Rongeurs

Une à six heures de chirurgie pour implanter des électrodes dans le cerveau, puis des séances d'enregistrement la tête fixée, montant progressivement jusqu'à deux ou trois heures. 720 souris vont être utilisées ainsi dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever le cerveau et vérifier la position des électrodes. Elles subissent aussi une biopsie de la queue, un gavage quotidien démarré neuf jours avant le premier enregistrement et un hébergement individuel. Ces souris portent une trisomie qui modélise le syndrome de Down, et le porteur écrit que le phénotype n'est pas considéré comme dommageable, tout en décrivant l'isolement et la perte de liberté de mouvement comme des inconforts modérés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'examiner le fonctionnement des circuits corticaux sur des souris modèles du syndrome de Down afin de mieux comprendre les mécanismes responsables des déficits cognitifs et comportementaux associés à cette pathologie et si possible comment les corriger. En effet cette maladie, liée au développement anormal du système nerveux à cause de facteurs génétiques (trisomie), se caractérise par des troubles du comportement, de l'humeur, des relations sociales, et des déficits cognitifs extrêmement invalidants. Les souris modèles du syndrome de Down présentent des déficits génétiques dans des gènes impliqués dans le développement du cerveau et le retard mental. Notre hypothèse principale, que nous testerons par des enregistrements électrophysiologiques et comportementaux, est que certains éléments des circuits neuronaux du cortex sont défaillants sur ces modèles, entrainant une activité cérébrale anormale qui perturbe l'encodage et la computation neuronale. Nous évaluerons également l'action sur le fonctionnement des circuits corticaux de 2 drogues (candidats médicaments) récemment proposées comme ayant un intérêt clinique potentiel contre le syndrome de Down. Ces drogues, qui affectent les mécanismes intracellulaires au sein des neurones, permettraient potentiellement de restaurer des interactions neuronales normales dans ces pathologies, contre lesquelles aucun traitement pharmacologique efficace n'est à ce jour disponible.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, notamment neurodéveloppementales telles que retard mental et syndrome de Down, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à 7 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 semaines : biopsie de la queue pour phénotypage, procédure instantanée (fraction de seconde), traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement); procédures chirurgicales (implantation, sous anesthésie, d'électrodes ou d'une barre miniature pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine; procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée de 7j, ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 1 à 2 semaines); procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h; et enfin anesthésie terminale pour prélèvement du cerveau, procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.

Impact sur les animaux

La biopsie de la queue pour phénotypage génère une douleur légère et de courte durée. Le traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement) représente un stress physique et psychologique léger, mais n'est associé à aucune douleur. Les procédures chirurgicales (implantation d'électrodes ou d'une barre miniature sur l'os cranien), d'une durée de 1 à 6h, sont effectuées sous anesthésie générale et donc sans douleur ni inconfort. L'acte chirurgical n'est associé à aucune perte de fonction. La récupération post-chirurgicale est accompagnée de traitement analgésique (démarré dès avant l'acte chirurgical), ce qui limite la douleur à un niveau modéré. La procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre ou en mode tête-fixée n'est associée à aucune douleur particulière. En plus de l'hébergement individuel (isolement), compensé par un enrichissement de l'environnement et des interactions quotidiennes avec l'expérimentateur, l'inconfort lié à la fixation de la tête (perte de liberté de mouvement) est modéré car mitigé par les interactions avec l'expérimentateur (handling, enrichissement comportemental lié à la tâche) et par une habituation très progressive (sessions quotidiennes de quelques minutes au départ). Les procédures d'enregistrement sur l'animal anesthésié et de prélèvement du cerveau sont effectuées sous anesthésie générale sans réveil, complétée par un traitement antalgique, et donc sans aucune perception de la part de l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort. Ceci est indispensable pour caractériser l'état histologique du cerveau et pour s'assurer de la localisation des électrodes (identifiée par un marqueur florescent, le DiI) après les enregistrements in vivo.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation dont actes chirurgicaux, perfusion transcardiaque ou mise à mort en cas d'atteinte de point limite).

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques (moyenne et variance) par conséquent inconnus. D'après la littérature du domaine, un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 20% de la moyenne. Il faut ainsi un échantillon de 10 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, σ=0.2µ). Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est donc de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.

