Rongeurs
Identification des mécanismes impliqués dans exacerbation de l’artériopathie oblitérante des membres inférieurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Neuf souris diabétiques sur dix auront un à cinq ongles nécrosés après la chirurgie qui leur coupe la circulation dans la patte arrière gauche. 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes, une partie recevant en plus quatre à cinq injections dans le ventre sur cinq jours consécutifs. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'artériopathie des membres inférieurs s'aggrave chez des patients souvent diabétiques, les nouvelles thérapies annoncées restant au stade de la perspective. Le porteur prévoit de prélever un maximum d'organes pour que ces souris servent aussi à des projets sur la démence, la néphropathie ou la rétinopathie.
Objectifs
L’ischémie critique des membres inférieurs est un problème de santé publique majeur dans les pays industrialisés ; son risque est accru par la proportion croissante de patients diabétiques ou obèses. Cette pathologie a un pronostic très sombre puisque, à un an, seule la moitié des patients survivent sans amputation majeure. Plusieurs essais thérapeutiques visant à favoriser le développement de nouveaux vaisseaux pour revasculariser le membre malade ont été réalisés mais sans succès. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre les processus pathologiques conduisant au développement de cette maladie dans le but de proposer de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les mécanismes responsables de l'aggravation de l'artériopathie oblitérante vers le stade le plus grave de la maladie c'est à dire l'ischémie chronique menaçant le membre dans le but de proposer de thérapies pour les patients atteints de cette pathologie qui sont souvent diabétiques et qui sont aujourd’hui sans options thérapeutiques.
Procédures
Une partie des souris subiront une série de 4 ou 5 injections intrapéritonéales. Toutes les souris subiront une chirurgie de 10 minutes visant à induire une ischémie du membre inférieur gauche. Toutes les souris seront anesthésiées pour être soumises à des protocoles sans réveil.
Impact sur les animaux
Administration intrapéritonéales répétées (pendant 5 jours consécutifs) pour les souris trangéniques. Surpoids, polyurie, polydipsie pour les souris diabétiques Douleur post-chirurgicale, Nécrose des ongles des orteils (1 souris C57BL/6J sauvage/10 va avoir un ongle nécrosé suite à la chirurgie d'ischémie du membre inferieur. 9 souris diabétiques sur 10 vont avoir 1 à 5 ongles nécrosés suite à la chirurgie d'ischémie du membre inferieur).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures dans le but de prélever des organes sur lesquels nous réaliserons des analyses post mortem.
Remplacement
L‘artériopathie oblitérante des membres inférieur est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions diverses entre de nombreux types cellulaires locaux (fibres musculaire, cellules endothéliales, péricytes, fibroblastes) et circulants (cellules sanguines diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc nécessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes, le nombre de souris par groupe doit être 10. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot et par analyse sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de l'irrigation sanguine et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit. Le premier objectif de ce projet est de mieux caractériser la physiopathologie de l'ischémie chronique des membres inférieurs, cependant nous prévoyons de prélever un maximum d'organes pour réutiliser ces souris dans des projets s'intéressant notamment à la physiopathologie d'autres pathologies micro vasculaires comme la démence, la néphropathie, la rétinopathie.....
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Aussi, il existe des souris transgéniques permettant d'invalider certains gènes d’intérêt. Des souris adultes âgées de 8 semaines (début du protocole) à 6 mois (fin du protocole) seront utilisées. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques. Pour être sûr de ne pas induire de phénotype lié à une anomalie du développement. L'invalidation de nos gènes d'intérêt sera induit chez des animaux âgés d'au moins 8 semaines.
Effets d’un composé X en développement sur le poids corporel et les dépenses énergétiques chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Tester le candidat médicament d'un client, seul ou associé au sémaglutide : 30 souris mâles rendues obèses par quatorze semaines de régime gras chez le fournisseur vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de sang et d'organes. Chacune reçoit trente-cinq administrations dans le ventre, décrites comme source de douleurs aiguës, subit dix-huit pesées, deux sessions de mesure des dépenses énergétiques de soixante-douze heures et une mise à jeun de quatre heures. Elles sont hébergées seules pendant toute l'étude, le porteur reconnaissant que cet isolement constitue une nuisance pour un animal social. L'étude se limite aux mâles parce qu'inclure des femelles obligerait à doubler les effectifs, une seconde étude chez la souris femelle n'étant prévue qu'en cas d'efficacité constatée chez le mâle.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché (sémaglutide). Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (18 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule, du composé X ou du composé de référence par voie intrapéritonéale (35 administration; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (1 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 72h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement de sang et d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins pratiqués à D-3, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieur et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines (25 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de pré-conditionnement au régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Influence de la consommation d’alcool sur la consommation de cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
240 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement du cerveau. Chacun subit une chirurgie d'une demi-heure pour la pose d'un cathéter permanent dans la veine jugulaire, puis s'auto-administre cocaïne et alcool pendant environ quatre mois, avec jusqu'à trois prises de sang par ce même cathéter. Le porteur attend un taux d'attrition de 20 % sur la durée et prévoit deux cohortes de trente rats par variable testée. Il présente le choix de l'espèce comme un compromis évolutif, le rat étant assez proche de l'humain pour valoir modèle et assez éloigné des primates non-humains, qu'il range parmi les espèces plus sensibles.
Objectifs
La cocaïne est la deuxième drogue illégale la plus consommée en Europe et son utilisation a augmenté au cours des 10 dernières années. Cette consommation est souvent associée à une consommation d’alcool. Notre projet a pour but d’étudier chez le rat de laboratoire l’influence de l’alcool sur la prise de cocaïne et d’identifier la signature neurobiologique de cette influence en mesurant l'activité globale du cerveau. Selon notre hypothèse générale, l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool devrait non seulement inciter à une consommation accrue de cocaïne mais aussi à un affaiblissement des capacités de contrôle sur cette consommation, notamment dans les situations qui requièrent qu’un tel contrôle soit exercé. Au plan neurobiologique, l’influence de l’alcool sur la consommation de cocaïne devrait se traduire par une diminution correspondante de l’activité neuronale dans les régions du cerveau responsables du contrôle de la récompense et de la motivation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera de préciser la nature de l’influence de l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool sur la perte de contrôle sur la consommation de cocaïne. Le second bénéfice sera d’identifier les régions du cerveau responsables de cette influence grâce à une mesure de l'activité globale du cerveau.
