Rongeurs

Ouverture de la cavité abdominale, implantation de cellules tumorales dans le pancréas ou le cæcum, ablation de la rate pour le modèle de métastases hépatiques, fermeture : trente minutes par souris. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite transférées dans un second établissement, reçoivent une injection tous les sept jours sous anesthésie, passent une imagerie hebdomadaire, puis subissent une seconde ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de la tumeur guidée par fluorescence, soit deux laparotomies par animal. Toutes sont tuées et autopsiées pour vérifier l'absence de reprise tumorale, au terme d'une démonstration que le porteur juge impossible autrement que sur des animaux porteurs de ces tumeurs.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. Ces travaux sont en cours de réalisation dans des souris qui sont déficientes en système immunitaire et permettent de greffer des cellules cancéreuses d’origine humaine. Pour mimer encore plus ce que nous pouvons retrouver chez l’homme, nous utiliserons dans ce projet des souris présentant un système immunitaire pour vérifier que les résultats retrouvés seront similaires à ceux obtenus dans les souris immunodéficientes. Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques, chez la souris immunocompétentes, mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou le caecum, ou d’enlever la rate. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant chez des animaux pourvus d’un système immunitaire fonctionnel. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée, mais également dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire (en cours).

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines. Ces souris sont largement utilisées pour l’implantation de cellules cancéreuses murines en sous-cutanée mais également dans les organes d’origine. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Un trou percé au dremel dentaire dans le tibia, un implant de titane posé au contact, une solution bactérienne inoculée dans la plaie : 29 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'opération dure dix minutes sous anesthésie fixe, et l'infection osseuse qui suit, une ostéomyélite localisée, fait partie des effets recherchés. Le porteur veut savoir si des bactériophages, seuls ou associés à la vancomycine, viennent à bout d'un staphylocoque résistant à la méticilline, et il précise que cinq des 29 rats sont utilisés uniquement pour que l'opérateur s'entraîne au geste. Le rat a été retenu parce que son tibia est plus gros que celui de la souris, "trop petite" pour que l'implant tienne.

Objectifs

Les infections ostéoarticulaires (ou ostéite) sont des infections qui touchent les os et/ou les articulations. Ce sont des pathologies graves susceptibles d’entraîner un handicap très lourd et parfois de mettre en jeu le pronostic vital. Elles peuvent survenir chez les patients porteurs de prothèse articulaire ou de matériel (clou, plaque, vis…) mais aussi à la suite de traumatismes (fractures ouvertes sans matériel), engendrant des ostéites chroniques. Actuellement, les infections ostéoarticulaires sont le plus souvent dues à des staphylocoques, avec une prédominance des Staphylocoques à coagulase négative et sont traitées par antibiothérapie. Cependant, l’antibiothérapie classique a montré ses limites pour diverses raisons : résistance des souches bactériennes, mauvaise diffusion des antibiotiques dans le tissu osseux, présence de matériel étranger (ex : prothèse) favorisant la formation de biofilm bactérien (lequel protège la bactérie de l’action des antibiotiques). Dans ce contexte, il est donc aujourd’hui nécessaire de trouver des solutions alternatives et/ou complémentaires aux antibiotiques, efficaces pour traiter ces infections. La phagothérapie (usage de bactériophages) apparait aujourd’hui comme une solution pertinente. Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries, d’être inoffensifs pour tous les organismes eucaryotes tels que les mammifères (humains, animaux) et d’être très spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Ils sont déjà largement utilisés chez l’homme en Europe de l’Est mais, s’agissant d’organismes vivants, leur développement en France se heurte à un cadre réglementaire peu clair et inadapté à la phagothérapie dans la conduite d’essais cliniques. De ce fait, les agences règlementaires demandent la réalisation d’études pré-cliniques préalables. Ce projet se déroulera de façon séquentielle et la première étape se divisera elle-même en deux parties : 1. Entrainement de la pose d’implant dans le tibia du rat non infecté. 2. Mise au point du modèle d’ostéite à Staphylococcus epidermidis résistant à la méticilline chez le rat avec matériel étranger ;

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement thérapeutique dans le traitement des infections ostéoarticulaires. L’efficacité de ce traitement permettra d’étendre le champ des possibilités dans la guérison de ces infections pouvant conduire à l’amputation de certains patients suite à l’échec de l’antibiothérapie seule.

