Rongeurs
Etudes de toxicologie de la reproduction avec observations post-natales longues chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 59624
74 464 rongeurs, 59 624 rats et 14 840 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par voie orale chaque jour, les femelles subissent des lavages vaginaux avant accouplement, et les petits nés dans les études sont soumis à des tests de développement physique, sexuel et neurologique, à des examens ophtalmologiques, à des mesures du tibia et de la distance ano-génitale ainsi qu'à des prélèvements de sang et d'urine. Les effets attendus portent sur toutes les étapes de la reproduction : accouplement, nidation, gestation, mise bas, lactation, comportement maternel et développement des descendants. Le porteur présente ces essais comme "indispensables" dans un dossier de mise sur le marché et "nécessaires règlementairement", et note qu'aucun modèle in vitro ne couvre l'ensemble de la fonction de reproduction.
Objectifs
Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché d’un médicament ou d'enregistrement d'un produit chimique et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).
Bénéfices attendus
A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.
Procédures
Les animaux sont traités, le plus souvent par voie orale de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits issus des portées pourront être soumis à des tests non invasifs de suivi de développement physique, sexuel ou de maturité sexuelle et neurologiques/comportementaux, ainsi qu’à des observations ophtalmologiques. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur et pourront faire l’objet d’une mise à jeun préalable .
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. De l’inconfort et du stress liés aux procédures elles-mêmes (contention, administration, sédation/anesthésie, l’hébergement individuel (quand nécessaire), observations et mesures (lavages vaginaux, examens ophtalmologiques, mesure de la taille du tibia ou de la distance ano-génitale, tests de suivi de développement ou de maturité sexuel(le), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques) et/ou prélèvements) et des effets systémiques liés au produit administré (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont actuellement pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e) : poids corporel, évaluation de la consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée, revue par un vétérinaire (le cas échéant) et si un ou plusieurs points limites sont atteints, que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Les rongeurs sont hébergés en groupe la plupart du temps à l’exception de certaines situations expérimentales ou sanitaires exigeant l’hébergement individuel.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces de choix, le rat étant celle qui est la plus fréquemment utilisée. En effet: - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits issus des portées, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance). Dans d’autres études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement et selon les lignes directrices/recommandations règlementaires) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).
Évaluation d’un radiotraceur diagnostique et thérapeutique ciblant l’intégrine avb3 dans des modèles de tumeurs cérébrales
- Recherche appliquée
- Cancers
Apporter une preuve de concept avant transfert en clinique d'un radiotraceur ciblant l'intégrine αvβ3 : 112 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit sous la peau une greffe de cellules de médulloblastome, une tumeur du cervelet, puis des injections de produit radioactif dans la veine de la queue sans anesthésie, suivies de séances d'imagerie nucléaire de quarante à soixante minutes sous anesthésie, jusqu'à six semaines consécutives. Un transport routier de cinq heures peut intervenir dans les jours suivant la greffe. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de mener ces études avant tout essai humain, et qualifie la méthode d'imagerie de non invasive.
Objectifs
La médecine nucléaire utilise des molécules marquées avec des éléments radioactifs pour aider à diagnostiquer et traiter le cancer. Ces molécules, appelées radiotraceurs, sont injectées dans le corps et peuvent être détectées à l'aide de caméras spéciales. Elles permettent de voir où ces molécules se distribuent dans l’organisme, y compris dans les tumeurs. Certaines de ces molécules peuvent également être utilisées pour détruire les cellules cancéreuses. Dans ce projet, nous étudions l'efficacité d'un radiotraceur sur des souris porteuses de tumeurs cérébrales (greffes sous-cutanée). Nous examinerons comment le radiotraceur se répartit dans l’organisme des animaux après son injection à différents temps. Nous évaluerons également si le traitement avec ce radiotraceur peut ralentir la croissance des tumeurs au fil du temps. Nous choisissons uniquement des types de tumeurs qui se développent facilement chez les souris pour minimiser l'utilisation d'animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l'approche permettant la combinaison de diagnostic et de thérapie(théranostique) ciblant l'intégrine αvβ3 dans les tumeurs du cervelet(médulloblastomes), et servira de preuve de concept pour le transfert en clinique du radiotraceur. Ensuite, un essai clinique déterminera la place de ce traceur dans la prise en charge des médulloblastomes.
Procédures
Les animaux auront tous une implantation sous cutanée de cellules tumorales,
Impact sur les animaux
L’étude sera conduite chez des animaux immunodéprimés mais hébergés et manipulés dans des conditions stériles et la méthode d’imagerie utilisée est non invasive. Un stress bref et léger pourra survenir au moment de l’injection intraveineuse du radiotraceur. L’implantation tumorale en sous cutanée sous anesthésie ne doit pas entrainer de douleur. De plus, les animaux seront étroitement surveillés suite à cette implantation et si le point limite est atteint, l’animal est mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des deux procédures de ce projet :soit une étude de biodistribution par prélèvements d’organes et comptage de la radioactivité sera réalisée, soit des prélèvements de tissus sont réalisés post mortem pour des études d’histologie.
Remplacement
Cette étude d’expérimentation animale fait suite à une validation en laboratoire du médicament candidat ainsi qu'à des tests préliminaires effectués sur animaux lors de projets précédents. La recherche sur l'utilisation de radiotraceurs ou de médicaments, ainsi que la confirmation des profils pharmacocinétiques, nécessite l'utilisation de modèles animaux précliniques en laboratoire. Ces modèles doivent refléter les différents organes impliqués dans l'élimination naturelle des molécules administrées. C'est pourquoi il est indispensable de mener des études sur des modèles animaux précliniques avant de pouvoir passer à des essais cliniques sur des êtres humains. De plus, les modèles cellulaires utilisés dans ces études représentent la pathologie étudiée, en l'occurrence le médulloblastome.
Réduction
L’imagerie non invasive permet de suivre un même animal au cours du temps, ce qui permet d’obtenir des données statistiques en minimisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le raffinement implique de prendre toutes les mesures nécessaires pour limiter au maximum la souffrance animale. Le projet sera mené dans deux établissements autorisés, avec un personnel qualifié pour manipuler les animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi adapté à leur espèce, et des mesures seront prises pour réduire le stress et la souffrance, y compris l'utilisation de points de référence appropriés. Leur bien-être sera surveillé quotidiennement. Pendant les procédures d'implantation des cellules tumorales, les animaux seront placés sous anesthésie. De même, lors des procédures d'imagerie, ils seront anesthésiés et leur température sera contrôlée. De plus, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire.
Choix des espèces
Les modèles de souris constituent une référence pour la recherche in vivo en cancérologie et sont très fréquemment utilisés pour les modèles de greffes de tumeurs sous-cutanée Les souris seront implantées au stade jeune adulte, à l’âge de 8 semaines environ afin d’optimiser la prise tumorale (absence de cellules NK + stade du développement du cervelet). Les injections des composés radiomarqués seront effectuées lorsque la tumeur aura atteint un volume de 100 mm3 environ.
Méthodes de prélèvements pour génotypage de souris en condition d’élevage
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Nées dans l'animalerie d'élevage de l'établissement, à raison d'environ 2 000 par an issues d'une cinquantaine de cages de croisement, 10 000 souris subissent un prélèvement au bout de la queue pour génotypage, quelques secondes sur animal vigile, dans des procédures classées en souffrance légère. Un reprélèvement à l'oreille ou une prise de sang peuvent s'y ajouter. Le porteur annonce une douleur légère et brève, et, dans de très rares cas, une perte de sang hémorragique. Celles qui portent le génotype recherché partent vers d'autres projets de recherche, les autres et les anciens reproducteurs sont tuées, et l'identification se fait dès sept jours de vie au motif que plus l'animal est jeune, moins la nociception est développée.
Objectifs
L'unité de service met, à disposition de la communauté scientifique, un ensemble de prestations liées à l’utilisation de modèles animaux à des fins scientifiques. Des modèles rongeurs sont générés, hébergés, développés et maintenus dans les locaux, pour les besoins de la communauté scientifique qui, pour réaliser sa recherche fondamentale et biomédicale, doit disposer de modèles précliniques permettant de comprendre diverses fonctions biologiques dans les pathologies humaines (maladies immunitaires, métaboliques, infectieuses inflammatoires, cancéreuses, etc). Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. L'utilisation de rongeurs génétiquement modifiés nécessite d'avoir recours à un génotypage et donc de réaliser une biopsie caudale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : *réaliser une identification permanente de qualité sur les souris afin de les distinguer en fonction de leur génotype *réaliser une biopsie de qualité permettant un génotypage sans contamination croisée entre deux individus *identifier et récupérer une biopsie sur les souris de manière à optimiser au maximum le bien-être animal *permettre aux utilisateurs des équipes de recherche de faire un suivi individuel des animaux en fonction de leur génotype. L’élevage de ces animaux est nécessaire dans le cadre de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société (domaines de recherche : pathologies respiratoires, musculaires, du système nerveux, métaboliques, cardiovasculaires ou génétiques).
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudale pour génotypage. Ces actes ne durent que quelques secondes. Dans de rare cas, un reprélèvement à l'oreille pourra être réalisé et ne durera que quelques secondes. Dans de rare cas, un prélèvement sanguin d'un faible volume sera réalisé (1 seule fois dans la vie de l'animal, acte de quelques secondes). Ces actes sont réalisés sur animal vigil.
Impact sur les animaux
Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation ainsi que pour les parents. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements pour génotypage (biopsie caudale et pavillon de l'oreille) et au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée.
Devenir
Les animaux avec un génotype d'intérêt seront utilisés dans un projet de recherche autorisé par le ministère. Les autres animaux du mauvais génotype qui n'auront pas pu être utilisés dans d'autres projets seront euthanasiés par une méthode réglementaire adaptée à l'âge des animaux ainsi que les anciens reproducteurs. Les animaux passant dans les projets de recherche autorisés seront alors en utilisation continue. Les accouplements sont réalisés pour produire au maximum des animaux d'intérêt.
Remplacement
Actuellement il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Un organisme vivant est donc nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. L'agrément de l'animalerie d'élevage ne concerne que les souris.
Réduction
L'établissement d'élevage lance environ 50 cages de croisements de lignées par an pour lesquelles l'identification individuelle et le génotypage sont nécessaires. En considérant que chaque accouplement donne en moyenne 5 portées de 8 souriceaux/an, notre établissement générera environ 2 000 animaux qui devront être identifiés et génotypés par an. Le projet comprend donc 10 000 animaux sur 5 ans. Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. Les demandes d'accouplements sont donnés par les équipes de recherche via un logiciel de gestion de lignées afin d'accoupler les animaux des génotypes d'intérêt pour leurs projets de recherche. Le nombre d'accouplements lancés est systématiquement revu en fonction du nombre d'animaux déclarés dans les projets de recherche. Les animaux sans génotype d'intérêt seront réutilisés en priorité (projets d'autres équipes de recherche ou projet de tutorat). Une lignée peut être maintenue en entretien minimum uniquement avec la validation de la structure bien être animal (SBEA). Sans justificiation scientifique du maintien en élevage d'une lignée, la cryoconservation de sperme sera systématiquement proposée.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, batônnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Si un animal se retrouve isolé de manière imprévue, il bénéficiera de deux enrichissements. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et quotidienne des animaux (points limites).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. L'agrément de notre animalerie ne concerne que ces souris. Tous les souriceaux, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés à partir de 7 jours de vie (plus l'animal est jeune, moins la nociception est développée). Pour certains projets de recherche, il est déconseillé d'utiliser de la pâte à tatouer/encre de Chine qui pourrait migrer dans différents tissus ou encore de toucher aux phalanges des animaux. Dans ces conditions, l'identification après 15 jours de vie sera privilégiée.
Évaluation de drogues inhibitrices du translocon Sec61 dans le traitement de l’amylose et du myélome multiple
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris dont la tumeur atteint le volume limite sont mises à mort avant terme. 3 376 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines de myélome multiple ou d'amylose sous la peau ou dans le sang, elles subissent des prises de sang une à trois fois par semaine pendant 86 jours, des injections de luciférase deux à trois fois par semaine sur la même durée, jusqu'à quinze administrations de composés et des anesthésies gazeuses de quarante minutes une à deux fois par semaine pendant un mois. Le porteur cherche de petites molécules reproduisant l'effet d'une toxine bactérienne, et affirme que les traitements retenus ne devraient pas induire de souffrance particulière puisqu'ils auront été sélectionnés sur l'absence de toxicité.
Objectifs
Le myélome multiple (MM) et l’amylose (AM) sont des pathologies associées à des anomalies des plasmocytes, cellules du système immunitaire produisant les anticorps. L'introduction de nouvelles approches thérapeutiques de chimiothérapies basées,entre autres, sur le blocage de complexes cellulaires qui assurent l’élimination des déchets protéiques dans les cellules a considérablement amélioré la survie des patients atteints. Cependant, ces traitements induisent souvent des effets indésirables graves ou des résistances aux traitements et les patients traités rechutent systématiquement Ces pathologies restent donc incurables et entrainent dans la majorité des cas le décès des patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de vaincre la résistance aux chimiothérapies et de réduire leur toxicité. Il a été montré qu’une toxine bactérienne capable d’inhiber la synthèse et l’expression de certaines protéines secrétées ou exprimées à la surface des cellules induisait un stress cellulaire associé à la production accrue de déchets protéiques qui, s’il est maintenu, évolue vers un suicide cellulaire. Cette inhibition permet à cette toxine de potentialiser l’efficacité thérapeutique des traitements du MM et permet de réduire efficacement la croissance tumorale dans un modèle animal murin immunodéficient. Ces résultats ont permis de démontrer l’intérêt thérapeutique de ce type d’inhibiteur dans le MM, et éventuellement pour l’AM car il bloquerait la production de la protéine responsable de la pathologie de l’amylose. Cependant la synthèse de cette toxine n’est pas compatible avec le développement de médicaments et ne peut donc pas être utilisée comme telle en tant que molécule thérapeutique. Le but de notre de projet est donc de caractériser de petites molécules possédant les propriétés inhibitrices de la toxine bactérienne mais facilement synthétisable, peu toxique et facilement administrable. Ces molécules seront sélectionnées par des tests in vitro sur leur capacité inhibitrice de la synthèse de protéines et plus particulièrement de la chaine légère anormale des immunoglobulines responsable de la pathologie de l’amylose et de leur capacité à induire la mort cellulaire sélective de cellules cancéreuses du MM tout en ne présentant pas ou peu d’effets secondaires délétères.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à l’identification de médicaments permettant de traiter l’amylose et le myélome multiple chez l’homme qui sont aujourd’hui, dans la plupart des cas, incurables. Le projet consiste au développement de molécules thérapeutiques contre ces pathologies et l’obtention de résultats positifs dans le cadre du traitement chez la souris selon les critères définis devraient permettre de valider la stratégie de l’approche thérapeutique basée sur l’inhibition de la sécrétion et l’expression de protéine. Les molécules donnant les résultats les plus prometteurs seront alors testées lors d’essais cliniques chez l’homme permettant d’aboutir à un développement de médicaments pour traiter ces maladies.
Procédures
Prises de sang (quelques secondes) 1 à 3 fois par semaines pendant 86 jours. Greffe de cellules humaines en sous cutané ou en intraveineuse, 30 secondes pour une injection, une greffe par animal. Administration de composés par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, ou sous cutanée ;10 secondes par administration ; maximum 15 administrations / animal. Injections de luciférase par voie intrapéritonéale (10 secondes), 2 à 3 fois par semaine pendant 86 jours. Anesthésie gazeuse de 40 minutes 1 à 2 fois par semaine pendant 1 mois.
Impact sur les animaux
Les souris seront injectées avec des lignées humaines de myélome multiple ou d’amylose en sous cutané ou par voie intraveineuse. L’injection des cellules pourra occasionner une douleur de courte durée au niveau du site d’injection. La croissance de ces cellules sera suivie et les souris dont la croissance aura atteint un point limite seront mises à mort. Ainsi la croissance de ces cellules dans les limites imposées dans le projet ne devrait pas générer de douleur particulière mais les souris pourraient subir une gêne dû à la croissance des cellules et devenir léthargiques et subir une perte de poids. La croissance des cellules pourrait être associée à des pathologies particulières, telles que celles observées chez l’homme et pourraient générer inconfort, stress et douleur. Les souris seront donc suivies périodiquement et si des symptômes révélateurs de souffrance, d’inconfort ou de stress étaient observés, les animaux seront mis à mort afin de réduire la souffrance en accord avec les points limites définis. Les traitements, quant à eux, ne devraient pas induire de souffrance particulière car ils auront été sélectionnés sur des critères d’absence de toxicité et d’effets secondaires. Mais la manipulation fréquente et périodique des souris pour l’administration des traitements et du suivi pourrait aussi générer un stress plus ou moins important en fonction de la voie d’administration choisie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse (effets des traitements sur la croissance tumorale et sur les pathologies étudiées).
Remplacement
Il s’agit ici de tester différentes molécules de synthèses possédant les propriétés inhibitrices de la sécrétion et de l’expression de protéine similaire à la toxine bactérienne. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires sur cette inhibition seront réalisées in vitro pour les caractériser et définir leurs propriétés biologiques. Cependant, le projet a pour objectif d’utiliser finalement ces molécules dans le traitement de pathologies chez l’homme et viseront donc à caractériser les effets thérapeutiques de ces molécules sur la prévention et le développement de ces pathologies. Il doit être réalisé dans un modèle expérimental physiologique de ces pathologies et doit donc être analysée et validée sur un organisme entier permettant d’analyser tous les organes cibles.
Réduction
Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos conceptions d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (6) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiple facteurs caractérisant la pathologie pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé. Les groupes expérimentaux de souris seront mélangés dans les cages afin de minimiser au maximum les conséquences de l’effet cage sur les résultats, permettant ainsi d’utiliser moins d’animaux et de réduire le nombre de répétition des expériences. Si possible, les molécules seront testées au sein d’une même expériences afin d’utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs molécules et donc réduire le nombre de souris.
Raffinement
Les souris immunodéficientes seront maintenues dans un environnement protégé sans pathogène opportuniste sous armoires ventilées et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La nourriture sera irradiée, l’eau de boisson autoclavée et le matériel en contact avec l’animal sera autoclavé ou décontaminé. La durée et les doses des traitements sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel. La plupart des gestes opératoires susceptibles d’être douloureux ou nécessitant un temps de plus d’une minute générateurs de stress seront effectués sous anesthésie. Des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences pour détecter les animaux qui seront en éventuellement souffrance. Dès que le point limite sera atteint, les animaux concernés seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain tout en utilisant un nombre suffisant pour l’obtention de résultats fiables. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, la disponibilité de souris immunodéficientes nous permet d’envisager la greffe de cellules humaines sans rejet de celles-ci par le système immunitaire nous permettant d’analyser l’effet du traitement seul. Nous étudions des pathologies de l’adulte, des individus adultes de 6 à 8 semaines seront donc utilisés. Pour les xénogreffes des animaux immunodéficients, cet âge est requis car au-delà de 8 semaines une irradiation est nécessaire avant implantation des xénogreffes.
Etude d’une pathologie humaine : impact pulmonaire du défaut génétique du gène PARN
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Chaque souris subit, sous anesthésie, une incision de la peau et des tissus au-dessus de la trachée, puis une injection d'une molécule qui déclenche une fibrose pulmonaire, la plaie étant refermée par un ou deux points de suture. 480 souris, dont des porteuses d'une inactivation d'une copie du gène Parn, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique un risque de mortalité lié à la fibrose du septième au quatorzième jour après l'injection, une gêne respiratoire et une perte de poids possibles, atteintes qu'il déclare pourtant en souffrance modérée. Toutes sont tuées pour prélever les poumons, après un lavage bronchoalvéolaire par cathéter introduit dans la trachée.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie pulmonaire fréquente et grave. Environ 10% des cas de FPI sont associés à des cas familiaux. En dehors de la transplantation pulmonaire, aucun traitement permettant de guérir cette maladie n’est disponible pour les patients. La FPI résulte d'un dysfonctionnement de cellules pulmonaires : les pneumocytes de type 2 (P2), qui résulte notamment d’expositions environnementales, et d’anomalies génétiques favorisantes, le vieillissement constituant un facteur favorisant majeur. On détecte dans près de 30% des formes familiales une lésion génétique pathogène (délétère) sur un gène contrôlant la stabilité de l'extrémité des chromosomes. Parmi celles-ci, les anomalies dans le gène « poly(A)-specific ribonuclease » (PARN) sont parmi les anomalies les plus fréquemment rencontrées. Les phénomènes biologiques reliant ces anomalies génétiques de PARN et le développement de la fibrose demeurent inconnus. Les modèles de souris de fibrose pulmonaire sont la référence actuelle pour l’étude de la physiopathologie (mécanismes à l'origine d'une maladie) de la fibrogenèse (formation de la fibrose) pulmonaire. Le développement d’un modèle sur la souris de fibrose pulmonaire associée au défaut génétique de Parn est justifié par i) l’accès très limité aux prélèvements pulmonaires de patients atteints de ce défaut génétique ; ii) les limites de l’utilisation de modèle in vitro (culture cellulaire) pour l’étude de la fibrogenèse pulmonaire. L’objectif de ce travail est de caractériser l’impact du défaut génétique de Parn sur la fibrogenèse pulmonaire.
Bénéfices attendus
La fibrose pulmonaire idiopathique est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions entre différents systèmes biologiques. Cette étude a pour objectif d’étudier le rôle du défaut autosomique dominant (la transmission d'une copie du gène muté est suffisante pour transmettre la maladie) de Parn dans des modèles sur la souris de fibrose pulmonaire. Atteindre cet objectif exige l’étude du rôle de Parn dans un organisme animal vivant respectant la complexité de la biologie pulmonaire qui implique de nombreux types cellulaires et médiateurs. Cette étude, réalisée d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins, assurera une meilleure connaissance de la physiopathologie de la fibrogenèse pulmonaire chez l’Homme. Ceci est un préalable indispensable au développement de nouvelles thérapies ciblées et curatives pour nos patients.
Procédures
Nous utilisons dans ce projet des souris contrôles, des souris transgéniques avec un défaut génétique inactivant l'une des deux copies du gène Parn. En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à des temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi qu'un lavage bronchoalvéolaire (une petite incision au niveau de la trachée est réalisée pour permettre de placer un cathéter souple, une injection unique de sérum Physiologique est effectuée délicatement, et ré-aspirée) et le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.
Impact sur les animaux
L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Dans les modèles de fibrose induite par deux molécules différentes, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après injection. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose . Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice, suite à l’intervention chirurgicale au niveau de la trachée, est également possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes cellulaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules issues d’autres tissus/organes via la circulation sanguine notamment. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères, des conférences en pneumologie/immunologie et une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2000-2023. Il faut noter que des méthodes alternatives comme les organoïdes (culture cellulaire en laboratoire) sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ce modèle n’intègre qu’un nombre restreint de sous-types cellulaires pulmonaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement des cellules extrapulmonaires (c'est à dire l'arrivée de cellules non pulmonaires dans le poumon).
Réduction
Le nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs
Raffinement
Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures expérimentales. Des antalgiques seront donnés en pré et post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton et d’un tunnel de change dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment de l'euthanasie. Les souris seront euthanasiée par dislocation cervicale. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins trois fois par semaine par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie, posture de repli, détresse respiratoire, hypothermie...), la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.
Choix des espèces
Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose pulmonaire humaine. Les souris offrent également la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et d’étudier spécifiquement le rôle d’un gène donné dans le poumon. Enfin, le modèle murin permet la mise en place de modèles pré-cliniques incontournable pour le développement précoce de thérapies innovantes. Actuellement, pour la fibrose pulmonaire, il n’existe pas de stratégie alternative pour modéliser la réponse d’un organe dans le contexte d’un organisme entier. La souris est donc un animal incontournable pour apporter des réponses à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 7 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.
Role du système glymphatique dans le Trouble de l’Usage d’Alcool
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rendus dépendants à l'alcool par consommation libre, inhalation de vapeurs ou injections dans l'abdomen, puis maintenus seuls en cage pendant huit semaines à un an, 4 480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Une partie reçoit des canules implantées dans le crâne sous anesthésie, passe jusqu'à six IRM de deux heures et subit des tests de compulsion où l'accès à l'alcool s'accompagne de chocs électriques ou d'un goût amer de quinine. L'alcoolisation commence à quarante-cinq jours, ce qui correspond au milieu de l'adolescence chez le rat, et se poursuit jusqu'à un an. Le porteur écrit que la consommation volontaire d'alcool "ne conduit à aucune souffrance ou douleur" chez ses animaux et compare les chocs électriques à l'électricité statique ressentie en sortant d'une voiture, dans un projet qu'il classe lui-même en souffrance sévère.
Objectifs
Nos objectifs scientifiques sont de découvrir le rôle du système glymphatique dans l’addiction à l’alcool, aussi nommée le « Trouble de l’Usage d’Alcool » (TUA), d’étudier les atteintes du système glymphatique provoquées par l’alcool et d’étudier si des molécules thérapeutiques potentielles améliorant le fonctionnement du système glymphatique peuvent diminuer les symptômes de l’addiction. Le TUA reste aujourd’hui un défi pour la santé publique à l’échelle internationale, étant donné les conséquences sanitaires de la consommation d’alcool (cancers, maladies cardiovasculaires et digestives, déficits cognitifs, démences précoces et troubles neurocomportementaux). L’addiction est marquée par le passage d'une consommation hédonique à une consommation compulsive avec perte du contrôle de sa consommation, conduisant peu à peu le patient dans un cycle pathologique de phases d’abstention et de rechute. Pendant les phases d’abstinence, l’individu expérimente un syndrome de sevrage fortement aversif et dysphorique qui précipite la rechute. Notre hypothèse de travail propose que l’amélioration du fonctionnement du système glymphatique pourrait constituer une piste thérapeutique pour traiter les symptômes spécifiques de l’addiction (par exemple, la compulsion, les rechutes) mais également les troubles cognitifs et anxieux observés dans le TUA. Le système glymphatique vient compléter la barrière hemato-encéphalique et permet l’existence d’un flux de liquide cérébrospinal dans le parenchyme cérébral, qui permet le drainage des déchets métaboliques . Il a été montré que ce système est impliqué dans les pathologies neurodégénératives (Alzheimer par exemple) provoquant une accumulation de déchets et une neuroinflammation causant la mort neuronale. Or, dans le cadre du TUA, l’alcool provoque le développement de démences précoces (encéphalopathie de Wernicke et syndrome de Korsakoff), ainsi que de la neuroinflammation. Par ailleurs, des études ont montré qu’un potentialisateur de la circulation de liquide cérébrospinal permet de réduire la sévérité du syndrome de sevrage. Nous souhaitons tester dans quel mesure le système glymphatique serait impliqué dans les troubles addictifs, anxieux et cognitifs présents chez les patients atteint de TUA.
Bénéfices attendus
Le rôle du système glymphatique dans la mise en place de l'addiction à l'alcool, dans le maintien des comportements addictifs et en tant que piste thérapeutique anti-addiction n'a jusqu'ici pas été exploré. Ceci est en particulier dû au fait que ce système a été découvert récemment, pendant la décennie 2012-2022. Les travaux publiés montrent que le système glymphatique est très important dans la gestion de la neuro-inflammation cérébrale. Or cette dernière est un élément clé dans le développement et le maintien des pathologies addictives. Du fait de notre expertise dans la mise en place des modèles animaux d'addiction à l'alcool et de la possibilité d'accéder à leur étude par IRM petit animal, nous pensons que ce projet pourrait conduire à des résultats enrichissants sur la physiopathologie de l'addiction à l'alcool et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques, non seulement pour traiter l’envie irrépressible de consommer, le risque de rechute et favoriser la réduction des consommations, mais également pour prendre en charge les déficits cognitifs présents chez les patients souffrant du TUA.
Procédures
Les animaux seront exposés à l'alcool par différents biais (consommation libre, inhalation ou injection) sur des périodes allant de 8 semaines jusqu'à 1 an. Certains animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale et avec analgésie pré-opératoire pour l'implantation de canules (environ 30 min) dans des zones d'intérêt (structure cérébrale ou cisterna magna). A la suite de quoi les rats seront soumis à des tests comportementaux (anxiété, cognition et addiction) et, éventuellement, des prélèvements sanguins sous anesthésie générale (environ 2 min, maximum 6/rat, 2 semaines minimum entre chaque prélèvement). Lors de l'acquisition d'image par IRM (environ 2 heures, maximum 6 acquisitions par rat sur une vie entière), les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse pour éviter tout mouvement.
Impact sur les animaux
Les animaux seront isolés pendant toute la durée de l'expérimentation (8 semaines à 1 an), ce qui peut entraîner un stress social chez le Rat. D'expérience, les étapes de consommation volontaire d'alcool ne conduisent à aucune souffrance ou douleur chez nos animaux. Les phases qui vont faire subir aux rats une certaine douleur sont : - les procédures chirurgicales visant à implanter des canules intracrâniennes. Il s’agit ici uniquement de douleurs post-opératoires de cicatrisation, le port de canules intracérébrales pendant plusieurs mois n’entrainant pas de douleur. - les injections intra-péritonéales répétées. Les phases qui vont faire subir aux rats un certain inconfort sont : - les chocs électriques, (réglés à une faible intensité, évoquant une sensation désagréable mais non douloureuse comparable à celle de l’électricité statique sur une voiture après un trajet, utilisés lors des tests de compulsion) - L’inconfort engendré par l’absorption de quinine lors des tests d’aversion. - L’inconfort engendré par les phases de sevrage et de privation d’alcool.
Devenir
Afin d'analyser les cerveaux des animaux, nous devons réaliser leur mise à mort pour prélever les cerveaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode de substitution aux expériences comportementales: Nous n'avons pas à notre disposition de modèle computationnel ou in vitro des symptômes du Trouble de l'Usage d'Alcool, des troubles cognitifs et mnésiques ni des troubles anxieux. Pour les aspects neurochimiques, nous ne disposons pas de modèle in vitro ou computationnel des mécanismes d’adaptations neuronales induites dans le cerveau par l'usage excessif et prolongé d'alcool pendant plusieurs mois. Notre recherche vise à caractériser le fonctionnement du système glymphatique sans alcool et chez le rats rendus dépendants à l'alcool , pour lequel nous ne disposons pas de modèle computationnel à ce jour.
Réduction
Pour réduire au minimum le nombre de rats, les groupes seront constitués de 10 rats pour un groupe expérimental donné. Pour les expériences comportementales de mémoire (comme par exemple le test "Reconnaissance d'un nouvel objet"), le nombre de rats sera augmenté à n=12 en raison des fortes variabilités interindividuelles. Pour les expériences incluant la tâche d’apprentissage de l’auto-administration et la tâche de compulsion, que certains rats n’apprennent pas, on augmente le n à 18 rats par groupe pour n=12 à la fin. L'étude par IRM de flux (Imagerie par Rénonance Magnétique),est une IRM fonctionnelle sur l'animal vivant. Aussi cette approche nous permettra d’étudier le même animal à plusieurs étapes du protocole, ce qui permet de REDUIRE le nombre d’animaux étudiés car il n’est pas nécessaire d’euthanasier les rats à chaque temps étudié. Nous avons prévu d’étudier 10 molécules d’intérêt différentes. Les 3 premières sont 1. un amplificateur du système glymphatique , 2. un amplificateur du courant hydrique généré par les aquaporines et 3. un agent anti-inflammatoire, ce dernier ayant déjà fait l’objet de publications au laboratoire. Ces 3 molécules sont bien identifiées, non toxiques, et un intérêt thérapeutique est pressenti au vu des analyses bibliographiques. Si les résultats obtenus sur ces 3 premières cohortes montrent une efficacité sur l’addiction, alors nous poursuivrons l’étude de leurs mécanismes d’action sur les 7 autres cohortes avec des molécules analogues connues, de façon à identifier la cible pharmacologique précise de l’effet obtenu. Les cohortes ne seront pas utilisées pour une étude toxicologique de molécules inconnues. Les doses toxiques des substances étudiées et les gammes de doses efficaces seront trouvées dans la littérature scientifique.
Raffinement
Les 3 modèles animaux utilisé (le modèle d’inhalation de vapeurs d’alcool ; le modèle EPA; l'intoxication par injection intrapéritonéale d'alcool), sont hautement validés dans la littérature scientifique pour fournir des supports efficaces de mise au jour de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine des addictions. Pour raffiner notre méthodologie, nous incluons des critères d'interruption d’expérimentation. En cas de signes de souffrance, une analgésie sera mise en place. La persistance de signes de douleur, entrainera une décision de mise à mort de l'animal. Les méthodes d’anesthésie et de mise à mort seront effectuées dans des conditions réduisant au maximum le stress. Pour limiter le stress provoqué par l’isolement des rats, nous mettrons en place un enrichissement inter- espèce. Notre mode expérimental d'étude par IRM fonctionnel (ici, l'IRM de flux) nous permet de RAFFINER notre mode expérimental avec une méthodologie non invasive. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées avec des soins permettant de réduire au maximum la douleur pendant et après l'opération. Dans le but d’améliorer la condition des animaux, nous réaliserons un enrichissement inter-espèces lors des périodes d’isolement et un enrichissement environnemental sera installé dans les cages (tube carton et bâtonnets de bois à ronger) durant toute la vie des rats, en plus de leur litière de rafle de maïs (COB12 de serlab)..
Choix des espèces
L’espèce que nous utiliserons est le Rat. Nous réaliserons trois modèles reproduisant les symptômes de l’addiction chez le Rat : Le modèle dit d'inhalation de vapeur d'alcool; le modèle "d'Effet de Privation d'Alcool" (EPA), et le modèle par injections intrapéritonéales d'alcool. Le choix de l’espèce Rat est motivé par des travaux précédents qui ont montré la forte validité de ces modèles dans la recherche de nouveaux traitements. Dans le modèle EPA, le choix du Rat est motivé par le fait que les Rats présentent des comportements plus stables que la Souris. Dans le contexte des addictions, plusieurs symptômes de l’addiction sont évalués par le test comportemental d’auto-administration opérante d’alcool, ou l’on propose à l’animal de travailler (en appuyant sur une pédale dans une enceinte d’auto-administration) de façon à obtenir une « récompense » (ici, l'éthanol). Pour ces tests, le gold standard est le modèle « Rat ». Nous allons réaliser notre étude sur des rats âgés environ de 45 jours au début des administrations d'alcool: cet âge correspond au milieu de l'adolescence du rat, qui s'étend de 30 à 60 jours. Cette période correspondant environ chez l'Homme à l’âge de 16-18 ans. Les rats seront gardés au laboratoire jusqu’à l’âge maximum de 1 an, et les expériences d'IRM, de comportement seront réalisées sur les rats adultes. En France en 2022, 80 % des jeunes de 17 ans ont consommé de l'alcool au moins 1 fois dans l'année passé et 36% des personnes de 17 ans ont connu au moins une ivresse dans le dernier mois (publication OFDT 2023). L'age précoce des premières alcoolisations est une donnée épidémiologique classique en Europe et constitue d'ailleurs un facteur de risque supplémentaire pour devenir alcoolodépendant : 10% de risque d'avoir un TUA en population générale, contre 15 % de risque si les premières alcoolisations ont eu lieu avant 15 ans. Dans notre objectif de modéliser la pathologie alcoolique, nous allons donc commencer les premières expositions à l'alcool chez des rats adolescents, pour mimer les caractéristiques épidémiologiques de l'addiction à l'alcool.
Caractérisation des déficits sensoriels, cognitifs et émotionnels en réponse à des challenges inflammatoires en période prénatale, dans un modèle de souris déficientes en peptide vasoactif intestinal (VIP)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Quarante-cinq minutes de contention, deux fois par jour, trois jours de suite, sur des femelles en gestation : 8 311 souris vont être utilisées, dont 3 311 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 1 008 femelles gestantes reçoivent en plus des injections deux fois par jour pendant trois jours, 1 176 animaux subissent une chirurgie, 980 des prises de sang par incision du bout de la queue, et 1 960 passent des tests de mémoire, de sociabilité, d'anxiété, de résilience et de perception de la douleur. Les mères sont tuées pour prélever placentas et embryons au douzième jour de gestation, les autres pour prélever le cerveau, le porteur indiquant que les animaux épargnés en période prénatale pourront ensuite servir de reproducteurs à la colonie. Il décrit lui-même la lignée déficiente en VIP comme portant un "phénotype dommageable" : rythmes perturbés, immunité faible, troubles digestifs, hypersensibilité à la douleur et cerveau plus petit.
Objectifs
Le stress psychosocial, lorsqu’il survient pendant la grossesse, est connu pour impacter négativement le développement du bébé. Il fait partie des facteurs de risques liés à la prématurité, aux troubles placentaires, et aux troubles du neurodéveloppement (TND). Ce type de stress s’accompagne généralement d’une réponse pro-inflammatoire de l’organisme, or l’inflammation chez la mère est de plus en plus proposée comme une des causes du développement de TND. Notre équipe travaille actuellement sur les stress survenant autour de la naissance et leur impact cérébral chez le rongeur. Nous nous intéressons aussi à un facteur endogène spécifique, le peptide vasoactif intestinal (VIP), qui est impliqué non seulement dans la croissance du cerveau embryonnaire mais joue également un rôle de médiateur anti-inflammatoire Nous souhaitons étudier le rôle joué par le VIP dans le développement du cerveau, dans un contexte d’inflammation maternelle modélisée par un stress psychosocial appliqué pendant la gestation. En utilisant des souris déficientes en VIP, nous voulons voir si elles présentent une vulnérabilité accrue aux effets du stress prénatal, et si à l’inverse l’ajout de VIP permet une protection du cerveau fœtal face à ce type de challenge inflammatoire. Dans un premier temps, nous allons étudier les conséquences de la déficience en VIP et du stress prénatal chez la progéniture au niveau émotionnel, cognitif, sensoriel, placentaire et de l’immunité cérébrale (microglie). Dans un deuxième temps, nous allons regarder avec plus de précisions les interactions inflammatoires mises en jeu.
Bénéfices attendus
De nombreux stresseurs, psychosociaux, inflammatoires ou autres, peuvent toucher les femmes enceintes, et on sait aujourd’hui que les conséquences peuvent être néfastes pour le développement du bébé. Les troubles engendrés et leurs origines précises peuvent être difficiles à discerner car bien souvent, ces troubles se manifestent plus tard dans l’enfance (c’est le cas des troubles du comportement). Nos travaux combinant le VIP placentaire et le stress gestationnel devraient nous permettre d’enrichir la connaissance sur le lien de cause à effet précis entre stress maternel, placenta et développement cérébral. Ces recherches s’inscrivent dans le cadre de l’hypothèse générale de l’origine développementale de la santé et des maladies à l’âge adulte (DOHaD), et plus particulièrement dans le contexte du caractère additif des évènements délétères tout au long de la vie (théorie du hit-multiple). Notre attention se porte sur le rôle pivot du VIP, qui est présent en quantité non négligeable dans l’embryon et le placenta et dont les effets sur le système nerveux et immunitaire sont bien connus. Ainsi notre hypothèse est que si le VIP agit bel et bien comme un neuroprotecteur et un immunomodulateur, ces résultats peuvent aider à dégager de nouvelles pistes de recherche sur l’étiologie de troubles neurodéveloppementaux, souvent d’origine complexe et multifactorielle. Ils peuvent aussi sur le long terme inspirer de nouvelles pistes thérapeutiques pour la prise en charge des femmes enceintes exposées à des challenges inflammatoires primaires (stress, infection) ou secondaires (conséquences de conduite à risques). Nos études ciblent à la fois l’apport maternel (exogène) et l’apport embryonnaire (endogène, tout le long de la vie) de VIP. Ainsi, nous pouvons imaginer établir avec plus de précision la fenêtre thérapeutique à cibler pour protéger au mieux l’embryon, et/ou utiliser les niveaux de VIP circulants comme marqueur de diagnostic précoce.
Procédures
Stress de contention : animal vigile, 161 femelles, durée de 45 min 2x/jour pendant 3 jours Injections prénatales : animal vigile, 1008 femelles, 2x/jour pendant 3 jours Injections prénatales + stress de contention : animal vigile, 322 femelles, durée 45 min 2x/jour pendant 3 jours Tests comportementaux (pour étudier mémoire, sociabilité, anxiété, résilience, perception de la douleur) : animal vigile, 1960 animaux, max 1 test/jour 5 jours sur 7 pendant 6 semaines Prise de sang : animal vigile avec antalgique, 980 animaux, 2x à une semaine d’intervalle Chirurgie : animal anesthésié, 1176 animaux, une seule fois Biopsie de queue : animal vigile (âgé de 5-10 jours), tous les animaux, 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
L’objectif de notre projet est d’induire un stress chez la mère gestante. Il est possible qu’à l’issue des 3 jours de stress, les femelles gestantes conservent un état de stress chronique. La progéniture soumise au stress prénatal est également susceptible de présenter une anxiété accrue, c’est un paramètre que nous avons prévu de mesurer. Les injections chez les mères gestantes ne mettent pas la grossesse en danger mais sont susceptibles de causer une inflammation du site d’injection ou une infection. Ce paramètre sera surveillé. L’injection de corticostérone peut induire l’apparition de comportements anxio-dépressifs chez la mère gestante similaires à ceux causés par un stress chronique. L’injection d’IL-1beta est susceptible de provoquer des perturbations cérébrales chez les petits mais pas de dommage spécifique pour la mère. Le neuropeptide VIP étant connu pour ses fonctions cardiovasculaires (action rapide) et immunitaires (action lente), nous serons particulièrement attentifs au comportement des mères gestantes (rythme cardiaque et respiration accélérés) au cours des 2 premières heures après injection. Notre lignée d’animaux déficients en VIP possède un phénotype dommageable, caractérisé par une perturbation des rythmes, des capacités reproductives diminuées, une faible immunité, des troubles digestifs, une hypersensibilité à la douleur et un cerveau plus petit. Les tests de perception de la douleur prévus sont court et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress léger. Le test de résilience implique le déclenchement d’un stress pour mesurer cette capacité. Les prises de sang avant et après le stress sont réalisées en pratiquant une incision de l’extrémité de la queue qui peut engendrer de la douleur. La biopsie de queue induit une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélever leur cerveau ou prélever les placentas et les embryons. Ces différents tissus serviront à des analyses ultérieures alimentant notre projet.
Remplacement
Le stress mobilise le cerveau et les organes périphériques. Un tel système ne peut être modélisé qu’avec un organisme entier. De plus, nous souhaitons étudier des perturbations du développement embryonnaire, et il n’existe pas encore de système alternatif capable de modéliser une gestation et de prendre en compte toutes les interactions mère-embryon qui en résultent. Enfin, afin d’appliquer au mieux nos résultats à l’humain, il est nécessaire d’utiliser un modèle de mammifère avec un placenta, un système nerveux et un système immunitaire proches des nôtres. C’est le cas de nos souris.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux et de groupes du projet, certaines injections seront communes entre les cohortes utilisées au cours de l’étude. Un maximum de tests comportementaux seront effectués sur les mêmes animaux, tant que leur accumulation n’engendre pas de souffrance ou d’inconfort chez ces individus. Les mères gestantes mises à mort pour prélever des placentas et des embryons seront les mêmes que celles utilisées pour les prélèvements sanguins par exsanguination. Elles pourront également avoir été utilisées pour générer des petits au préalable. Les animaux n’ayant pas subi de procédure en période prénatale pourront être réutilisés comme reproducteurs pour la colonie à la fin des tests comportementaux. Si certains tests ne montrent aucun impact du stress prénatal de contention couplé à la déficience en VIP, ils ne seront pas reconduits. Si certains tests ne montrent aucune différence sexe-spécifique, les mâles et les femelles seront mélangés et le nombre d’animaux requis par groupe pourra être diminué lors des tests suivants. Il en va de même si certains sous-groupes se comportent de la même manière, les individus seront mélangés pour la suite des tests afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, certains animaux seront réutilisés dans plusieurs tests. Par ailleurs nous nous efforcerons toujours de prélever un maximum d’échantillons biologiques aux animaux mis à mort (placenta, embryons, sang embryonnaire et maternel, cerveaux et sang chez les animaux adultes) afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés pour constituer nos banques de matériel biologique.
Raffinement
Dans toutes les procédures, nous mettrons en œuvre les mesures nécessaires pour assurer des conditions expérimentales en adéquation avec le bien-être animal, lorsqu'elles ne vont pas à l'encontre de ce que nous souhaitons étudier (par ex. le stress). Pour les tests de comportement, les animaux sont habitués à la pièce et l'expérimentateur, et des seuils limites sont définis (tests stoppés si signes de détresse ou de douleur). Les prises de sang et les chirurgies sont accompagnées de l'administration d'anti-douleur, et d'anesthésiants pour les dernières. Les animaux sont hébergés en groupe (sauf exceptions) dans des cages à environnement enrichi (de quoi faire un nid et ronger pour que l’animal exprime son comportement naturel). Les animaux génétiquement modifiés sont observés au moins deux fois par semaine par les expérimentateurs et les zootechniciens, tout en veillant à les déranger le moins possible, plus particulièrement en cas de gestation. Ils sont pesés toutes les deux semaines. Un suivi renforcé est mis en place dans les jours suivants les injections et les prises de sang. Au moindre signe anormal, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et les mesures de soin préconisées seront mises en place.
Choix des espèces
Pour étudier les troubles du neurodéveloppement (TND), nous avons besoin d’une espèce avec un cerveau aux structures proches du cerveau humain. Il faut aussi un modèle avec une gestation de type mammifère. Pour travailler sur le placenta nous avons besoin d’un rongeur ou d’un lagomorphe (lapin) ou d’un primate. On a déjà un modèle transgénique de souris, et la souris correspond à tous ces critères. Elle est fréquemment utilisée pour modéliser des TND, et les modèles transgéniques (déficience en VIP) et de stress sont assez bien caractérisés et semblent pertinents pour l’appliquer à l’humain. La souris exprime également une grande variété de comportements comparables aux nôtres (sociabilité, douleur, anxiété, mémoire). Les animaux utilisés lors des tests comportementaux seront âgés d’au moins 30 jours pour les reproducteurs, afin de s’assurer de leur fertilité, et de 60 jours pour les autres, âge auquel le cerveau est entièrement développé et mature. Le stress prénatal appliqué à la mère ainsi que les différentes injections seront réalisés au 9e, 10e et 11e jours de gestation, afin de cibler la période critique pour la formation des neurones. Les embryons seront prélevés au 12e jour de gestation.
Incidences des comorbidités tardives chez le modèle rat de la dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Porteurs d'une mutation qui les prive de dystrophine, 330 rats voient leurs muscles dégénérer et, passé dix mois, développent pour environ un sur cinq une tumeur musculaire, le plus souvent au muscle de la mâchoire. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le protocole se limite à les laisser vieillir et à les palper chaque semaine sur tout le corps pour détecter la masse, l'animal étant tué au plus tard quinze jours après la découverte, pour prélever la tumeur. Le porteur signale que ces rats perdent la mobilité au point de ne plus pouvoir se toiletter, et qu'il les loge avec des rats sains qui s'en chargent, avant de conclure qu'ils sont "irremplaçables" pour ce travail.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l’absence d’une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d’insuffisance cardio-respiratoire. Dans des modèles animaux de DMD, notamment chez les rats, des complications sont observées de façon précoce lors de leur vieillissement. En effet, à partir de 10 mois, les rats DMD peuvent développer de manière spontanée une tumeur musculaire, pouvant se retrouver au niveau de tous les muscles squelettiques mais majoritairement au niveau du muscle masséter permettant de fermer la mâchoire. Suivant la localisation, les conséquences à l’échelle de l’organisme varient et peuvent impacter différentes fonctions comme la prise de nourriture, la locomotion et le toilettage. Le but de ce projet est donc de déterminer globalement les différents signes cliniques tardifs chez les animaux DMD, incluant le développement de tumeurs musculaires et de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l'apparition de ces tumeurs.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de caractériser au mieux la DMD et son histoire naturelle en vue de proposer des traitements innovants permettant de contrer les mécanismes pathogéniques. Comprendre les possibles comorbidités en vue de les traiter dans un contexte de réparation musculaire est donc un étape essentielle. À court terme, il est attendu une amélioration du suivi et de la prise en charge des comorbidités associées à l’évolution tardive de la maladie. À moyen terme, il s’agira de mieux investiguer le rôle de suppresseur de tumeurs de la dystrophine – et de ses variants de forme (longeur variable de la protéine) - pour, à long terme, aboutir à des tests de stratégies thérapeutiques ciblant de façon spécifique ou en parallèle les tumeurs musculaires dans les modèles animaux dystrophiques. Il est en effet crucial d’identifier la signalisation moléculaire conduisant au développement de ces tumeurs musculaires chez le rat et d’inclure ces connaissances dans le design des solutions thérapeutiques pour qu’elles visent d’emblée à traiter le syndrome dystrophique dans son ensemble, au-delà de la seule récupération fonctionnelle cardio-respiratoire et locomotrice.
Procédures
Pour la procédure décrite dans la présente saisine, les animaux ne subiront aucune intervention particulière à part une manipulation régulière par les zootechniciens pour leur suivi clinique. S’ils présentent une masse tumorale, elle sera prélevée au moment de leur mise à mort en accord avec la grille de score et au plus tard 15 jours après la détection de la tumeur.
Impact sur les animaux
Jusqu’à l’âge de 10 mois, il n'a été constaté aucune entrave à une qualité de vie globalement compatible avec une vie en cage autonome pour les animaux DMD. Au-delà de 10 mois en revanche, un suivi individuel s’impose. Dans cette étude, les animaux seront plus âgés que 10 mois et auront atteint un stade sévère de la pathologie qui s’accompagne d’un développement spontané de tumeurs pouvant toucher les muscles squelettiques. Un personnel compétent pratiquera alors de façon hebdomadaire un suivi individualisé et complet des animaux en plus du suivi classique dispensé par une zootechnicienne. Les animaux seront donc palpés manuellement sur l’ensemble de leur corps afin de détecter une éventuelle masse tumorale. La locomotion des animaux sera également observée afin de détecter un possible déficit engendré par une tumeur sur les muscles mobilisant les articulations des membres postérieurs. L’impact de la masse tumorale dépend de sa localisation (locomotion, prise alimentaire, toilettage, …). Une perte de mobilité générale est observée lors de la phase sévère de la maladie, pouvant empêcher les rats DMD d’effectuer certaines tâches essentielles à leur bonne santé comme le toilettage. Pour cette raison, les rats DMD sont systématiquement allotés avec un ou deux rats de génotype sauvage qui, nous l’avons constaté, prennent soin des rats handicapés, par exemple en les toilettant. Ainsi, le pelage des rats DMD demeure entretenu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires ainsi que la mise en culture.
Remplacement
Le rôle de la dystrophine en tant que suppresseur de tumeur est connu et décrit. L'objectif de cette saisine n’est pas de tester des molécules antitumorales, ce qui pourrait être réalisé en partie sur des cellules, mais 1) de calculer l’incidence de la tumeur du muscle dans des modèles dystrophiques, 2) de quantifier la variabilité de l'âge de démarrage du processus cancéreux dans un contexte biologique, et 3) d’initier la caractérisation des tumeurs au niveau ultrastructural du tissu et moléculaire. Le modèle du rat étant celui qui mime le plus fidèlement et en une seule année l’évolution chez l’humain, ces animaux sont irremplaçables pour remplir en un temps court les objectifs de ce projet.
Réduction
De nombreuses études sont menées sur les lignées DMDdel52 et DMDdup10-17. Dans ces deux modèles, la survenue de tumeurs musculairesa été observée de façon assez fréquente (20%). Jusqu'à présent, les animaux qui présentaient ces tumeurs étaient écartés des procédures dans lesquelles ils étaient inclus pour être mis à mort sans autre utilité, la présence de la tumeur pouvant potentiellement altérer les résultats de ces études. Comme ce type de tumeur a également été décrite chez les patients DMD, le présent projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent à l'apparition de ces tumeurs dans les modèles de rats dystrophiques, et nous proposons d'inclure dans nos analyses les tumeurs détéctées chez les animaux enrôlés dans d'autres saisines afin qu'ils ne soient plus mis à mort sans que leur tissus ne soient prélevés et analysés. Ainsi ces animaux fourniront également des données biologiques grâce à l'analyse de leurs tumeurs. Ces animaux étant par ailleurs décomptés dans d'autres saisines, leur utilisation dans ce projet permettra de réduire le nombre de rats sur la cohorte dédiée. En effet, dès lors que le nombre de sujets nécessaires aux analyses sera atteint, il n'y aura pas de nouveaux animaux inclus. De plus, la diversité des animaux utilisés permettra par ailleurs un résultat biologique de meilleure qualité puisqu’il intègrera des rats au parcours de vie différent : parfois peu manipulés notamment ceux de la présente saisine, parfois manipulés régulièrement, parfois soumis à un exercice musculaire, autant de situations proches de la variabilité des modes de vie de l’enfant atteint.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventiléesde grande taille, de sorte qu’ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont les capacités locomotrices sont évaluéesen permanence. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. En cas de score clinique élevé, les animaux affaiblis seront suivis de façon rapprochée via une procédure de gestion spécifique à ces animaux. Tout dépassement des points limites sera suivi d’une action correctrice et en cas d’absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Par ailleurs, les animaux provenant d'autres saisines ne subiront aucune procédure supplémentaire puiqu'ils seront mis à mort dès lors qu'une tumeur sera détéctée.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l’humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis d’en faire un modèle de choix pour l’analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rats DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris mdx, mondialement utilisé, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s’insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d’environnement, format). Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 10 mois et plus, sans excéder 17 mois. L'étude de caractérisation montre que c’est à partir de 10 mois que les animaux entrent dans une phase de la maladie qui les rend prédisposés au développement de rhabdomyosarcome et éventuelles autres comorbidités.
Caractérisation d’une nouvelle lignée murine permettant de manipuler des transgènes dans les cellules satellites gliales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées de tamoxifène un ou trois jours de suite, 20 souris d'une nouvelle lignée transgénique sont tuées quinze jours ou un mois plus tard par perfusion de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde, une opération de vingt minutes. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le gène modifié est présenté comme "non dommageable" et le protocole comme visant "l'absence de douleur", alors que le porteur reconnaît par ailleurs un risque de tumeurs des gonades à long terme, que la mise à mort programmée empêchera d'observer. Les ganglions rachidiens, la moelle épinière et le cerveau sont prélevés pour caractériser des cellules gliales encore mal connues, sur une étude pilote fixée à cinq animaux minimum par expérience.
Objectifs
Les ganglions nerveux présents le long de la colonne vertébrale contiennent les corps cellulaires des neurones sensoriels et permettent la transmission des informations provenant de la peau et des muscles (par exemple : température, position des muscles…). Un dysfonctionnement de ces neurones induit différentes pathologies incluant les douleurs neuropathiques et les troubles de la posture et de la marche. Ces neurones sont entourés de cellules satellites gliales qui contribuent à leur bon fonctionnement. FABP7 est une protéine qui est spéficiquement exprimée dans les cellules satellites gliales. L’objectif de ce projet est de caractériser et valider un nouveau modèle murin pour l’étude du rôle des cellules satellites gliales. Ce modèle murin exprime un gène modifié (non dommageable) seulement dans les cellules exprimant FABP7 et recevra des injections de tamoxifène. La procédure sera optimisée afin de respecter les devoirs de Réduction et Raffinement pour assurer l'absence de douleur et optimiser le confort des animaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de caractériser si le nouveau modèle murin exprime un gène modifié sélectivement dans les cellules satellites gliales et dans quelle proportion. Si nous trouvons que c’est le cas, ce modèle permettra de mieux comprendre le rôle des cellules satellites gliales dans la modulation de l’activité des neurones sensoriels. Ce modèle permettra d’appréhender le fonctionnement du système nerveux sensoriel périphérique en conditions normales et par consequent, d’aider à mieux comprendre et traiter les altérations des interactions glie-neurones en conditions pathologiques.
Procédures
Les souris seront injectées 1 fois par jour, avec du tamoxifène dilué dans de l'huile de maïs pendant 1 ou 3 jours consécutifs. L’étape d’injection avec du tamoxifène dure 20 secondes. 15 jours ou 1 mois après les injections, les animaux seront injectés avec du paraformaldehyde 4% sous anesthésie profonde, étape qui dure 20 minutes.
Impact sur les animaux
Stress dû l’injection de tamoxifène / Risques de formation de tumeurs gonadiques à long terme.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les ganglions rachidiens dorsaux, la moelle épinière et le cerveau et d’étudier au niveau cellulaire et moléculaire ces ganglions.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’utilisation de cultures de cellules satellites gliales ou de co-cultures neurones-cellules satellites gliales ne permet pas une étude physiopathologique des interactions propriocepteurs-cellules satellites gliales : les cultures induisent des altérations morphologiques et physiologiques (électrophysiologiques, calciques et biochimiques) majeures des propriocepteurs et des cellules satellites gliales ne reproduisant pas les mécanismes physiopathologiques existant in vivo. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences ex vivo et in vivo sur l’animal). Par ailleurs, aucun modèle in silico n'existe pour étudier les cellules satellites gliales, encore trop peu connues.
Réduction
Ce projet est une étude pilote utilisant un petit nombre d’animaux, les données préliminaires vont nous permettre d’affiner, d’arrêter ou de continuer les études dans le futur pour un projet plus global. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique, à savoir que les expériences histologiques et cytologiques nécessitent un minimum de 5 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux et optimiser nos résultats, certains organes (moëlle épinière et cerveau) autres que les ganglions rachidiens dorsaux seront prélevés en cas de demande des rapporteurs de nos articles. De plus, les croisements et les lots seront optimisés selon les génotypes et les sexes afin d’avoir le plus d’animaux expérimentaux avec le bon génotype et avec une représentation homogène des sexes.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages, en communauté de 2 à 5, dans des conditions d’hébergement contrôlées. L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal, tout au long de l’étude. Les animaux seront suivis quotidiennement par les mêmes expérimentateurs afin de réduire leur stress au maximum. Nous appliquerons des critères d’arrêt des souffrances et de prise en charge de la douleur selon un arbre décisionnel basé sur les points limites stricts et spécifiques, basés sur l'apparence et le comportement de l'animal. Avant l'expérimentation finale, les animaux recevront d’une anesthésie et une analgésie chimique.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude des fonctions et dysfonctions du système nerveux des mammifères. L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du système nerveux de la souris sont bien caractérisés. Il existe une vaste littérature sur le comportement sensorimoteur et sensoriel de la souris. De plus, la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées (transgéniques, «knockout» ou «knockin») est un grand avantage pour les études physiologiques car les gènes codant certaines protéines peuvent être manipulés (activés, inactivités, surexprimés) ou des transgènes exprimés chez ces animaux afin d’aider à mieux comprendre certains mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les maladies affectant les ganglions rachidiens dorsaux. Des souris adultes d’environ 8 semaines seront utilisées.
Endometriose : validation de modèles souris et évaluation de l’efficacité de candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Injectées d'hormone à trois reprises pour développer leur endomètre, puis tuées pour qu'on le leur prélève, des souris donneuses fournissent les fragments utérins qu'on injecte dans l'abdomen d'autres souris, munies la veille d'une mini-pompe implantée sous anesthésie. 2 400 souris femelles vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une perte de poids d'environ 15 % et une douleur persistante, qu'il mesure jusqu'à trois fois par semaine au filament de Von Frey et sur plaque chauffante, une heure par séance. La mise à mort sert à récupérer les organes et de grands volumes de sang, pour juger de l'effet de molécules candidates sur une endométriose provoquée en laboratoire.
Objectifs
L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but de développer un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose. L’objectif est donc d’obtenir des lésions d’origine endométriale, encapsulées dans les tissus et/ou organes abdominaux environnants, et présentant des signes de métaplasie en muscles lisses, et des signes de fibrose importants. Une étude pilote sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose et que ces lésions remplissent les critères de l’endométriose profonde. Dans un second temps, des candidats de traitement de l’endométriose seront administrés aux animaux afin de tester leur efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’endométriose profonde. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées voire absentes.
Procédures
Ce projet vise à tester des molécules chimiques ou biologiques dans un modèle d’endométriose chez la souris. Pour mettre en place l’endométriose, un groupe de souris donneuses recevra trois injections de benzoate d’estradiol à D-7, D-5, D-3 qui développeront l’endomètre, puis ce groupe sera euthanasié pour récupération du tissu utérin. Plusieurs groupes de souris receveuses seront pourront être implantés ou non avec une mini-pompe osmotique délivrant de la substance P ou du sérum physiologique à D-1,. La pose sera réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : dérivé morphinique (Buprénorphine) et alpha2. La plaie sera ensuite désinfectée régulièrement et un cicatrisant (Dermaflon crème) pourra être appliqué. Si besoin, la suture sera reprise sous anesthésie à l’isoflurane. Ces souris recevront ensuite à D0 une injection intrapéritonéale de fragments utérins issus des souris donneuses. La substance P participera à la mise en place de l’inflammation caractéristique de l’endométriose. Les souris receveuses pourront recevoir un composé chimique ou biologique à tester, ou un placebo : Administrations intra veineuses, intra vaginales, intrapéritonéales, sous cutanées sous anesthésie générale si nécessaire ; intra musculaires, intra dermiques sous anesthésie générale avec analgésie systématique (buprénorphine) Administration per os : gavage sous contention Des tests visant à quantifier la douleur abdominale des animaux seront réalisés (1 heure maximum par animal, maximum 3 fois par semaine). Des prélèvements de sang et de tissu (après la mort) pourront être réalisés in vivo afin de doser des paramètres d’intérêt de la maladie et donc d’évaluer l’efficacité des composés administrés sur le développement de l’endométriose. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous suspectons une douleur persistante modérée ou sévère transitoire, et des pertes de poids transitoires, c’est pourquoi il sera classé en sévère. Ce degré sera revu suite à l’étude pilote. Nous nous attendons à observer une perte de poids transitoire chez les animaux du fait de l’inflammation générée, environ 15%, au début de l’induction de la maladie (pendant la première semaine), avec ensuite une reprise de poids. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. Des tests de douleur pourront être réalisés et génèreront un stress et une douleur modérée. En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes et donc un stress léger. La pose de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez la femme.
Réduction
Un nombre minimum de 8 souris receveuses adultes par groupe sera par exemple nécessaire pour pouvoir observer une réduction significative de l’étendue des lésions et de leur fibrose suite à un traitement. Ce nombre pourra monter jusqu’à 16 en cas d’ajout d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, d’autres colorations en histologie et/ou l’expression de gènes dans les lésions, certaines analyses étant incompatibles les unes avec les autres. Cette analyse sera effectuée au moyen du test ANOVA. Par ailleurs, on comptera entre une et deux souris donneuses par souris receveuses selon le nombre de lésions visées par receveuse.
Raffinement
Le poids des animaux sera suivi au moins 2x/semaine, et quotidiennement en cas de perte de poids >10%. En cas de perte de poids constatée >10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. Les pertes de poids >20% ou persistantes (15 à 20% pendant 3 jours consécutifs) seront un point limite. Indépendamment des tests comportementaux (Von Frey, hotplate), une grille de scoring de douleur a été mise en place et sera raffinée après la première étude (cf procédure). Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. Dans ce cas, un traitement antalgique (buprénorphine) pourra être administré. Les AINS seront évités afin de ne pas modifier l’induction de la maladie. En cas de test de hotplate, un animal ne présentant pas de réponse au test sera systématiquement retiré de la plaque au bout d’une minute de contact. Une habituation à la plaque la veille sera prévue (30 secondes à une minute). Une habituation au plancher grillagé du test de Von Frey sera prévue la veille (30min) et sera mise en place avant les tests à chaque mesure (30min). En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes. Les animaux seront surveillés afin de détecter des signes d’agressivité ou de stress. Les animaux agressifs seront séparés de leurs congénères, et en cas de stress des enrichissements supplémentaires seront apportés. Les animaux seront monitorés matin et soir. La pose éventuelle de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée. La plaie sera inspectée quotidiennement jusqu’à complète cicatrisation. En cas de besoin, une désinfection pourra être réalisée, ainsi que l’application d’une crème cicatrisante. En cas de déhiscence de plaie dans les trois jours post-chirurgie, la plaie pourra être reprise en suture. En cas de non cicatrisation de la plaie et de persistance au-delà d’une semaine d’une plaie déhiscente, l’animal concerné sera euthanasié.
Choix des espèces
- Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Des femelles sevrées (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, le modèle d’endométriose profonde étant bien décrit chez les animaux adultes.
Elevage et caractérisation génétique (par des prélèvements de tissus) de rongeurs génétiquement modifiés utilisés dans l’étude des lymphocytes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Produites en interne pour alimenter d'autres protocoles d'immunologie, 3 000 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, à raison de 600 par an. Chacune subit au sevrage, à trois semaines, l'ablation de l'extrémité de la queue, et une biopsie de l'oreille si un second prélèvement s'avère utile. Aucune n'est tuée dans ce projet, dont l'objet se réduit à identifier génétiquement les animaux : 2 800 partent vers des expérimentations ultérieures et 200 sont gardées comme reproductrices. Le porteur indique explorer le prélèvement de poils, de salive ou de fèces pour remplacer le bout de queue, sans donner d'échéance.
Objectifs
L'objectif du projet est de caractériser génétiquement les souris transégniques produites pour être utilisées en immunologie dans l'étude d'une population de lymphocytes T.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront la caractérisation génétique de la lignée permettant l'optimisation de la gestion de l'élevage et permettant de fournir des animaux pour les projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP expérimentation)
Procédures
Le projet permettra d'identifier les animaux à partir d’un échantillon de queue prélevé par biopsie caudale (5 secondes). Si besoin d'un second prélèvement, une biopsie auriculaire sera prélevée (5 secondes aussi). Cela représente 600 animaux par an.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont celles liées au prélèvement de biopsie de queue ou d'oreille pour génotypage qui peut entrainer une sensation d'inconfort. Cette nuisance est passagère et n'entraîne pas de complications majeures.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie pour utilisation continue pour les expérimentations (2800 animaux) ou pour maintien de la lignée (reproducteurs, 200 animaux).
Remplacement
Nous utilisons une méthode de génotypage non-invasive dans la mesure du possible: détection de la GFP par illumination sous lampe UV. Néanmoins pour la lignée porteuse des modifications génétiques autres que GFP, il n'y a pas de remplacement possible et nous devons réaliser un génotypage par PCR. Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation de lignées murines génétiquement altérées pour étudier de manière mécanistique la biologie des lymphocytes MAIT dans un organisme vivant intégré.
Réduction
Le nombre d'animaux qui vont subir le prélèvement pour génotypage est réduit à son minimum: La production est lié aux besoins des projets scientifiques. Les schémas d'accouplement sont optimisés pour ne produire que des animaux "utiles" porteurs de modifications génétiques d'interet.
Raffinement
Pour minimiser la douleur associée au prélèvement de l'extrémité de la queue ou d'oreille des souris de 3 semaines, l'équipe de l'animalerie travaille activement à l'exploration de nouvelles techniques de génotypage. Des approches alternatives, comme le prélèvement de poils, de salive ou de fèces, sont actuellement en cours d'étude. Le prélèvement de tissu est réalisé par une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée de façon à limiter les effets indésirables (stress et douleur). Du Douxocalm sera appliqué en cas de signes de stress ou douleur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix en immunologie du fait de la parenté génétique avec l'humain et car les lymphocytes T (notamment les MAIT) y ont été largement étudiés. La souris est l'espèce pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques et de modèles de pathologies bien établis permettant l'étude de la biologie des lymphocytes MAIT. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension).
Mise en place d’un modèle expérimental de cataracte sénile chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Des ratons de dix jours, dont le cristallin n'a pas fini de mûrir, reçoivent une injection sous la peau qui rend leur œil opaque. 810 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit ensuite des gouttes deux à trois fois par jour, ou des injections quotidiennes, ou des injections péri-oculaires hebdomadaires sous anesthésie, jusqu'à sa mise à mort vers trente jours de vie. Le porteur qualifie de "sénile" la cataracte ainsi obtenue chez des nouveau-nés. 720 rats sont tués pour l'analyse des tissus, les 90 mères gestantes écartées avant la fin pouvant être réutilisées dans d'autres procédures après avis du vétérinaire.
Objectifs
La cataracte est une affection oculaire très courante chez l'homme comme chez l'animal. Elle touche plus d’une personne sur cinq à partir de 65 ans et près de deux sur trois après 85 ans. Elle est en augmentation constante dans les pays développés du fait de l’allongement de l’espérance de vie. Il s’agit de la première cause de cécité chez l’homme, avec plus de 20 millions de personnes atteintes dans le monde. Elle est aussi l'une des causes principales de cécité chez l’animal domestique. Cette affection est caractérisée par une opacification du cristallin, la lentille naturelle de l'œil, qui entraîne une diminution de la vision, une vision trouble ou brouillée, une sensibilité accrue à la lumière et des difficultés à voir la nuit. La cataracte est souvent liée au vieillissement, mais peut aussi résulter de maladies, de traumatismes ou de traitements médicamenteux. À l’heure actuelle, la prise en charge médicale de la cataracte comporte des mesures préventives ou symptomatiques censées ralentir l’apparition de l’opacification du cristallin et son évolution. Chez l’homme comme chez l’animal, la chirurgie de la cataracte reste le seul traitement curatif disponible à ce jour. Actuellement plusieurs études étudient de nouvelles pistes de traitements. Ce projet s’inscrit donc dans ce courant et a pour objectif de mettre en place un modèle expérimental afin de tester et valider ces nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de la mise en place d'un modèle expérimental de cataracte sénile chez le rat sont multiples et visent principalement à améliorer la compréhension de cette maladie ainsi qu'à développer de nouveaux traitements. Ce projet pourra nous aider à : 1. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l'efficacité de nouveaux traitements potentiels ou de médicaments existants pour ralentir ou inverser la progression de la cataracte. 2. Observer comment les traitements sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans un organisme vivant, ce qui est crucial pour le développement de médicaments. 3. Fournir des données précliniques sur la sécurité et l'efficacité des traitements avant de passer aux essais sur l'homme.
Procédures
L'induction de la cataracte se fera par une injection sous-cutanée unique à 10 jours de développement. La durée de l’acte ne dépassera pas plus d’une minute par animal. La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 30 jours après la naissance. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 30 jours après la naissance. Là aussi, la durée des administrations et de la manipulation des animaux ne dépassera pas plus d’une minute par animal. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 30 jours de l'étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation au biomicroscope) seront généralement hebdomadaires et ne dureront pas plus de 5 minutes par animal. Tous les examens décrits ici sont également pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Ces examens sont totalement indolores et ne durent que cinq minutes tout au plus par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés à leur manipulation et à l’administration des produits. L'affection recherchée - la cataracte sénile - n'induit pas de douleur chez l'animal. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet secondaire en dehors de l'opacification du cristallin, d'une dégradation de la vision et d'une éventuelle sensibilité accrue à la lumière. La manipulation des animaux sera limitée au maximum et sera réalisée par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.
Devenir
A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, coton pour le nid) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. Dans le cas où des signes de douleur sont manifestés, un analgésique sera administré. Cette administration sera renouvelée au tant que nécessaire. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis sa mise en place par Ostadalova et al. en 1977. Il est bien caractérisé. L'espèce choisie est le rat jeune, avant la fin de la période critique de maturation du cristallin. C'est l'espèce référence pour ce modèle, l'opacification du cristallin est très facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité et une bonne fiabilité De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. L'induction se fera à 10 jours de développement du jeune rat avant la fin de la période critique de maturation du cristallin.