Procédures
Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie. Un prélèvement de sang veineux (0,15 ml) sera réalisé pour mesurer l’alcoolémie et certains métabolites de la cocaïne. Ce prélèvement sera effectué via le cathéter intraveineux installé à demeure dans la jugulaire. Cette méthode de prélèvement est indolore. Ce prélèvement sera répété au maximum 3 fois, avec un intervalle d’au moins 2 semaines entre prélèvements.
Impact sur les animaux
Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, traitement antibiotique, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool, hormis un possible risque d’infection lié à l’utilisation chronique de la voie d’administration intraveineuse. Les animaux seront sous surveillance quotidienne pour repérer et prévenir tout problème éventuel.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés post-mortem pour effectuer une mesure de l'activité globale du cerveau.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) l’éthique humaine actuelle interdit l’utilisation d’interventions invasives chez l’homme, compliquant ainsi l’étude directe des relations causales entre usages de différentes drogues ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales ; 3) l’influence de l’usage d’alcool sur la prise de cocaïne ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différentes variables à tester. Pour tester chaque variable, il faudra deux cohortes de 30 rats chacune (une de mâles et une de femelles) pour un obtenir un effectif final suffisant, prenant un taux d’attrition de 20 pourcents au bout de 4 mois. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour tester les quatre variables du projet sera égal à 240 rats.
Raffinement
Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie, sous anesthésie chimique et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique. L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique. Enfin, si cela ne suffit pas au rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus, lignée Wistar) constitue une sorte de compromis du point de vue de l'évolution biologique. Cette espèce est suffisamment proche de l'espèce humaine (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes au début des expériences (âge moyen 3 mois demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
La queue plongée dans un bain-marie jusqu'à vingt secondes, les pattes posées sur une plaque chauffée jusqu'à trente secondes, la queue tirée par l'expérimentateur pour mesurer la force d'agrippement, la course sur tapis roulant puis sur cylindre rotatif : 720 souris passeront cette série de tests à six mois puis à un an. 1 246 souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth vont être utilisées au total, 1 104 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyse histologique. 584 reçoivent une injection de virus adéno-associés entre le premier et le vingt et unième jour après la naissance, et des femelles sont isolées une semaine pour que leurs ultrasons soient enregistrés. Le porteur écrit que ces lignées ne présentent aucun signe de douleur ni incapacité locomotrice, alors qu'il déclare lui-même 1 104 souris en gravité sévère.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des virus adéno-associés) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chauffée et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes.Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale. Amendement. Nous isolerons les femelles pendant 1 semaine puis nous les mettrons en contact avec des femelles wt plus jeunes pendant 10 minutes durant laquelles nous mesurerons les ultra-sons émis par les animaux isolés.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux modèles âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure. Amendement. Pour les tests de vocalisation, l'isolement des animaux pendant 1 semaine provoquera un stress de classe modérée mais l'isolement est le seul moyen de stimuler la vocalisation des femelles avant de faire le test.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements d'organes pour des études histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Etude de la cardioprotection au cours de l’infarctus en ciblant la voie extrinsèque de l’apoptose. Influence du sexe et des hormones femelles
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Commandées chez un fournisseur à 7 ou 11 semaines pour subir un infarctus entre 12 et 14 semaines, 2 595 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 611 d'entre elles et sévère pour 984, toutes tuées pour prélèvement du cœur. Une ligature d'artère coronaire suivie de reperfusion leur provoque l'infarctus, certaines femelles subissant en plus une ovariectomie, la pose d'un implant hormonal et deux frottis vaginaux, dont l'un sur animal vigile. Les protocoles longs ajoutent cinq prélèvements sanguins sur animal vigile et quatre échocardiographies d'une demi-heure sous anesthésie. Sur la réduction, le porteur indique que l'analyse statistique se fera au fil des expériences afin d'arrêter d'inclure des animaux dès que la différence devient significative.
Objectifs
Le seul traitement pour sauver un patient lors de l’infarctus du myocarde est de réouvrir l’artère occluse le plus rapidement possible. Cependant, malgré des effets bénéfiques immédiats associés à l’arrêt des lésions d’ischémie, la reperfusion induit des effets indésirables, appelés lésions de reperfusion, du fait du retour brutal du sang oxygéné dans le muscle cardiaque ischémique. Il est admis que le taux de mortalité précoce (30 jours post-infarctus) est plus élevé chez les femmes que les hommes. Bien que le rôle des hormones sexuelles au cours de l’infarctus soit loin d'être univoque, de nombreuses données suggèrent que les hormones sont impliqués dans les différences liées au sexe au sein des maladies cardiovasculaires et ont été montrées cardioprotectrices. Il est essentiel de mener des recherches expérimentales pour mettre au point des stratégies thérapeutiques spécifiques aux femmes. Nous avons montré que la voie des récepteurs de mort joue un rôle crucial dans les lésions de reperfusion. Des travaux de la littérature montrent chez des femelles ovariectomisées des lésions d’infarctus plus sévères et suggèrent un lien entre hormones et mort cellulaire. Nous avons développé des stratégies thérapeutiques permettant de bloquer cette cascade de mort cellulaire au cours de l’infarctus et de la reperfusion. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans le cœur de souris femelles au cours de l’IR myocardique et d’étudier l’influence des hormones sur la mort cellulaire à court et long termes.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun traitement pharmacologique disponible pour traiter les lésions de reperfusion au cours de l’infarctus. Les études jusqu’à présent n’ont considéré que de jeunes animaux de laboratoire (jeunes adultes de 8 à 12 semaines) et en majorité des mâles afin de s’affranchir de l’influence des hormones femelles qui sont décrites comme cardioprotectrices. Ce projet permettra une meilleure connaissance de la physiopathologie de l’infarctus dans le cœur de femelles, afin de pouvoir développer et de tester des stratégies thérapeutiques pour le sexe féminin, répondant à un besoin sociétal actuel compte tenu de la recrudescence des cas observés les 15 dernières années. De plus, ce projet sera le premier à étudier l’implication de la mort cellulaire dans les cœurs de souris femelles au cours de l’infarctus et sa dépendance au statut hormonal ainsi que dans l’insuffisance cardiaque post-infarctus. Puis, ce sera également la première évaluation de l’effet cardioprotecteur des nos molécules thérapeutiques dans le cœur féminin . Ce projet devrait permettre de réussir la translation vers la clinique en permettant notamment de développer un traitement de l'infarctus, destinés aux patients (2ème cause de mortalité masculine) et à des patientes (1ère cause de mortalité féminine devant le cancer du sein) à risque d’infarctus.