Procédures

- Les rats recevront une injection intrapéritonéale (5 secondes) d’un mélange anesthésique. - Un acte chirugical de 10 min subit par l’animal sous anesthésie fixe : Une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué de façon à pouvoir placé l’implant dans un premier temps puis inoculé la solution bactérienne. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur. La phase pilote consistera à calibrer les différentes conditions expérimentales permettant d’induire une infection ostéoarticulaire avec un matériel étranger dans le tibia du rat. La première nuisance sera liée à l’administration du mélange d’anesthésiques. La deuxième nuisance principale est due à la chirurgie en elle-même. Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. Sous anesthésie fixe, une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué à l’aide d’un dremel dentaire de façon à pouvoir placé l’implant en titane. Dans un même temps, l’infection bactérienne sera effectuée au contact de l’implant. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie. Une troisième nuisance également attendue est le développement de l’infection, une ostéomyélite localisée.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (29))afin de récupérer les tibias et implants pour dénombrement bactériens.

Remplacement

Une étude a été réalisée in vitro sur l’efficacité de ce bactériophage sur un grand nombre de souches de S. epidermidis ainsi que dans des modèles de biofilm. Toutefois, l’efficacité de tels composés in vivo peut s’avérer très différente de celle obtenue in vitro tant sur le plan de l’efficacité elle-même que sur la cinétique des phages dans un organisme vivant au niveau du site de l’infection. Également, l’infection ostéoarticulaire est particulière dans le sens où toutes les conditions qui la caractérisent ne peuvent être rassemblées dans un modèle vitro. Enfin, les modèles pré-cliniques sont règlementaires pour le développement de ces nouvelles alternatives thérapeutiques, au vu du peu d’informations existantes sur ce sujet.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Nos expériences passées nous permettent de tester qu’un seul inoculum pour la mise en place de l’infection ostéoarticulaire. 6 animaux par jour d’autopsie (J7, J12, J21, J28) seront nécessaires pour évaluer la charge bactérienne au cours du temps. De plus, pour la phase d’entrainement, seuls 5 animaux seront utilisés pour l’appréhension du geste technique de la pose d’implant dans le tibia du rat.

Raffinement

Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de l’implant au niveau articulaire sera réalisée sous anesthésie fixe. De plus, une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée. Le suivi post-chirurgical d’une récupération de la mobilité de l’animal sera mis en place. Durant toute l’étude, La nourriture sera placée directement à l’intérieur des cages et des biberons au bec plus long seront également installés afin de faciliter l’accès aux animaux. La litière sera également changée tous les deux jours Le suivi du poids sera effectué tous les deux jours. Enfin, un programme d’enrichissement de l’environnement (igloo, jouet …) sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal préférentiellement utilisé dans la littérature dans ce type d’expérimentation est le rat. En effet, la taille du tibia chez le rat permet un meilleur accès et une meilleure prise d’infection et d’implantation que chez la souris trop petite. Le tibia du rat permet une implantation plus stable et reproductible. Des rats mâles de 250 g seront nécessaires pour la phase pilote.

Vingt rats subissent l'ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes sous anesthésie, dix un simulacre d'opération, puis tous sont transportés trois heures par la route jusqu'au site d'expérimentation. 30 rats vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent l'implantation d'une minipompe sous la peau, cinq séjours de deux jours en cage à métabolisme, quinze injections dans l'abdomen et cinq ponctions de la veine de la queue, pour savoir si des excès de calcium répétés abîment le rein. Le porteur énumère lui-même les atteintes attendues, douleur opératoire, hémorragie, infection de plaie, hypocalcémie, insuffisance thyroïdienne, angoisse en cage à métabolisme et douleur à chaque piqûre.

