

Objectifs

Le projet vise à établir le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans la perception de la douleur chez la souris. Les Treg sont des cellules supprimant la réponse immunitaire. Ils sont donc bénéifiques dans les maladies auto immunes mais nuisibles dans le cancer. Notre hypothèse est que les lymphocytes T régulateurs masquent la douleur directement de par leur capacité à sécréter des analgésiques naturels. Nous utiliserons des lignées de souris mutantes et des tests de sensibilité à la douleur dans différentes conditions inflammatoires et non inflammatoires. Nous évaluerons particulièrement la douleur ressentie dans un modèle de cancer, dans un modèle de chimiothérapie et dans un modèle inflammatoire induit. Nous évaluerons aussi le rôle des Treg dans la douleur dans un modèle de chirurgie du nerf sciatique, le modèle communément admis de douleurs neuropathiques chroniques chez l'homme. Nous mesurerons l'intensité de la douleur percue par stimulation mécanique ou par des observations comportementales. L'ensemble des résultats de ce projet permettra de proposer un nouveau mécanisme de régulation de la douleur chez la souris avec de possibles implications cliniques chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de cancer et traités par chimiothérapie souffrent souvent d'une sensibilité thermique altérée. Notre projet va permettre de préciser les mécanismes associés afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales sur animal vigile, nécessaire à l’induction des modèles génétiquement modifiés à raison de cinq injections à un jour d'intervalle (moins d’une minute/injection). Une première partie des animaux seront impliqués dans une injection unique dans le coussinet plantaire effectuée sous anesthésie générale gazeuse (environ 5 minutes). Une deuxième partie des animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de cellules tumorales effectuée sous anesthésie gé nérale gazeuse (environ 5 minutes). Une troisième partie des animaux seront impliqués dans une unique chirurgie de constriction du nerf sciatique ischio-jambier (environ 30 minutes) effectuée sous anesthésie et analgésie pré et post-opératoire. La sensibilité à la douleur sera mesurée à l’aide d'un test de référence (filaments Von Frey) à raison de 8 mesures de 3 à 9 jours d'intervalles (environ 60 minutes). Enfin, une quatrième partie des animaux seront impliqués dans une injection unique voie intrapéritonéale d’une molécule d’intérêt (environ 1 minute) et la sensibilité́ thermique sera mesurée à l’aide de test de référence en exposant les animaux sur une courte durée sur un plaque au froid (4 degrés) et au chaud (55 degrés) et en mesure le temps de retrait (maximum 1 minute/animal). Ce test sera effectué 4 fois avant et après l’induction du modèle génétiquement modifié. A l’issue de ces actes, l’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et des analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les injections intra péritonéales entrainent une douleur légère et brève, L'injection d'adjuvant complet de Freund dans la patte est susceptible d'entrainer douleurs modérées mais persistantes, difficultés à se mouvoir et auto-mutilations. Les animaux sont opérés avec une chirurgie invasive, entrainant une douleur modérée. Il existe des risques infectieux suite à la chirugie. Le comportement des souris peut être altéré suite à l'anesthésie et à la chirurgie. Des comportements aggressifs peuvent apparaitre avec destructions de sutures et cannibalisme. L'anesthésie en tant que telle présente des risques tels que hypothermie, difficultés respiratoires pouvant aller jusqu'à l'arrêt cardiaque. Le réveil de l'anesthésie est une étape critique avec un risque certain de décès. La croissance des tumeurs en sous cutanée pourrait entrainer douleurs et perte de poids liées soit à la croissance de la tumeur localement, soit à la dissémination métastatique de la tumeur. Les tests thermiques peuvent entrainer une douleur légère à modérée, objet de l'étude.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Selon la définition de la Douleur par l'Association Internationale de l'Etude de la douleur (1979), " La douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à un dommage tissulaire présent ou potentiel, ou décrite en terme d'un tel dommage. ", on perçoit le caractère pluridimensionnel et plurifactoriel de la notion de douleur. Au regard de notre thématique faisant appel à des mesures de variation de la nociception, il nous est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants (anesthésiés ou vigiles). Notre projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal sans possibilité de remplacement par des expérimentations in vitro, la douleur n'étant pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum (342) sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Après calculs, nous avons établi que 6 animaux par groupe dans 3 expériences indépendantes assurait la fiabiité statistique des résultats. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est aussi de réaliser les expériences sur les deux lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin de les comparer au même groupe témoin.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie ou par les membres habilités de l'équipe. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du carton pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Les animaux provenant de l'extérieur seront acclimatés une semaine avant leur inclusion dans les protocoles. Les animaux sont anesthésiés durant les procédures pouvant engendrer de la souffrance. Les animaux entrant dans le cadre d’une chirurgie seront traités avec des analgésiques/anti-inflammatoires avant et après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales utilisées depuis de nombreuses années pour ce type d’étude. La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire. En outre le choix des rongeurs dans les études portant sur la douleur est admis depuis de nombreuses années et les modèles expérimentaux de douleurs chroniques sont bien caractérisés tant du point de vue des études comportementales que des analyses cellulaires ou moléculaires. La disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Dans ce projet 3 lignées différentes de souris génétiquement modifiées seront utilisées. Ces animaux sont issus d'élevage réalisés dans notre animalerie. Des souris de 8 à 12 semaines d'âge seront utilisées pour travailler avec un système immunitaire mature. De plus, des souris adultes résistent mieux à l'anesthésie, ce qui garantit un réveil rapide et sans séquelles.