Procédures
In vivo court terme : 3 injections de produits anesthésiants + 1 chirurgie sous anesthésie ; 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min) In vivo court terme avec réveil : 3 injections de produits anesthésiants; 1 chirurgie sous anesthésie (selon procédure de 1h10 à 1h30) + 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). 3 prélèvements sanguins sur animal vigile In vivo long-terme avec réveil: 5 injections de produits; 1 chirurgie sous anesthésie + 5 prélèvements sanguins sur animal vigile + 4 échocardiographies sous anesthésie gazeuse (30 min chacune) + 1 injection létale + 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). * en plus pour les femelles: 1 frottis vaginal sur animal vigile et 1 frottis vaginal sous anesthésie . Quand ovariectomie : chirurgie sous anesthésie gazeuse (30 min); 5 injections de produits, 1 Pose d’implant (10 min);
Impact sur les animaux
- Pour le frottis vaginal, les souris subiront l'inconfort de la contention et du geste gynécologique. - Pour le protocole in vivo d’échographie, les animaux subiront le stress de la préhension par l’expérimentateur puis ils auront une anesthésie gazeuse avec une première phase d’induction le stress sera de courte durée à l’endormissement et au réveil. - Pour l’ovariectomie et la mise en place d’implants, outre le stress de préhension qui sera de courte durée avant l’anesthésie gazeuse, les animaux subiront des douleurs post-chirurgicales qui seront gérées par des antalgiques lors des phases de réveil. - Pour le protocole de chirurgie d’ischémie-reperfusion myocardique, les animaux subiront un stress lié à la contention et une douleur légère de courte durée à l’injection intramusculaire d’anesthésiques ainsi qu’un inconfort lié aux sutures. Les douleurs post- chirurgicales seront gérées avec des analgésiques. - Prélèvements sanguins : procédure réalisée sur animal vigile non anesthésié, ce qui peut constituer un stress et une douleur légère.
Devenir
L'analyse de la cardioprotection nécessite de prélever le coeur en fin de protocole expérimental et donc de mettre à mort chaque souris incluse dans ce projet.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. Dans le cadre du développement d’un médicament, la cardioprotection par les peptides thérapeutiques doit se mesurer à la fois en terme d’effets vasculaires et musculaires et par conséquent sur cœur entier. Les expériences in vivo à court terme permettent d’évaluer s’il y a bien un ciblage des outils pharmacologiques développés dans le tissu cardiaque après une injection intraveineuse en aigu. Les expériences in vivo avec suivi à long terme, permettent de mimer ce qui se passe dans la condition clinique chez les patients et donc d’évaluer l’effet de la molécule à long terme sur le tissu cardiaque tout en considérant la métabolisation et l’élimination des molécules mimant la situation clinique.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, et dans la mesure du possible, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : échographie, dosage marqueurs sériques, analyse de la cicatrice d’infarctus par histologie. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les nombres de souris à inclure dans les groupes de traitement ont été définis à priori afin de garantir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre minimal d’animaux. Pour les expériences comprenant une ligature de coronaire, un groupe Sham d'animaux (protocole complet sauf ligature) sera inclus en réduisant à n=6 souris pour chaque contingent. Ensuite, l’analyse statistique permettra de faire les comparaisons statistiques. Elle se fera au fur et à mesure des expériences afin d’arrêter d’inclure des animaux dès que la différence est significative.
Raffinement
- Conditions d’hébergement : les cages de stabulation sont enrichies (maisons en cartons) pour limiter le stress. - Chirurgie cardiaque : les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient le moins invasifs possible. Il est important de noter que l'utilisation de substances anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures. - La phase de réveil permettra une récupération optimale de l’animal : réchauffement, oxygénothérapie et hydratation (poche sous-cutanée de sérum physiologique injectée dès la dernière phase de la chirurgie) et hygrométrie contrôlée. Une feuille de suivi avec grille de scores et points limites sera mise en place. - L’échographie transthoracique et l’injection d’implants sous- cutanés sont réalisées sous anesthésie gazeuse. - Pour l’ovariectomie, l’anesthésie gazeuse est complétée par l’injection d’analgésique.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus a été choisie pour développer les modèles d’étude de l’équipe. Les raisons sont : - Les résultats obtenus par l’équipe montrent que ce modèle est proche de l’Homme : par exemple, le Post- conditionnement ischémique est une technique cardioprotectrice qui fonctionne aussi bien chez la souris que chez l’Homme (ce n’est pas le cas pour le rat). - De plus, l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes homologues donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera développée en thérapeutique ; - Petite taille et faible prix des animaux ; - Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. Les animaux femelles : les femelles jeunes qui seront ovariectomisées seront commandées à 7 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Pour les femelles jeunes non ovariectomisées : elles seront commandées à 11 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Les animaux mâles : seront commandés chez le fournisseur à 11 semaines pour être utilisés entre 12 et 14 semaines pour les animaux mâles jeunes.
Caractérisation et comparaison de deux modèles d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Fabriquer chez la souris deux versions d'une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, puis comparer laquelle ressemble le plus à la maladie humaine : 60 souris vont être utilisées pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du cœur. 22 reçoivent par chirurgie un réservoir sous la peau diffusant un produit en continu, 22 autres suivent cinq à neuf semaines de régime gras avec un produit pharmacologique dans l'eau de boisson. Toutes sont immobilisées deux à trois fois pendant un quart d'heure pour la mesure de pression artérielle, et endormies pour l'échocardiographie. Une grille de score portant sur l'apparence, le comportement et les signes cliniques déclenche selon le résultat une analgésie supplémentaire ou la mise à mort.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, l’insuffisance cardiaque a un pronostic grave, avec plus de 75% des hommes et plus de 50% des femmes décédant 5 ans après le diagnostic. L’insuffisance cardiaque est une incapacité du cœur à fournir suffisamment de sang à l’organisme, tout d’abord en condition d’exercice physique, puis avec l’évolution de la pathologie également au repos. Ce mauvais fonctionnement du cœur peut venir de défauts pendant sa contraction ou pendant son relâchement. Jusqu’à maintenant, une majorité d’études se sont intéressées au défaut dans la contraction cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection réduite). Cependant, depuis quelques années, des études cliniques ont démontré que chez les patients avec un défaut principalement dans la relaxation cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée) la mortalité est similaire ; il s’avère que les traitements actuels, développés pour les défauts de contraction, ne sont pas adaptés. De plus, un effet lié au sexe est possible car il y a plus de femmes que d’hommes souffrant de cette maladie. Une limite majeure pour étudier les mécanismes de la maladie et développer de nouveaux traitements est le manque de modèles expérimentaux. Cette maladie étant fréquemment associée à plusieurs facteurs de risque tels l’obésité et l’hypertension, nous allons tester deux modèles qui combinent l’insuffisance cardiaque avec une obésité (génétique ou par régime gras) et une hypertension (par traitement pharmacologique). Le but de ce projet est de comparer deux modèles expérimentaux qui présentent des caractéristiques similaires à la condition clinique, et de réaliser les premières études sur les défauts au niveau des cellules.
