Rongeurs

Chaque rat reçoit une seule molécule par une seule voie, soit dix injections sous la conjonctive en un mois, soit six injections dans le vitré étalées sur six mois, soit une injection unique sous la rétine. 3 000 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'électrorétinogramme final dure quarante minutes, avec des électrodes plantées sous la peau des joues et du bas du dos et des lentilles posées sur l'œil, après une nuit passée dans le noir. Le porteur estime que dix rats traités et dix témoins suffisent par molécule, et retient le rat parce que la taille de son cristallin rend l'abord chirurgical de l'œil plus commode.

Objectifs

La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie neurodégénérative de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine, des couleurs et du contraste. S’ils dégénèrent, le sujet perd l’information visuelle centrale. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays développés. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif efficace pour la forme sèche, qui représente 80 pourcents des cas de DMLA. De nouveaux traitements sont actuellement en essai clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ne cible spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs. Ainsi, le but de ce projet est de trouver des molécules protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissu rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets neuroprotecteurs potentiels de certaines molécules. Les molécules qui ont démontré un sauvetage des photorécepteurs à cônes ont été sélectionnées. Ces molécules seront testées in vivo sur différents modèles de rat présentant une dégénérescence de la rétine, et seront administrées selon différents modes d’injections oculaires déjà pratiqués en clinique. En fin de traitement, un examen électrorétinographique sera réalisé afin de mesurer l’activité des photorécepteurs à cônes après un stimulus lumineux. La réponse obtenue à cet examen permet une première évaluation de l’éventuel effet neuroprotecteur sur les cônes in vivo. Suite à cet examen, les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés afin de corréler les résultats du premier examen avec une analyse histologique des photorécepteurs à cône ex vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou plusieurs molécule(s) sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), de rétinopathie pigmentaire autres dystrophies rétiniennes.

Procédures

Etape 1 : administration des molécules Nous allons administrer des molécules aux rats, par différentes voies oculaires selon leur pharmacologie. Chaque animal se verra administrer 1 seule molécule par 1 seule voie d’administration au cours de la procédure. -Collyres (sans anesthésie, animal vigile) : 1 goutte 1 à 3 fois par jour en fonction des molécules, pendant 3 mois -Injection sous-rétinienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 15 minutes) -Injection supra-choroïdienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections intravitréennes : sous anesthésie générale, 1 injection mensuelle pendant 6 mois (soit 6 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections sous-conjonctivales : sous anesthésie générale, 1 injection tous les 3 jours pendant 1 mois (soit 10 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 5 minutes). Suite aux administrations, un examen électrorétinographique (fonctionnement de la rétine sur animal vivant) sera réalisé, sous anesthésie générale, après mise en chambre noire pendant 1 nuit. Etape 2 : électrorétinogramme Des électrodes seront placées lors de l’électrorétinogramme en sous-cutané dans les joues et dans le bas du dos du rat comme prise de terre. Des lentilles cornéennes placées sur l’œil de l’animal enregistreront les réponses rétiniennes. Les électrodes sous cutanées se retirent comme une aiguille. La durée d’un examen électrorétinographique est de 40 minutes par animal. Suite à cet examen, l’animal sera directement euthanasié par une méthode règlementaire, puis des prélèvements oculaires seront réalisés.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir de la peur/détresse au moment des injections intra-péritonéales d’anesthésiants. Les animaux subiront un stress physique/thermique au moment des interventions chirurgicales. Dans les suites post-opératoires, une douleur oculaire du côté de l’intervention pourra survenir et la vision pourra être altérée, pendant quelques jours au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, puis les yeux seront prélevés pour permettre des analyses histologiques complémentaires.

Remplacement

Les molécules qui seront administrées in vivo ont préalablement été sélectionnées in vitro sur cultures cellulaires et explants de rétines de porc. Ces modèles présentent une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles, nous avons sélectionné des molécules ayant une double action : 1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant permettant un abord thérapeutique local facilement accessible et contrôlable (œil de rat). Dans le cas présent, les tests seront effectués sur un modèle de rat présentant des signes de dégénérescence similaires à celui de l’homme, induite ou congénitale.