Raffinement

Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité : cf fiche de suivi en annexe). Les animaux utilisés sont des souris d'une lignée transgénique modèle du syndrome de Down. Ce modèle a pour but de reproduire les altérations développementales des circuits neuronaux qui sous-tendent la pathologie chez l'homme. Toutefois, aucune étude à notre connaissance ne montre que les troubles associés au développement des circuits neuronaux dans le modèle que nous utilisons soient douloureux pour l'animal, et le phénotype n'est pas considéré comme dommageable.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Elle est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (8-12 semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats (meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.

Tuées au bout d'une semaine ou d'un mois pour prélever le côlon et l'intestin, 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections répétées dans l'abdomen, jusqu'à deux fois par semaine pendant quatre semaines. L'autre subit l'implantation chirurgicale d'un aimant sous la peau du dos et une injection intraveineuse de nanoparticules magnétiques, dispositif destiné à reproduire la pression qu'exerce une tumeur, puis une coloscopie sous anesthésie chaque semaine pendant un mois, avec perte de poids et diarrhée attendues à mesure que les tumeurs se développent. La souche retenue porte une mutation du gène APC que le porteur présente comme le seul moyen d'aborder la question, 80 % des tumeurs du côlon humain portant selon lui cette même mutation.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de décès dans le monde, accumulant près de 10 millions de décès en 2020, selon les rapports publiés par l'OMS. Environ un million de ces décès ont été attribués au cancer colorectal, ce qui le place au deuxième rang mondial sur l'échelle de la mortalité par cancer. Malgré la grande variété et la combinaison de traitements, y compris la chirurgie et la chimiothérapie, 50 % des patients souffrent de métastases (les cellules cancéreuses migrent et s’installent dans une autre partie du corps) qui conduisent à la mort par la maladie. La létalité des différents types de cancers est déterminée par divers facteurs, l'un des plus pertinents étant le type de cellule promotrice de cellules tumorales (les cellules à l’origine de la production de cellules tumorales). Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont les promoteurs les plus agressifs de la progression tumorale et se caractérisent par leur résistance ou leur récidive après traitement, une tendance à métastaser et un taux de mortalité élevé. Dans le cancer de côlon, la pression mécanique liée à la croissance tumorale joue un rôle dans la production de cellules souches cancéreuses mais les mécanismes sous-jacents sont inconnus. L'objectif principal du projet est de déterminer l'origine cellulaire de CSC dans le cancer du côlon chez la souris. Les résultats attendus de notre projet sont de faire la lumière sur un nouveau mécanisme sous-jacent pour la formation de CSC et ouvrir ainsi à de nouveaux traitements inhibiteurs ciblant la formation des CSC.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet vont permettre d'élargir les connaissances sur les mécanismes d'émergence et de développement tumoral les plus agressifs pouvant mener à la formation de métastases dans le cancer du côlon chez la souris (court terme) à partir d'un axe moins exploré dans la communauté scientifique comme l'apport de la physique à la biochimie et à la biologie de l'établissement de cette maladie. Dans un second temps, ces connaissances pourraient être extrapolées au cancer du côlon chez l'homme, du fait de la forte homologie des mécanismes sous-jacents au développement de la maladie chez l’homme et la souris (long terme), et aux tumeurs d'autres organes, pour lesquels il y a des données montrant l’activation anormale de notre protéine d’intérêt dans 8 autres tumeurs solides humaines, en plus du côlon humain (long terme). Enfin, nous visons à obtenir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du cancer du côlon chez la souris d'abord, puis chez l'homme, afin d’aider à supprimer les effets tumorigènes provoqués par la pression mécanique exercée par le développement de tumeurs dans les tissus environnants, et ainsi à atténuer les processus induits par la tumeur primitive, parmi lesquels la formation de métastases, la furtivité au système immunitaire, la résistance aux traitements et la résurgence (long terme).

Procédures

Dans un premier temps, les souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale à différents temps déterminés en avance (une fois par jour pendant 4 jours ou une fois tous les deux jours pendant une semaine, ou deux fois par semaine pendant 4 semaines) (durée du geste inf à 10 sec). Ensuite, les souris seront divisées en différents groupes. Un groupe contrôle recevra seulement une injection intraveineuse (une fois au cours de l’expérience, sur animal vigile, durée du geste inf à 10 sec)). L’autre groupe suivra une chirurgie pour l’implantation d’un aimant en sous-cutané dans le dos de la souris suivi d’une injection intraveineuse avec des nanoparticules magnétiques (une fois au cours de l’expérience, chirurgie réalisée sous anesthésie pendant une durée maximale de 10 minutes). Une partie de ces souris sera suivie par colonoscopie sous anesthésie (une fois par semaine pendant 4 semaines, la durée de la procédure ne dépassera pas 20 minutes pour chaque souris). Au bout d’une semaine ou d’un mois, les animaux seront mis à mort pour prélever des échantillons du côlon et d’intestin

Impact sur les animaux

Les animaux seront injectés avec une solution de particules magnétiques encapsulés par voie intraveineuse et un petit aimant sera inséré par voie sous-cutanée dans le flanc supérieur droit pour établir la pression équivalente à celle d'une tumeur dans le côlon. La douleur provoquée dans cette partie expérimentale du projet est associée à l'injection et à l'implantation de l'aimant, mais ne devrait pas s'étendre sur le temps où la pression mécanique est établie (aucune réponse inflammatoire associée à la stabilisation des nanoparticules magnétiques n'a été trouvée). Après environ un mois, nous attendons le développement de tumeurs chez les animaux et l'inconfort qui y est associé, principalement une perte de poids et diarrhée, qui peut être observée dans les premières semaines après le développement de la tumeur. Un groupe de souris sera injecté par voie intrapéritonéale avant l'implantation de l'aimant et l’injection de particules magnétiques afin d'éliminer la population de cellules souches. Cela peut provoquer une gêne superficielle momentanée due à la piqûre qui ne devrait pas perdurer dans le temps. L’effet d’éliminer les cellules souches intestinales réduit la capacité du tissu à se régénérer et en conséquence induit une diminution de sa fonctionnalité qui peut se traduire en une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Les questions auxquelles on cherche à répondre dans ce projet ne peuvent être abordées expérimentalement sans l'utilisation d'animaux en raison de la complexité présentée non seulement par l'architecture et l'arrangement des organes in vivo, mais aussi par leur interrelation et leur rétroaction avec les systèmes immunitaire et circulatoire. Le modèle de souris est le plus approprié pour le développement expérimental de ce projet en raison de plusieurs aspects, notamment la caractérisation approfondie des mutations à utiliser, ainsi que la maladie et la réponse immunitaire dirigée contre elle. De même, tous ces aspects ont une forte homologie avec l'homme, la souris étant un excellent modèle pour les études précliniques des maladies humaines. Les alternatives de remplacement partielles ou complètes telles que les approches in vitro ou ex vivo comme les cultures de cellules tumorales ou les organoïdes ne peuvent pas imiter avec précision la croissance tumorale in vivo, notamment les pressions de croissance mécaniques associées qui provoquent l’activation des cellules souches cancéreuses. L'utilisation des souris transgéniques comme modèles pathologiques est actuellement le seul moyen d'aborder la problématique de ce projet fondamental. Les questions posées requièrent une complexité tissulaire qui ne peut être récapitulée qu’in vivo.

Réduction

Les résultats obtenus dans nos projets précédents nous ont permis de réduire et d’ajuster le nombre minimal de souris par condition nécessaire pour obtenir de résultats statistiquement fiables. Les analyses par colonoscopie in vivo tout au long des expériences à temps long nous permettent également de réduire le nombre total des souris utilisées.

Raffinement

L'implantation de l'aimant et l'injection de particules aimantées seront réalisées sous anesthésie et après injection d’un analgésique pour réduire la douleur post-opératoire. Pour éviter la déshydratation de la cornée un gel ophtalmique hydratant sera déposé sur les yeux. Des soins désinfectants seront administrés après mise en place sous-cutanée de l'aimant avec un contrôle de la cicatrisation de la plaie. Les souris seront pesées 2 fois par semaine et, en cas de déshydratation (maintien d'un pli cutané dorsal), une réhydratation sera réalisée d’une injection intrapéritonéale de Lactate Ringer avec présentation d’un gel alimentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement) et les expériences seront contrôlées pour minimiser et prévenir la douleur chez les souris. Un maximum de 4 souris par cage sera autorisé en raison du risque accru de diarrhée après le traitement. Pour analyser la croissance tumorale, des analyses d'imagerie in vivo seront effectuées. Toutes les expériences d’imagerie seront réalisées sous anesthésie et seront effectuées par une équipe de 2 personnes si nécessaire et ne dureront pas plus de 20 minutes par animal. Pour toutes les techniques d'imagerie, un gel oculaire et des tapis chauffants seront utilisés pour minimiser l'inconfort et l'hypothermie. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et sera utilisée afin d’intervenir rapidement sur la douleur et l’inconfort et arrêter l’expérimentation avant des signes de douleur.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l’utilisation d’un modèle animal anatomiquement proche de l’humain en vue d’une application clinique chez l’homme. La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en cancérogenèse. La souche de souris choisie contient une mutation génétique importante sur le gène APC connue pour jouer un rôle prépondérant dans le développement du cancer du côlon chez l'homme (80% des tumeurs du côlon humain possèdent cette mutation). Elle est donc depuis longtemps reconnue comme le modèle de choix pour le développement spontané de tumeurs intestinales. L'utilisation des souris sauvages et transgéniques comme modèles pathologiques est actuellement le seul moyen d'aborder la problématique de ce projet ayant comme but la description de l’influence des contraintes mécaniques dans les processus d’initiation et de progression tumorale avec une possible application pharmacologique thérapeutique associée chez l’homme.

Avant même l'accident vasculaire cérébral provoqué, 1 540 souris sont rendues diabétiques par cinq injections quotidiennes de streptozotocine, puis piquées deux fois par semaine, après quatre heures de jeûne, pour contrôler leur glycémie. 4 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin du projet par perfusion sous anesthésie profonde pour prélever leur cerveau. Chacune subit une chirurgie de la tête pour l'injection de thrombine qui bouche l'artère cérébrale moyenne, la pose d'un cathéter dans la veine de la queue, des IRM sous anesthésie générale à des jours tirés au sort, et trois tests comportementaux répétés jusqu'à huit fois en trois semaines, dont le porteur réserve le détail à sa demande d'autorisation. Les souris vivent seules en cage pendant toute l'expérience. Les molécules testées viennent de partenaires industriels, et le porteur annonce qu'en cas de résultats encourageants elles passeront en essais cliniques, "avec pour objectif ultime la mise sur le marché".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Pour l’étude 3/ de cette DAP, 1540 animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale de streptozotocine permettant d’induire une hyperglycémie chronique. Une injection par jour, pendant 5 jours est prévue. Cette injection dure quelques secondes. Un prélèvement d’une gouttelette de sang sera également réalisé 2 fois par semaine pour ces animaux permettant de contrôler la glycémie sanguine. Ce prélèvement ne durera pas plus d’une minute. La mise à jeun des souris pour une durée de 4 heures sera nécessaire avant chaque prélèvement.Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la thrombine murine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de tests comportementaux, détaillés dans cette DAP, avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. À la fin du projet, les animaux seront soumis à une euthanasie sous anesthésie profonde afin d’obtenir des prélèvements biologiques. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion, puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à nos données historiques permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à un par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits réguliers entre les souris et ainsi faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton, et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès ad libidum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum).

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Nous effectuerons notre étude sur des adultes mâles et femelles afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

85 souris et 85 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués dès la fin de la phase de réveil. Chaque animal subit une ovariectomie par voie latérale, opération pouvant durer une heure et demie, réalisée par un stagiaire, avec un risque de délabrement des tissus en cas de gestes mal exécutés et d'hémorragie en cas d'hémostase manquée. Aucune connaissance n'est produite, la finalité étant de satisfaire l'obligation réglementaire de formation à la chirurgie expérimentale, à raison d'un rongeur par participant et de deux animaux supplémentaires par session en cas de décès pendant l'opération. Le porteur décrit une formation qui se déroule d'abord sur substituts synthétiques, cuisses de poulet et cadavres de rongeurs, avant de conclure que la chirurgie des tissus vivants et vascularisés reste "indispensable".

Objectifs

Les formations spécifiques en expérimentation animale constituent une obligation réglementaire à laquelle doivent se soumettre tous les acteurs de la recherche in vivo afin d’acquérir les outils nécessaires à la mise en place d’une démarche éthique prenant en considération la sensibilité animale. Ces formations ont pour objectif de sensibiliser les personnels impliqués afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux lors des procédures expérimentales. Ceci implique notamment, pour les personnes amenées à concevoir ou à réaliser des interventions chirurgicales dans le cadre des projets scientifiques, l’obligation réglementaire de suivre un enseignement théorique et pratique à la chirurgie expérimentale. Le projet ci-présent soumis concerne les travaux pratiques d’une formation à destination de ces personnes, aux bases fondamentales de la chirurgie expérimentale avec utilisation d’animaux vivants, qui s’inscrit dans ce cadre réglementaire et éthique et a été soumise à l’avis de la CNEA, Commission nationale pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et l’approbation du Ministère chargé de l'Agriculture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes réalisant des procédures chirurgicales sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.

Procédures

Les animaux sont d’abord soumis à une anesthésie : Après contention de l’animal, le stagiaire effectue une injection intrapéritonéale unique d’un anesthésique, et une injection sous-cutanée d’un analgésique afin de raffiner au mieux la technique et d’éviter toute douleur à l’animal. (30 secondes). Sous anesthésie, Ils sont ensuite préparés pour la chirurgie de façon aseptique. Cette préparation dure environ 30 minutes. La procédure chirurgicale réalisée est une ovariectomie par voie latérale. Cette procédure chirurgicale dure au maximum 1h30. A la fin de la procédure chirurgicale, l’animal est placé dans une cage individuelle pour la surveillance de son réveil. Cette phase dure au maximum 30 minutes. La séance de travaux pratiques sur animaux a une durée totale de 3h30, débutant par la préparation des chirurgiens, du matériel, des animaux et se terminant par le rangement de la salle. La durée de la chirurgie, depuis l’induction de l’anesthésie jusqu’au réveil est de 2h30 maximum et elle n’est réalisée qu’avec une seule fois sur chaque animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles durant l’intervention sont : - un délabrement des tissus lié à des gestes chirurgicaux incorrectement réalisés - une hémorragie en cas de mauvaise réalisation de l’hémostase - une souffrance liée à une monitoring insuffisant de l’anesthésie

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure chirurgicale. Cela est justifié par le fait que le suivi post-opératoire sur plusieurs jours ne peut pas être intégré à la formation et que l’utilisation d’animaux ovariectomisés n’est pas prévue dans un autre projet.

Remplacement

Diverses méthodes sont mises en œuvre au cours de la formation pour remplacer l’animal. Ainsi, la première et majeure partie des travaux pratiques se déroule sur substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie (cuisses de poulets) et cadavres de rongeurs issus d’euthanasies indépendantes des besoins de la formation. L’utilisation de substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie est un atout pour les participants et les intervenants qui peuvent ainsi rapidement se concentrer sur les gestes chirurgicaux, sans avoir à gérer les contraintes inhérentes à l’accès en animalerie et au suivi d’animaux opérés, disposer aisément de leurs notes et supports vidéo ou Power point. En outre, les participants peuvent s’entraîner et répéter, à leur rythme, les gestes chirurgicaux, sans avoir le stress de la surveillance du respect de l’asepsie, de l’anesthésie et des fonctions vitales de l’animal vivant. Cela favorise la sérénité et la confiance dans l’apprentissage de la chirurgie expérimentale. Néanmoins, l’observation des réactions physiologiques lors de l’anesthésie et l’apprentissage de la chirurgie des tissus vivants et vascularisés ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente. Cette formation a été validée par la Commission nationale pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (dite CNEA) et le Ministère en charge de l’Agriculture.

Réduction

Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons préférentiellement des animaux de réforme ou surnuméraires présents dans l’établissement qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine présents dans l'établissement. Dans le cas où de tels animaux ne seraient pas disponibles en quantité suffisante au moment de la formation, des animaux de réforme peuvent être demandés à un élevage agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire : Pour la partie sur animal vivant, un seul rongeur par participant (rat ou souris, fonction des besoins pédagogiques exprimés par les participants) est utilisé pour la réalisation d’une chirurgie complète. 2 animaux supplémentaires sont prévus à chaque session, dans le cas où un décès surviendrait avant la réalisation complète de la chirurgie par un ou 2 stagiaires (problème lors de l’anesthésie ou atteinte d’un point limite lors de la chirurgie). Dans un esprit de réduction, les 2 animaux surnuméraires, si non utilisés, pourront être utilisés par la suite pour du training en interne, ou des prélèvements de matrice pour bioanalyse. Afin de limiter également le nombre de participants, la formations n'est dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles. L'établissement prévoit jusqu'à 2 sessions de formation par an avec 17 animaux par session soit 170 animaux (souris ou rats) sur 5 ans.

Raffinement

En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques sur animaux en dernière partie de formation. Dans l’attente, les animaux sont gardés dans une salle d’hébergement et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment. Toutes les techniques enseignées font d’abord l’objet d’une démonstration et d’un apprentissage sur support inerte ou animal mort afin de remplacer l’animal vivant par des méthodes alternatives tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé pour pratiquer sur animal vivant. Pour limiter toute douleur per-opératoire, un analgésique adapté est administré aux animaux opérés dès l’induction de l’anesthésie et sa durée d’action couvre la totalité de la procédure chirurgicale et de la phase de réveil. Les animaux sont euthanasiés dès la fin de la chirurgie et observation des phases du réveil, leur évitant ainsi toute douleur post-opératoire prolongée. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques (manipulation atraumatique et aseptique des tissus, lutte contre l’hypothermie, soins post-opératoires…) Les personnes encadrant les travaux pratiques sont particulièrement attentives à tout signe de douleur ou de détresse. Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure chirurgicale en cours sera immédiatement interrompue et une personne compétente prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire).

Choix des espèces

Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux…). Les notions enseignées sont applicables à toutes les espèces de mammifères utilisés à des fins scientifiques. Néanmoins, les rongeurs étant très majoritairement utilisés dans la recherche in vivo, certains concepts sont particulièrement développés pour les rongeurs, et les travaux pratiques sont réalisés sur rongeurs également. Le choix de l’espèce (souris ou rat) correspond aux espèces principalement hébergées dans notre établissement, et aux besoins pédagogiques exprimés par les participants. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au-delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.

472 souris privées du récepteur aux LDL vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à un régime enrichi en cholestérol pendant deux à cinq mois et à une IRM de deux heures et demie. Jusqu'à 260 d'entre elles reçoivent six à dix injections dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, geste qui peut entraîner une nécrose au point de piqûre. Le porteur annonce des œdèmes de la face et des membres en fin de régime, une insuffisance cardiaque possible et une prostration, chaque animal atteignant un de ces seuils étant tué et ses organes prélevés. Le bénéfice avancé, une meilleure prise en charge des patients atteints de démence vasculaire, est renvoyé au long terme et conditionné à des résultats concluants.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives sont des maladies qui affectent le cerveau. Les plus connues sont la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson. Il en existe de nombreuses autres comme une maladie connue sous le nom de Niemann-Pick qui est dû à l’accumulation de cholestérol directement dans les cellules du cerveau. Cette accumulation de cholestérol a également été montrée dans la maladie d’Alzheimer. Ce cholestérol, peut également s’accumuler dans les parois des vaisseaux sanguins qui irriguent le cerveau, formant des lésions d’athérosclérose qui empêchent une bonne oxygénation des neurones et aboutit à une altération du fonctionnement cognitif : la démence vasculaire. L’objectif de ce projet est l’identification des mécanismes par lesquels des protéines spécifiquent régulent le taux de cholestérol dans la cellules. Nous étudierons comment ces proteines sont impliquées dans l’apparition des altérations cognitives, morphologique du cerveau et métaboliques liées à la démence vasculaire et aux maladies neurodégénératives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des phénomènes de démence vasculaires liés aux dépôts de cholestérol dans les artères et de déterminer si l’injection d’anticorps anti-proteine X (confidentiel) est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cérébrales et cardiovasculaires. A long terme, si les résultats obtenus sont concluants, cette études permettra une meilleur prise en charge des patients atteint de démence vasculaire et autres maladies neurodégénératives liées à une perturbation du métabolisme du cholestérol.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 2 mois ou 5 mois. Certains animaux (au maximun 260) seront soumis à 6 injections (protocole de 2 mois de régime) ou 10 injections (protocole de 5 mois de régime) dans la veine caudale (processus de 10 minutes environ) ou intrapéritonéale (2 minutes environ). Les animaux pourront subir un stress léger lors des manipulations. Les animaux seront soumis également à une IRM (durée 2 à 2,5H).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent développer des oedème faciaux et des membres en toute fin de la période de régime proathérogène. Un stress engendré par les injections à la queue ou intrapéritonéale et lors de l'anesthésie finale en IP. L'injection à la queue peut potentiellement entrainer une nécrose au point d'injection. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids.

Devenir

Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traité par anticorps seront euthanasiés pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.

Remplacement

ll n'est pas encore possible de nos jours de modéliser les processus cognitifs de façon assez fiable et complète dans un modèle in silico des pathologies étudiées. Il est donc nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie, la connectivité cérébrale et les performances cognitives. Pour le projet concernant la démence vasculaire, l’athérosclérose est un phénomène multifactoriel qui ne peut être totalement décrit par un modèle cellulaire et nous devons intégrer les facteurs présents in vivo qui sont responsables de la survenue de cette pathologie.

Réduction

Si nous obtenons des résultats significatif avant la fin de l'étude, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé (472 animaux sur 5 ans au total). Nous utiliserons également nos souris SmWnt5a, SmLRP1 afin de faire des cultures de cellules musculaires de vaisseaux sanguins et de cellules cardiaques, dans le but d’identifier les mécanismes cellulaires par lesquels Wnt5a protège de l’accumulation du cholestérol. La partie « culture de cellules » permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaire à notre étude, car nous utiliserons peu d'animaux pour mettre en culture les cellules musculaires lisse, alors que cette même étude mécanistique In vivo nécessiterait un plus grand nombre d'animaux. Pour chaque étude, la taille des groupes a été déterminée mathématiquement et les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques pour mettre en évidence le rôle de la protéine wnt5 dans les troubles cognitifs vasculaires et les maladies neurodégénératives.

Raffinement

Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que faire se peut la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime (oedèmes dû à l’insuffisance cardiaque qui peut s’installer, prostration). Le suivi de l’état des animaux sera quotidien et les animaux seront soumis à une inspection visuelle. Dès qu'un animal atteint un des points limites, il sera euthanasié et ces organes prélevés pour étude.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour les délétions de gènes (souris Knock Out conditionnel ou non). Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée sur un fond génétique C57BL/6J, LDL-/- (Low Density Lipoprotein). Ces souris sont KO pour le récepteur aux LDL afin d’accélérer la formation de lésions d’athérosclérose lorsqu’elles sont soumises à un régime riche en cholestérol (paigen). Ce fond génétique n’a aucun impact sur la longévité ou le bien être des souris hors régime paigen. Pour les groupes avec un régime standard ou proathérogène de type paigen pendant 2 à 5 mois, nous utiliserons des souris adulte de 3 mois, afin de déterminer l‘évolution de la maladie sur les plans histologique, biochimique et fonctionnelle (IRM ) et cognitif (Arène ouverte). Les souris de 3 mois ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleur reproductibilité des résultats.

Les souris utilisées appartiennent à des lignées dont la rétine dégénère rapidement, l'une perdant sa réponse électrophysiologique dès quatre mois. 540 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection sous la rétine, qui peut provoquer un décollement rétinien, une opacification de la cornée ou des saignements dans l'œil, puis passe des séances d'électrorétinographie et de tomographie sous anesthésie à six âges différents, une partie subissant en plus un test de réflexe optomoteur de trois fois vingt minutes à cinq âges et un test clair-obscur. La mise à mort sert à prélever les rétines pour des marquages histologiques et des analyses transcriptomiques, l'ensemble visant à documenter une thérapie génique avant un éventuel essai clinique.

Objectifs

Plus de 200 gènes sont actuellement associés à la cécité congénitale. Bien que la thérapie génique ait été proposée pour un grand nombre de ces gènes, cette approche présente des limites. Nous avons la preuve que l'introduction d'une copie saine d'un gène spécifique impliqué dans le développement des photorécepteurs (cellules de détection de la lumière dans l'œil) peut retarder la perte de vision. Pour explorer plus avant cet effet thérapeutique, nous utiliserons deux modèles murins différents de cécité congénitale causée par des mutations dans différents gènes. Notre objectif est d'établir l'effet thérapeutique et d'élucider les mécanismes à l'origine de cet effet.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies. La plupart permettent uniquement de ralentir la dégénérescence. Certaines, plus efficaces, sont uniquement proposées en fonction de votre mutation. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace pour de rétinopathies. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles animaux, qui serviront de preuves de concept, ou d’études précliniques, nécessaires à réaliser en amont d’essais chez les patients. Le but est de poursuivre vers un essai clinique.

Procédures

Toutes les souris recevront une injection sous rétinienneous. Par la suite, les animaux seront soumise a ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes) à 6 âges diffeérents. Une autre partie des souris passeront un test de reflexe optomoteur (3 x 20 minutes espacés d’1 heure minimum) à 5 âges diffeérents. Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée.

Impact sur les animaux

Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum. L’injection sous rétinienne peuvent provoquer un décollement rétinien qui se résorbe en 48h. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

L'étude préclinique s'étendra sur une période de deux ans et a pour but d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie ophtalmique. Cette thérapie sera expérimentée sur deux lignées de modèles animaux. L'objectif est de confirmer l'efficacité du traitement sur un vaste panel de patients et de comprendre son mode d'action. La première phase de l'étude consistera à identifier la dose optimale à administrer à chaque modèle animal. Par la suite, une comparaison de l'efficacité du traitement sera effectuée. Seuls les animaux ayant reçu la dose la plus efficace seront soumis aux étapes ultérieures. L'objectif de cette étude est d'obtenir entre 7 et 10 yeux par traitement, afin de garantir des résultats statistiquement pertinents. Ce chiffre a été établi sur la base de données scientifiques. Seuls les animaux ayant été correctement injectés dans au moins un œil seront pris en compte dans l'analyse. Il est également possible que le nombre de modèles animaux soit réduit en fonction des résultats obtenus. Si, après un certain temps, le traitement s'avère inefficace, l'étude sera interrompue.

Raffinement

Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille de score adaptée est utilisée pour apprécier l’état des animaux, ce système comprend des points limites précoces qui permettent de détecter les premiers symptômes de douleur ou d’inconforme et d'intervenir rapidement.

Choix des espèces

La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Comme nous connaissons les modèles animaux que nous allons utiliser, nous pouvons définir le temps auquel il est plus pertinent d’injecter nos AAV, ainsi que les temps auxquels il faudra réaliser les expériences. Les rétines des souris utilisées dégénèrent très rapidement. Nous injectons donc à 14 jours aprés naissance et regarderont 21 jours plus tard les effets de l'injection. Les souris d'une autre lignée présentent une faible réponse électrophysiologique (ERG) dès l'âge de 4 mois, c'est pourquoi nous réaliserons les injections 30 jours après la naissance et examinerons l'efficacité de ces injections 30 jours plus tard. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.

Opérés trente minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure, 300 rats mâles et femelles s'administrent ensuite eux-mêmes de l'alcool par voie orale et de la cocaïne par voie intraveineuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'expérience dure cinq à six mois, avec un taux d'attrition que le porteur estime à 20 %, et il s'agit de mettre au point un modèle de polyconsommation qui n'existe pas encore. Il liste après la chirurgie des risques d'inflammation, d'infection, de plaies dues à un toilettage excessif et de lâchage des points de suture. Il écrit ensuite n'anticiper aucune nuisance particulière pendant l'auto-administration de cocaïne et d'alcool, tous les rats étant tués à la fin pour prélever leur cerveau.

Objectifs

La polyconsommation est la norme, et non l'exception, chez les utilisateurs de drogues. Elle peut prendre plusieurs formes mais elle implique presque toujours le co-usage d'au moins un produit licite (par exemple, ingestion d'alcool) et d'une substance illicite (par exemple, inhalation ou injection intraveineuse de cocaïne). L'objectif principal de ce projet vise à développer et valider un modèle animal de polyconsommation d’alcool et de cocaïne. Il s’agira d’étudier l'influence du co-usage d'alcool sur le développement, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne chez le rat. Des rats mâles et femelles auront un accès concomitant à l'alcool (par voie orale) et à la cocaïne (par voie intraveineuse). Pendant cet accès concomitant, ils pourront co-utiliser les deux substances librement avant de s'installer dans un profil de polyconsommation donné parmi les nombreux possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne). Ce projet de recherche est conçu pour permettre la découverte et l’étude de différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, de leur développement et de leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe (Objectif 1). Ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien (Objectif 2), l’abstinence et la rechute de la consommation de cocaïne (Objectif 3). Enfin, ce projet permettra aussi la collecte et le stockage de tissus cérébraux issus d’individus ayant développé différents profils de polyconsommation pour des analyses neuromoléculaires futures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera la validation d’un modèle animal de co-usage d’alcool et de cocaïne. Un tel modèle n’existe pas actuellement. Les autres bénéfices attendus incluront le recueil d’informations uniques sur les différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, sur leur développement, sur leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe, et, à plus long terme, sur leurs corrélats moléculaires dans le cerveau. Enfin, ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool mais les animaux seront sous surveillance pendant les premières séances de polyconsommation pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux pour des analyses moléculaires futures.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales et 2) les polyconsommations de substances dans l’addiction ne peuvent pas être récapitulées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différents objectifs à remplir. Pour répondre à chaque objectif du projet, il faudra deux cohortes de 50 rats chacune (une de mâles et une de femelles). Ce nombre permettra d’avoir assez d’individus répartis dans les nombreux profils de polyconsommation possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne), tout en tenant compte d’un taux d’attrition estimé à 20 pourcents après 5 à 6 mois d’expérience. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera égal à 300 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie (anti-inflammatoire non-stéroïdien), sous anesthésie chimique (mélange de kétamine et de xylazine) et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl) pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures pour faciliter l'accès à l’alimentation (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique (anti-inflammatoire non-stéroïdien). L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl). Enfin, si cela ne suffit pas au bon rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus) constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche d’H. Sapiens d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes en fin d’adolescence au début des expériences (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction