Rongeurs

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et celles qui portent un cathéter jugulaire voient leur glycémie mesurée quinze fois en deux heures, avec huit prélèvements de sang. La queue est coupée au ciseau pour ces prélèvements, geste dont le porteur écrit qu'il entraîne une douleur. La moitié des souris reçoit pendant deux à quatre mois un régime hypercalorique qui les rend prédiabétiques, certaines subissent la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire sous quarante-cinq minutes d'anesthésie générale, d'autres une inoculation par voie rectale que le porteur reconnaît pouvoir les blesser. Le bénéfice avancé tient en une phrase, la mise au point de traitements antidiabétiques à base de probiotiques, quand l'expérimentation court sur cinq ans.

Objectifs

De nombreuses bactéries vivent dans le tube digestif et composent ce que l’on appelle le microbiote intestinal. Ces bactéries produisent des petites molécules (les bactériocines) qui agissent comme des antibiotiques, et permettent aux bactéries qui les produisent de se défendre contre des bactéries dangereuses ou nocives. Nous avons sélectionné une bactériocine, produite naturellement dans l’intestin, qui pourrait avoir un effet bénéfique sur le microbiote intestinal et protéger du diabète de type 2. Nos résultats précédents nous ont permis de montrer que cette bactériocine est en partie dégradée dans les intestins ce qui diminue son efficacité. L’objectif de ce projet est de mettre au point une nouvelle formulation afin de protéger notre molécule lors d'un traitement par voie orale (le plus couramment utilisé chez l'Homme). Pour cela nous utiliserons deux approches : la première sera d’utiliser des nanoparticules, d’origine naturelle, pour entourer notre molécule et ainsi la protéger quand elle sera dans le tube digestif. Une seconde approche consistera à enrichir le microbiote intestinal de nos souris avec les bactéries qui produisent naturellement notre molécule. Nous utiliserons des souris pré-diabétiques et des souris diabétiques. Au cours de cette étude, qui durera 5 ans, nous utiliserons 512 animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mettre au point de nouveaux traitements antidiabétiques d'origine naturelle à base de probiotiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 à 4 mois, ainsi ces animaux deviendront prédiabétiques. 2. Les animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. 3. Les animaux non opérés passeront deux scanners, à 7 jours d'intervalle, pendant lesquels ils seront immobilisés pendant 3 minutes. Ensuite ils seront utilisés pour faire des tests : deux fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Ils seront gavés avec du glucose puis pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront libres de leurs mouvements. Les animaux opérés suivrons un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 15 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 8 fois). Il n’y aura qu’un seul test.

Impact sur les animaux

#1. Régime hypercalorique : Après 2 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2 (intolérance au glucose et résistance à l'insuline). Concernant les souris diabétiques, la maladie entraîne une polyurie et une prise hydrique augmentée. #2. Traitement antibiotique : ce traitement peut entraîner des diarrhées et une éventuelle déshydratation. #3. Inoculation : L’inoculation par voie orale peut stresser les animaux. L'inoculation par voie rectale, pourrait blesser les animaux. #4. Test de tolérance au glucose et à l'insuline : Le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux. La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur. #5. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : Plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs et des problèmes de récupération. #6. Mesure du renouvellement du glucose : le risque est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux. #7. Ponction intra-cardiaque : L’animal sera stressé par l’injection sous-cutanée d’analgésiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet anti-diabétique d'une nouvelle molécule. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de reproduire la complexité d'un organisme vivant.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux par groupe à n=6 pour les tests métaboliques et n= 8 quand il y a des chirurgies, de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents. Toute fois nous devrons réaliser deux séries pour les tests métaboliques afin de s'assurer de la reproductibilité de nos résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant, pendant, et après l’opération. L’ensemble des procédures de ce projet visent à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Pour cela des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet de notre molécule sur un modèle animal, dans la perspective de la tester ensuite dans une phase clinique humaine. Tous les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines car nous souhaitons étudier la physiologie adulte.

Une glycémie au-dessus de 500 ou en dessous de 65 mg/dl fait tuer la souris, comme le cumul de plus de trois signes de douleur relevés dans la grille du porteur. 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examen du pancréas. Elles reçoivent des injections répétées, des piqûres à la queue pour suivre leur glycémie, et un test final après cinq heures de jeûne avec six prélèvements sanguins successifs. Six âges sont étudiés, du quatorzième jour après la fécondation à huit mois, et le porteur écrit avoir calculé un effectif "aussi faible que possible" par des tests statistiques dont il ne donne aucun détail.

Objectifs

Le diabète résulte de la destruction des cellules fabricant l'insuline dont le rôle est de diminuer le taux de sucre sanguin. Cela conduit une augmentation du taux de sucre sanguin qui peut avoir de graves conséquences. Les traitement actuels consistent en l'injection d'insuline mais le maintien du taux de sucre sanguin n'est pas optimal. Il faut donc développer de meilleurs thérapies. Dans ce but, nous avons identifié des composés chimiques qui induisent la régénération des cellules productrices d'insuline, ce qui est d'intérêt pour les patients diabétiques. Cependant, ces résultats obtenus sur cellules doivent être validés sur l'animal.

Bénéfices attendus

Ce projet se propose de déterminer si ces composés pourraient induire une augmentation du nombre de cellules beta pancréatiques quand administrés à des animaux. Il est clair qu'une telle approche représenterait un bénéfice d'importance pour les personnes atteintes de diabète.

Procédures

Les animaux recevront des injections (chaque injection durant une dizaine de secondes). Des prélèvements sont prévus pour suivre le taux de sucre sanguin des animaux (1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures du taux de sucre sanguin) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer un diabète très modéré (légère hyperglycémie). La source principale de nuisance est reliée aux piqures des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie ayand plusieurs orgines (génétiques mais aussi environementales). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible (calculé grâce à des tests statistiques) mais permettant l’obtention de résultats exploitables sans besoin de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis afin d’évaluer d’éventuelles souffrances. L'expérience serait immédiatement arrétée en cas de souffrance mesurée comme suit: -Déplacement difficile -Diminution du comportement exploratoire Posture inhabituelle (dos vouté, prostration) -Agressivité -Amaigrissement > 10% du poids initial -Aspect du poil (piqué, hérissé, mal entretenu) -Déshydratation -Agressivité à la manipulation - Glycémie: >500 ou

Choix des espèces

Ce projet a pour but de déterminer les effets des nos composés dans un système biologique intégré. La souris correspond au meilleur compromis pour suivre sur le long terme l'action de ces molécules. En effet, la souris est très proche de l’homme pour ce qui est des mécanismes de régulation de la glycémie/du nombre de cellules beta pancréatiques. 6 âges seront évalués : 14 jours suivant la fertilisation, le jour de la naissance, 1 mois après naissance, 2 mois après naissance, 4 mois après naissance, 8 mois après naissance. Ces âges furent sélectionnés afin de représenter les différentes périodes de la vie : embryonnaire, jeunes, matures, âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter nos observations dans ces animaux.

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 900 d'entre elles reçoivent pendant douze semaines un régime gras destiné à provoquer un diabète de type 2, les 108 autres étant diabétiques par modification génétique, puis chacune subit sous anesthésie l'ouverture d'une plaie dans la peau du dos, avec un dispositif de recueil implanté autour et un suivi de quinze à vingt jours. Le porteur signale que le régime gras rend souvent les souris agressives envers leurs congénères et que la plaie devient douloureuse quand l'animal doit s'étirer. Sur le remplacement, il décrit des tests sur cellules ayant servi à présélectionner les traitements, sans indiquer ce qui empêche d'aller plus loin sans animaux.

Objectifs

De nos jours, la cicatrisation des patients diabétiques et des sujets agés demeure un enjeu social et économique crucial. De précédents travaux ont démontré un retard dans la vitesse de cicatrisation chez différents modèles murins diabétiques, causé par un état inflammatoire persistant. Aucune stratégie thérapeutique n’a encore permis d’apporter de véritables solutions efficaces, dans l’amélioration de la vitesse de cicatrisation chez le patient diabétique de type 2. La compréhension de la dérégulation des mécanismes cellulaires et moléculaires du processus cicatriciel chez le diabétique représente donc un enjeu essentiel pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le dispositif placé sur le dos de l'animal permet de récolter in situ la totalité de l’exsudat présent sur la plaie. Cette méthode de prélèvement préserve l’intégrité morphologique et fonctionnelle de différentes populations cellulaires et de différents médiateurs contenus dans l’exsudat, permettant de suivre l’évolution de la phase inflammatoire et de sa résolution. Notre dispositif nous donne ainsi une vraie « image de la plaie » et de son environnement. Ce dispositif permet l’administration de solutions à travers un septum directement sur la plaie et plus particulièrement de nouveaux principes actifs pouvant agir sur la vitesse de cicatrisation. Ainsi, les avancées récentes sur la compréhension de la dérégulation de la cicatrisation chez les patients diabétiques, notamment sur l’implication des macrophages, et notre savoir-faire sur ces cellules, ouvrent de nouvelles perspectives quant aux stratégies expérimentales à développer. L’exploitation de nos résultats de recherche et l’utilisation de notre dispositif expérimental innovant rendent possibles : i) le test de nouvelles molécules par application topique et; ii) la caractérisation des populations cellulaires présentes aux différentes étapes de ce processus (phase inflammatoire, phase de résolution, phase de réparation) sur un même animal, et iii) l’étude de nouveaux mécanismes d’actions favorisant la cicatrisation chez le patient diabétique en déterminant des cibles thérapeutiques(animaux génétiquement modifiés, administration de cellules pro-resolutives ).

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 pendant 12 semaines (900 souris). Les animaux diabétiques soumis au régime gras (900) ou génétiquement diabétiques (108) subiront ensuite une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant de créer une lésion cutanée dorsale et un dispositif non invasif sera implanté sur le pourtour de la plaie (1008 souris). La durée de l’anesthésie et de l’intervention est de 10min par animal. Les animaux seront suivis pendant 15-20 jours (observations de leur état général et suivi de la fermeture de la plaie par photographie). Les traitements cicatrisants seront administrés soit par injection intrapéritonéale (durée de quelques secondes), soit dans l’eau de boisson ad libitum ou par gavage (durée de quelques secondes), ou directement sur la plaie (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 présentent très souvent un comportement agressif vis-à-vis de leurs congénères. La formation de la plaie peut induire de la douleur et l’animal peut modifier son comportement en réduisant ces mouvements. Le traitement par voie topique commencera 3 jours post-lésion. Il sera appliqué une fois par jour jusqu’à la cicatrisation complète. Ce mode d’administration sera privilégié car le dispositif facilite le traitement topique et ne génère aucune souffrance à l’animal. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson peuvent altérer la prise hydrique.

Devenir

A l’issue du régime hyperlipidique et du suivi de la plaie, les animaux seront sacrifiés afin de prélever les tissus cicatriciels à différents temps post-lésion.

Remplacement

Nous testerons plusieurs types de traitements par voie topique et par voie orale qui sont susceptibles de pouvoir améliorer la cicatrisation chez les patients diabétiques. Ces traitements, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires réalisés en amont de ces études. Ces études sont basées sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels des traitements sur les processus cicatriciels (contraction, migration et prolifération cellulaires, différenciation…). Les cellules pro-résolutives auront également été sélectionnées en amont grâce à des tests in vitro au laboratoire (cellules myéloides et mesenchymateuses).

Réduction

Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres à évaluer, qu’un nombre de 9 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi).

Raffinement

Au cours du régime gras, les animaux seront pesés 1x/semaine. Au cours du processus de cicatrisation, une surveillance journalière sera effectuée afin de suivre le poids par une pesée mais aussi le comportement des animaux. La perte de poids (20% maximum), le changement de posture (recroquevillée, tremblement...), la modification d’activité (isolement, difficulté respiratoire) et l’aspect des poils sont des signes de douleurs qui seront des critères d’arrêt de l’étude. Bien que le dispositif n’entrave pas le mouvement des animaux, la plaie peut être douloureuse lorsque l’animal doit s’étirer. Suite à la création de la lésion cutanée pratiquée sous anesthésie sur le dos des animaux, des biberons avec embouts longs, ainsi que des croquettes humidifiées permettront de faciliter l’hydratation et la prise de nourriture de ces souris. Ces aménagements permettront de limiter les déplacements et les redressements des animaux pour se nourrir. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux.

Choix des espèces

Les souris représentent le modèle préclinique idéal. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés. Cette approche permettra d'étudier des mécanismes moléculairesafin de définir des cibles thérapeutiques. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. De plus, le modèle de souris diabétique mime la physiopathilogie du diabète observée chez l'homme avec une inflammation chronique à bas bruit altérant les mécanismes de cicatrisations. Le diabète de type 2 est essentiellement observé à l’âge adulte. Des souris présentant un état diabétique spontané et une obésité caractéristique du diabète de type 2, comme rencontré chez l’homme, seront utilisées entre 7 et 12 semaines. Le modèle du diabète de type 2 sera induit chez des souris mâles âgées de 6-7 semaines (stade adulte) par un régime riche en graisses (régime diabétogène) pendant 12 semaines minimum. L’âge influençant la cicatrisation, les expérimentations pourront être effectuées sur des animaux âgées entre 12-20 mois.

Immunodéprimées pour que des cellules tumorales humaines prennent sans être rejetées, 272 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules exprimant la mésothéline sous anesthésie, puis des séances d'imagerie par bioluminescence également sous anesthésie, et 24 d'entre elles un prélèvement sanguin. Le porteur écrit qu'elles développeront une pathologie humaine potentiellement grave et que l'anesthésie, les pesées et les mesures de masse tumorale peuvent être source d'angoisse. Toutes sont tuées pour que leurs organes soient examinés en imagerie ex vivo, l'objet étant de mettre au point un agent d'imagerie servant à présélectionner les patients éligibles à une thérapie ciblée.

Objectifs

Combiner l’imagerie des tumeurs et un traitement ciblé constitue une avancée prometteuse dans le domaine de la médecine personnalisée, c'est-à-dire adaptée à chaque patient. Cette combinaison d’approches se base sur l'utilisation d’une même cible tumorale pour, à la fois, guider la pré-sélection des patients susceptibles de mieux répondre au traitement ciblé et suivre l’effet du traitement et l'évolution de la maladie. La mésothéline est une protéine présente en grande quantité dans divers cancers agressifs tels que ceux des ovaires, du pancréas, du sein triple négatif et des poumons, pour lesquels les options thérapeutiques sont limitées. En raison de sa forte expression dans les tumeurs et de son rôle dans le développement tumoral, la mésothéline est une cible intéressante. Les anticorps à un seul domaine sont des molécules attrayantes en raison de leur petite taille, de leur courte demi-vie sérique, de leur spécificité et de leur modularité. Ils sont utilisés pour développer de nouveaux traitements et des agents d’imagerie non invasive. Des anticorps à un seul domaine ciblant la mésothéline ont été utilisés pour développer des agents d'imagerie non invasive afin de faciliter le diagnostic des patients atteints de cancer sur-exprimant la mésotheline. Après une caractérisation in vitro approfondie sur des différents modèles cellulaires, la capacité des molécules candidates à cibler spécifiquement les tumeurs sera évaluée in vivo sur des modèles murins porteurs de greffes de cellules tumorales humaines exprimant la mésothéline. Ces avancées pourraient ouvrir de nouvelles perspectives dans le diagnostic et le traitement des cancers associés à la surexpression de la mésothéline.

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car dans une perspective de thérapie ciblée des cancers exprimant la mésothéline, le développement d’agents d’imagerie spécifiques de la mésothéline comme test compagnon pour prédire l'éligibilité des patients, suivre la réponse au traitement, surveiller l’évolution de la maladie l’évolution ou pour guider en temps réel l’exérèse des tumeurs au cours d'une intervention chirurgicale est d'une importance croissante.

Procédures

L’ensemble des animaux recevra l’administration de candidats diagnostiques et subira une transplantation de cellules tumorales sous anesthésie (durée= 6 à 10 minutes/souris). Le ciblage tumoral par les composés sera effectué par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris). Enfin, 24 animaux sur les 272 prévus dans ce projet subiront également un prélèvement sanguin (durée = moins d’1 minute) à l’aide de matériel dédié aux rongeurs.

Impact sur les animaux

Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L’ensemble des animaux recevront des molécules candidates pour de l’imagerie optique de tumeurs. L'anesthésie des souris nécessaire à l’imagerie et à la transplantation, les pesées et les mesures de masse tumorale peuvent être source d'angoisse.

Devenir

L'ensemble des animaux de cette étude sera mis à mort à la fin des étapes expérimentales pour des raisons de caractérisations ex vivo par imagerie sur les organes.

Remplacement

Le projet in vivo est dans la continuité d’études réalisées in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez des patients. Nous avons besoin d’un modèle pertinent permettant de reproduire au mieux, non seulement la complexité du développement tumoral d’un point de vue phénoménologique, mais également la biodistribution des molécules candidates.

Réduction

Les études in vivo ne seront réalisées que sur les molécules candidates qui auront démontré une efficacité maximale in vitro. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer que l’effet de nos molécules est significatif par rapport aux groupes contrôles. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Les procédures d’implantation des cellules tumorales et d’imagerie par fluorescence seront réalisées sous anesthésie volatile. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

Tester des candidats médicaments fournis par des clients, dont le porteur écrit ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles : 2 160 rats sont utilisés pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs tissus. On leur provoque une prostatite ou une hypertrophie de la prostate, avec des chirurgies pour injecter des composés directement dans la prostate, poser des pompes osmotiques ou des cathéters vésicaux externalisés, après quoi ils passent jusqu'à 48 heures en cage individuelle. S'ajoutent jusqu'à 24 heures en cage à métabolisme, trois heures trente en cage de restriction pour la cystométrie et une heure de contention pour un test de douleur. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à calculer les effectifs, retenus à douze animaux par groupe sur la base de son expérience et de la littérature.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles mimant différentes pathologies de la prostate (prostatite, hypertrophie bénigne de la prostate). La population vieillissant, de nombreuses pathologies de la prostate chez l’homme engendrent des problèmes urinaires ayant un impact important sur le bien-être et la qualité de vie (problème de sociabilisation, sujet tabou…). Il est donc nécessaire de réaliser des études expérimentales pour cette thématique de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et/ou avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de pathologies de la prostate (prostatite et hypertrophie bénigne de la prostate).

Procédures

Les animaux seront traités avec des candidats médicaments ou des agents inducteurs de pathologie par des voies d’administration classiques. Ces gestes, réalisés par du personnel qualifié et ayant de l’expérience, seront rapides (environ 1 min) pour limiter la manipulation des animaux et la gêne occasionnée. Les animaux auront des chirurgies pour l’administration de composés directement dans la prostate ou via l’implantation de pompes osmotiques ou d’implants (chirurgie rapide, environ 15 min). Les animaux pourront avoir une chirurgie un peu plus longue (environ 30 min) avec l’implantation de cathéters externalisés (cathéter vésical et d’administration). Les animaux pourront avoir des prises de glycémie donc un léger prélèvement sanguin à la queue (1 goutte) étant très rapide (1 min) 2 fois par semine. Des prélèvements sanguins plus importants pourront être réalisés au cours des traitements selon les protocoles expérimentaux (geste rapide 1-2 min) sur animal vigile (1 fois par semaine maximum). Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme pendant 24H maximum ou être mis dans des cages de restriction pour évaluer le profil mictionnel via la cystométrie (pendant 3H30). Après l’implantation de cathéters externalisés, les animaux seront mis dans des cages individuelles pendant 48H maximum. Les animaux subiront un test comportemental de douleur où ils seront dans des « cages » de restriction pendant 1 heure environ (30-45 min acclimatation pour que l’animal se calme et test de douleur pendant 15 min). Ce test comportemental sera réalisé avant l’induction de la pathologie et à différents temps après l’induction de la pathologie.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ces modèles miment des pathologies prostatiques humaines, les animaux pourront ressentir les mêmes symptômes tels que des troubles urinaires, une douleur pelvienne. De plus, une chirurgie peut toujours entraîner une gêne post-opératoire lors de la cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet car des tissus seront collectés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique réellement efficace pour le traitement des pathologies prostatiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience sur ces modèles et les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes et des tests pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes). Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) notamment pour le suivi mictionnel via l’utilisation de cages à métabolisme. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, morceau de bois…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Un antalgique sera administré pour diminuer la douleur des chirurgies. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Nous essayons d’utiliser des méthodes non invasives (test de comportement, cages métaboliques) et d’acclimater les animaux avant l’expérimentation aux différentes installations afin de limiter au maximum le stress des animaux. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Les différents modèles sont bien décrits chez le rat dans la littérature et permettent de mimer les 2 pathologies prostatiques non cancéreuses les plus diagnostiquées et impliquant des troubles urinaires et/ou douleurs engendrant une diminution non négligeable de la qualité de vie des patients. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

Quarante-deux jours d'administration quotidienne par gavage ou par injection, et une colite entretenue par un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des cycles de cinq jours espacés de neuf : 1 200 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le produit altère le côlon, provoque des diarrhées et une perte de poids d'environ 10 % malgré une alimentation normale. La molécule testée a déjà passé un essai de phase 2 chez des patients atteints de rectocolite hémorragique et se trouve en phase 3, et il s'agit ici de tester son association avec d'autres composés en vue d'une autorisation de mise sur le marché. Le porteur retient des souris de neuf semaines, âge qu'il décrit comme optimal pour une colite ni trop importante ni trop mineure.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (rectocolite hémorragique et maladie de Crohn) touchent plus de 0,3% de la population mondiale et sont de plus en plus fréquentes avec l'industrialisation des pays. Les traitements existants ne sont parfois pas efficaces ou non-suffisamment efficaces avec une très grande variabilité au sein des malades. Ainsi, la proposition de nouvelles thérapies est nécessaire. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2 et est actuellement évaluée dans un essai de phase 3. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, nous voulons étudier la possibilité de l’associer avec d’autres composés déjà sur le marché ou en développement, pour améliorer la réponse des patients au traitements.

Bénéfices attendus

La démonstration de l’intérêt d’une association de notre molécule avec d’autres thérapies existantes, permettra d’offrir de nouvelles possibilités aux malades qui ne répondent pas aux traitements actuels des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Procédures

Les animaux seront exposés à l'ingestion d'un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des périodes de 5 jours entrecoupées de 9 jours. Ils recevront un traitement par voie orale ou par injection (intrapéritonéale ou intraveineuse) de façon quotidienne sur une durée de 42 jours maximum. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte faible en environ 10 secondes. Une prise de sang sera réalisée à la fin du protocole afin d'analyser différents paramètres biologiques. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et est réalisée en maximum 30 secondes. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de l’administration d’un composé chimique qui mime une inflammation du colon chez l’homme. Ce produit chimique induit une altération du colon provoquant une inflammation suivie par une perte de poids de l’ordre de 10% chez les souris, malgré une alimentation et une hydratation normale, et des diarrhées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Nous voulons étudier le traitement d’une inflammation du colon et pour cela seule l’utilisation d’un modèle murin est adaptée car il permet d’étudier les effets sur un organisme vivant dans son intégralité étant donné que ce traitement a vocation d’être ensuite utilisé chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats solides garantis par des analyses statistiques. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats précédemment obtenus dans un modèle d’inflammation murine du colon et les données recueillies dans la littérature.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera régulièrement avec une évaluation du stress et de la douleur grâce à l'utilisation d'une grille de score, permettant d'évaluer l'atteinte des points limites. L'administration répétée des composés par voie orale ou injection sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide, ceci afin de limiter le stress de l'animal. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux. Lors des périodes de récupération des animaux, de la pâtée alimentaire sera également distribuée dans les cages pour favoriser leur hydratation.

Choix des espèces

Le modèle murin d’inflammation du colon est très documenté et permet de reproduire les symptômes et les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique chez l'homme. C’est un modèle très utilisé car sa mise en place est rapide et non invasive (ajout d’un composé chimique dans l’eau de boisson) tout en offrant une bonne reproductibilité des résultats, évitant ainsi la répétition des études et limitant l’utilisation d’animaux. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets des composés thérapeutiques.

Toutes tuées pour analyser l'infiltration inflammatoire de leur muscle cardiaque, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 45 reçoivent des cellules tumorales implantées dans le pancréas au cours d'une intervention de vingt minutes, 45 autres des cellules de tumeur pulmonaire sous la peau du flanc, et 60 portent quinze jours une mini-pompe osmotique sous-cutanée qui diffuse l'hormone testée. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale gêne les déplacements dans les derniers stades et réduit la prise alimentaire. Il justifie le recours à la souris par sa reproduction rapide et son nombre de naissances, et fixe les effectifs sur une bibliographie qui, écrit-il, suggère dix à quinze souris par procédure.

Objectifs

L'obestatine est une petite hormone produite principalement dans le tube digestif et distribuée dans divers organes et tissus. Cette hormone a des effets très bénéfiques sur le muscle squelettique, dont elle favorise la régénération. Cependant, le rôle de cette hormone dans le tissu musculaire cardiaque pathologique demeure peu clair de nos jours. Par conséquent, l'objectif principal de la présente étude est d'explorer la capacité de l'hormone en tant que traitement possible de la pathologie cardiaque associée à la perte musculaire consécutive au cancer. L'atrophie et la fonte musculaire sont des complications extrêmement graves du cancer et constituent la principale cause de décès chez de nombreux patients. L'atrophie et le dysfonctionnement du muscle cardiaque sont communs à pratiquement tous les types de tumeurs, réduisant la qualité de vie des patients. Au cours des dernières décennies, la réponse immunitaire s'est imposée comme une composante majeure de la pathologie cardiovasculaire et du muscle cardiaque. Pour cette raison, il nous semble intéressant de réaliser cette étude dans laquelle nous établirons : - Le profil des cellules inflammatoires qui atteignent le cœur en présence de différentes tumeurs. - Le rôle de l'hormone sur ces populations inflammatoires atteignant le cœur.

Bénéfices attendus

- Identification de nouvelles voies thérapeutiques ou de traitements liés aux cellules inflammatoires infiltrant le cœur. - Établissement de la petite hormone obestatine comme agent thérapeutique anti-inflammatoire potentiel.

Procédures

Au cours du développement de ce projet, les souris seront soumises à 4 interventions différentes : 1.- Echographie du cœur: Cette intervention sera réalisée sur toutes les souris du projet. L'acquisition a une durée de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette ntervention. 2.- Anesthésie : une anesthésie sera pratiquée pendant les échographies, pendant l'implantation des cellules tumorales et lors de la pose de mini-pompes osmotiques. La durée de l'anesthésie pendant l'échographie sera de 10 minutes. La durée de l'anesthésie pendant l'implantation des cellules tumorales sera de 20 minutes (pancréas) et 5 min (sous-cutanée). La durée de l'anesthésie pendant la pose de mini-pompes osmotiques sera de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette intervention. 3.- Induction de tumeur pancréatique: Des cellules tumorales pancréatiques seront implantées dans le pancréas sain de souris. Le développement de la tumeur dure trois semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 20 minutes 4.- Induction tumorale sous-cutanée: Des cellules tumorales du pulmon seront implantées sur le flanc de la souris. Le développement de la tumeur dure quatre semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 5 minutes 5.- Pose de mini-pompes osmotiques sous cutanées et infusion continue de l’hormone: les mini-pompes resteront implantées pendant 15 jours. A effectuer sur 60 souris. Intervention d'une durée de 10 minutes

Impact sur les animaux

- L'utilisation de l'anesthésie pour procéder à l'immobilisation de l'animal peut entraîner une baisse de la température de l'animal. - L'implantation de cellules tumorales dans le pancréas expose les animaux à un risque de blessure et peut provoquer une douleur modérée au niveau de l'incision. Les souris peuvent avoir une mobilité réduite. L'implantation de cellules tumorales sous-cutanées implique une petite piqûre, sans irritation observable. Les animaux peuvent simplement présenter des symptômes de stress. - Le développement de la tumeur dans les deux modèles peut entraîner une gêne pour les animaux, en particulier en ce qui concerne la mobilité dans les derniers stades du développement de la tumeur. Dans les deux modèles, les souris peuvent présenter une réduction de l'ingestion. - La mise en place de mini-pompes expose les animaux à un risque de blessure et stress.

Devenir

A l'issue de chacune des procédure les animaux seront mis à mort afin que l'infiltration inflammatoire du muscle cardiaque puisse être analysée.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux pour l'étude des pathologies est standardisée et largement utilisée. Cette étude serait irréalisable chez l'homme, et bien qu'il existe des modèles animaux peut-être plus proches de l'homme, des éléments tels que leur acceptation par la communauté scientifique, leur coût/bénéfice, et leur disponibilité (stabulation, protocoles expérimentaux, nombre d'animaux, etc.), explique l’utilisation de modèles murins, adaptés à ce type d'étude. Les modèles in vivo sont une étape essentielle dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des complications cardiaques. Il n'existe actuellement aucun modèle cellulaire ni aucune approche computationnelle permettant de visualiser le problème de l'acquexia.

Réduction

La bibliographie examinée suggère l'utilisation d'un nombre compris entre 10 et 15 souris pour les procedures signalées ci-avant. Ce nombre est décrit comme le plus approprié pour obtenir des données fiables et une analyse statistique robuste. On essaiera d'obtenir le maximum d'informations à partir d'un seul animal afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cages avec un maximum de 5 animaux par cage. L'air, l'humidité et la température doivent être contrôlés dans l'animalerie. Les animaux doivent avoir accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de réduire les comportements nuisibles ou anormaux, les animaux doivent bénéficier de techniques d'enrichissement appropriées. Toutes ces techniques d'enrichissement permettent aux animaux de développer des capacités d'adaptation telles que la recherche de nourriture, la manipulation et les activités d'exploration. La surveillance des animaux s'effectue selon une grille de score de points limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. Grâce à ces modèles de souris, nous pouvons obtenir très rapidement des résultats pour la recherche, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce dont la reproduction serait beaucoup plus longue et dont le nombre de naissances serait beaucoup plus faible. Les animaux adultes ont été choisis pour le projet car ils ont une réponse inflammatoire suffisamment élevée pour être surveillée.