Réduction

Dans un souci de réduction, nous avons établi préalablement à l’étude la taille des effectifs utilisés grâce à un calcul de puissance. Nous estimons ainsi que 10 rats traités et 10 rats contrôles seront suffisants. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet. Toujours dans un esprit de réduction, nous regrouperons les témoins pour les molécules ayant le même véhicule si les expérimentations ne sont pas trop asynchrones. Au total, 3000 animaux seront nécessaires à notre étude sur 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, rouleaux en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des injections oculaires et des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale appliquée directement sur le site opératoire (œil). Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les rats seront placés sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’intervention et en chambre thermostatée de 32 degrés Celsius jusqu’à leur réveil complet. Une nouvelle aiguille stérile sera utilisée pour chaque animal afin de limiter la douleur induite lors des injections. Les animaux seront réveillés de l’anesthésie par administration d’un antidote en fin d’intervention. Nous appliquerons une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne suite aux injections intra et péri-oculaires et à l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les rats resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, rouleaux en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière pour les animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

L’anatomie oculaire chez le rat (notamment taille et volume du cristallin) est beaucoup plus favorable à un abord chirurgical pour délivrance intra- et péri-oculaire des molécules testées, permettant de réduire le nombre d’animaux et d’expérimentations étant donné une diminution du nombre d’échecs. Nous utiliserons des rats chez qui nous induirons une dégénérescence rétinienne et d’autres présentant une dégénérescence congénitale. Les administrations oculaires seront réalisées entre le 6ème et la 8ème semaine de vie pour les rats chez qui nous induisons la dégénérescence. Les administrations oculaires chez les rats avec dégénérescence congénitale auront lieu entre P21 et P45 ou entre 1 et 8 mois de vie en fonction de la lignée (âges respectifs correspondant à la dégénérescence des cônes dans ces modèles).

Une partie des souris utilisées a un système immunitaire déficient, ce qui permet de leur greffer des cellules leucémiques prélevées sur des patients. 4 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à sept injections intraveineuses et dix injections intrapéritonéales, 3 192 d'entre elles jusqu'à quinze gavages, 1 440 jusqu'à trois ponctions de moelle osseuse dans le fémur et 720 une injection directe dans la moelle. La leucémie provoquée peut entraîner une anémie, une grosse rate et des difficultés de locomotion quand la greffe gagne le cerveau, et le porteur prévoit de tuer l'animal dès l'apparition de signes de souffrance.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent les cancers du sang les plus courants de l’adulte, mais elles demeurent très difficiles à traiter avec un taux de rechute élevé et seulement 20% de survie chez les patients agés. Au cours des 40 dernières années, les traitements pour les LAM ayant très peu progresser, il est crucial de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients, notamment après une rechute. Nos recherches ont identifié une nouvelle cible : la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines. Nous avons réalisé des tests en laboratoire sur des cellules leucémiques, y compris celles résistantes aux traitements existants, ainsi que sur des cellules de patients. Nos résultats préliminaires ont montré que notre traitement ciblant la SUMOylation pourrait être prometteur pour traiter les LAM. Nous devons désormais confirmer ces résultats dans des modèles animaux, plus proches de la réalité clinique, avant de pouvoir envisager des essais sur des patients. De plus, nous avons découvert que bloquer la SUMOylation pouvait stimuler le système immunitaire pour combattre les cellules cancéreuses mais nous devons confirmer ces résultats sur des souris. Enfin, nous explorerons également si notre traitement peut être utilisé en combinaison avec d'autres médicaments déjà utilisés en clinique pour augmenter son efficacité.

Bénéfices attendus

Les LAM sont des cancers au pronostic sombre. Ce projet a pour objectif d’étudier une nouvelle approche thérapeutique consistant à cibler la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines, seule ou en combinaison avec d'autres molécules déjà utilisées en clinique. La validation préclinique effectuée dans le cadre de ce projet constituera une étape essentielle au développement clinique de ces nouvelles molécules.

