Rongeurs
Dissection moléculaire et fonctionnelle des circuits limbiques contrôlant la vulnérabilité au stress
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Privés de matériel de nidification du deuxième au neuvième jour après leur naissance, des souriceaux sont soumis à un stress juvénile fabriqué pour l'occasion. 2 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec biopsie de la queue à dix jours, une chirurgie crânienne de deux heures trente à l'âge adulte, quatre semaines de récupération, puis jusqu'à sept tests de comportement. Le porteur décrit un hébergement en cages collectives enrichies d'un nid cotonné pour éviter l'angoisse de l'isolement social, alors que le protocole consiste précisément à priver les portées de ce matériel pendant huit jours. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, les femelles et les mâles reproducteurs étant auparavant réutilisés pour d'autres lots.
Objectifs
Les troubles cognitifs et émotionnels peuvent résulter de l'interaction entre les prédispositions génétiques et les influences environnementales pendant des périodes critiques du développement. À l'échelle mondiale, l'anxiété a une prévalence de 12% par an, soulignant l'importance d'étudier ses mécanismes pour restaurer les altérations des circuits neuronaux contrôlant la peur physiologique. La période postnatale chez les rongeurs et les humains est particulièrement sensible aux effets des facteurs environnementaux, notamment le stress, en raison de la maturation continue du cerveau. Le stress juvénile peut avoir des effets profonds et durables sur la structure et la fonction cérébrales, influençant ainsi le comportement et la susceptibilité aux stress ultérieurs. L'activité anormale de l'insula, une zone du cerveau, est associée à plusieurs troubles anxieux. Des altérations de sa structure et de sa connectivité sont observées chez les personnes souffrant de ces troubles, suggérant son rôle dans leur physiopathologie. Une étude récente a montré que l’insula est impliquée dans l’expression de phénotypes anxieux chez la souris, mais les mécanismes sous-jacents restent à élucider. Ce projet vise à : 1. Établir un modèle animal de stress juvénile en limitant le matériel de nidification pendant la période post-natale. 2. Enregistrer et moduler l'activité neuronale de l’insula lors de tâches comportementales. 3. Enregistrer l’activité électrique des neurones de l'insula. 4. Identifier les modifications moléculaires des circuits neuronaux de l’insula en réponse au stress.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet comprennent : 1. Compréhension accrue des mécanismes neurobiologiques : Le projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux effets du stress juvénile sur le cerveau et le comportement, ce qui pourrait contribuer à l'élaboration de thérapies plus efficaces pour traiter les troubles cognitifs et émotionnels. 2. Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques : En identifiant les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la réponse au stress juvénile, le projet pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces mécanismes. 3. Amélioration des interventions préventives : En comprenant comment le stress juvénile affecte le cerveau et le comportement, le projet pourrait également contribuer au développement d'interventions préventives visant à réduire les effets néfastes du stress juvénile sur la santé mentale. 4. Avancées dans les techniques de recherche : Le projet utilisera des techniques de pointe telles que l’imagerie par photométrie, la chémogénétique, l'optogénétique, et le séquençage à haut débit du transcriptome ce qui pourrait également contribuer à l'avancement des méthodes de recherche en neurobiologie et en psychiatrie. En résumé, les bénéfices attendus du projet incluent une meilleure compréhension des troubles cognitifs et émotionnels liés au stress juvénile, le développement de nouvelles thérapies et interventions préventives, ainsi que des avancées dans les techniques de recherche en neurobiologie.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à un stress juvénile (stress par limitation de matériel de nidification) du jour post-natal 2 au jour post-natal 9. Au jour post-natal 10, un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé pour génotypage. A l’âge adulte (semaine 9), ils subiront une chirurgie d’un maximum de 2h30 suivie d’une période de 4 semaines de récupération. La moitié des animaux seront ensuite soumis à un stress léger de courte durée (semaine 13) puis à une batterie de tests comportementaux (7 au maximum d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes) étalés sur 2 semaines à raison d’un test par jour au maximum.
Impact sur les animaux
1. Les manipulations des animaux et les tests comportementaux peuvent induire du stress et de la détresse chez les animaux d’un degré de gravité léger. 2. Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. Elles peuvent également générer de la détresse et du stress ainsi que de la douleur post-opératoire minorée par les antalgiques d’un degré de gravité modéré. 3. L'utilisation d'agents chimiques pour la manipulation de l'activité neuronale peut potentiellement entraîner des effets secondaires non désirés, tels que des altérations du comportement ou des réactions toxiques ainsi que de l’inconfort et du stress lié aux injections de ces agents chimiques. Ces effets secondaires sont d’un degré de gravité léger. 4. La biopsie de queue des animaux issus de parents transgéniques peuvent occasionner du stress, de l’inconfort et une douleur d’un degré de gravité léger à modéré.
Devenir
A l’issu du projet, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours de comportements complexes. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une simulation sensorielle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir la puissance statistique requise a été calculé afin d'obtenir des résultats robustes tout en minimisant le nombre d'animaux utilisé. De plus, les femelles utilisés pour la génération de nos souris expérimentales seront réutilisés pour des expériences de cartographie anatomique des différents circuits étudiés ainsi que de leurs collatérales. Les mâles seront réutilisés pour plusieurs lots de reproductions. Nous utiliserons aussi des techniques de neurosciences computationnelles pour maximiser les données comportementales que nous allons extraire de nos souris. En effet, nous utiliserons des logiciels tels que Deep Lab Cut pour extraire les données comportementales et constituer une base de données. Les souris non transgéniques générées par les croisements de souris hétérozygotes des différentes lignées transgéniques requises seront utilisées comme souris sauvages pour les autres expériences.
Raffinement
Pour réduire la souffrance imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- Les animaux seront hébergés en cages collectives, regroupés par fratrie afin d’éviter l’angoisse d’un isolement social. Les cages seront enrichies ave un nid cotonné. 2- Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée par les animaliers. Avant le début de l’expérience, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par l’expérimentateur, puis quotidienne au cours de l’expérience. Lors de ces observations, on vérifiera la capacité de l’animal à s’alimenter, son poids, son comportement, sa vivacité et l’état du pelage. 3- Un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 4- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Durant la chirurgie, la température de l’animal sera contrôlée par une sonde durant la chirurgie, et maintenue grâce à un tapis chauffant. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire. 5- Après la chirurgie, du sérum physiologique stérile sera administré pour éviter la déshydratation, et de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. 6- L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. De plus, nos études font appel à l’utilisation de marqueurs génétiques n’existant que chez la souris. Nous utiliserons également des lignées de souris transgéniques bien caractérisées préexistantes. Les animaux destinés à la reproduction contrôlée seront utilisés au stade adulte en plein période reproductive afin de maximiser les portées et le bien-être des parents et des petits, soit à partir de 10 semaines. Les animaux produits seront soumis au protocole de stress juvénile du jour post-natal 2 au jour post-natal 9 inclut puis seront utilisés au stade adulte, soit à partir de 9 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les souris adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie.
Impact de la craniectomie décompressive sur la neuroinflammation après un AVC ischémique malin.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une grande partie de la voûte crânienne retirée, la peau seule refermée sur le cerveau : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. 160 subissent cette craniectomie, 160 un accident vasculaire cérébral provoqué, 180 les deux combinés, 160 constituant le groupe témoin avec des incisions cutanées refermées. Le porteur indique que le déficit neurologique provoqué peut entraîner des difficultés à se mouvoir, à se nourrir et à s'hydrater, ainsi que des troubles de la vigilance pouvant conduire au décès. Il affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées, tout en écrivant que le bénéfice de la craniectomie décompressive est déjà démontré chez les patients.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologique fréquente et grave dont un des traitements standards est l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA, par son action lytique sur le caillot fibrino plaquettaire, restaure le flux d’une artère occluse et améliore le pronostic neurologique du patient lorsqu’il est mis en place précocement. Un AVC malin est un type particulier d’AVC qui présente un volume important et notamment plus de 50% du territoire de l’artère sylvienne. Il est associé à plus de 80% de mortalité. La craniectomie décompressive (CD), procédure courante en neurochirurgie, permet de limiter à 30% le taux de mortalité de ces AVC. Elle consiste à retirer une grande partie de la voûte crânienne et à ne fermer que la peau sur le cerveau. Cela permet de limiter la compression du cerveau, de diminuer la pression intracrânienne et d'améliorer la perfusion cérébrale. Son bénéfice a été clairement démontré en clinique. Elle limite le risque de lésions cérébrales secondaires et diminue donc le risque de handicap séquellaire lourd. Cependant, même si la craniectomie décompressive présente un bénéfice à court terme en contrôlant l'augmentation de la pression intracranienne, il est probable que le fait de laisser le patient sans voûte crânienne puisse modifier la physiologie cérébrale, ainsi que les phénomènes secondaires à l’œuvre après une lésion cérébrale. Il est décrit dans la littérature que la voute cranienne est composé de niches de leucocytes. Dès lors, enlever la voûte cranienne pourrais influencer la neuroinflammation qui est un phénomène central lors d'un AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle (AVC et processus inflammatoires). Nous souhaitons évaluer l’évolution de la neuro inflammation lors de la réalisation d’une craniectomie et notamment mettre en évidence une modification de l’infiltrat leucocytaire. Cela permettra d’améliorer nos connaissances sur les craniectomies décompressives, et donc potentiellement d’en affiner les indications et les caractéristiques techniques. Ainsi, nous espérons améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
L’ensemble des animaux de la procédure seront soumis à une craniectomie décompressive (n = 160 ; 15 minutes), un modèle d’AVC (n = 160 ; 75 minutes), ou la combinaison des 2 techniques (n = 180 ; 90 minutes). Le groupe « sham » subira des incisions cutanées, ensuite refermées (n = 160 ; 5 minutes). 24 heures et 5 jours après, chaque animal fera l'objet d’un examen par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n = 660 , 45 minutes), ainsi qu’une évaluation comportementale (n = 660, 2 minutes). Un génotypage par biopsie sur la queue sera effectué à 1 semaine de vie pour les souris transgéniques (n=560).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress. La procédure d’AVC provoque un déficit neurologique qui peut entrainer une situation anxiogène importante associée à de difficultés pour se mouvoir, se nourrir et s‘hydrater. L’augementation de la pression dans la tête peut être à l’origine de troubles de la vigilance et peut conduire au décès. En plus, on peut noter des dysrégulations thermiques et des troubles hydroélectrolytiques dans le contexte de souffrance cérébrale. La biopsie de la queue lors du génotypage peut entrainer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du système nerveux central (SNC).
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Au vu de l’implication à la fois locale et systémique de l’inflammation, il est nécessaire de réaliser les procédures in vivo. De plus, nous souhaitons évaluer l’inflammation dans la moelle osseuse, les méninges et le parenchyme ce qui implique d’avoir un ensemble de tissus (méninges, parenchymes…) non modélisables actuellement.
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Dans chaque phase du projet, le minimum d’animaux a été prévu afin d’arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet et des données de la littérature sur la neuroinflammation. Les procédures décrites ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas d'animaux. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’imagerie par résonnance magnétique sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s’alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l’oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage maximum, coton, paillettes, petite maison. Pendant les 48h critiques au modèle, les animaux seront également évalués et pesés 3 fois par jour pour surveiller les points limites. Une mise à mort sera réalisée si les points limites sont atteints et non reversés. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau cervical et/ou crânien. Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront d’une couverture analgésique. Au vu des difficultés d’alimentation attendues, nous leur disposeront des croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage et mettrons également du « diet gel ».
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Ceci se justifie par le fait que l’AVC touche principalement les adultes. De plus, les études antérieures concernent également des modèles murins adultes. Dans ce sens, afin de faciliter le comparatif, nos souris le seront également.
Effet de la manipulation pharmacologique et génétique d’un récepteur à la sérotonine dans des modèles murins d’autisme
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester un fragment d'anticorps ciblant un récepteur de la sérotonine dans deux lignées de souris présentées comme des modèles d'autisme, 824 souris vont être utilisées, 168 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 656 d'un niveau modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant douze jours et passent des tests portant sur la sociabilité, les stéréotypies, l'anxiété, la locomotion et l'olfaction, jusqu'à quarante-cinq minutes par jour pendant trois à quatre semaines. Le porteur signale que l'isolement, la mise à jeun et les contentions stressent les animaux, et que les attaques entre mâles dominants et jeunes mâles iront jusqu'à la morsure. Il espère identifier une molécule réduisant d'au moins 70 % les déficits sociaux, attente chiffrée renvoyée à l'avenir, quand les injections quotidiennes, les biopsies d'oreille et la mise à mort des 824 souris sont, elles, programmées.
Objectifs
Des dysfonctionnements sont rencontrés dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques comme les troubles du spectre autistique, la schizophrénie, la dépression ou les addictions, et leurs prises en charge représentent un coût élevé pour la société. L’identification de nouvelle piste thérapeutique constitue donc un enjeu majeur. Le récepteur de la sérotonine 5-HT7 est devenu une cible prometteuse pour le traitement de ces troubles comportementaux. L’administration de composés se fixant dans ce récepteur permet une meilleure réponse aux antidépresseurs. Ainsi, un de ces ligands chimiques est actuellement en phase d’essai clinique pour le traitement des troubles bipolaires et la dépression majeure. D’autres petites molécules chimiques ciblant également ce récepteur auraient des effets sur la sociabilité et les comportements stéréotypés dans des modèles de souris autistes. Au cours de ces dernières années, une alternative aux composés chimiques a vu le jour et repose sur le développement de fragments d'anticorps. Nous avons déjà identifié un fragment d’anticorps qui cible spécifiquement ce récepteur. Dans ce projet, nous souhaitons explorer l’effet de cet anticorps sur les comportements chez la souris sauvage et dans deux modèles murins d’autisme et évaluer l’effet de la délétion du récepteur sur le comportement social et maternel, ainsi que d’identifier les dérégulations au niveau moléculaire dans le cerveau. Le nombre total d’animaux dans ces expériences sera de 824 souris.
Bénéfices attendus
Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 70% les déficits sociaux et capable de restaurer les déficits sensoriels et cognitifs. Nous espérons faire progresser l'état des connaissances quant au rôle du récepteur sur la sociabilité. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques de ce récepteur, mais également contribuer à la découverte et au développement de potentiels traitements innovants pour les comportements chez les animaux d’élevage et chez l’homme.
Procédures
Des administrations par voie intrapéritonéale (1 min/jour) seront réalisées tous les jours pendant 12 jours. Les animaux recevront une dose d'anesthésiques (1 min/injection intrapéritonéale) avant leur mise à mort. Tous les animaux effectueront des tests de comportement, soit 10 min une fois, soit de façon répétée tous les jours ouvrés pendant 3-4 semaines (de 5 à maximum 45 min/jour/animal)pour mesurer leurs comportements sociaux, leurs stéréotypies, leur anxiété, leur locomotion et leur olfaction. Une biopsie de l’extrémité de l’oreille sera prélevée à 3-4 semaines pour le génotypage de tous les animaux.