Bénéfices attendus
L'insuffisance cardiaque est une maladie affectant plus d’1 million de personnes en France dont environ la moitié souffrent d’insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée. Cela représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. La fonction cardiaque et la qualité de vie chez les patients souffrant de cette maladie sont gravement altérées. En effet, le cœur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relâcher suffisamment durant la phase de relaxation. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et à des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles du reste du corps. Les traitements contre l’IC à fraction d’éjection réduite ne sont pas ou peu efficaces pour les patients souffrant d’IC à fraction d’éjection préservée. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche pour mieux comprendre la maladie et trouver des traitements. Le bénéfice principal attendu de ce projet est d’établir un modèle expérimental que reproduit bien l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Ce modèle pourra ensuite être utilisé par différentes équipes au niveau de notre laboratoire et au niveau national et international afin de déterminer les mécanismes et tester des thérapies adaptées.
Procédures
22 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale légère sous anesthésie et sous analgésie : implantation sous la peau d'un petit réservoir qui diffuse un médicament en continu ; durée de la chirurgie, environ 10 minutes. 22 animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier (riche en gras) et un produit pharmacologique dans leur eau de boisson ; 5 à 9 semaines. Tous les animaux auront une mesure de la pression artérielle : mesure non invasive mais qui nécessite l'immobilisation des animaux ; durée environ 15 minutes, 2 à 3 fois. Tous les animaux auront une exploration de la structure et fonction cardiaque : mesure non invasive par échocardiographie, sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L'implantation sous la peau du réservoir peut causer une douleur liée à l'ouverture et la suture de la peau.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés car nous avons besoin de prélever les cœurs ainsi que d'autres organes pour faire d'autres analyses pour caractériser les modèles.
Remplacement
Le cœur est un organe complexe, composé de plusieurs compartiments et de plusieurs tissus spécialisés. Il comporte plusieurs sortes de cellules au rôle et au propriétés spécialisées. Il n’existe actuellement aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) qui permette d’analyser la fonction et les défauts cardiaques. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. De plus, notre étude vise à comparer des modèles pathologiques, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes impliqués sont largement conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables. De plus, nous allons obtenir les données de la fonction cardiaque par des méthodes non invasives, ce qui permet de mesurer plusieurs fois sur le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux. Le groupe de souris contrôle (sans pathologie) est commun aux deux modèles.
Raffinement
Les animaux hébergés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés pendant toute la durée de leur présence. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence, comportement naturel et provoqué, signes cliniques. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques de la souris sont très proches de celle de l’homme et la plupart des gènes conservés. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études sur l’insuffisance cardiaque ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées. Des souris adultes âgées de 3 mois (adulte) seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Cibles cellulaires thérapeutiques dans une maladie du système immunitaire : le lupus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Attrapées et immobilisées à la main pour recevoir jusqu'à cinq injections dans le ventre en quinze jours, certaines souris subissent en plus un prélèvement de sang sous anesthésie générale dont la cicatrisation prend vingt-quatre heures. 1 380 souris, dont une lignée génétiquement modifiée qui développe une pathologie lupique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 900. Le porteur écrit que ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus, et qualifie lui-même de "dommageable" le génotype qu'il utilise. Toutes sont tuées en fin de procédure pour analyse des organes, ceux des souris témoins servant en plus à des cultures cellulaires.
Objectifs
Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles et les éosinophiles) dans le contrôle des facteurs immunitaires responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs médiateurs (des molécules qu'elles libèrent) dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de l'élimination de ces cellules ou de leur injection dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les éosinophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène absent dans une lignée de souris) dit dommageable (souris LynKO) est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie lupique légère mais cependant quantifiable. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : 1- des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») qui induiront une douleur brève de piqûre. Ces injections sont aussi efficaces que des intraveineuses pour disperser le composé injecté dans tous le corps mais moins contraignantes pour les souris. 2- des contentions (souris attrapées et immobilisées dans une main) : cet acte induit un stress bref pour les souris, mais sont indispensables pour réaliser les injections. 3- certaines souris seront soumises à un prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Ce geste peut induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures). Ce prélèvement permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant le traitement et à la fin de la procédure. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois au maximum sur une période de 15 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits sur les animaux seront un stress bref et des douleurs brèves. La contention des animaux induira un stress bref passager chez les animaux. Les injections induiront une légère douleur de piqûre brève. Les prélèvements sanguins (une seule fois) peuvent induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures).
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fin de procédure afin d'en analyser les organes d'intérêts.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des approches in vivo (dans l’organisme vivant) verront leurs organes utilisés pour des cultures cellulaires et des expériences in vitro et les organes des souris malades traitées ou non serviront de contrôles positifs ou négatifs pour des expériences ultérieures. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement. Le nombre d’individus à analyser par groupe d’animaux sera gardé au minimum autant que faire se peut.
Raffinement
Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'ils soient contaminés par des agents infectieux, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et avec un contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de l’humidité. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, ne sont jamais isolés et sont toujours hébergés avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher). Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans le présent projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. La contention des animaux reste nécessaire aux injections par voie intrapéritonéale (dans le ventre) prévues ce qui engendrera un stress bref chez les animaux. Ces pratiques seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut. Les souris seront observées quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante sur un modèle de pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 8 semaines (stade adulte). Tous les animaux seront utilisés avant 41 semaines d’âge pour éviter tout risque de souffrance des individus.
Traitement de modèles murins de la maladie d’Alzheimer par des mini-anticorps ciblant des protéines du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans le ventre ou dans le nez, puis soumises à des épreuves censées mesurer la mémoire, l'exploration et les comportements répétés, des souris porteuses de mutations modélisant la maladie d'Alzheimer reçoivent entre quatre et quarante injections espacées d'une semaine. 960 souris sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélèvement de structures cérébrales. Le détail des procédures cite pourtant 540, puis 960, puis 2 880 souris, soit un total très supérieur à l'effectif déclaré. Aucun des tests comportementaux n'est nommé, et le porteur conclut à l'absence de souffrance attendue en s'appuyant sur des études déjà publiées.
Objectifs
La démence touche environ 50 millions de personnes dans le monde, et atteindrait 139 millions de personnes en 2050. La maladie d’Alzheimer représente 60 à 70% des démences et se classe 5ème cause de mortalité dans le monde. Seuls 4 médicaments ont été autorisés sur le marché, mais ne sont plus remboursés depuis 2018 en France dû à leur efficacité limitée. Récemment, des immunothérapies ciblant un des marqueurs de la pathologie ont été autorisées, mais leur approbation est controversée à cause de leurs effets secondaires. Il est donc urgent de mettre au point des stratégies thérapeutiques efficaces contre cette pathologie. Des anticorps produits chez les camélidés, appelés mini-anticorps et 10 fois plus petits qu’un anticorps classique, apparaissent comme outils prometteurs pour franchir les barrières entre le sang et le cerveau. Ils promettent également moins d’effets indésirables grâce à leur haute spécificité pour leur cible. Le laboratoire a ainsi développé, produit et optimisé plusieurs mini-anticorps ciblant des récepteurs connus pour être dérégulés et impliqués dans la maladie d’Alzheimer. Ce projet vise ainsi à évaluer les effets pharmacologiques des mini-anticorps dans différents modèles de la maladie d’Alzheimer. Pour cela, le projet se découpe en trois parties : (1) Evaluation de la spécificité des mini-anticorps pour les différentes cibles dans le cerveau. (2) Evaluation du passage de la barrière sang-cerveau par les différents mini-anticorps. (3) Evaluation de traitements chroniques sur des modèles de souris transgéniques Alzheimer.
Bénéfices attendus
Le projet permettrait d’évaluer les différents mini-anticorps produits et optimisés au laboratoire, et de sélectionner les mini-anticorps prometteurs dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Les principaux avantages de ces molécules sont leur haute spécificité, leur capacité à moduler uniquement les récepteurs impliqués dans la maladie d’Alzheimer, et peu ou pas d’effets secondaires. On souhaite donc mettre en place une nouvelle génération de stratégies thérapeutiques, qui engendreraient moins d’effets secondaires.
Procédures
L’intégralité des souris sera soumise à minima à une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort, 540 souris ne seront que dans ce cas-ci. Pour étudier le passage des mini-anticorps dans le cerveau, 960 souris recevront une injection intra-péritonéale ou intra-nasale de mini-anticorps ou de tampon salin (480 souris pour chaque mode d’injection). Elles recevront aussi une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort pour un temps total de 30min entre l'injection d'anesthésiques et la mise à mort. Concernant les traitements chroniques, les 2880 souris restantes recevront entre 4 et 40 injections intra-péritonéales de mini-anticorps ou de tampon salin, espacées d’une semaine. Ces mêmes souris seront également soumises à divers tests comportementaux évaluant les déficits cognitifs. Un test permettra d'évaluer la mémoire, un autre évaluera les capacités exploratoires de la souris, et un dernier test permettra de mesurer les comportements répétés. Elles recevront aussi une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort pour un temps total de 30min entre l'injection d'anesthésiques et la mise à mort. Ponctuellement, une anesthésie gazeuse sera effectuée avant l’anesthésie médicamenteuse pour des prélèvements de fluides biologiques, pour une durée comprise entre 2 et 3h.
Impact sur les animaux
Une douleur légère produite par l’introduction d’une aiguille au cours de l’administration des mini-anticorps peut être attendues. L’injection par voie intra-nasale pourra induire un stress à l’animal, dû à la contention plus longue. D’après des études déjà publiées, aucune souffrance, douleur ou angoisse ne sont attendues après traitement avec des mini-anticorps.
Devenir
L’ensemble des animaux est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever des structures d’intérêt pour analyse.
Remplacement
Le sujet de l’étude étant l’évaluation des effets pharmacologiques et comportementaux chez la souris, le remplacement de l’animal n’est pas envisageable. La maladie d'Alzheimer est une pathologie complexe à plusieurs échelles, moléculaire et comportementale. De même, l’évaluation d’une immunothérapie prend en compte divers critères qui doivent être translationnels à une immunothérapie sur l’Homme. En effet, il n’existe aucun modèle de recherche qui puisse mimer les effets thérapeutiques des mini-anticorps injectés et la complexité de l’organisme répondant à cette immunothérapie, d’un point de vue moléculaire et comportemental, d’où le besoin d’un modèle animal transgénique (Alzheimer).
Réduction
Les études préliminaires ont permis de réellement identifier et sélectionner les mini-anticorps prometteurs dans des traitements sur la souris, afin de réduire au maximum les études sur l’animal. Tout au long de ce projet, plusieurs étapes permettront d’affiner la sélection des mini-anticorps, ce qui diminuera le nombre de souris qui ne seront pas nécessaires pour les étapes suivantes. La dernière partie de l’étude sur l’évaluation d’un co-traitement pourra être réduite drastiquement, voire non réalisée, si les résultats n’y montrent pas un intérêt suffisant. De plus, l’utilisation de mâles et de femelles est une question de santé publique afin d’évaluer au mieux les effets du traitement qui peuvent différer entre les deux sexes, notamment dans la maladie d'Alzheimer.