96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à J2 ou J14 pour prélever leurs muscles. Elles reçoivent une à sept injections dans l'abdomen, dont une drogue qui détruit chimiquement leurs nerfs sympathiques, des gavages, puis une injection dans l'orbite sous anesthésie juste avant la mise à mort. Le projet cherche à savoir si le système nerveux sympathique règle le comportement des cellules souches du muscle sain, avec des retombées annoncées, à terme, pour des maladies neuromusculaires comme la dystrophie de Duchenne. Parmi les raisons du choix de la souris, le porteur cite sa petite taille, sa gestation rapide et sa "durée de vie courte compatible avec notre étude".

Objectifs

Le processus de régénération musculaire est très important pour la restauration de la fonctionnalité du tissu après une lésion. La niche des cellules souches du muscle est un environnement complexe impliquant des interactions entre les cellules interstitielles, les cellules des vaisseaux et les cellules souches. Le muscle est également un tissu innervé par le système nerveux somatique responsable de la contraction volontaire ainsi que par le système nerveux sympathique dont les neurones sensoriels sont capables de capter les contraintes mécaniques et sensitives appliquées au tissu musculaire. Tout changement dans la niche comme le vieillissement peut altérer le potentiel de régénération du muscle. Pour cette raison, il est capital d’élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires nécessaires au maintien fonctionnel de la niche. Par ailleurs, plusieurs myopathies sont causées par l'épuisement et la perte du potentiel de réparation musculaire et à une altération de l'organisation du réseau vasculaire. Le présent projet a pour objectif d’étudier l’interaction entre les nerfs sympathiques, les cellules vasculaires et les cellules souches en conditions physiologiques. Le rôle du système nerveux sympathique a récemment été décrit dans la niche des cellules souches hématopoïétiques et des cellules souches intestinales mais n'a été parfaitement étudié dans le muscle. Des observations sur des coupes de tissu musculaire ont permis d’émettre l’hypothèse que le système nerveux sympathique pourrait intervenir dans la régulation des fonctions des cellules souches musculaires via une modulation des signaux moléculaires émis par les cellules composant les microvaisseaux.

Bénéfices attendus

Nombre de pathologies du muscle sont liées à des perturbations du fonctionnement intrinsèque de la cellule souche musculaire mais également de sa niche. L'implication du système nerveux central mais surtout périphérique en tant que modulateur de la niche reste encore peu exploré. Cette étude vise à identifier un nouveau mécanisme contrôlant la quiescence des cellules souches musculaires par le système nerveux autonome sympathique via le relais des cellules des vaiseaux. En effet, la modulation de ce circuit neuro-vasculaire aura des implications significatives pour mieux comprendre le comportement des cellules souches musculaires dans les maladies neuromusculaires, comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Effectivement, l'innervation sympathique et les signaux de la niche vasculaire, sont déréglés et peuvent altérer directement la fonction des cellules souches dans la DMD. Ainsi, comprendre les mécanismes de la modulation des voies signalisation impliquées dans le dialogue nerf-muscle, ouvre potentiellement sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies neuromusculaires.