Impact sur les animaux
Les injections quotidiennes en intrapéritonéales peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. L'administration peut induire des effets secondaires liés au composé, comme la sédation. Les différentes contentions ainsi que les tests comportementaux, l’isolement des animaux et la mise à jeun peuvent entrainer du stress pour l’animal. De plus, les attaques entre mâles dominants et jeunes mâles engendreront de l’agressivité pouvant aller jusqu’à la morsure. Le prélèvement de l’extrémité de l’oreille pour le génotypage entraîne une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issu des procédures, soit par une injection d’anesthésique, soit par dislocation cervicale et mise à mort.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées avant des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’action de ce récepteur. Cependant, l’évaluation de l’effet comportemental des ligands de ce récepteur de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans les processus de sociabilité. L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement de médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet d’une molécule résulte de son action au niveau de l’ensemble de l’organisme. A ce jour aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de prédire et rendre compte de l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’action d’un médicament et en particulier ceux qui conditionnent le comportement.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides, tout en prenant en compte les contraintes expérimentales ainsi que la variabilité comportementale exprimée par chaque animal. Nous utiliserons des tests de comparaison entre chaque groupé traité avec un ligand donné ou de différents génotypes.
Raffinement
Le milieu est enrichi avec entre autres, avec une cabane en carton et des frisotis en papier kraft pour optimiser le maintien de leur chaleur corporel et de leur bien-être. Pour les tests de comportement maternel, les mères auront en plus deux carrés de ouate afin de pouvoir faire leur nid avec cette matière. Les procédures expérimentales, majoritairement des tests de comportements seront réalisées dans des pièces dédiées auxquels les animaux seront habitués au préalable et sont les plus brèves possibles et réalisées dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. Les animaux seront suivis et manipulé tout au long des procédures afin de les habituer au contact des expérimentateurs et pour vérifier leur état de santé. Tout changement sera suivi d'une surveillance renforcée et en cas de dépassement du point limite, nous procédons à la mise à mort compassionnelle de l'animal.
Choix des espèces
Bien que les troubles du comportement social, ou des seuils de douleur ne menacent pas la durée de vie, ils entravent la qualité de vie pour l’homme. Les souris sont des petits animaux sociaux qui se reproduise bien et vite et dont les comportements sociaux et les seuils de douleur sont mesurables. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les effets de composés sur le comportement social, la douleur et les comportementaux affectifs. A l’heure actuelle, seule des petites quantités de fragments d’anticorps sont produits dans notre laboratoire, compatibles uniquement avec une utilisation in vivo chez la souris. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 à 12 semaines) afin que le cerveau soit mature. Cet écart d'âge se justifie pour pouvoir constituer nos groupes d’animaux) et réduire le nombre de portées nécessaires. Nous veillerons à ce que l'âge moyen des animaux par groupe soit homogène. Afin d’étudier le comportement maternel des mères, les mères et leurs petits (Jour 0-3 après la naissance) seront utilisés, et les mêmes petits seront également testés à Jour 10-13 afin d’identifier un éventuel phénotype social précoce.
Production d’immunsérum et prélèvements sanguins chez le lapin, les ovins et caprins et les cobayes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
Lapins : 1500
Chèvres : 30
Moutons : 30
Immunisés cinq à plus de seize fois par an, puis saignés jusqu'à vingt et une fois par an pour produire du sérum, 1 500 lapins, 1 000 cobayes, 30 chèvres et 30 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués une fois le titre d'anticorps et le volume de sérum jugés suffisants, après un dernier prélèvement plus important. Les anticorps polyclonaux obtenus alimentent des tests de diagnostic vendus dans le monde entier, le porteur mentionnant jusqu'à un test utilisé par seconde et un nombre d'animaux fixé par le "Donneur d'ordre". Il indique que la réaction inflammatoire au point d'injection disparaît en quelques jours et qu'aucune conséquence néfaste n'est observée ensuite, description difficile à tenir pour des animaux immunisés et ponctionnés pendant deux ans avant d'être tués.
Objectifs
L’objectif de ce projet est l'immunisation des animaux afin d’obtenir des anticorps polyclonaux. Après immunisation et prélèvement du sang, le sérum obtenu contient les anticorps polyclonaux spécifiques de l’antigène utilisé. Après purification, les anticorps servent à produire différents tests par exemple : hémostase, thrombose, infections inflammatoires, détermination des groupes sanguins (utilisés pour les transfusions et les transplantations…). Ces tests de laboratoire permettent de doser les facteurs concernés dont le déficit est responsable des troubles cliniques dans le suivi des patients en thérapie ou en postopératoire. Les tests peuvent aussi permettre de confirmer des résultats sérologiques faibles ou peu clairs avant une transfusion ou une transplantation… Les tests immunologiques produits à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés à partir des sérums des animaux hyperimmunisés sont marqués CE, ou enregistrés IVDR pour l’Europe, ou FDA (510(k)) pour les USA, ainsi que dans les systèmes règlementaires de la majorité des pays, afin de pouvoir les utiliser dans les hôpitaux pour le diagnostic et le suivi des pathologies. Le projet est principalement à visée humaine.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la production d’anticorps polyclonaux, sont la mise à disposition des laboratoires hospitaliers et cliniques de tests diagnostiques performants et précis, utilisant directement ou indirectement la technologie immunologique. L’utilisation du processus d’immunisation sur animaux permet d’obtenir des anticorps polyclonaux, d’isotype IgG, reconnaissant l’ensemble de la structure de la protéine (utilisée comme antigène), avec une grande affinité, c’est-à-dire une réaction spécifique et très forte avec cette protéine. Cela permet de l’identifier, de la quantifier ou de l’extraire dans un milieu très complexe, comme le sang, tout liquide biologique (ascites, liquide céphalo-rachidien, urines, etc…), ou un lysat cellulaire. Deux applications importantes sont mises en œuvre dans le projet : a) test l’utilisation des anticorps pour la production de tests de diagnostic médical, permettant de quantifier précisément une protéine ou un anticorps dans un liquide provenant du corps humain, à des fins de diagnostic, de pronostic, ou de suivi de traitement thérapeutique. b) Extraction spécifique d’une protéine d’un milieu complexe, comme le plasma humain, afin de produire un plasma déficient en cette protéine. Ce plasma est ensuite utilisé dans des trousses de diagnostic, pour doser l’activité de la protéine concernée, apportée par le plasma à tester. Le bénéfice est très important car une faible quantité de sérum permet de fournir une très grande quantité de tests, ils sont utilisés au niveau mondial à très grande échelle (jusqu’à un test utilisé par seconde dans le monde).
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées sur une durée de 2 ans maximum : Prélèvements sur animaux vigiles : 1 prélèvement de sang sain. Immunisations sur animaux vigiles : 5 à plus 16 par an. Prélèvements sur animaux vigiles : 1 à plus 21 prélèvements sanguins par an pour la production sérum. Lorsque le titre des anticorps et le volume de sérum seront jugés suffisants, le protocole d’immunisation sera arrêté et les animaux euthanasiés après prélèvement d’un volume sanguin plus important.
Impact sur les animaux
L’expérience acquise avec ces protocoles permet de dire que la principale nuisance sur les animaux concerne la réponse au processus d’immunisation, qui peut induire une réaction inflammatoire au point d’injection. Cette réaction inflammatoire disparait généralement en quelques jours, et aucune conséquence néfaste n’est observée ensuite. Les autres nuisances possibles concernent la contention et l’introduction de l’aiguille sous la peau des animaux pendant le prélèvement, pouvant provoquer de l’inconfort, une sensibilité légère limitée à la durée du prélèvement. L'anesthesie a répétition chez le cobaye. Cette étape n’a pas d’autre conséquence particulière sur les animaux.
Devenir
Tout animal ayant étaient immunisés sera mis à mort car l'immunisation ne permet pas de les utiliser dans d'autre procédures.