Raffinement
Les données préliminaires obtenues au laboratoire et présentes dans la littérature scientifique n’indiquent aucune toxicité possible liée à l’injection de mini-anticorps. Il n’est donc pas attendu de souffrance chez les animaux qui seront injectés. Les animaux seront sous surveillance journalière par le personnel zootechnicien. Différents paramètres seront observés : les processus neuro-inflammatoires, suivi de paramètres comportementaux généraux et cognitifs, ainsi que le suivi de l’amélioration ou l’aggravation de la pathologie. Avant les tests comportementaux, les souris seront soumises à plusieurs séances d’habituation pour diminuer le stress. Au vu des données disponibles dans la littérature scientifique, aucun symptôme de douleur n’est attendu pour ces modèles de souris. Les souris seront hébergées en groupe dans un milieu enrichi, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles génétiques de souris qui développent la maladie d’Alzheimer. Ces modèles peuvent donc être utilisés pour évaluer l’évolution des déficits cognitifs lors des traitements avec les mini-anticorps. Les modèles de souris déficientes des récepteurs cibles sont indispensables pour avoir des contrôles fiables de la spécificité des mini-anticorps en vue des traitements chroniques. Les animaux seront traités à une dose unique entre 2 et 6 mois pour évaluer la spécificité des mini-anticorps et leur passage dans le cerveau. Ces âges-ci correspondent à un développement du cerveau bien achevé. D’autres animaux seront traités chroniquement à partir du sevrage et jusqu’à 11 mois d’âge au plus tard, là où les déficits cognitifs seront bien établis.
NIAGARA : Implication des noyaux paraventriculaires dans la neurogenèse hypothalamique et sensibilité au régime alimentaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélèvement de tissus. La moitié reçoit pendant trois jours un régime riche en graisses, une partie subit une injection dans le ventre chaque jour pendant une semaine, et des prélèvements sanguins sont faits au niveau de l'œil sous anesthésie locale. Le bénéfice annoncé reste interne à la recherche : identifier une population de cellules souches dans une région précise de l'hypothalamus et observer sa réaction au régime gras. Le porteur affirme que la flexibilité métabolique ne peut pas être reproduite en culture cellulaire et qu'il faut "utiliser l'organisme dans son ensemble".
Objectifs
Des cellules spécialisées, nommées tanycytes, se trouvent dans une partie du cerveau appelée l'hypothalamus, région qui contrôle la prise alimentaire et le métabolisme. Ces cellules agissent comme des cellules souches neurales : elles génèrent de nouveaux neurones et cellules cérébrales. Un régime riche en graisse peut perturber la formation des tanycytes et leur devenir, entraînant ainsi des problèmes métaboliques. Cependant, certains organismes ont développé des mécanismes pour s'adapter à ce type de régime et éviter l'obésité. Ce mécanisme, appelé flexibilité métabolique, est la capacité d'ajuster le métabolisme en fonction de la disponibilité des nutriments. De manière intéressante, des cellules similaires aux tanycytes ont été découvertes chez les souris résistantes à l'obésité dans une région de l’hypothalamus où ils n’ont pas encore été décrits, les noyaux paraventriculaires. Il s’agit de noyaux qui bordent le ventricule de part et d’autre de celui-ci, d’où leur nom de « paraventriculaire ». Ces cellules, renommées dans cette étude les tanycytes-like sont peu présentes voire inexistantes chez la souris de laboratoire sensibles à l'obésité. Cette découverte suscite des questions sur le rôle de ces cellules, similaires aux tanycytes, dans le contrôle du métabolisme. Cette étude a deux objectifs : 1) déterminer si les tanycyte-like, sont des cellules souches neurales et 2) déterminer si ces cellules se multiplient et produisent plus de neurones en réponse à un régime alimentaire riche en graisses uniquement chez les souris résistantes à l’obésité, (en comparaison avec de souris sensibles à l’obésité). Si c’est le cas, cela suggèrerait que les tanycyte-like donnent au cerveau de la souris résistante à l’obésité une capacité d'adaptation spéciale à des signaux extérieurs, tels que le régime alimentaire.
Bénéfices attendus
Cette recherche identifierait une nouvelle population de cellules souches neurales dans une partie spécifique du cerveau et évaluerait comment elles réagissent à différents régimes alimentaires. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles explorations sur le rôle des noyaux paraventriculaires et des tanycyte-like dans la capacité de l’organisme à s'adapter à des régimes variés. Les résultats pourraient également expliquer pourquoi certaines souris sont plus résistantes aux problèmes métaboliques que d'autres. En fin de compte, cette étude aiderait à comprendre les mécanismes liés à des maladies métaboliques et à mieux saisir comment l'hypothalamus fonctionne dans des conditions alimentaires changeantes.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à un régime riche en graisse pendant 3 jours. Une partie des animaux recevra également une injection intrapéritonéale par jour pendant 7 jours d’un traceur qui permet de marquer et suivre les cellules nouvellement formées. Cette intervention ne nécessite aucun anesthésiant, mais les animaux seront surveillés les heures suivants l’injection. Des prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de l’œil, après anesthésie locale par gel d’oxybuprocaine 0,4%. Les souris seront euthanasiées à la fin de l'expérience.
Impact sur les animaux
Nos procédures ont été précédemment testées pour minimiser tout impact négatif sur les souris. Dans une étude antérieure, un régime riche en graisses administré pendant 3 jours a entraîné une augmentation de seulement 4% du poids corporel chez les souris. Cependant, chez les souris naturellement résistantes à l‘obésité, ce régime n'a eu aucun effet sur le poids corporel. Les injections répétées du traceur pendant une semaine ne semblent pas avoir d'effets nocifs ou toxiques sur les souris, ce qui rend ces deux interventions légères et sans effets indésirables sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car des prélèvements de tissus et analyses sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Nous souhaitons combiner des approches in vitro et in vivo pour étudier la capacité de prolifération des tanycyte-like. Pour confirmer qu'une cellule est une cellule souche neurale, nous devons utiliser les deux approches, et il est crucial d'inclure une approche sur animal entier. Les études physiologiques liées au métabolisme ne peuvent être menées qu'avec des animaux vivants, car le métabolisme est un processus complexe qui nécessite un système intégré. Ainsi, les effets du régime riche en graisses sur les cellules des noyaux paraventriculaires ne peuvent être observés qu'en examinant les cerveaux des souris. Nous devons donc confirmer à la fois in vivo et in vitro la capacité des tanycyte-like à proliférer, ainsi que leur destin cellulaire. Cela nous permettra ensuite de comprendre leur rôle potentiel dans la flexibilité métabolique. De plus, la flexibilité métabolique ne peut pas être reproduite dans des expériences de culture cellulaire, c'est pourquoi nous devons utiliser l'organisme dans son ensemble pour étudier ce phénomène.
Réduction
Nous utiliserons cinq animaux par groupe et par expérience dans notre étude, ce qui est considéré comme le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Utiliser moins d'animaux serait préjudiciable à la qualité de nos données et conduirait à une utilisation inutile d'animaux. Au final, nous estimons qu'un total de 100 animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs de notre étude, tout en maintenant une puissance statistique suffisante. Pour analyser nos résultats sans compromettre la précision statistique, nous utiliserons une méthode adaptée aux petits échantillons qui garantira la robustesse de nos conclusions.
Raffinement
Nous surveillerons de près le poids corporel et la consommation alimentaire des animaux chaque semaine. Si des effets négatifs tels que la prostration, la non-alimentation ou des blessures étaient observés, l'animal serait retiré du groupe expérimental et euthanasié si nécessaire. Pendant toute la durée de l'expérience, nous veillerons à enrichir l'environnement des animaux avec une maisonnette et un bâtonnet à ronger. De plus, les animaux auront la possibilité de construire leur nid avec du coton pour favoriser leur bien-être. Même si les souris doivent être isolés pour évaluer la quantité de nourriture consommée, les contacts olfactifs et visuels avec leurs congénères sont conservés. Chaque cage sera équipée d'un igloo pour offrir un refuge aux animaux, ainsi que de matériel de nidification (plusieurs bâtons de ouate) et des bâtonnets de bois à ronger pour les stimuler et enrichir leur environnement. Pour les prélèvements sanguins, un gel anesthésiant sera appliqué au niveau de l’œil pour éviter toute éventuelle douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle biologique pour notre étude. Les souris sont largement utilisées en recherche scientifique, ce qui a permis d'accumuler des connaissances approfondies sur de nombreux aspects physiologiques et comportementaux liés à l'équilibre énergétique. Notre recherche se base sur la différence de contrôle métabolique entre deux souches de souris déjà bien caractérisées au laboratoire, ce qui constitue le fondement de notre étude. Tous les protocoles que nous utiliserons ont été spécifiquement adaptés et validés pour les souris, avec un contrôle rigoureux des paramètres vitaux. Nous travaillerons avec des souris jeunes adultes, c'est-à-dire des animaux âgés de 2 mois.
Mesure de la biodisponibilité et de la pharmacocinétique de produits pharmacologiques chez la souris – Prélèvements répétés
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Jusqu'à vingt et une administrations espacées de huit heures et dix micro-prélèvements de sang à l'extrémité de la queue, sur quarante-huit heures au minimum : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour recueillir les échantillons. Le projet mesure la concentration sanguine de quatre-vingts candidats médicaments par an pendant cinq ans, à raison de trois souris par condition testée. Le porteur écrit renoncer à toute grille de score parce qu'un score obligerait à maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution, et prévoit la mise à mort dès 2 à 5 % d'écart de poids. Le choix de la souris tient à ce qu'elle est l'espèce la plus utilisée pour cette mesure et à ce que sa petite taille consomme moins de composé, certains candidats médicaments étant difficiles à synthétiser.
Objectifs
Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…
Bénéfices attendus
La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h.
Impact sur les animaux
Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses
Remplacement
Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.
Réduction
La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou avant le vide sanitaire suivant…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire). Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement
Choix des espèces
La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.
Etude de la pharmacocinétique et de la biodistribution de différentes nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPIONs) chez le rat sain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
33 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacun subissant soit huit prélèvements sanguins sous anesthésie après une injection intraveineuse, soit deux séances d'IRM d'une heure. Tous seront tués en fin de procédure pour prélever leurs organes. Le porteur justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la possibilité de prélever davantage de sang sur un même individu, ce qui divise par huit le nombre d'animaux utilisés. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment influencer le comportement de nanoparticules d'oxyde de fer dans le sang, un usage en médecine humaine étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Les nanoparticules à base de fer sont en plein développement et possèdent de nombreuses propriétés pour des applications en médecine : en effet, 1/ elles pourraient aider au diagnostic par imagerie IRM (imagerie par résonance magnétique) car le fer est visible en IRM mais aussi 2/ elles pourraient servir pour traiter des pathologies: i) sous un champ magnétique le fer peut dégager de la chaleur et détruire les cellules à proximité, ii) le fer peut également aider à augmenter les effets de radiothérapie (traitement par rayons) et enfin, iii) les nanoparticules peuvent jouer le rôle de transporteur de médicaments. Un élément indispensable avant de développer des nanoparticules est de contrôler leur comportement dans l’organisme afin de les amener sur leur lieu d’action. Le principal problème de la plupart des nanoparticules est qu’elles sont vite éliminées de la circulation sans avoir le temps de rejoindre leur cible et qu’elles s’accumulent dans le foie qui est l’organe qui permet leur élimination. Dans de précédents travaux nous avons identifié que certaines protéines présentes dans la circulation sanguine pouvaient influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer aussi appelées Spions (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles). Dans ce projet, nous souhaitons maintenant greffer ces protéines sur les Spions et évaluer leur comportement biologique : temps de circulation sanguine et élimination.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer pour à terme permettre leur utilisation en médecine humaine.
Procédures
Procédure 1 : Une injection intraveineuse (1minute) puis 8 prélèvements sanguins (2 minutes chacun) sous anesthésie. Procédure 2 : deux sessions d’imagerie par IRM (1h maximum chacune) seront réalisées ainsi qu’une injection intraveineuse (1 minute) sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pourraient présenter un léger inconfort et des lésions locales si le geste est mal maîtrisé. Un stress associé à la mise sous anesthésie peut également intervenir. Les composés administrés ne devraient avoir aucun effet.
Devenir
Des analyses complémentaires sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude. La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de procédure
Remplacement
L’étude du devenir d’une molécule dans l’organisme rend la règle de remplacement difficilement applicable puisqu’il est nécessaire de l’étudier dans son contexte global avec une interaction entre les différents organes préservée.
Réduction
Une sélection de 6 Spions, préalablement testés in vitro pour l’étude de leur pharmacocinétique puis par la suite des 3 meilleurs Spions pour l’étude de biodistribution permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant ceux avec les moins bonnes propriétés physiologiques. L’effectif de chaque groupe expérimental a été réduit à son minimum dans chaque procédure afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents sur la base des études menées précédemment. L’utilisation du rat permet également de réduire les effectifs car il est possible de réaliser des prélèvements sanguins répétés compatibles avec nos analyses biologiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 3 avec accès illimité à l’eau et la nourriture. L’enrichissement des cages sera composé de 2 pad de sizzle-dri (frisottis de carton). Un temps d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respecté avant le début de la procédure. La réalisation d’une imagerie IRM dans cette étude, qui est une méthode non invasive, permet de réduire la douleur et l’inconfort à son niveau minimum. La totalité des procédures est réalisée sous anesthésie et sur plaque/lit chauffant afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance et également à la bonne réalisation des gestes techniques.
Choix des espèces
Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever de façon répétée des volumes de sang pour nos analyses qui demanderaient l’utilisation de nombreuses souris. Dans un but de réduction du nombre d’animaux nous utiliserons le rat qui permet de diminuer le nombre d’animaux par 8 mais également l’imagerie par IRM. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g) afin qu’ils aient atteints leur maturité physiologique
Evaluation de l’effet de différents traitements contre l’état de mal épileptique chez le jeune rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 100 rats juvéniles, âgés de 21 à 45 jours, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à la fin pour prélèvement d'organes. Des convulsivants leur provoquent un état de mal épileptique pouvant durer jusqu'à quatre heures, 360 d'entre eux subissant en plus une chirurgie d'implantation d'électrodes crâniennes d'une heure, et jusqu'à vingt-deux gavages ou injections quotidiennes selon les groupes. L'isolement de deux à vingt-quatre heures pendant l'enregistrement des crises figure lui aussi parmi les nuisances déclarées, et les rats dont l'état de mal dépasse deux heures après administration des produits sont tués par surdose d'anesthésique. Sur le remplacement, le porteur affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas les propriétés des crises dans un "cerveau entier" et que la modélisation informatique manque encore de données.
Objectifs
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements (pharmacologiques et probiotiques) sur 1) la terminaison de l’état de mal épileptique (status epilepticus) dans un premier modèle, et 2) la prévention de ce status epilepticus dans un deuxième modèle, chez des rats jeunes. Le status epilepticus est défini par une crise prolongée (plus de 5 min). Bien que la plupart des patients répondent bien aux benzodiazépines (médicament donné en première intention), certains patients sont réfractaires (35%) et nécessitent d’autres traitements. Nous proposons ici d’étudier les effets de différents traitements et différentes voies d’administration (orale, intrapéritonéale et intraveineuse) dans 2 modèles de status epilepticus, en commençant par une analyse comportementale, puis, après confirmation des doses effectives, par analyse électroencéphalographique (EEG).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traitements anti-épileptiques pharmacologiques et/ou probiotiques efficaces dans la terminaison et/ou la prévention de l’état de mal épileptique. Le but est de proposer ces traitements chez l’enfant, soit pour prévenir de l’état de mal épileptique, présent dans de nombreux syndromes épileptiques, dont le syndrome de Dravet ; soit pour terminer un état de mal épileptique afin d’éviter la survenue d’altérations neurologiques. L’état de mal épileptique prolongé (réfractaire aux traitements actuels) touche 1 tiers de patients épileptiques et peut avoir des conséquences délétères pour le cerveau, voire entrainer la mort des patients.
Procédures
- Injection sous-cutanée : animal vigile, 1 fois pour tous les 1100 animaux, et au moins 2 fois pour les 360 animaux qui subiront une chirurgie. - Injection intrapéritonéale : animal vigile, 1 fois ou 2 fois pour 378 animaux respectifs ; et 6 fois (1 fois/jour) ou 22 fois (1 fois/jour) pour 86 animaux respectifs. - Injection intraveineuse : animal vigile, 1 fois pour 378 animaux. - Gavage oral : animaux vigiles, 6 fois (1 fois/jour) ou 22 fois (1 fois/jour) pour 86 animaux respectifs. - Chirurgie d’implantation d’électrodes EEG : anesthésie générale (une fois par animal) et analgésie (en tout 3 ou 4 injections sous-cutanée), 360 animaux, durée de la chirurgie maximum 1h. Ces procédures seront effectuées par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue d’un état de mal épileptique (d’une durée maximale de 4h) 2) un stress et une douleur dus à l’administration des convulsivants (PTZ et pilocarpine) 3) un stress et une douleur dus à l’administration aigue ou chronique des traitements proposés 4) un stress du à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes (procédures 2 et 4) 5) un stress dû à l’isolement (de 2h à 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées expérimentalement chez l’humain. (2) Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier (et ceux malgré le développement de méthodes alternatives). (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord les traitements par analyse comportementale avant d’effectuer des analyses EEG. De plus, les groupes contrôles et traités seront regroupés afin de minimiser l’utilisation des animaux. Enfin, pour les traitements préventifs : le traitement court de 5 jours sera réalisé en premier avant d’envisager un traitement plus long (21 jours) si nécessaire. Le calcul du nombre des animaux est fait selon une approche statistique, il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. Pour les animaux qui seront implantés par des électrodes, un maximum de 12 animaux/groupe sera envisagé afin d’atteindre un minimum de 10 en cas de perte d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec des tunnels en plastiques (ou des huttes en carton après implantation d’électrodes, afin d’éviter que les animaux se soient coincés au niveau de leur connecteur). La température est controlée. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée (environ 45 min avant). Pendant la chirurgie, un gel est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le dessèchement de la cornée. Un spray d’anesthésique local est appliqué au niveau de la peau incisée pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant avec rétrocontrôle. Puis, à la fin de la chirurgie, une deuxième dose d’analgésique est administrée dans les 4h (soit 6h après la première) pour réduire la douleur postopératoire, puis un antalgique dans l’eau de boisson est donné pendant 48h. Une distribution d'aliment hydraté pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Lors de l’induction de l’état de mal épileptique, les animaux sont suivis par vidéo ou vidéo-EEG. Si cet état de mal dure plus de 2h après administration des produits, les animaux seront mis à mort par surdose d’anesthésique. Les administrations (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage oral) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisi (rat Sprague Dawley) est le modèle le plus décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induit par les proconvulsivants utilisés dans cette étude. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. De plus, la lignée Sprague Dawley choisie montre un taux de survie élevé suite à l’induction des crises proposées. Pour toutes les procédures, nous testerons des animaux juvéniles (entre P21 et P45) afin d’évaluer des traitements compatibles chez l’enfant.