Procédures

Les drogues utilisées pour la dénervation, pour stimuler la voie de signalisation cible seront injectées par voie intrapéritonéale. La drogue inhibitrice de la voie de signalisation ciblée sera administrée par voie orale. Les anticorps inhibiteurs de la voie de signalisation ciblée et les anticorps contrôles seront injectés par voie intrapéritonéale. La molécule permettant de visualiser les vaisseaux sanguins sera administrée par voie retro-orbitale une seule fois avant la mise à mort. Toutes les autres administrations seront faites 1 jour sur deux pendant 1 à 14 jours soit 1 à 7 injections selon le jour de mise à mort (J2 ou J14). Les injections intrapéritonéales et par gavage sont rapides et durent de quelques secondes à 30 secondes pour le gavage, en respectant les volumes autorisés à injecter. L'injection par voie retro-orbitale est également assez rapide et sera effectué sous anesthésie pour éviter le stress et la douleur.

Impact sur les animaux

Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort pour prélèvement de leurs muscles à des fins d'analyses histologiques et moléculaires ou de mise en cultures cellulaires.

Remplacement

La niche des cellules souches du muscle squelettique est un environnement tissulaire complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires notamment avec les cellules vasculaires, les cellules inflammatoires et le systèmes nerveux moteur et sympathique. Expérimentalement, il n’est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro ou par modélisation mathématique. C’est pourquoi, l’utilisation des modèles animaux reste nécessaire à la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires intégrés à la base du fonctionnement de la niche et qui peuvent influencer la régénération musculaire. Cependant en préambule à l'étude proposée, la présence de récepteurs du système nerveux autonome a été mis en évidence in vitro sur les cellules musculaires et vasculaires, ces récepteurs permettant l'activation et/ou l'inhibition de ces cellules. Les études in vivo permettront de valider l'hypothèse de travail ainsi que les résultats obtenus in vitro.

Réduction

Pour avoir des résultats statistiquement significatifs, il faut un minimum de 6 animaux par groupe dans les différentes procédures en raison de la variabilité dans un même groupe d’animaux et afin d'avoir assez de matériel pour réaliser toutes les analyses prévues. Cela devrait également éviter d'avoir à répéter l’expérience. Par ailleurs, l'expérience du laboratoire sur les modèles animaux a permis de déterminer que l'utilisation d'une solution saline comme contrôle en injection intrapéritonéale ou en injection intramusclaire ne provoquait aucun effet secondaire ou altération sur le processus de régénération musclaire, aussi ces contrôles ne seront pas systématiquement inclus afin de limiter le nombe d'animaux utilisés. Ne seront injectées que les solutions qui n'ont jamais été utilisées et pouvant potentiellement avoir des effets sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et limiter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h et si cela n'est pas suffisant, une mise à mort compassionnelle sera réalisée avec approbation du vétérinaire référent. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de l’innervation sympathique sur le tissu musculaire car la dénervation chimique chez la souris est un procédé assez rapide et bien caractérisé. La souris est par ailleurs un modèle de petite taille, avec une gestation rapide et une durée de vie courte compatible avec notre étude. Les souris utilisées seront des adultes âgés de 16 semaines parce qu'à cet âge le système nerveux sympathique est mature.

Des parasites sont injectés dans l'abdomen de souris pour déclencher une toxoplasmose, suivis d'un gavage quotidien pendant sept jours et de quatre séances d'imagerie sous anesthésie. 2 127 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que les souches de type I conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement, et que les kystes formés par les souches de type II persistent toute la vie de l'hôte. Toutes les souris seront tuées, notamment pour disséquer leur cerveau et y compter les kystes.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet de recherche est double, visant à approfondir notre compréhension d'une maladie due à une infection par des parasites, et à développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans un premier volet, l'équipe se concentre sur l'identification et la caractérisation des des protéines sécrétées par les parasites lors de l'infection de la cellule hôte. L'objectif ultime est de déterminer le rôle de ces protéines dans le processus de virulence du parasite chez son hôte intermédiaire naturel, la souris. Ce volet comprend une analyse in vivo, en se penchant particulièrement sur la phase initiale de la maladie et la formation de kystes pendant la phase persistante de la maladie. Dans un second volet, le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité in vivo de composés antiparasitaires, préalablement sélectionnés parmi des molécules approuvées par la "U.S. Food and Drug Administration" (FDA, fda.gov). La FDA veille à ce que des médicaments sûrs et efficaces soient disponibles pour améliorer la santé de la population des États-Unis. Ces composés sont donc déjà utilisés dans le traitement de différentes maladies, garantissant leur non-toxicité chez l'humain. L'objectif est de comparer leur efficacité à la sulfadiazine, un médicament antiparasitaire utilisé actuellement en clinique, tout en confirmant in vivo leur cible moléculaire. Notez que ce projet se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (nommés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche présente des avantages significatifs sur plusieurs aspects. Tout d'abord, il vise à répondre à des questions fondamentales sur les infections causées par les parasites, en éclairant le rôle des protéines sécrétées dans la virulence et le processus infectieux. À moyen terme, ces réponses permettront de mieux comprendre le dialogue établi entre le parasite et son hôte ainsi que les mécanismes permettant le contrôle de l'infection, guidant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En ce qui concerne le deuxième volet, l'évaluation in vivo des composés antiparasitaires présente un intérêt majeur. À long terme, si ces composés s'avèrent efficaces, cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement contre les infections parasitaires, offrant des alternatives potentielles aux traitements actuels, tout en minimisant les effets secondaires. Il est important de souligner ici qu'il n'existe jusqu'à présent aucun traitement contre les formes persistantes d’infections parasitaires. Une fois établis, les kystes persistent théoriquement pendant toute la durée de vie de l'hôte. Pour information, il est estimé que 30% de la population mondiale est infectée par un parasite. En somme, ce projet offre une approche globale, alliant une compréhension approfondie des mécanismes d'infection à des solutions thérapeutiques novatrices. Les connaissances générées et les avancées thérapeutiques potentielles contribueront à la lutte contre les maladies parasitaires, avec des implications positives pour la santé publique à moyen et long terme.

Procédures

Lors de ce projet, les interventions sur les animaux vivants seront de trois types : (i) Les injections au niveau abdominal (1 par expérience et par souris, durée du geste : quelques secondes) des parasites dans le but de déclencher l'infection parasitaire avec une charge parasitaire contrôlée. Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU1. (ii) Traitement des animaux par administration par voie orale des composés à l'aide de sondes de gavage adaptées à la souris (1 gavage par jour pendant 7 jours consécutifs et par souris, durée du geste : quelques secondes à chaque gavage). Cette étape sera réalisée dans les Etablissements Utilisateurs EU1 et EU2. (iii) Pour les expériences d'imagerie in vivo, les animaux sont anesthésiés et le produit luminescent est injectée dans l’abdomen des animaux (4 fois par souris à J0, J2, J5, et J7, durée du geste : quelques minutes chaque jour). Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les infections parasitaires peuvent est caractérisées par deux phases distinctes : la première phase de l’infection, qui correspond à la phase de dissémination des parasites dans les différents organes de l'hôte (la souris ou l’homme). Celle-ci peut être mortelle chez la souris comme chez l'homme si elle n'est pas contenue et contrôlée par le système immunitaire. Les souches de type I sont particulièrement virulentes chez les souris de laboratoire et conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement. Les souches de type II, non-virulentes, induisent une première infection légère, conduisant systématiquement à une infection parasitaire persistante sans symptômes. Cette phase correspond à l'étape où la multiplication des parasites est contenue par le système immunitaire de l'hôte, et seuls les parasites capables de s'enkyster dans les muscles et le cerveau vont survivre. Cette étape se met en place plus tardivement, et les kystes vont persister pendant toute la durée de vie de l'hôte.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sur les animaux morts tels que le prélèvement du sang dans le but de détecter la présence d’une réaction immunitaire contre le parasite et la dissection du cerveau pour la détection et la quantification des parasites sous forme de kystes dans le cerveau des animaux.

Remplacement

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Des études préliminaires réalisées in vitro en culture cellulaire nous ont permis d’identifier spécifiquement des gènes (24 gènes candidats) du parasite codant pour des protéines du parasite sécrétées dans la cellule infectée et ayant donc un rôle potentiel dans le contrôle de la virulence chez l’animal. De même, que des études de biochimie ont permis de montrer que ces protéines s’associent avec des protéines de la cellule hôte confirmant leur rôle potentiel dans la régulation des interactions hôte-parasite. Il est donc essentiel de pouvoir réaliser des expériences chez la souris afin de déterminer l’importance de ces gènes dans le contrôle de la virulence, ainsi que dans la capacité des parasites à persister chez l’animal sous forme de kystes (infection persistante). En effet, aucune autre approche alternative in vitro ou de culture cellulaire ne permet de répondre à ces questions. Le modèle murin d’étude des maladies parasitaires est communément utilisé par la communauté scientifique. En effet, la souris constitue un hôte intermédiaire naturel et privilégié étant donné que le cycle sexué du parasite s’effectue exclusivement chez les félidés en tant qu’hôte définitif, après ingestion de proies infectées. Contrairement aux études in vitro de culture cellulaire, la souris permet l’étude de l’infection parasitaire avec la formation de kystes dans les tissus. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides" : L'activité antiparasitaire des composés (27) a été déterminée à travers des tests effectués sur des cellules in vitro. Il est maintenant essentiel de tester ces composés in vivo chez la souris afin de confirmer leur activité parasiticide chez un mammifère. En effet, des essais cliniques chez l'homme ne seront envisageables que si des études précliniques chez l'animal ont été réalisées.

Réduction

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, 3 souches mutantes différentes seront testées en parallèle d’une souche sauvage parentale de référence. Par exemple, les souches mutantes de type I seront comparées entre elles et à la souche sauvage de référence de type I. Idem pour les souches parasitaires de type II. Concernant les souches de type I (virulentes), une première lignée des souris seront d’abord testées. Si une atténuation de virulence est observée, l’analyse sera poursuivie sur lignée différente de souris. Ces dernières étant plus sensibles, cette expérience permettra d'évaluer la robustesse de l’atténuation de virulence. Si aucun effet du mutant n’est observé sur la virulence avec la première lignée de souris, l’expérience ne sera pas poursuivie sur la deuxième lignée de souris, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides dans les phases initiale et persistante de l’infection parasitaire" : La première expérience sera conduite avec 2 à 3 animaux par condition à tester (totalisant 13 souris pour cette première expérience). L'objectif est d'assurer une efficacité totale des composés, et les expériences subséquentes ne seront menées que si la survie atteint 100% parmi les souris traitées avec les composés testés lors de cette première expérience. Si les composés se révèlent seulement partiellement efficaces, le protocole ne sera pas poursuivi. De plus, les contrôles sont mutualisés puisque les trois composés sont testés simultanément. En cas de réussite, les expériences ultérieures seront menées avec 2 à 5 animaux par condition à tester.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un établissement utilisateur agréé par du personnel formé. Les souris seront maintenues en groupes autant que possible, dans des cages offrant un enrichissement du milieu de vie, et leur bien-être sera régulièrement contrôlé. Les animaux seront logés dans un environnement contrôlé, exempt de germes dangereux pour les animaux, afin d'éviter toute infection supplémentaire pouvant biaiser l'interprétation des résultats obtenus. Dès le début de chaque expérience, les souris sont observées 3 fois par semaine jusqu'à l'apparition des symptômes, puis quotidiennement (jusqu'à deux fois par jour) jusqu’à la fin de la procédure expérimentale et elles seront euthanasiées dès l'apparition des premiers signes cliniques dû à l’infection parasitaire, avec le point limite défini dans ce document. Les composés testés, non toxiques, seront mis en solution selon une formulation préalablement déterminée. Pour l'expérience d'imagerie in vivo réalisée dans une autre animalerie, les animaux seront transportés dans des conditions optimisées afin de limiter le stress lié au transport.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé pour étudier les infections parasitaires est largement adopté par la communauté scientifique. La souris, en tant qu'hôte intermédiaire naturel du parasite, offre un cadre privilégié, car le cycle sexué du parasite se produit exclusivement chez les félidés, en tant qu'hôtes définitifs, après l'ingestion de proies infectées. Les souris développent ainsi une infection parasitaire avec une réponse immunitaire comparable à celle observée chez l'homme. Les souches de souris utilisées présentent des niveaux de sensibilité variables aux parasites. Il est donc pertinent d'explorer le potentiel rôle des effecteurs parasitaires dans la virulence des différents types de parasites (Type I virulent et Type II non-virulent), ainsi que chez des souris présentant divers niveaux de sensibilité à cette infection. De plus, les modèles murins sont particulièrement adaptés pour étudier l'efficacité de composés antiparasitaires, car les souris peuvent reproduire les différentes phases de l’infection, tant infection initiale que persistante. Seules des expériences in vivo, réalisées sur des modèles murins, permettront de confirmer l'efficacité de ces composés au cours des différentes phase de l’infection parasitaire, et de répondre à la question cruciale : représentent-ils de véritables candidats médicaments ? Par conséquent, les expériences seront réalisées sur de jeunes adultes, car le système immunitaire doit être mature afin de pouvoir répondre à l’infection parasitaire.