Remplacement
A chaque fois que cela est possible, des anticorps monoclonaux produits par culture cellulaire, ou des anticorps recombinants, sont utilisés, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés pour la production d’anticorps polyclonaux. Toutefois, les anticorps polyclonaux présentent des caractéristiques uniques par leur grande affinité vis-à-vis de la protéine utilisée pour leur immunisation, et par la reconnaissance globale des structures de cette protéine. A l’inverse, les anticorps monoclonaux ou recombinants, ne reconnaissent qu’une seule structure de la protéine, et si cette structure est affectée par une mutation génétique, la reconnaissance et perdue, et le variant n’est pas détecté. Les anticorps obtenus par immunisation des animaux permettent ainsi d’obtenir des caractéristiques uniques pour les besoins du laboratoire et la mise à disposition d’outils de diagnostic performants. Le client s'engage à faire la production in vitro lorsque cela est possible et respecte les normes réglementaires de diagnostic.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu résulte de 2 contraintes : a) Utiliser un nombre suffisant d’animaux pour réduire la variabilité inter-animaux de la réponse immunitaire. b) Utiliser le nombre requis pour obtenir la quantité de sérum suffisante pour la quantité d’immunoglobulines IgG purifiées nécessaires pour répondre aux besoins. Le nombre d'animaux utilisés correspond au minimum en fonction des volumes souhaités, définis par le Donneur d'ordre. La ré-immunisation des animaux au long terme permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. En moyenne, nous pouvons produire 26 litres de sérum par an avec 6 moutons ou 6 caprins, 130 litres de sérum par an avec 300 lapins et 13 litres de sérum par an avec 200 cobayes.
Raffinement
Les animaux sont tous contrôlés de façon journalière, ils ont à disposition des enrichissements adaptés et variés avec des roulements périodiques si possible (Lapin: bloc de cellulose à ronger, bout de bois.../Ovins, caprins:balai, un gros ballon, sapin perchoir(tronc d'arbre).../Cobayes: petite balle, bloc de cellulose...).- Pour les lapins, les cages disposent de mezzanines et de petits trous sur les parois leurs permettant de voir et de sentir les lapins dans les cages voisines . Les prélèvements se font dans une pièce séparée des hébergements. Après chaque prélèvement les lapins sont placés dans une piscine remplie de copeaux et de balles en plastique le temps du prélèvement d’un autre lapin.- Les ovins et caprins,sont dans une bergerie qui leurs est dédiée avec accès sur 2 hectares de prairie. Ils sont hébergés dans un box recouvert de paille. L'alimentation est composée de foin, pierre à sel, graines d'orge et d'avoine. Les prélèvements se font dans une partie dédiée, séparée de l'enclos. -Les cobayes sont hébergés dans une unité indépendante dans des cages par groupes sociaux harmonieux (2ou 3) avec mise à disposition d'une maison . Après chaque prélèvement ou immunisation ils reçoivent une récompense .Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être provoqué lors des procédures avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Des isolements de quelques minutes seront appliqués le temps des immunisations. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor. Un tableau d’évaluation des points limites est mis à disposition pour suivre l’évolution d’un animal qui présente des signes cliniques. (voir arbre décisionnel et critères d'arrêt des souffrances en pièces jointes). Les administrations ou les prélèvements s’arrêteront si un animal atteint un score de 3 sur la grille d’évaluation. Le dernier prélèvement est réalisé sous anesthésie générale , (excepté s' il y a contre-indication scientifique). Dans ce cas, l’animal ne se réveille pas, il est mis à mort dans la foulée du prélèvement .
Choix des espèces
Les lapins, les ovins, caprins et cobayes font partis des espèces les mieux documentées et les plus appropriées pour la production d’anticorps polyclonaux selon les recherches des donneurs d’ordres L'un des facteurs qui influence la production d'anticorps est la nature de l'immunogène utilisé (spécifique à chaque espèce). Le lapin est facile à manipuler et à prélever, il produit des volumes suffisants d'antisérum à titre élevé et à forte affinité. Les ovins et caprins ont une longue durée de vie, sont facile à manipuler et le prélèvement sanguin est facile à réaliser (veine jugulaire). La grande taille des animaux apporte un volume important d'immunsérum et réduit par la même occasion le nombre d'animaux. Les lapins ont au minimum deux mois et demi à la première immunisation et 5 mois aux premiers prélèvements. Les ovins et caprins ont au minimum trois mois à la première immunisation et 5 mois et demi aux premiers prélèvements. Les cobayes ont au minimum trois mois à la première immunisation et de 4 mois et demi aux premiers prélèvements. Cet âge à l’avantage de permettre une bonne acceptation des administrations par les animaux avec le développement d’une réaction immunitaire correcte et de permettre prélever une quantité intéressante de sang.
Efficacité d’une approche thérapeutique par combinaison d’anticorps dans un modèle de souris syngénique de carcinome épidermoïde de la tête et du cou
- Recherche appliquée
- Cancers
212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une injection de cellules cancéreuses de la tête et du cou, puis pour certaines un anticorps trois fois par semaine pendant six semaines sur animal vigile, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau. Le porteur écrit que le traitement administré a le potentiel d'améliorer le bien-être des animaux non-humains en réduisant la charge tumorale, tumeurs qu'il a lui-même greffées. Sur le remplacement, il indique que des études sur lignées cellulaires précèdent les expériences, mais qu'une validation sur "animal entier" reste requise pour reproduire la complexité du système immunitaire.
Objectifs
Les cancers de la tête et du cou sont la 8ème causes de mortalité attribuable au cancer dans le monde. De nouveaux types de traitements faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour les cancers de la tête et du cou. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches aux cancers de la tête et du cou afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.
Bénéfices attendus
Les cancers de la tête et du cou sont un grave problème de santé public. Dans les cas les plus avancés, ils répondent très mal au traitements traditionnels et l’immunothérapie n’est efficace que chez un groupe restreint de patients. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et potentiellement la survie de très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres maladies.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine pendant 6 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Les animaux anesthésiés subiront un prélèvement de sang unique, d'une durée de 1 minutes.
Impact sur les animaux
Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection, ou de l’inflammation. La contention des animaux peut engendrer un stress. Par ailleurs, le traitement administré a le potentiel d’améliorer le bien-être des animaux en réduisant la charge tumorale.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation sur animal entier permettant de reproduire la complexité du système immunitaire avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement
Oestradiol et déconditionnement musculaire chez la souris KI-Dnm2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Porteuses d'une mutation du gène de la dynamine qui reproduit une myopathie humaine, 300 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié dans des procédures d'un niveau sévère. Les femelles subissent une ovariectomie, l'implantation sous la peau de pastilles d'œstradiol, des prises de sang et une mesure invasive de force musculaire, les mâles recevant deux implantations à quinze jours d'intervalle. Le porteur affirme que cette myopathie n'est associée ni à une souffrance de l'animal ni à une altération de sa mobilité, alors que 150 souris sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées au terme de chaque procédure pour prélever leurs tissus et leur sang.
Objectifs
La myopathie centronucléaire autosomale dominante (MCN-AD) est principalement due à la mutation du gène dynamine. Le modèle murin de cette pathologie exprime à l’état hétérozygote la mutation la plus fréquemment retrouvée chez l’homme. Elle présente un retard de croissance musculaire et une perte de force musculaire entre 4 et 8 semaines d’âge. De façon intéressante, nos données préliminaires suggèrent l'existence d'une différence d'évolution de la maladie entre les mâles et les femelles. Par ailleurs, des éléments bibliographiques indiquent que les œstrogène, hormones feminines, s exercent un effet bénéfique sur la synthèse de protéines du muscle et procurent une résistance à la fatigue musculaire. Dans ce contexte, notre hypothèse générale est que les œstrogènes confèrent un effet protecteur aux souris femelles face au développement de la myopathie. L'objectif de ce projet consistera donc à vérifier si les œstrogènes procurent un effet protecteur dans l'évolution de la myopathie centronucléaire et comment transposer cet avantage aux souris males.
Bénéfices attendus
En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes lors de la mise en place des symptomes de la myopathie centronucléaire ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de ce déconditionnement, et de proposer des stratégies d'intervention basées sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux oestrogènes.
Procédures
Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes: ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles (diamètre 3,5 mm, épaisseur 2 mm) contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (45 min), prélèvements tissulaires (15 min). Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: 2 implantations à 15 jours d'intervalle sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min x 2 ), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (45 min), prélèvements tissulaires (15 min).
Impact sur les animaux
La procédure d'ovariectomie et d'implantation sous cutanée de la pastille sont susceptibles d’engendrer des douleurs post-chirurgicales chez les souris. La mesure de force musculaire de part son invasivité peut générer des douleurs imperceptibles chez l'animal du fait de la profondeur de l'anesthésie. Nuissances en lien avec les prélèvement sanguins : les prélèvements au bout de la queue seront réalisée sous anesthésie générale gazeuse. A l'issue de cette prise de sang, les souris seront injectées avec un mélange kétamine et xylazine en vue de la réalisation d'une procédure de prélèvements tissulaires sans réveil Aucune nuisance n'est donc attendue compte tenu de l'état de l'animal au moment du prélèvement et du volume prélevé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon réglementaire et éthique au terme de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires et sanguins.
Remplacement
L’atteinte de la masse et de la fonction musculaire associé à la myopathie centronucléaire autosomale dominante est un processus multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal, à savoir la force musculaire, à l'aide d'un outil statistique prenant en compte les données de la littérature pour anticiper sur la variabilité des résultats dans notre projet. Pris en semble, ces prévisions indiquent que 14 animaux par groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats.
Raffinement
L'hébergement des animaux leur permet d'avoir accès à un enrichissement (dômes et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés par 2 à 4 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) à partir de l'âge de 3 semaines. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6 heures après la réalisation des procédures, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
La totalité des données dans le domaine du déconditionnement musculaire associé à la MCN-AD et l'ensemble des techniques utilisées ont été développés chez la souris. Nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des déjà publiées ou acquises au laboratoire. La myopathie centronucléaire autosomale dominante (MCN-AD) est une myopathie modérée qui n'est pas associé à une souffrance de l'animal, ni à une altération de leur mobilité ou de leur comportement. Leur durée de vie, leur fertilité et leur vieillissement sont dans la norme des souris sauvages. Le phéntoype de la souris reste modérée tout au long de sa vie etdans les conditions d'hébergement que nous lui proposons. Il n'y a pas de détérioration majeur de son état physiologique au delà de la mise en place du phéntoytpe au cours de la croissance post-natale. Aucune donnée de la littérature ne suggère une agravation de son phénotype quelques soient les conditions d'hébergement ou expérimentales. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 4 semaines. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 8 semaines. En effet les symptômes apparaissant entre l'âge de 4 et 8 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficacité de thérapie basée sur l’utilisation de substances hormonales.
Identification de molécules pour traiter un stress chronique imprévisible (CUS) chez la souris et évaluation du comportement 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
La finalité annoncée est d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, la validation in vivo de leur molécule comme antidépresseur. 1 500 souris vont être utilisées, 1 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour mesurer la motilité intestinale et des marqueurs cérébraux. Chacune subit un stress différent par jour pendant huit semaines, contention, stress olfactif, stress social, stress environnemental, perturbation du rythme circadien, puis huit jours de tests comportementaux dont un test de préférence au sucrose imposant cinq jours d'isolement et un autre, non nommé, plaçant l'animal dans une position inconfortable. Le porteur qualifie chaque stress de léger pris isolément, et l'accumulation de l'ensemble de classe sévère.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs -EU 1/2 et EU 2/2/). Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte 15% de la population. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables. De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression sont associés une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu’un déséquilibre de la flore intestinale. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.
Procédures
Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le second groupe (G2) subira ces stress pendant 8 semaines. Le troisième groupe (G3) subira le protocole de stress pendant 8 semaines et recevra un traitement antidépresseur connu. Ce groupe permet de comparer les effets des molécules à tester contre la dépression avec l’antidépresseur connu. Enfin, les souris du quatrième groupe (G4) subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple). Cette étape d'induction d'un stress chez l'animal s'effectuera dans l'EU ½. Après 8 semaines, une évaluation comportementale des souris sera effectuée dans l’EU 2/2. Le niveau d’anxiété des animaux, leur activité exploratoire, ainsi que leur état “dépressif” sera évalué au moyen de tests de comportement sur une période de 8 jours.
Impact sur les animaux
Les souris des groupes stressés ou CUS seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Ces animaux vont subir certaines contraintes d'une courte durée (une fois par jour, le matin). L’intensité de la nuisance de ces stress cumulés est modérée. De plus, le groupe stressé recevant le traitement avec l’antidépresseur de référence recevra une injection quotidienne tout le temps du protocole de stress (8 semaines). L’intensité de la nuisance de ces injections répétées est modérée. Le dernier groupe recevra par voie orale le traitement à tester pendant la durée du protocole. L’intensité de la nuisance de ces gavages sur 8 semaines est faible. Les animaux vont également subir des contraintes de courte durée pendant les tests comportementaux, et notamment lors d’un test de comportement au cours duquel les animaux seront placés dans une position inconfortable pendant quelques minutes. L’intensité de la nuisance de ce test est modérée. Lors du test de préférence au sucrose, les souris vont être placées en cage individuelle pendant 5 jours afin de mesurer leur consommation hydrique. L’intensité de la nuisance due à l’isolation des animaux pendant 5 jours consécutifs est modérée.
Devenir
Les souris seront ensuite mises à mort afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.
Remplacement
Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.
Réduction
Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. Deux des tests comportementaux peuvent être chacun considéré comme modérée, du fait de l’inconfort et de l’isolement nécessaire à leur exécution. Le temps de repos entre chaque test comportemental bien qu'important et suffisant pour permettre un retour à la normale de l’état des animaux, l'accumulation de l'ensemble de ces stress nous semble de classe sévère. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.
Choix des espèces
La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).
Caractérisation d’une maladie inflammatoire de la peau déclenchée par la déficience d’un inhibiteur de protéase à sérine chez les la souris.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
Des souriceaux de sept jours sont séparés de leur mère et de son lait pendant six heures, maintenus à 37 °C. 2 256 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et l'autre un niveau modéré, toutes tuées pour le prélèvement des tissus. Les animaux déficients naissent avec des moustaches désorganisées et une peau qui desquame, l'atteinte culminant vers le septième jour, et subissent quatre à cinq injections dans l'abdomen, une biopsie de la queue au sevrage et un prélèvement de sang. Le porteur reconnaît qu'un calcul statistique du nombre d'animaux est difficile, et fonde l'effectif de 2 256 sur la littérature.
Objectifs
Les maladies inflammatoires de la peau sont très répandues dans les pays développés et les stratégies de traitement efficaces font défaut en raison du manque de compréhension des mécanismes pathogènes sous-jacents. Parmi ces maladies, les plus courantes, telles que la dermatite atopique, le psoriasis et la rosacée, ont une étiologie complexe. Il existe également des maladies monogéniques rares qui peuvent donner un aperçu des maladies inflammatoires cutanées courantes. L’une de ces maladies est le syndrome de Netherton, causé par des mutations dans un gène d'intérêt montrant que sa dérégulation peut être impliquée dans des maladies inflammatoires cutanée courantes. Il a été montré qu'une déficience génétique d’un inhibiteur de protéases déclenche une inflammation cutanée moins sévère et à résolution spontanée chez la souris. L'objectif de ce projet est de caractériser cette inflammation cutanée spontané ainsi que le rôle de cet inhibiteur dans cette inflammation.
Bénéfices attendus
A court terme les résultats de cette étude permettront de caractériser le phénotype inflammatoire déclenché par la déficience en un inhibiteur de protéase chez les souris. A long terme, le nouvel aperçu physiopathologique fourni par les résultats de ce projet sera utile pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de certaines pathologies inflammatoires.
Procédures
Injection en intra péritonèale sur souris vigiles : 4 à 5 injections en fonction de la procèdure, durée du geste : 30 secondes. Application de crème antibiotiques sur la peau sur souris vigiles : 3 applications, durée du geste : 30secondes. Prélèvement de sang sur souris anesthésiées : 1 prélèvement durée : environ 2 minutes. Incubation 6 heures à 37°C (température corporelle de la mère).
Impact sur les animaux
Des observations préliminaires montrent un schéma caractéristique de retard de croissance de la fourrure et de desquamation de la peau qui culmine environ 7 jours après la naissance et s'améliore progressivement avec l'âge. À la naissance, les souris déficientes peuvent présenter des moustaches désorganisées ainsi des défauts de la barrière cutanée qui déclenchent une inflammation cutanée. Tous les animaux subiront un prélèvement de biopsie de queue lors du sevrage (procédure 1) pouvant occasionner de la douleur. Les animaux soumis à une anesthésie gazeuse lors de la procédure 2 subiront un stress inhérent à cet acte. L'absence de la mère ainsi que du lait maternel pendant 6h lors de la procédure 3 induira un stress au petit souriceaux âgés de 7 jours. Les souriceaux soumis au procédures 4 et 6 pourront également être soumis à des douleurs lors des injections en intra péritonéal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement et analyse des tissus
Remplacement
L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet car nous évaluons l'impact de la perturbation des voies de signalisation dans des types cellulaires distincts dans un contexte où les autres types cellulaires de l'organisme restent inchangés. Ces études ne peuvent donc pas être réalisées in vitro (Evaluations phenotypiques, analyse de l’intégrité de la barrière épithéliale, analyse de sang).
Réduction
De nombreux paramétres de natures variées sont à prendre en compte dans cette étude (obention des bons génotypes, numeration sanguine, dosage sur plasma, imuno histo chimie) ce qui rend difficile tout calculs statistiques concernant le nombres minimum d animaux requis. Pour cela nous nous somme basés sur les études reportées dans la litérature utilisant les mêmes approches expérimentales. En évaluant plusieurs paramètres chez les mêmes animaux, nous évitons les duplications.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance quotidienne par des animaliers. Des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie (à différents âges) afin de prévenir toute souffrance chez l’animal et les prélèvements de biopsie de queue seront réalisés au moment du sevrage via des petit fragment d’environ 1-2 millimètres afin d’occasionner le moins de douleur possible.
Choix des espèces
L'étude des pathologies humaines est souvent limitée par l'absence de modèle animal. Les souris sont de bons modèles car ce sont des mammifères suffisamment proches de l'espèce humaine. De plus elles se prêtent particulièrement à des manipulations génétiques. Par exemple : Les souris chimériques que nous avons créées, nous permettent d'aborder spécifiquement le rôle d'un inhibiteur de protéase à sérine dans le developpement post natal jusqu’à la souris adulte. Pour l’élevage les souris seront utilisées de la naissance jusqu’à l’âge adulte. Pour les modèles expérimentaux, la caractérisation de l’inflammation cutanée sera évaluée au cours du temps entre le 1er jour de vie jusqu’à 70 jours de vie post-natale. L’inflammation étant bien plus marqué en début de vie.
Caractérisation du rôle d’une voie de la réponse immunitaire (ALPK1) et de souches bactériennes commensales dans le traitement de colites induites dans des modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Vingt-sept jours seule en cage, vingt-sept gavages quotidiens, vingt-sept collectes de fèces, une coupure de la queue et un prélèvement de sang à la joue avant la mise à mort. 1 296 souris vont être utilisées ainsi dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement des organes. L'objectif est de tester l'effet de bactéries commensales et d'une voie immunitaire sur une colite, avec diarrhées et signes de douleurs intestinales pendant les phases inflammatoires aiguës. Le produit qui déclenche cette colite n'est jamais nommé, il apparaît sous la seule mention d'un traitement chimique et ne figure pas dans la liste des interventions.
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elles sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de la modulation de l’inflammation intestinale chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans la régulation de la réponse inflammatoire intestinale dans un modèle de colite induite chimiquement chez la souris.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) sont des maladies très invalidantes dont l’incidence est particulièrement importante dans les pays industrialisés. Les traitements utilisant des anti-inflammatoires ou des actes chirurgicaux sont peu efficaces et ont de nombreux effets secondaires importants. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients, la persistance de l’inflammation conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Les MICI sont donc une préoccupation majeure de santé publique. Il apparait alors aujourd’hui essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des MICI. De nombreux travaux étudiant les MICI témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une augmentation des réponses inflammatoires dans l’intestin. Dans ce contexte, des bactéries intestinales peuvent être directement responsables de cette inflammation ou, au contraire, peuvent être considérées comme anti-inflammatoires. Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans le développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI). Ce projet amènera une meilleure compréhension mécanistique de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire intestinale et permettra ainsi de proposer de nouvelles voies permettant le traitement et la prévention de ces maladies.
Procédures
Pendant la durée totale du protocole soit 27 jours, les souris seront isolées et recevront quotidiennement un gavage oro-gastrique (quelques secondes) soit 27 gavages. Un gavage supplémentaire, précédé d’une mise à jeun de 6 heures, sera réalisé en milieu de protocole, suivi d’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes) pour effectuer un prélèvement sanguin. Nous effectuerons 27 collectes de fèces lors de l’émission naturelle (collecte quotidienne). La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang à la joue sera réalisé une fois, sur animaux vigiles, en fin de procédure avant la mise à mort. Ce prélèvement dure 5 à 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress modéré de par leur placement en cage individuelle.. Les animaux seront également soumis à des gavages quotidiens engendrant un stress modéré du fait de la répétition malgré la courte durée du geste (moins de 10 secondes). Le traitement chimique pour l’installation de la colite engendre des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues entrainant des signes de douleurs intestinales. Les prélèvements fécaux quotidiens (émission naturelle de fèces par la souris) et pesées quotidiennes des animaux seront réalisés sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. La période de mise à jeun précédent le test de perméabilité intestinale engendre un stress . La coupure au niveau de la queue nécessaire aux prélèvements de sang lors du test de perméabilité intestinale induit une douleur légère de très courte durée (quelques secondes). Une déshydratation chez certains animaux peut être observée.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, et la réponse immunitaire. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal, la composition en lien avec les données biologiques obtenues à partir du sang et des tissus intestinaux de l’hôte.
Réduction
L’effet des bactéries de ce projet ont été testées préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro pour sélectionner les plus intéressantes d’entre elles, et réduire ainsi le nombre de bactéries à tester in vivo et le nombre d’animaux utilisés. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparent et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés tout d’abord deux fois par semaine pendant 10 jours, puis quotidiennement (surveillance visuelle, mesure de la perte de poids) tout au long de l'expérience. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.
Choix des espèces
Les animaux auront au minimum 6 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies inflammatoires, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et immunologiques et des outils d’analyse des paramètres biologiques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal dans lequel il est possible de bloquer les mécanismes auxquels nous nous intéressons pour pouvoir les étudier.
Rôle du nerf vague dans la pathogenèse de la stéatose hépatique non-alcoolique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Le nerf vague est sectionné au niveau du cou, d'un seul côté, sur des souris ensuite nourries d'un régime riche en lipides pendant quatre à vingt-quatre semaines. 4 608 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les prélèvements de tissus. Chacune subit un gavage de glucose ou une injection d'insuline ou de toxine diphtérique, cinq prélèvements de sang successifs sur deux heures, une contention en tube et un séjour seule en cage de calorimétrie, une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort. Le porteur écrit que les souris récupèrent rapidement et complètement après la section du nerf, sans signe significatif de douleur ni de détresse, et que le régime gras ne devrait causer aucune douleur perceptible.
Objectifs
La stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) est une maladie du foie caractérisée par une accumulation excessive de graisse dans les cellules hépatiques, accompagnée d'une inflammation et d'une lésion hépatique. Actuellement, il n'existe pas de traitement pharmacologique efficace et validé pour cette maladie. Cependant, des recherches antérieures ont mis en évidence le rôle clé de l'inflammation dans le développement de la NASH. Précédemment, nous avons montré que l’inflammation pathogène était un acteur important dans le développement de la NASH. Une découverte intéressante a montré une relation entre l'innervation vagale et le métabolisme hépatique. Le nerf vague, qui est une composante du système nerveux autonome, semble jouer un rôle dans la régulation du métabolisme du foie. Des études ont montré que la stimulation du nerf vague pouvait avoir des effets positifs sur la fonction hépatique. De plus, des recherches ont indiqué que la vagotomie cervicale unilatérale (section du nerf vague du côté gauche du cou) était associée à une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Cela suggère que la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, à partir de la moelle osseuse et de la rate. Cependant, les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux saisir ces interactions complexes, nous proposons une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront soumises à un régime riche en lipides pour induire une NASH. L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la NASH. Cette recherche pourrait fournir des informations cruciales pour mieux comprendre les liens entre le système nerveux autonome, l'inflammation et la pathogenèse de la NASH, ouvrant potentiellement de nouvelles voies pour le développement de traitements futurs.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). La NASH représente la forme la plus prévalente de maladie hépatique et est étroitement liée à la progression de l’obésité. A ce jour, les patients souffrant de NASH ne disposent pas de traitements approuvés, et le nombre de patients nécessitant une transplantation hépatique est en constante augmentation. Par conséquent, une compréhension plus approfondie des mécanismes sous-jacents ouvre la voie à de nouvelles approches et stratégies thérapeutiques anti-inflammatoires dont les patients atteints de NASH pourront bénéficier.
Procédures
Les souris seront soumises à des interventions chirurgicales consistant en une section du nerf vague au niveau cervical côté gauche (vagotomie) ou des chirurgies contrôles sans section du nerf vague (Sham). Chaque souris subira une seule opération, qui durera environ 10 minutes et sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Une période de récupération de 3 semaines suivra l’intervention. Ces procédures chirurgicales sont décrites en détail dans la littérature scientifique. Les observations indiquent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes significatifs de douleur ou de détresse. Par la suite, les souris seront soumises à des régimes alimentaires, soit une diète standard, soit une diète riche en lipides induisant la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). Ces régimes alimentaires ne sont pas associés à une détresse particulière. Nous examinerons l’impact de ce régime à 4 moments différents : une période courte de 4 semaines, une période intermédiaire de 8 semaines, une période de 16 semaines marquée par une inflammation avancée, et enfin, une période de 24 semaines caractérisée par une fibrose avancée. Des explorations dites métaboliques seront réalisées en fin de procédure impliquant un gavage des animaux avec du sucre (glucose) ou une injection d’insuline puis des prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures). La durée des actes techniques de prélèvements de sang est de 5 à 7 minutes par souris, et de gavage est de 2 à 5 minute par souris. En toute fin de procédure, les souris seront placées dans un tube pendant 2 minutes avec une certaine restriction de mouvement pour mesurer leur quantité de graisse. Elles seront ensuite placées seules dans des cages de dimension réglementaire permettant des mesures de leur métabolisme, leur activité et de leur consommation d’eau et de nourriture. Avant l’euthanasie, un prélèvement sous-mandibulaire de sang sera réalisé d’une durée d’environ 30 secondes puis l’animal sera euthanasié conformément aux directives éthiques. Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les éventuels effets indésirables chez les animaux sont principalement liés à la chirurgie (douleur physique passagère, hypothermie éventuelle durant l’anesthésie). Les observations montrent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes de douleur ou de détresse significative. Dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime gras (Western-type). Ce régime alimentaire ne devrait pas causer de douleur ou de détresse perceptible chez les souris, mais plutôt entraîner une prise de poids, qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude. Toutefois, en cas d’infection et non cicatrisation de la plaie, l’animal sera sorti de l’étude. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant 4 heures, le gavage de glucose, l’injection intra-péritonéale d’insuline ou de toxine diphtérique (une seule piqure abdominale) avec contention douce de l’animal et la microcoupure de la queue pour les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires et de courtes durées pour les animaux. De plus, l’isolement nécessaire de la souris de ses congénères en cage de mesure calorimétrie peut également provoquer un stress de l’animal.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la maladie dans un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.
Réduction
Nous aurons besoin de 12 souris par groupe. Nous visons à minimiser le nombre d’animaux nécessaires tout en maintenant la robustesse des résultats. Pour assurer la solidité statistique de nos résultats, il sera nécessaire de reproduire les expériences sur deux lots de souris. Le nombre total d’animaux prévu est de 4608 souris. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins (réduction jusqu’à 25 pourcents).
Raffinement
Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft, maisons en carton, tunnels en carton ou carrés de coton compacté). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. L’identification des animaux génétiquement modifié sera réalisée par le personnel qualifié et formé de l’animalerie. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal, conformément aux directives éthiques. En ce qui concerne les chirurgies, les animaux seront soumis à une anesthésie générale par injection intrapéritonéale. Une dose préventive d’antalgique sera administrée avant la chirurgie, puis renouvelée toutes les 8-12 heures pendant 48 heures. Un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant l’anesthésie. Lors de la chirurgie, réalisée sur un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal, une attention particulière sera portée sur sa fréquence respiratoire. Un rétablissement complet sans douleur ni détresse notable devra être observé après la chirurgie. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. Une perte de poids de 20 pourcents dans les jours suivant la chirurgie sera considérée comme point limite et entrainera l'euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) chez la souris. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la NASH. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude de la NASH et des effets de la vagotomie. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines à leur entrée dans la procédure expérimentale. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris entreront en procédure à 8 semaines et en ressortiront à 15, 19, 27 et 35 semaines. L’âge des animaux est suivi par rapport à leur date de naissance qui sera sur les étiquettes des cages ainsi que dans le logiciel de gestion des animaux.
Etude des différentes de voies de sensibilisation de l’allergie alimentaire au gluten dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
100 souris femelles Balb/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour le prélèvement des organes. Pendant cinq à huit semaines, chacune reçoit une sensibilisation hebdomadaire au gluten par injection abdominale, gavage, application sur la peau du ventre ou dépôt dans les narines, puis deux gavages de déclenchement à sept jours d'intervalle, cinq prélèvements de sang à la queue et des prises de température par voie rectale. Le porteur annonce une gêne œsophagienne, un inconfort abdominal, des douleurs à l'estomac et une baisse de la température corporelle. La question posée porte sur l'influence de la voie de sensibilisation dans l'allergie au blé, et le porteur qualifie le modèle in vivo d'"irremplaçable" pour y répondre.
Objectifs
Les allergies sont répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ainsi, l’allergie est considérée comme un enjeu majeur de santé publique. Coûteuses, les allergies altèrent également la qualité de vie des patients. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. L’allergie au blé est l’une des allergies alimentaires les plus fréquentes, due principalement à un ensemble de protéines, nommé gluten. Le gluten est composé des allergènes majeurs de la céréale. Les études publiées sur la mise en place et le déclenchement de l’allergie au gluten sont restreints. L'allergie se caractérise en deux phases : la phase de sensibilisation et la phase de déclenchement de symptômes. Le rôle des différentes voies de sensibilisation (orale, intra-nasale, percutanée ou intra-péritonéale) reste largement à explorer. L’objectif de ce projet est de caractériser l’influence de la voie de sensibilisation sur le développement de l’allergie alimentaire au gluten. Ainsi lors de cette étude, un examen approfondi des mécanismes immunologiques impliqués dans l’allergie au gluten sera mené. A terme, l'objectif de cette étude est d'améliorer la prise en charge des patients mais également de prévenir le risque de développer cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le rôle des différentes voies de sensibilisation possibles de l’allergie au gluten. De ce fait, pour chaque voie de sensibilisation (orale, intra-péritonéale, intra-nasale, percutanée), le mécanisme impliqué sera élucidé. A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie du développement de l’allergie au gluten permettant d’améliorer la prise en charge des sujets atteints. Aussi, des solutions préventives pourront être proposées. Dans le futur, le modèle développé permettra de tester de nouvelles méthodes ou de nouveaux traitements permettant la prise en charge de l'allergie au gluten.
Procédures
Les souris seront sensibilisées 1 fois par semaine pendant 5 à 8 semaines par soit : - une injection intraperitonéale ou - un gavage orale ou - une application cutanée sur l'abdomen ou - un dépôt d'une goutte sur chaques narines. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par deux gavages, 7 jours après la fin de la phase de sensibilisation et à 7 jours d'intervalle. Pour une injection intrapéritonéale ou un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’injection ou d’administration (soit environ 10 secondes). Pour l’application cutanée sur l’abdomen ou le dépôt sur les narines, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie (soit 15 à 20 minutes). Toutes les souris auront également un prévèlement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la semaine 3 à la semaine 8) soit 5 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce protocole, il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, les différents moyens de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances notamment en raison de la répétabilité des gestes (1 fois par semaine pendant 8 semaines). Les souris sensibilisées par voie percutanée pourront ressentir un inconfort abdominal suite à la réalisation d’une légère inflammation au niveau de la peau pour permettre le passage de l’allergène. Les sensibilisations réalisées par voie orale peuvent engendrer une gêne au niveau de l’œsophage. Les sensibilisations réalisées par voie intra-péritonéale peuvent également provoquer une gêne abdominale au niveau du point d’injection. La sensibilisation par voie intra-nasale peut provoquer une gêne au niveau pulmonaire pour la souris. La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire, peut également contribuer à des nuissances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs à l'estomac liées à l’administration de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les organes pour analyses de la réponses immunologiques et des marqueurs de l'allergies
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro (tels que la culture cellulaire) ou in silico (sur des organes entiers) ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, dans le cas de l’étude de l’influence des différentes voies de sensibilisation, le modèle in vivo reste irremplaçable pour établir le mécanisme et la symptomatie de la réponse allergique.
Réduction
Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes et des tests statistiques, le nombre de souris a été déterminé à 20 souris par groupe. Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hébergées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 3 à 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Pour limiter les nuisances sur les animaux et notamment la répétition des gestes de sensibilisation, des prélèvements de sang seront effectués à partir de la 3ème sensibilisation pour suivre le taux d’immunoglobulines E spécifiques au gluten (marqueur immunologique de la réaction allergique). En fonction du taux d’immunoglobuline, les sensibilisations seront arrêtées et les challenges effectués.
Choix des espèces
Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires (cellules spécifiques de l'allergie) seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et 4 semaines de vie au début des interventions. Cinq semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.
Elevage de souris génétiquement modifiées pour des études sur des maladies inflammatoires.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des couples sont formés, les nouveau-nés sexés et identifiés, puis l'extrémité de leur queue coupée aux ciseaux pour prélever l'ADN et vérifier la modification génétique. Le sevrage intervient à trois ou quatre semaines. 10 300 souris de dix-sept lignées génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, celles qui portent la modification recherchée partant vers d'autres projets, les autres tuées, les reproductrices tuées à quarante-et-une semaines ou après deux mois sans portée. Une lignée développe spontanément un lupus et une grosse rate invalidante à partir de douze mois, et le porteur avance ce chiffre de 10 300 sans en détailler le calcul.
Objectifs
L'objectif du projet est l'élevage d'animaux génétiquement modifiés au sein de notre animalerie avec identification et détermination de la présence des gènes modifiés (génotypage) par deux méthodes distinctes. Ces animaux seront inclus dans d'autres demandes d’autorisation d’utilisation. Ces projets auront pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares, les basophiles et les éosinophiles, dans l'amplification ou le contrôle des facteurs responsables de maladies inflammatoires chroniques, notamment autoimmunes (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même). Les traitements actuellement utilisés dans ces maladies chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Ces projets expérimentaux seront analysés pour autorisation par le comité d’éthique dont nous dépendons et le ministère.
Bénéfices attendus
Ce projet d’élevage permettra de réaliser des études dont les bénéfices attendus se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes des maladies inflammatoires étudiées et la biologie des éosinophiles et des basophiles. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension des mécanismes et la validation des basophiles et des éosinophiles comme cibles thérapeutiques dans les maladies inflammatoires autoimmunes permettront de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Le but final est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de ces maladies qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Ce projet consiste en l'élevage de 17 lignées de souris génétiquement modifiées. Pour cela des accouplements (une souris mâle et une ou deux souris femelles) seront réalisés. Les souris nées de ces accouplements seront sexées (identification des mâles et des femelles) et identifiées. Au moment d’être replacé dans la cage d’hébergement, l’extrémité de la queue (moins de 2 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi de s'assurer de la présence de la modification génétique d'intérêt. Cette manipulation très rapide ne dure pas plus de quelques secondes. Les jeunes seront sevrés (séparation d'avec leur mère) à l'âge de 3-4 semaines. Les animaux d’intérêt entreront alors dans des projets expérimentaux. L'une des lignées de souris développe spontanément la maladie étudiée (lupus).
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 2 mm) peut conduire à une légère perte de sang et une douleur très brève. Les souris d'une lignée développant une maladie d'intérêt (lupus) dans les projets du laboratoire peuvent développer une splénomégalie (grosse rate) invalidante (diminution de l'activité de la souris) à partir de 12 mois mais seront utilisées au maximum 10 semaines avant cet âge.
Devenir
Les animaux comportant les modifications génétiques d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus post-mortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le ministère avant d'être euthanasiées. Les animaux ne portant pas les modifications génétiques d’intérêt seront euthanasiés. Seront également euthanasiées les souris présentant des signes d’altération de leur état général ou, pour les souris reproductrices, lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois ou si elles sont âgées de 41 semaines (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche ou risquant une altération de leur état général).
Remplacement
De par la complexité des maladies étudiées et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nous ne pouvons réaliser nos analyses que sur des organismes entiers. Il n’existe aucune alternative à l’utilisation de modèles animaux développant eux-mêmes la maladie. Ces modèles animaux permettront de valider les nouvelles approches thérapeutiques identifiées afin de transférer nos découvertes aux patients. Aucune technologie actuelle ne permet de simuler une maladie inflammatoire chronique ni les interactions cellulaires intervenant au niveau de l’organisme.
Réduction
Nous adapterons les élevages au besoin des projets de recherche de l’équipe. Ces lignées de souris (nombre et taille des portées) sont bien connues des membres de l’équipe, ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Le nombre de couples en reproduction est adapté au plus près des besoins expérimentaux. A cette fin, on définit si les animaux sont porteur du gène d'intérêt avant le sevrage et les besoins (couples reproducteurs et procédures expérimentales) sont anticipés avant la naissance de la génération suivante en fonction des groupes d’animaux d’intérêts générés qui entreront dans des procédures expérimentales d'autres demandes d'autorisation.
Raffinement
Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les lignées du présent projet d’élevage. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Différentes actions seront éventuellement mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Au cours du prélèvement d'un petit bout de queue pour déterminer si le gène d'intérêt est présent chez la souris, afin d'empêcher le saignement, une légère compression avec une compresse stérile sera réalisée.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus domesticus (souris) est le modèle de mammifères disposant le plus de lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques des projets ayant trait aux maladies inflammatoires. Elle permet d'éliminer des compartiments cellulaires spécifiques et/ou d’éteindre ou d’induire l’expression de certains gènes spécifiquement. Les animaux utilisés dans ce projet d'élevage ne sont pas disponibles dans une autre espèce. Les animaux seront identifiés par tatouage et prélevés pour vérifier la présence des gènes d’intérêt à un âge compris entre 5 et 10 jours (dès que le sexe est connu). Les animaux élevés entreront dans des procédures de projets où ils seront utilisés au minimum à 6 semaines et au maximum à 41 semaines d'âge (stade adulte).