Procédures

En fonction de la procédure dans laquelle ils seront impliqués, les animaux pourront subir : 1- Injection intraveineuse à la veine caudale sur animaux vigiles à l’aide d’un tube à contention (durée de la procédure : 1 minute): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet (soit 4912 souris) seront soumis à des injections en I.V., au maximum 7 fois au cours de leur vie 2- Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet seront soumis à des injections en I.P., au maximum 10 fois au cours de leur vie 3- Gavage sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): cette intervention concernera un maximum de 3192 animaux (en fonction des combinaisons de molécules sélectionnées pour la suite du projet au cours de la procédure 1) et sera réalisée au maximum 15 fois au cours de la vie de l’animal 4- Prélèvement de moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 1440 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé au maximum 3 fois au cours de la vie de l’animal et au minimum à 4 semaines d’intervalle. 5- Injection orthotopique dans la moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 720 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal. 6- Prélèvement de sang à la veine caudale (durée de la procédure : 1 minutes): Cette intervention concernera au maximum 2208 animaux et sera réalisée au maximum 7 fois (50µl de sang) au cours de la vie de l’animal et au minimum à 14 jours d’intervalle. L’ensemble de ces gestes étant parfaitement maîtrisés par le personnel amené à intervenir dans ce projet, les durées d’interventions sont très courtes ce qui limite le stress et l’inconfort des animaux.

Impact sur les animaux

La greffe de cellules leucémiques chez la souris peut induire l'apparition de symptômes tels que l'anémie, la splénomégalie ainsi que des difficultés de locomotion lorsque la greffe se localise dans le cerveau.

Devenir

Dans la mesure où nous induisons une pathologie chez l’animal qui peut induire des nuisances, les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure ou dès lors qu'un des animaux présentera des signes de souffrance.

Remplacement

Nos recherches ont montré en laboratoire l'importance de la SUMOylation, un mécanisme qui modifie les protéines, dans les Leucémies Aigues Myéloïdes (LAM), notamment en tant que cible potentielle pour des traitements. Maintenant, pour confirmer si ces observations pourraient être applicables en clinique dans le futur, nous devons nécessairement tester ces molécules sur des animaux de laboratoire dont le système immunitaire est déficient et qui portent des cellules cancéreuses de patients pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur un organisme vivant complet plus proche de la réalité clinique. De plus, étant donné que le TAK possède des effets sur le système immunitaire, nous devons également vérifier ces résultats sur des animaux de laboratoire ayant un système immunitaire normal, pour comprendre comment celui-ci pourrait contribuer à l'efficacité du traitement contre le cancer. Si nos résultats se confirment dans ces tests, cela ouvrirait de nouvelles pistes pour traiter les patients atteints de LAM.

Réduction

Nous utilisons des cellules leucémiques luminescentes pour suivre l’évolution du cancer à l’aide d’une caméra adaptée dont nous disposons au laboratoire. Quand cela sera possible, nous utiliserons cette méthode pour suivre la progression des tumeurs. Cela nous permettra d'utiliser beaucoup moins d'animaux pour nos expériences. De plus, nous utiliserons un logiciel de calcul de statistiques qui permet d'optimiser nos groupes expérimentaux, avec un maximum de 8 souris par groupe. Cela nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés tout en étant certains que nos résultats restent fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées au maximum par groupe de 5 animaux par cage afin de limiter stress et angoisse et bénéficieront d'au moins 2 enrichissements/cage (coton et cabane). Lors du change, effectué de façon hebdomadaire par le même zootechnicien, la cabane et une partie du nid seront conservés afin de garder les odeurs des animaux dans la cage propre et ainsi limiter le stress. Dans les pièces de stabulation, nous diffusons des sons de nature (oiseaux, rivière, forêt) afin de limiter les variations sonores entre le jour et la nuit dans le but de réduire le stress des animaux. Pour les animaux en cours d'expérimentation et qui sont manipulés plusieurs fois par semaine, nous ajouterons une roue d'exercice par cage comme enrichissement supplémentaire, ainsi que de l’aliment et de l’eau en gel afin de favoriser l’hydratation des animaux et d’agrémenter leur alimentation. Au cours des procédures nécessitant une anesthésie, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane 2,5%. Concernant les procédures pouvant induire de la douleur (injection intra-fémorale), une analgésie à la Buprénorphine 0.05mg/kg en sous-cutané 30 minutes avant l’injection puis 12h post-injection sera administrée. Afin de réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement, y compris les weekends, et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité, isolement, hérissement des poils, dos voûté, difficulté de locomotion) seront recherchés et seront répertoriés dans la grille de scoring jointe en annexe. En fonction du score obtenu, l’animal sera maintenu sous simple surveillance, surveillance accrue (2 fois/jour) ou immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

En vue d'une utilisation clinique future, seule une étude pré-clinique menée in vivo chez la souris permettra de valider la SUMOylation comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des LAMs. Le modèle murin est particulièrement pertinent pour la réalisation notre projet. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéprimées et immunocompétentes. En effet, les modèles immunodéprimés permettent de greffer aisément des cellules de patients et de récapituler la pathologie humaine chez la souris afin de tester l'efficacité anti-tumorale de nos molécules. Par ailleurs, il existe déjà des modéles syngéniques de LAM chez la souris qui nous permettrons d'évaluer le rôle du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale induite par l'inhibition de la SUMOylation. Les animaux utilisés auront entre 6 et 8 semaines. Ce niveau de développement permet une greffe efficace des cellules humaines et permet d'effectuer des expériences à long terme, en particulier dans le cas des patient-derived xenografts (Pdx) qui peuvent nécessiter jusqu'à 6 à 8 mois pour se développer.

Chaque souriceau est amputé d'une phalange par patte entre le septième et le dixième jour après la naissance, pour l'identifier et le génotyper en une seule opération. 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gavées chaque jour pendant quatre semaines ou injectées dans l'abdomen, puis soumises à des tests de locomotion en environnement nouveau et de coordination des membres. Le porteur écrit pourtant que les expériences réalisées ici "ne sont pas douloureuses" et qu'elles consistent uniquement en des études comportementales. Toutes sont tuées à la fin pour récolter le matériel biologique qui complétera les résultats de comportement.

Objectifs

Des mutations d’un récepteur de la vitamine A sont à l’origine d’une maladie neurologique rare (MCOPS12) responsable de symptômes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodéveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostic vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations. Les souris mutantes présentent des symptômes moteurs similaires (n’affectant pas fondamentalement la vie des animaux qui peuvent marcher et se redresser sans aucun problème) à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle de ce récepteur dans le développement et dans la fonction du striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire ce récepteur contrôle le développement d’une sous-population de neurones, alors qu’à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une autre sous-population de neurones. Notre objectif est de prévenir et/ou de normaliser les symptômes moteurs et cognitifs en modulant l’activité de ces neurones afin de prévenir leur mort et/ou leur dysfonctionnement pour éviter l’apparition des symptômes. Les effets liés au mode d’administration des traitements seront contrôlés grâce à un traitement supplémentaire avec une solution saline, pour s’assurer qu’aucun effet observé ne soit en réalité que le résultat du stress causé par l’administration des composés. Nous avons donc 6 traitements différents à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles pistes de traitements pour la maladie sur laquelle nous travaillons. En effet, notre objectif est de prévenir l’apparition et/ou réduire des symptomes moteurs et cognitifs grâce aux différents traitements que nous allons utiliser en empêchant la perte de certains neurones responsables de ces symptomes, ou en régulant leur activité. Si un ou plusieurs traitement(s) montre(nt) des effets bénéfiques, nous pourrions envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients.

Procédures

La technique d'identification utilisée dans notre EU est la phalangectomie. Celle-ci permet d'identifier les animaux et également de les caractériser génétiquement en une seule étape. L’identification sera réalisée entre les 7è et 10è jours postpartum conformément aux recommandations de la CNREEA. Cependant des méthodes alternatives sont en développement afin de remplacer la phalangectomie par une autre méthode moins invasive. 3 traitements pharmacologiques visant à prévenir les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 4 semaines. Tous les traitements se feront par voie orale (gavage des animaux, 15 secondes par traitement) pendant 4 semaines, à raison d’un traitement par jour. Nous utiliserons 12 animaux par groupe et par traitement (12 x 4 x 4), soit 192 mâles et 192 femelles = 384 animaux au total. 2 traitements pharmacologiques visant à atténuer les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 10 à 25 semaines (adulte). Tous les traitements se feront par injection intrapéritonéale (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et le traitement contrôle (solution saline) (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 120 mâles et 120 femelles = 240 animaux au total. Ensuite, des tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 = 30 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 = 3 x 5 minutes, évaluation de la coordination des membres, test 3 = 32h, évaluation de l’activité locomotrice, test 4 = 30 minutes, évaluation des réflexes, test 5 = 30 minutes, évaluation de la mémoire. Un délai minimum de 1 jour sera respecté entre chaque test afin de diminuer l’effet du stress sur les résultats obtenus. Les mêmes cohortes recevront une seconde dose de traitement et s'en suivra les mêmes tests à des fins de réduction et pour évaluer la meilleure dose dans l'efficacité du traitement dans l'atténuation des symptômes. La moitié des animaux de chacun des 6 traitements (pharmacologique + contrôle) = 312 animaux (156 mâles et 156 femelles), sera ensuite utilisée pour réaliser des analyses cellulaires. L’autre moitié sera utilisée à des fins d’analyses moléculaires.

Impact sur les animaux

Les phalangectomies réalisées entre le 7e et 10e jour postpartum comme recommandé par le CNREEA provoqueront une douleur de durée légère. Elles seront limitées à une seule phalange par patte pour ne pas compromettre la préhension que les animaux exercent avec leurs pattes. Les autres effets indésirables ne dépasseront pas la gêne occasionnée par le gavage des animaux. En effet, les tests comportementaux effectués ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive et un léger stress sont à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables majeurs. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. Amendement : Les injections intrapéritonéales des traitements, et du mélange anesthésie/analgésie lors des perfusions intracardiaques, peuvent provoquer une légère douleur à l'animal ainsi qu'un stress. De plus, nous injecterons une seconde dose des traitements sur les mêmes cohortes expérimentales, espacée d'une semaine

Devenir

L’ensemble des animaux utilisé sera mis à mort afin de récolter le matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui compléteront les résultats obtenus en comportement.

Remplacement

Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique de la signalisation calcique et de la neurotransmission ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.

Réduction

Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée. De plus, nous n’utiliserons qu’un seul groupe d’animaux traités avec le vehicule (contrôle). En effet, les différents traitements seront préparés et administrés de la même manière, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux contrôle. Enfin, la réalisation de la procédure numéro 2 dépendra des résultats obtenus dans la procédure numéro 1. En effet, nous n’utiliserons la seconde procédure uniquement si les résultats de la première procédure ne sont pas concluants. En effet le caractère moins séléctif de la seconde molécule, permettra de moduler la signalisation calcique plus largement.

Raffinement

En vue de RAFFINER les procédures les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses et effectuées par des personnes compétentes et qualifiées (formations conception et chirurgie des rongeurs). Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans traitement préalable de composés pharmacologiques à des doses faibles. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses qui permettent simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Ces cinq traitements ont déjà été utilisés aux mêmes doses, sans causer de souffrance chez les animaux. Les traitements par gavage seront réalisés par des expérimentateurs formés à l’aide de canules souples afin d’éviter toute lésion interne. Les animaux seront surveillés méticuleusement tous les jours à l'occasion des traitements et un suivi de poids sera réalisé 2 fois par semaine (le mardi et le vendredi) pour contrôler leur bien-être. En cas de mal être de l’animal sera exclu de l’étude et un examen vétérinaire sera immédiatement réalisé. Amendement : Différentes injections intrapéritonéales seront réalisées lors des procédures expérimentales 4 et 5 d'une part pour administrer les traitements pharmacologiques, et d'autre part pour administrer le mélange anesthésie/analgésie. En effet, les perfusions intracardiaques seront réalisées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale d’un mélange anesthésie/analgésie afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections intrapéritonéales sont peu douloureuses également. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort après une anesthésie sans réveil par exsanguination par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle des mutations d’un gène dans la mise en place et la progression d’une maladie neurologique progressive rare, les performances comportementales et les fonctions des signalisations calcique, dopaminergique et glutamatergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans un premier temps des animaux de 4 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements, avant même l’apparition de des symptômes. Dans un second temps, nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 25 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements visant à réduire les symptômes moteurs et cognitifs.

Six prélèvements sanguins pour chaque rat, trois pour chaque souris, tous réalisés sous anesthésie gazeuse. 16 rats Wistar et 40 souris vont être utilisés, tous tués six heures après le dernier prélèvement pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif tient en une mesure de cinétique sanguine sur une nanoémulsion de fénoldopam, molécule candidate contre les complications vasculaires de la polykystose rénale. Le porteur mentionne parmi les effets attendus l'exérèse du rein gauche et un gavage, deux actes absents de sa description des procédures, et justifie le recours aux animaux en une seule phrase.

Objectifs

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est une maladie rénale héréditaire ayant une prévalence estimée à 4 sujets sur 10 000 en Europe.1 Dans la PKRAD, le développement de kystes rénaux altère progressivement la fonction rénale aboutissant à une insuffisance rénale terminale chez 1/3 des patients qui représentent 10% des dialysés et des transplantés. Ces patients développent précocement une hypertension artérielle et des complications cardiovasculaires avec une fréquence beaucoup plus élevée que dans la population

Bénéfices attendus

Malheureusement, les effets centraux de la rotigotine restent un frein à son utilisation dans la PKRAD et donc à l’évaluation de cette stratégie pharmacologique sur la structure et la fonction rénale à long terme. Une molécule plus intéressante au plan pharmacologique est le fénoldopam (FENO) qui est un agoniste spécifique des récepteurs DR1 et DR5 ne franchissant pas la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule est notamment utilisée aux USA pour la prise en charge des crises hypertensives ou des hypertensions post-opératoires. A ce jour, le FENO est uniquement administré sous forme intraveineuse du fait de son métabolisme rapide et de sa faible demi-vie. Afin d’évaluer dans notre unité l’intérêt du FENO dans la PKRAD, celui-ci a été administré de façon chronique au moyen de mini-pompes chez des souris invalidées pour la polycystine-1 spécifiquement au niveau endothélial (VE-Cadh/Pkd1fl/fl). Celui-ci a permis de restaurer la dilatation-débit dépendante d’artères mésentériques isolées et de prévenir l’augmentation de la pression artérielle induite par la déficience en polycystine-1 endothéliale (Hamzaoui M et al. Hypertension 2022). L’ensemble de ces travaux montre que la stimulation des récepteurs dopaminergiques D1-like constitue une nouvelle approche thérapeutique d’intérêt pour la prise en charge des complications vasculaires de la PKRAD. Dans la mesure où les mécanismes de mécanotransduction sont communs, cette approche pourrait être également intéressante pour ralentir le déclin de la fonction rénale chez ces patients. Cependant, il n’existe actuellement aucun agoniste dopaminergique des récepteurs D1-like ayant des propriétés pharmacocinétiques permettant une utilisation par voie orale pour le traitement de la PKRAD.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront effectués 6 fois sur les rats lors de la pharmacocinétique et 3 fois chez la souris . Tout les prélement serons réalisé sous-anesthésie gazeuse (isoflurane 2 %) de courte durée.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2, ainsi que l’exérèse du rein gauche pourront occasionner des effets secondaire. Les effets indésirables suite au prélèvement de sanguin sont de la fatigue chez les animaux et le gavage peut induire une petite prostration de l'animal

Devenir

Tout les animaux après le dernier temps de prélèvement au temps 6h serons mis à mort dans les deux procédures pour la récupération des organes et l'analyse des tissus .

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro car nous avons pour but dans cette étude de mettre au point une cinétique sur un produit pharmacologique

Réduction

Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex-vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaires

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=4 pour les rat et n=5 pour les souris ) par cage, dans un environnement stabilisé (température 21°C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux, durée du cycle de lumière (12h/12h)). Tout au long de l’étude, les animaux sont nourris ad libitum et hébergés dans des portoirs ventilés avec de l’enrichissement (plaque de cellulose vierge, tunel, papier krafs et maison en carton). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole pour les rats . Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mis en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et nous appliqueront une grille d’évaluation du bien-être animal séparément pour chaque individu (Annexe I).

Choix des espèces

Le choix du rat Wistar pour les premières analyses se justifie par la probabilité importante d’obtenir des prélèvements permettant une analyse pharmacocinétique détaillée afin de réaliser une translation optimale vers l’étude chez les souris transgéniques. Le choix de la souris pour les analyses complémentaires se justifie par l’abondante littérature, sur l’expérience du laboratoire et sur la possibilité de recourir aux animaux transgéniques pour approfondir les résultats du travail (modèle de souris invalidées pour le gène codant la protéine d’intérêt). Afin de permettre une étude pharmacocinétique chez des animaux adultes, avec la possibilité de recueils sanguins suffisants, le poids des animaux sera : -Rats Wistar (N=16) : 400g -Souris C57Bl6J (N=40): 20g

Tuées quelques jours après l'instillation pour prélèvement des organes, 24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral par le nez et par voie intraveineuse sous anesthésie gazeuse de deux minutes au maximum, avec un risque de gêne respiratoire que le porteur prévoit de corriger au bronchodilatateur. Le projet porte sur la mise au point d'un protocole d'exposition dans le laboratoire, en vérifiant qu'un gène rapporteur s'exprime bien dans les bronches. Quatre souris par groupe suffisent pour cette étape que le porteur présente comme un préalable technique à ses futurs travaux sur le remodelage bronchique de l'asthme.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des symptômes non traité actuellement dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Les travaux de notre laboratoire ont déjà mis en évidence un lien entre la taille du muscle lisse bronchique et l’augmentation de la masse mitochondriale. Selon nos données, quand la masse mitochondriale dans la cellule musculaire lisse bronchique est augmentée, cette dernière prolifère plus vite. Notre but est d’utiliser une approche basée sur une diminution de l'expression de gènes candidats jouant le rôle dans le remodelage bronchique. Cette technique est réalisée avec l'utilisation de particules AAV (Adeno-associated Virus), qui vont désactiver les gènes d'intérêt. Ainsi, nous pourrons mettre en évidence leur fonctionnement dans le remodelage des muscles lisses bronchiques chez les asthmatiques. Nous souhaitons donc mettre en place cette technique dans notre laboratoire. Dans ce cadre, nous souhaitons mener cette étude pilote pour développer le protocole d’exposition de souris naïves aux vecteurs AAV possédant le gène-rapporteur. L'analyse d’expression du gène rapporteur dans les bronches nous permettra de valider les vecteurs et la méthode d’exposition des animaux aux particules AAV.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote sur le traitement de souris naïves par les vecteurs AAV nous permettra d’avancer pour déceler des gènes jouant un rôle clé dans le remodelage des voies aériennes.

Procédures

Les animaux administrés par instillation intra-nasale et intra-veineuse seront soumis à une anesthésie gazeuse dont la durée maximale est de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Le risque de dyspnée (gêne respiratoire, sensation de manque d'air accompagnée d'un essoufflement) chez les animaux suite à l’instillation de solution avec les vecteurs AAV sous anesthésie gazeuses existe. Après l’anesthésie les animaux seront observés par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation d’un bronchodilatateur.

Devenir

L’objectif de ce projet est d’étudier l’expression du gène-rapporteur par des techniques différentes. Quelques jours après l’instillation intranasale les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. L’utilisation du modèle d’asthme chroniques murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 4 souris dans chacun des quatre groupes soit 24 souris pour ce projet. Nous allons comparer les organes des souris de nos quatre groupes avec ceux des animaux témoins qui ne seront dans la procédure expérimentale et donc n’auront aucun traitement.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie générale pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupes sociaux, coppeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales de solution avec les vecteurs AAV peut être traitée par l'utilisation d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml par exemple : Ventoline®).

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes âgés de 5 à 13 semaines afin d'avoir un système respiratoire mature.

2 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de médicament et douze injections de traceur luminescent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées avec des cellules tumorales de myélome, elles subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie et des séances d'imagerie espacées de deux à trois jours. Le porteur indique que la tumeur peut se nécroser, s'ulcérer au point d'injection ou gêner l'animal dans ses mouvements. Les retombées annoncées pour les personnes malades, moins de toxicité et une meilleure pharmacocinétique, restent au conditionnel, quand l'objectif immédiat consiste à comparer cinq nanotransporteurs.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est une tumeur maligne caractérisée par une infiltration de la moelle osseuse. La survie à 5 ans de patients atteints de MM est de 48,5 % et malgré l'introduction de médicaments immunomodulateurs et d'inhibiteurs du protéasome, de nombreux patients présentant des caractéristiques à haut risque ont toujours de faibles taux de survie. Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive de la maladie après le traitement est un défi central pour améliorer les résultats des patients atteints de MM. Les objectifs du projet sont de développer de nouveaux nanotransporteurs pour la délivrance de molécules d’intérêts à visés thérapeutiques dans le cadre de traitement anti-cancéreux notamment dans le myélome multiple. Ces nanotransporteurs auront également la capacité d’être couplées à des molécules pour le dépistage ou le suivi du développement tumoral par imagerie chez l’Homme. Nos expertises pluridisciplinaires à l’interface entre la chimie et la biologie, nous permettent de développer des nanotransporteurs aux caractéristiques physico-chimiques divers (polymérique, lipidique et inorganique de tailles variables). Ces molécules synthétiques pourront encapsuler des agents thérapeutiques tels que des peptides, des chimiothérapies, des protéines. Les nanotransporteurs seront couplés à des molécules thérapeutiques et fonctionnalisés pour le ciblage des cellules cancéreuses ou de son environnement direct afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité du traitement. Ils pourront également être utilisés pour l’amélioration de la sensibilité, du suivi des tumeurs et du diagnostic. Cette première partie du projet consistera à identifier via des études pharmacocinétiques sur souris saines les nanotransporteurs proposant les meilleures propriétés cinétiques ainsi que la biodistribution la plus adéquates en fonction de l’utilisation souhaitée (traitement, imagerie). Dans un second temps, nous évaluerons précliniquement sur un modèle de tumoral de myélome murin l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules formulées en nanotransporteurs.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanotransporteurs dans l’arsenal thérapeutique et diagnostic actuel du myélome. La comparaison des différentes nanotransporteurs ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanotransporteurs sur le ciblage actif, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanotransporteurs pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

Pour la mise en place des modèles tumoraux, les animaux seront soumis à une injection sous cutanée ou intra veineuse de cellules tumorales d'une durée

Impact sur les animaux

Certaines molécules envisagées sont en essais cliniques et leurs effets indésirables sont donc connus. Les nuisances dues à leurs utilisations peuvent être les suivantes : une perte de poids, un œdème, une tachycardie, une dyspnée, une hypotension, un syndrome de réponse respiratoire systémique (SIRS) ou une pneumonie (inflammation de la couche mince de tissu située entre les sacs alvéolaires). Les nuisances identifiées sur souris implantées avec des cellules tumorales sont l'apparation d'une tumeur dont la taille va augmenter si ce n'est dans les groupes traités avec les nouveaux médicaments qui s'ils sont efficaces devraient réduire la taille de ces tumeurs. En évoluant la tumeur pourrait présenter une apparence de nécrose ou s'ulcérer au lieu d’injection ou génêr l'animal dans ses mouvements. Les transporteurs de médicaments testés ont pour but d’améliorer la délivrance des traitement directement dans l’environnement tumoral par leur fonctionnalisation et de ce fait, d’en réduire les effets secondaires et en potentialisant leurs pouvoirs thérapeutiques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la spécificité de ciblage et la cytotoxicité des nanotransporteurs ont été préalablement réalisé afin de remplacer une partie des expérimentation in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. Un modèle de greffe orthotopique est notamment important car même s’il demande un suivi tumoral par imagerie (sous anesthésie) il reste plus représentatif du microenvironnement du myélome (cancer du sang) ; l’animal entier est donc nécessaire. En effet, la pharmacocinétique des groupes de traitement cités ci-dessus et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peut être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanotransporteurs pour le traitement du myélome multiple et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérent à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été calculé mathématiquement et les résultats entre les groupes d’animaux seront comparés avec des tests statistiques adaptés et robustes permettant de mettre en évidence l’effet des traitements testés sur la croissance des tumeurs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude complète de 5 nanotransporteurs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la cellule bien-être (ex : bâton à ronger, coton pour faire un nid permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels). Les animaux observeront une période d’acclimatation après réception. Un tunnel dans la cage et/ou une habituation à la contention (2-3x par semaine sur au moins 1 semaine) sera réalisée avant chaque procédure afin de minimiser le stress due à la contention lors des injections ou à leur manipulation. Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal est étroitement suivi dès lors qu’il entre dans l’une des procédures (2 à 3 fois par semaine) afin d’identifier les signes de stress, de douleur le plus précocement possible. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin de soustraire l’animal à toute forme de souffrance en interrompant la procédure. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de douleur, taille de tumeur, etc.) et l’animal pris en charge selon le score obtenu.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Dans le domaine de la cancérologie , la greffe de cellules tumorales ne peut être réalisée avec succès que sur des souris immunodéprimées adultes afin d'éviter tout phénomène de rejet de la greffe de cellules tumorales ce qui permet ensuite de suivre la croissance tumorale au cours diu temps et d'évaluer l'impact de candidats médicaments sur cette croissance.