Objectifs

L’hypoparathyroïdie est une maladie endocrine rare et complexe, caractérisée par une concentration basse ou indétectable d’hormone parathyroïdienne (PTH) entrainant une hypocalcémie et une hyperphosphatémie lorsqu’elle n’est pas traitée. Le traitement conventionnel est une association de métabolite de la vitamine D et de sels de calcium. Un effet secondaire habituel de ce traitement est une hypercalciurie ainsi que des épisodes d’hypercalcémie. Les 2 sont dus à une augmentation de l’absorption intestinale de calcium et à une diminution de la réabsorption tubulaire rénale de calcium, due à l’absence de PTH. L’hypoparathyroïdie et/ou le traitement conventionnel sont associés à une augmentation de la morbidité rénale, sous forme d’une lithiase rénale et/ou d’un néphrocalcinose et/ou d’une insuffisance rénale. Selon les séries, la prévalence de l’insuffisance rénale s’étend de 14 à 41 pour cent, dans tous les cas beaucoup plus élevée que dans la population générale. Epidémiologiquement, le risque d’insuffisance rénale est associé au nombre d’évènements hypercalcémiques et à la durée de la maladie. L'objectif du projet est de déterminer expérimentalement s'il existe un lien de causalité entre la survenue d'épisodes répétés d'hypercalcémie et la survenue d'une insuffisance rénale, et, si oui, d'en déterminer le mécanisme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif principal de déterminer l'éventuel lien de causalité entre épisodes répétés d'hypercalcémie, induite par un surdosage thérapeutique (fréquent en médecine humaine) et la survenue d'une dégradation de la fonction renale, une des principales morbidités observées au cours du suivi des patient.es avec hypoparathyroïdie. La démonstration du lien de causalité aurait 2 conséquences -

Procédures

Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (ou un simulacre) est réalisée, sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes, 1 fois). Les animaux sont transporté du site d'élevage (où a lieu la chirurgie) au site d'expérimentation, par transport routier agréé (3 heures, 1 fois). Un traitement par hormone thyroïdienne dans l'eau de boisson est apporté aux animaux ayant subi une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes pendant 71 jours. Une minipompe sous cutanée est implantée sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes, 1 fois). Les animaux subissent une acclimatation à l'hébergement en cage à métabolisme pour habituation (animal vigile, 3 jours, 1 fois). Dix animaux reçoivent un régime riche en calcium (animal vigile, 3 jours, 5 fois). Les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne (animal vigile (1 minute par injection), 3 jours de suite, 5 fois). Les animaux sont hébergés en cage à métabolisme pour recueil d’urine (animal vigile, 2 jours, 5 fois). Un prélèvement sanguin par ponction de la veine de la queue est réalisé chez les animaux (animal vigile, 1 minute, 5 fois); le volume prélevé est conforme aux recommandations. Une euthanasie est pratiquée chez les animaux sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire (10 minutes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissent une chirurgie cervicale : il s’agit d’une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (thyroparathyroïdectomie) chez 20 d’entre eux et d’un simulacre chez 10 d’entre eux. La plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort, la thyroparathyroïdectomie cause une hypocalcémie et une insuffisance thyroïdienne. La chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont transportés du site de l’éleveur au site d’expérimentation par transport routier, ce qui peut induire un stress. Les animaux de tous les groupes subissent une chirurgie sous anesthésie pour implantation de la pompe sous-cutanée : la plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort. Par ailleurs, la chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont hébergés périodiquement en cage à métabolisme : cet hébergement peut être à l’origine d’une perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, d’angoisse et d’intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme. Des injections intrapéritonéales de calcitriol ou de placebo, et d’anesthésiques sont réalisées chez les animaux, causant une douleur au point d'injection. Des ponctions veineuses sont réalisées de manière itérative chez tous les animaux : ces ponctions causent une douleur et peuvent causer une hémorragie.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus pour analyse moléculaires (ARNm et protéines)

Remplacement

La complexité des mécanismes contrôlant la valeur de calcium dans le sang et la fonction rénale est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences des épisodes d'hypercalcémie sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.

Réduction

Trente (30) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.

Raffinement

Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. L’anesthésie est encadrée par une analgésie lors de l’implantation des pompes ; après la chirurgie, l’analgésie est maintenue systématiquement pendant 48 heures. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Lorsqu'un hébergement en cage à métabolisme est nécessaire, les animaux sont préalablement acclimatés à cet environnement, et la durée d'hébergement est réduite au strict nécessaire. Des soins peuvent être mis en place en fonction des signes de souffrance observées (soins médicamenteux, raffinement des conditions d’hébergements, et des techniques de chirurgie etc…). Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande

Choix des espèces

L'espèce étudiée est le rat chez qui l’homéostasie du calcium est proche de celle de l’humain et chez qui la thyroparathyroïdectomie est techniquement réalisable. La stade de développement est celui du jeune adulte, ce qui correspond à l’âge auquel sont souvent réalisées les thyroparathyroïdectomies chez l’humain.

246 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de mélanome puis un gavage quotidien pendant quinze à vingt semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur tumeur est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et une partie d'entre elles reçoit en plus une injection tous les deux à quatre jours. Le porteur indique que le gavage quotidien peut irriter le larynx et gêner la déglutition, et que la tumeur peut finir par empêcher l'animal de se déplacer, de s'alimenter et de s'hydrater. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme d'une étude qui vise à confirmer chez la souris un résultat déjà obtenu en culture cellulaire.

Objectifs

Les mélanomes avec mutations activatrices d’un gène particulier peuvent être traités par des thérapies ciblées entrainant une rémission rapide chez 65-70% des patients. Cependant, la majorité des cas développent des résistances au traitement, parfois au bout d’un an seulement. Certaines cellules de la tumeur,, appelées « cellules persistantes », auraient un rôle essentiel dans le développement de ces résistances. Les « cellules persistantes » sont en effet capables de survivre aux thérapies ciblées en engageant des changements qui leur permettent de s'adapter au traitement. Or, ces cellules constituent un réel problème clinique car elles peuvent évoluer en cellules qui résistent de façon permanente à la thérapie. Cette évolution vers des cellules résistantes implique l'introduction d'erreurs dans l'ADN, appelées mutations, qui leur permettent de proliférer et de survivre malgré le traitement. Une étude a mis en évidence que, pour survivre à la thérapie ciblée, les cellules persistantes de mélanome modifient le processus qui permet aux cellules de fabriquer des protéines à partir d'une copie de l'ADN, appelée ARN messager. En effet, lors de thérapie ciblée, il y a une augmentation de la production de certaines protéines, dont l’une d’elles peut potentiellement favoriser l’introduction des erreurs dans la séquence de l'ADN. Afin d'offrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour surmonter cette résistance chez les patients atteints de mélanome, ce projet a pour objectif de démontrer que l'inhibition de la production de cette protéine peut supprimer, ou au moins retarder, la résistance aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Environ 50 % des mélanomes présentent une mutation activatrice d’un oncogène (gène dont l’expression favorise la survenue de cancers) particulier. L'inhibition, par thérapie ciblée, de la protéine issue de cet oncogène, permet d'obtenir des réponses thérapeutiques efficaces. Cependant, ces réponses sont souvent limitées dans le temps et la moitié des patients rechutent après 12 à 15 mois. La compréhension des mécanismes à la base de cette résistance est nécessaire, et l'identification du déterminant moléculaire de cette résistance peut offrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer le pronostic des patients. Les expériences in vitro dans les cellules de mélanome traitées par thérapie ciblée montrent un rôle de notre protéine clé dans l'augmentation de l'instabilité génétique, qui est la cause principale de la résistance aux thérapies. Ce projet a donc pour objectif de confirmer l’implication de notre protéine clé dans cette résistance dans un contexte in vivo. De plus, nos expériences in vitro ont permis d’identifier une molécule_actuellement utilisée dans des essais cliniques pour le traitement d'autres types de cancer_ qui peut empêcher les mutations lors de la réparation des dommages à l’ADN et donc limiter la résistance thérapeutique aux thérapies ciblées. Nous devons confirmer ces résultats dans un contexte in vivo. L'objectif à long terme est d'apporter des bénéfices aux patients atteints de mélanome en améliorant le taux de survie des patients .

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience- durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines-durée du geste inf à 10sec)). Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour par gavage. Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois tous les 2 jours pendant 22 jours avec un second traitement (administration des traitements par injection aux animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Enfin, dans une troisième procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront aussi traités à raison d’une fois tous les quatre jours pendant 3 semaines (administration des traitements par injection i sur animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Pour tous ces animaux, la croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine sur animal vigile à l’aide d’un pied à coulisse (durée du geste inf à 15 sec).

Impact sur les animaux

La greffe sous-cutanée de cellules tumorales peut amener une gêne qui peut s’amplifier avec le développement de la tumeur, pouvant aller jusqu’à une modification de l’état physiologique de l’animal (manque de toilettage, prostration, difficulté à se déplacer, s’alimenter et à s’hydrater). Ces effets ne sont attendus qu’en fin d’expérience. Le gavage quotidien peut amener une irritation du larynx pouvant amener des difficultés à s’alimenter, à déglutir. L’injection des médicaments peut entrainer une gêne liée à la piqûre elle-même juste après l’injection.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortem d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vitro utilisant différentes lignées cellulaires de mélanome a permis de déterminer l'implication du processus de production de notre protéine d’intérêt dans la résistance acquise du mélanome à la thérapie ciblée. De plus, nos résultats obtenus in vitro ont montré que l'inhibition de ce processus peut limiter la résistance acquise. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. De plus, Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro suffisamment robuste pour tester des synergies thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d'outils statistiques.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. De plus, un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place de la procédure expérimentale pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la procédure , qui est raffinée par l’établissement de points limites précoces, entrainant et la mise en place de soins (supplément alimentaire, administration de solutés) voire la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de points limites. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. La souris est le modèle de choix pour les études de cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la production de souris immunodéficientes nous permet de travailler sur des modèles cellulaires d’origine humaine. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et ciblée par les éventuels traitements.

Une nécrose humide, creuse ou douloureuse à la palpation sur la tumeur d'une souris déclenche sa mise à mort, comme une tumeur qui atteint la taille limite. 2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales, puis jusqu'à trois semaines d'injections combinant chimiothérapie, immunothérapie et molécules ciblant les récepteurs TLR, avec un épisode fébrile possible. Le porteur cherche à retirer la chimiothérapie de ces combinaisons et écrit que l'avantage pour le bien-être des patients "serait alors énorme", à un stade où les résultats restent à établir chez la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à démontrer l’intérêt d’utiliser des agents qui ciblent des récepteurs de l’immunité (TLR) afin d’induire l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs, et ainsi favoriser les réponses aux thérapies anti-cancéreuses. Il est déjà connu que les agents ciblant les TLRs peuvent induire le recrutement de cellules immunitaires dans les tumeurs et ainsi favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale. Certains agents ciblant ces TLR sont actuellement utilisés en clinique dans le traitement des cancers. Ces agents sont utilisés individuellement et associés à d’autres thérapies conventionnelles comme les chimiothérapies (drogues anti-cancéreuses) ou les immunothérapies (agents stimulant la réponse immunitaire). Dans ce projet, nous nous proposons d’utiliser ces agents ciblant les TLRs en association et de tester leur capacité à augmenter l’efficacité anti-tumorale des immunothérapies sans l’ajout de chimiothérapies qui sont connues pour induire des effets secondaires.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques pour les patients atteints de cancer. L’association des agents ciblant les TLRs devrait permettre le recrutement d’un fort infiltrat immunitaire qui après stimulation pourra éliminer efficacement les tumeurs. L’étude de la composition de l’infiltrat immunitaire permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans l’élimination des tumeurs, ce qui est cruciale pour le développement et l’optimisation des thérapies anti-cancéreuses chez les patients. De plus, nous nous attendons à ce que l’association des deux ligands de TLR avec l’immunothérapie induise une efficacité anti-tumorale bien supérieure à celle pouvant être obtenue avec l’association des chimiothérapies à l’immunothérapie. L’avantage en terme de bien être des patients serait alors énorme.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (30 secondes) de chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes) d’immunothérapies au maximum 2 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes à 1 minute) de molécules ciblant les TLRs, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections intra-péritonéales et intraveineuses répétées pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies et immunothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Les agents ciblant les TLRs sont également utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. L’injection des agents ciblant les TLRs membranaires pourrait induire un léger épisode fébrile.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro mais la capacité de nos associations d’agents ciblant les TLRs à pouvoir induire le recrutement des cellules immunitaires dans la tumeur et ainsi à promouvoir l’efficacité anti-tumorale des thérapies conventionnelles ne peut être démontrée que dans un organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique. L’analyse de l’infiltrat immunitaire sera réalisée sur 8 groupes uniquement, ceux associés aux immunothérapies ne seront pas ajoutés, leurs rôles étant déjà connus. La mise en évidence de l’importance du système immunitaire dans l’efficacité des associations thérapeutiques ne sera étudié que dans les 3 modèles où nous aurons déterminé les meilleures efficacités thérapeutiques et avec les 6 groupes les plus représentatifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les souris immunodéficientes seront hébergées sous couvercle filtrant pour éviter les risques d’infection. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids, des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection du composé ciblant les récepteurs, les souris recevront 1 injection d’un analgésique toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Dans un premier temps, nous utiliserons des souris immunocompétentes permettant l’implantation de cellules cancéreuses murines syngéniques. Afin de déterminer l’implication du système immunitaire dans l’effet anti-tumoral de nos combinaisons thérapeutiques, nous utiliserons alors des souris immunodéficientes. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Sous anesthésie, des souris sont brûlées ou privées d'un fragment de peau pour créer une plaie, puis anesthésiées à nouveau tous les trois jours et demi pour recevoir crème ou pansement, mesurer la plaie et en prélever l'exsudat, avec trois prises de sang en deux semaines. 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposées selon le porteur à la douleur de l'inflammation, et possiblement à la déshydratation, à l'anémie et aux hématomes. Il parle de "génération des plaies" et d'"application de plaies", la brûlure n'apparaissant qu'une fois, entre parenthèses. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes, dans l'espoir de montrer que les actifs de l'équipe cicatrisent mieux que le Bepanthen.

Objectifs

Le but de la cicatrisation des plaies à la suite d’une blessure est de former un tissu régénéré dont la fonctionnalité et l’aspect visuel sont aussi proches que possible de la peau d’origine. La cicatrisation des plaies, en tant que processus biologique normal dans le corps humain, est obtenue par le biais de quatre phases précisément et hautement programmées. Pour qu’une plaie guérisse avec succès, les quatre phases doivent se dérouler dans le bon ordre et dans le bon délai. De nombreux facteurs peuvent interférer avec une ou plusieurs phases de ce processus, provoquant ainsi une altération de la cicatrisation des plaies. Pour remédier à l’altération du processus de cicatrisation, des dispositifs médicaux tels que l’application de crèmes cicatrisantes ou de pansements ont été développés. Ces dispositifs accélèrent la cicatrisation, soulagent la douleur induite par l’inflammation, aident à prévenir les infections et améliorent la régénération tissulaire. L’objectif de notre projet est de montrer l’efficacité accrue de nouveau composés, utilisable sous forme de crème ou en association avec un pansement, sur la cicatrisation cutanée suite à des blessures.

Bénéfices attendus

Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité de nos actifs cicatrisants par rapport au contrôle positif (Bepanthen) largement utilisé pour améliorer la cicatrisation.

Procédures

Interventions sur animaux : 1) Génération des plaies : Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. Une chirurgie de 10 minutes pour chaque souris. 2) Administration des dispositifs médicaux : Sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. 4 fois car l’expérimentation dure 14 jours (Tous les 3,5 jours). Durée de l’administration des dispositifs médicaux, 10 minutes pour chaque souris. 3) Mesures des dimensions et de la température des plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie, en même temps que l’application des dispositifs médicaux. Durée 2 minutes pour chaque souris. 4) Prélèvements des exsudats de plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie. Durée 3 minutes pour chaque souris. 5) Prélèvements sanguins (Tous les 7 jours) : 3 fois, durée 2 min, pour chaque souris sous anesthésie générale. Toutes les souris (120) du projet sont concernés par cette procédure.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de l’application de plaies est la douleur induite par l’inflammation. Ces plaies pourraient aussi induire une déshydratation des animaux. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances telles que l'anémie, l’apparition d’hématomes et une déshydratation des souris.

Devenir

À la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leurs organes à des fins d'analyses d'immunohistochimie, de biochimie et de biologie moléculaire. Ces analyses approfondies sont essentielles pour élucider les mécanismes thérapeutiques de nos agents cicatrisants.

Remplacement

L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’actifs cicatrisants au niveau systémique. Actuellement, aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Après l’intervention chirurgicale, des mesures seront prises pour éviter un isolement complet, telles que l'utilisation d'adhésifs pour protéger les plaies et maintenir les animaux en groupe. L'anesthésie et l'analgésie seront systématiquement administrées lors de la génération des plaies et tout au long de l'expérimentation. Nous accordons une attention particulière à la gestion de l'inflammation induite par les plaies. En cas de dépassement des critères définis, comme par exemple une perte de poids dépassant 10-15% de leur poids initial, des mesures seront prises pour restaurer leur santé et pour éviter toute souffrance inutile. Pour atténuer l'angoisse des animaux qui seraient isolés en post-opératoire, nous enrichirons leur environnement en leur fournissant davantage de coton, d'igloos et de roues d'exercice, et nous les nourrirons avec une gelée alimentaire enrichie en nutriments. Cette alimentation spécifique sera également distribuée après chaque prise de sang. Un suivi attentif des animaux sera effectué en conformité avec les recommandations du comité de suivi du bien-être animal de notre établissement.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de l’efficacité thérapeutique des produits que nous avons développés. Ce projet a pour but de démontrer que des actifs cicatrisants sont efficaces dans deux modèles de cicatrisation (Excision/Brûlure). Les rongeurs, et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines, ainsi des modèles de cicatrisation utilisant des souris ont été développés. Ces modèles induisent une plaie sur la peau de l’animal. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques des processus de cicatrisation observable chez l’humain (Inflammation, synthèse d’exsudats, ré-épithélialisation des lésions cutanées, etc…). Les animaux seront utilisés à l'âge adulte car nos actifs cicatrisants seront prescrits chez l'adulte et que ce stade de développement est plus stable d'un point de vue physiologique.

Soumis à une chirurgie du cerveau de 45 à 90 minutes, puis à des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines et à des tests comportementaux d'une heure par jour pendant neuf semaines, 612 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neurotoxine leur est injectée pour reproduire une maladie neurodégénérative, et certains auront besoin d'une alimentation enrichie pour continuer à se nourrir. Tous sont tués à l'issue pour que leur cerveau soit observé au microscope et que l'activité de leurs neurones soit enregistrée sur des tranches, dans un projet portant sur les troubles de l'humeur associés à la maladie de Parkinson. Le porteur qualifie les nuisances des tests comportementaux de "très modérées" et ses gestes chirurgicaux de "très bien maîtrisés", sans nommer aucun des tests qu'il fait subir aux rats pendant ces neuf semaines.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser l’implication d’une communication neuronale entre deux structures cérébrales chez le rat dans les effets délétères sur l’humeur d’une maladie neurodégénérative et de l’un de ses traitements. Ce projet met en œuvre des approches de biologie moléculaire, des approches électrophysiologique et des approches comportementales chez des animaux sains et des animaux malades

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir une compréhension de certains troubles de l’humeur dans une maladie neurodégénérative. Ce projet conduira à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à ces troubles suite, ou non, a un traitement. L’identification des circuits impliqués dans ces troubles permettra ensuite d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Intervention numéro 1: Une chirurgie cérébrale d'une durée de 45 minutes. Un enregistrement électrophysiologique in vivo sous anesthésie. Intervention numéro 2: chirurgie cérébrale d'une durée de 45 minutes. Des injections quotidiennes (1 par jour, quelques secondes) dans l'abdomen pendant 2 semaines. Des tests comportementaux d'1h par jour environ pendant 9 semaines au total. Intervention numéro 3: chirurgie cérébrale d'une durée de 60 minutes. Intervention numéro 4: chirurgie cérébrale d'une durée de 90 minutes). Des injections quotidiennes intrapéritonéales pendant 2 semaines (1 par jour, quelques secondes). Des tests comportementaux d'1h par jour environ pendant 9 semaines au total.

Impact sur les animaux

Suite à la mise en place de la pathologie neurodégénérative, certains animaux nécessiteront une assistance particulière avec supplémentation en nourriture riche. Les injections dans l'abdomen, individuellement très bien tolérées et peu douloureuses, pourraient par leur répétition entraîner une souffrance légère et des hématomes bénins. Les approches comportementales induiront des nuisances très modérés (stress) en cas de contention temporaire. Les procédures chirurgicales et suites opératoires peuvent induire des nuisances modérés comme une perte de poid légère et passagère, mais ces approches sont très bien maitrisées au sein de l'équipe. Enfin, l'isolement de certains groupes d'animaux peut être lié à un stress modéré de l'animal.

Devenir

L'ensemble des animaux sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour les analyser au microscope et enregistrer l’activité des neurones sur des tranches de cerveau.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront à,la fois l’évaluation comportementale et électrophysiologique. De plus, de telles expérimentations chez l'homme sont impossibles

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables, en se basant sur des procédures similaires réalisées auparavant. L’utilisation des outils statistiques appropriés nous permettra également de gagner en puissance statistique et donc de réduire le nombre d'animaux nécessaire. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des expérimentations se feront sur des cohortes distinctes plus petites. Ainsi, à l’issue de la première session, si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives des différents paramètres étudiés, il ne sera pas nécessaire de faire appel à une seconde session.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée et ils seront manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations afin d’atténuer le stress lié à l'isolement relatif et aux manipulations. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi et les pesées quotidiennes des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et de points limites adaptés. Un analgésique pourra également être injecté si nécessaire. Les animaux nécessitant une assistance particulière suite à l’injection de la neurotoxine seront supplémentés en nourriture riche.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux neuronaux sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les comportements explorés et les tests associés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Les animaux utilisés sont des animaux adultes de 8 à 10 semaines, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales.