Rongeurs

Pour tester si une supplémentation nutritionnelle et l'exercice volontaire renforcent l'effet d'une immunothérapie anticancéreuse, 84 souris mâles de cinquante semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour un prélèvement de sang et de tissus. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la veine de la queue, puis un anticorps anti-PD1 dans le péritoine tous les quatre jours pendant trente jours, avec une imagerie hebdomadaire sous anesthésie. Les tests mesurent la force par traction sur un dynamomètre, l'animal étant tiré par la queue, la vitesse maximale de course sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement, et l'équilibre sur un cylindre rotatif. Le porteur signale que la tumorisation pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, une léthargie et une agressivité accrue, et prévoit la mise à mort dès trois points limites notables ou un point limite sévère.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire. Afin de répondre à cet objectif, le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs (un principal et un second pour la réalisation d'imagerie optique in vivo)

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivi du volume tumoral sera réalisé par imagerie de biolomuminescence à raison d'un examen par semaine sur une durée 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implantation (J0) puis à J15 et J30 post-implantation. Pour ce projet, l'ensemble des procédures se déroulera dans l'EU.1. Seule les acquisitions d'imagerie de bioluminescence seront réalisées au sein de l'EU.2.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6 dans des cages T4 (55cm x 33cm, soit 1815cm2, et 19cm de hauteur sous grille). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes 1 et 2. Afin de réaliser les imageries optique dans l'EU.2 les animaux seront transportés dans des cages à filtres dans un véhicule dédié. Le transport dure moins de 5min d'un site à l'autre. A leur arrivée, les animaux seront hébergés au calme dans une armoire ventilée.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.

144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un composé chimique ajouté à leur eau de boisson déclenche une inflammation intestinale, en trois cycles de cinq jours à concentrations croissantes, entrecoupés de quatre jours d'eau avec ou sans antibiotiques. Le porteur indique que cette inflammation peut provoquer des diarrhées et une perte d'environ 25 % du poids initial, poids retrouvé deux à sept jours après la fin du traitement. Les souris sont hébergées sur un site et transportées vers un second uniquement pour y être mises à mort, leurs organes étant ensuite analysés par histologie et par cytométrie en flux.

Objectifs

Les bactéries du système digestif (microbiote intestinal) assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs : les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote intestinal et dans la réduction de l’inflammation du colon. Décrypter les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains ouen cas d’inflammation intestinale chronique, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Nous souhaitons maintenant déterminer le rôle des bactéries dans l'activation et dans la fonction protectrice des lymphocytes T au cours de l’inflammation du colon. L'étude permettra de mieux comprendre le mécanisme de protection des lymphocytes T au cours de cette inflammation. Le modèle de souris nécessite des conditions d’élevages particulières qui sont disponibles dans le laboratoire 1. L’euthanasie et les prélèvements d’organes seront réalisés dans le laboratoire 2.

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et les bactéries du système digestif. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris recevront dans l’eau de boisson un composé chimique qui génère une inflammation intestinale pendant 3 cycles de 5 jours à des concentrations progressives. Chaque cycle est suivi de 4 jours d’eau avec ou sans traitement d’antibiotiques. Le projet est réalisé sur le site n°1 sauf l’acte de mise à mort qui est réalisé sur le site n°2.

Impact sur les animaux

L’inflammation intestinale est induite par administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson et est associé à des effets indésirables attendus. Elle peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 25% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet, les antibiotiques utilisés n’ont jamais montré d’effet indésirable lorsqu’ils sont utilisés pour éradiquer les bactéries. De plus, la bactérie utilisée pour le projet est une bactérie naturellement présente dans le système digestif. Le transport peut engendrer un stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par histologie ou cytométrie en flux.

Remplacement

Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules dans un organisme entier. Le rôle (bénéfique ou délétère) de l’interaction hôte-microbiote ne peut pas être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.

Réduction

Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (changes de cages etc…) et une observation accrue durant l’inflammation intestinale induite, susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress, et cela plusieurs fois dans la journée pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet délétère. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (3 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport selon leur répartition d’origine afin de ne pas induire un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera rajoutée de la litière, de l’enrichissement et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Le transport se fera dans un véhicule agréé et climatisé.

Choix des espèces

La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature.

Une greffe intracérébrale de quarante-cinq minutes, au moins dix injections pour l'imagerie de bioluminescence, dix séances de radiothérapie et douze administrations du composé testé. 164 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet évalue si la surexpression d'une protéine ralentit la croissance d'un glioblastome humain greffé dans leur cerveau et améliore la réponse aux traitements standards. Les souris sont choisies immunodéprimées pour qu'elles ne rejettent pas le greffon tumoral humain, et quarante-huit d'entre elles, dites "satellites", sont tuées plus tôt pour l'analyse de leurs tissus, les autres l'étant dès qu'un point limite est atteint, perte de poids et troubles de la motricité surtout.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment l'augmentation de la quantité d'une protéine affecte la croissance des tumeurs cérébrales chez les souris, et favorise leur réaction aux traitements anticancéreux habituels. L'objectif final est d'appliquer cette méthode aux patients. Des études précédentes sur des données de patients ont montré que plus cette protéine est présente, meilleure est la survie des patients, surtout chez les femmes. En laboratoire, nous avons aussi observé que lorsqu'on augmente la quantité de cette protéine, le nombre de cellules tumorales diminue de moitié. De plus, nous avons constaté qu'un activateur de cette protéine a un effet antitumoral sur des tumeurs greffées sous la peau de souris, qu'elles soient mâles ou femelles. Notre objectif est maintenant d'étudier comment une augmentation de la quantité de cette protéine combinée à son activation par une molécule spécifique affecte la croissance tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux standards dans un modèle de tumeur intracérébrale chez la souris (qui se rapproche de la réalité chez l'humain). Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour comprendre le rôle de la protéine étudiée dans l’augmentation de la survie des patients et éventuellement proposer l'utilisation de l'activateur de cette protéine pour le traitement des glioblastomes chez les patients dont la tumeur présente une forte quantité de cette protéine. Cette étape est indispensable pour soutenir le transfert clinique de nos travaux en lien avec une thèse de doctorat et les financements de la Ligue contre le cancer et du CNRS. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences d'apparition des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettrait d'apporter de nouvelles voies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des inducteurs (qui augmentent la quantité) et des activateurs (qui augmentent la fonctionnalité) de cette protéine dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimio-sensibilisation).

Procédures

- greffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min (EU1) - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections) : durée 15 min (EU2) - Traitement par radiothérapie (10 itérations) : durée 10 min pour chaque session (EU2) - Traitement par le composé d'intérêt (12 itérations) combiné ou nonà la chimiothérapie (10 itérations) : durée 1 min par traitement (EU1). - Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min (EU1)

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l'implantation même du glioblastome (apparition d'une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Puis, le schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et l'imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Lorsque les sessions de bioluminescence sont le même jour que la radiothérapie, une seule anesthésie sera réalisée, l'irradiation et l'imagerie se faisant sur le même site où est hébergé l'irradiateur. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux. Les administrations quotidiennes de l'activateur de la protéine conduisent à un dérangement journalier des animaux, le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Le site d'injection dans le péritoine sera alterné chaque jour (gauche-droite) pour éviter les réactions liées à l'injection et des aiguilles très fines seront utilisées pour l'injection.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue des procédures. Ainsi 164 souris au maximum seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 58 souris femelles et 58 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (48 souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser une analyse des tissuss pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à un traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d'une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. En outre, la réponse d'une tumeur traitée par un médicament dépend de la quantité de médicament qui parvient à la tumeur. De plus, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.

Réduction

Chacune des 3 étapes sera d’abord réalisée chez des animaux femelles puisque la surexpression de la protéine d'intérêt est de bon pronostic essentiellement chez les femmes, puis éventuellement testée chez des animaux mâles pour évaluer la pertinence de cette modulation hormonale pour les hommes. Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées étape par étape, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux "femelles" associés à l'étape 1 qui concerne la comparaison in vivo de la croissance tumorale de cellules avec une forte quantité de protéine par rapport à des cellules tumorales ayant une quantité modéré de la protéine étudiée. Nous implanterons d'abord la concentration habituelle de cellules : si cette dernière offre un bon taux de prise tumorale et une croissance tumorale acceptable cette concentration sera validée et les animaux du groupe suivant ne seront pas utilisés. A l'inverse, si cette concentration s'avère insuffisante, les souris du groupe 3 seront greffées avec une concentration double. La concentration "optimale" retenue sera celle utilisée dans le reste de l'étude. Notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Concernant le nombre de souris satellites, il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs dans les tissus prélevés : ces analyses sont fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour révéler un effet, s’il existe. Ainsi on estime -à priori- que même si l’effet des traitements est faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour assurer une puissance statistique suffisante (simulation par logiciel de calcul de puissance). Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, la comparaison se fera aussi indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures d'imagerie seront réalisées en suivi de traitement. Le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé 10 animaux par groupe pour assurer une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post opératoire rigoureux) puis à la suite de la greffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de l'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Quel que soit le groupe, nous réaliserons la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).

Choix des espèces

Dans les études menées pour comprendre le développement des cancers, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 7 semaines au moment des greffes (20 à 26g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.

La veille de la chirurgie, les 298 souris passent des tests comportementaux dont le porteur ne précise pas la nature, répétés chaque jour du premier au quinzième jour. À J0, le crâne est ouvert pour injecter du NMDA dans le striatum et déclencher une réaction excitotoxique, puis un cathéter posé dans la queue sert à administrer le traitement, toujours sous anesthésie. Le lendemain vient une IRM sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À la fin, chaque animal est ouvert du ventre au thorax pour une ponction de sang dans le cœur, puis tué par perfusion transcardiaque qui fixe le cerveau avant son prélèvement.

Objectifs

Cette étude vise à déterminer l’effet neuroprotecteur de thérapeutiques potentiels sur la mort neuronale induite par la stimulation de la voie excitotoxique par l’administration du traitement de référence face aux accidents vasculaires cérébraux ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène, en utilisant un modèle de lésion cérébrale via l’injection de N-méthyl-D-aspartate au sein du striatum cérébral chez la souris.

Bénéfices attendus

Chez l’Homme, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux réaliseront différents test comportementaux (à J-1, J+1 jusqu’à J+15 post chirurgie) visant à quantifier et à observer des différences (et donc d’observer une récupération fonctionnelle ou pas) entre les différents groupes sur des déficits sensoti-moteurs induits par la lésion cérébrale générée par le modèle de chirurgie. A J0, ils seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter du NMDA, provoquant ainsi une réaction excitotoxique au sein du striatum. Cette chirurgie sera suivie de l’administration d’un des différents traitements par voie intraveineuse après la pose d’un cathéther caudal, toujours sous anesthésie générale. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction intracardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. Les procédures douloureuses (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement de sang et du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales les plus étudiées dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 15. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront 5 par cage avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et une bûchette de peuplier), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux sont réceptionnés au sein de l’animalerie 2 semaines avant la réalisation de l’acte chirurgical pour permettre leur habituation et la diminution de leur stress dû au transport et au changement d’environnement. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et un analgésique sera administré par voie intrapéritonéale avant incision ou pour l’étape de mise à mort par perfusion intracardiaque. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux de l’animal pour éviter le déssèchement de la cornée. L’incision de la peau est précédée d’une tonte préalable du pelage, d’une désinfection ainsi que de l’application d’un analgésique local au niveau du site d’incision. Le choix de la technique de sutures se porte sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, les gaz anesthésiques sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivant l’opération.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle ainsi que le devenir des lésions cérébrales induites par le modèle excitotoxique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids d’environ 35g ou de 25g selon la souche utilisée. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles.

Pour vérifier, dans une étude qualifiée de pilote, si un AVC provoque des altérations dans des régions du cerveau non connectées à la zone lésée, 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes pour déclencher l'infarctus cortical, puis une perfusion intracardiaque de vingt minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie le modèle de peu invasif et annonce qu'il ne s'accompagne "typiquement" pas de symptômes majeurs, tout en prévoyant douleur et perte de poids après l'opération. La douleur est notée jusqu'au deuxième jour selon une grille à cinq critères, dont l'aspect de la plaie et les changements de poids, l'animal qui ne montre aucun signe passant ensuite à un suivi hebdomadaire.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont une cause majeure de déficits moteurs à long-terme et de déficits cognitifs. Certains symptômes se manifestent tardivement et ne sont pas forcément liés à la région initialement lésée, suggérant qu’un AVC dans une région spécifique peut aussi causer des modifications dans d’autres régions du cerveau. Des altérations dans des régions directement connectées à la zone infarcie ont déjà été corrélées à l’apparition de troubles tardifs. Cependant, les régions associées aux fonctions impactées (les fonctions de mémoire par exemple) ne sont pas toujours directement connectées à la région lésée. Nous émettons donc l’hypothèse que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux régions connectées à l’infarctus primaire mais s’étendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette étude pilote, nous voulons induire un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle murin afin d’étudier l’impact de la lésion dans d’autres régions du cerveau, pas directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous aurions identifié un des mécanismes qui pourraient sous-tendre la manifestation de symptômes fonctionnellement liés à des zones non connectées dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider notre observation préliminaire qui vise à mieux comprendre les mécanismes sous-tendant les troubles de mémoire qui se manifestent tardivement après un AVC, même quand la région initialement lésée n’est pas impliquée dans les fonctions mnésiques. Nous émettons l’hypothèse que l’altération d’un mécanisme cellulaire associé à la mémoire ainsi qu’un état inflammatoire pourraient être présents dans des régions non directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous effectuerons une étude complète qui pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux troubles cognitifs post-AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Ils seront enfin soumis à une perfusion intracardiaque toujours sous anesthésie générale (20 minutes). Tous les animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et typiquement ne s’accompagne pas de symptômes majeurs, ce qui rend le modèle facilement utilisable et limite la souffrance animale. Cependant, suite à la procédure chirurgicale, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir. Les animaux seront observés quotidiennement pendant deux jours. La douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon une grille d’évaluation, organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si après deux jours l’animal ne montre aucun signe de souffrance, il sera suivi ensuite une fois par semaine. En cas de détérioration ou de souffrance animale, l’animal sera pris en charge par l’utilisateur ou par la vétérinaire.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

L’AVC sera induit par la méthode la moins invasive disponible actuellement pour reproduire certain aspects de la pathologie humaine. Aujourd’hui ils n’existent pas des modèles in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) pour étudier des conséquences anatomiques et cellulaires induites par un AVC dans les régions non lésées initialement et donc pas de méthode alternative permettant de REMPLACER les animaux. En effet, cette étude nécessite la complexité et la connectivité du cerveau adulte.

Réduction

Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, la perfusion,des expériences d’électrophysiologie et d’immunohistochimie), ainsi que de la variabilité des résultats. Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Nous adapterons d’abord le protocole afin d’avoir une lésion initiale reproductible, de taille maximale limitée au cortex, et seulement ensuite les autres expériences seront réalisées.

Raffinement

Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être. Ils seront placés dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 animaux par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Dans une étude précédente, le nombre d’animaux qui ont montré des signes de souffrance dû à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%). Nous nous attendons à ce que la lésion soit plus petite avec un temps d’illumination plus court et donc que ce pourcentage se rapproche de zéro. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, l’animal sera pris en charge par l’expérimentateur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris et il a été démontré que les AVC s’accompagnaient de modifications dans des structures du cerveau pas initialement lésées, mais connecté à la région infarcie. Ce modèle permet de produire des tranches de cerveau pour réaliser des études d’électrophysiologie et d’immunohistochimie afin d’explorer des modifications dans d’autres régions du cerveau pas encore étudiées. Nous utiliserons des souris âgées de 16-24 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC chez un animal adulte et correspond à un jeune adulte chez l’homme.

La moitié des ratons sont retirés de la cage de leur mère trois heures par jour, du deuxième au douzième jour après la naissance. 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de tissus nerveux. Le protocole cherche à reproduire chez le rat les effets de la prématurité humaine, puis à enregistrer l'activité des neurones de la moelle épinière et de l'hippocampe, le porteur décrivant lui-même ce stress comme installant une anxiété chronique et des troubles durables de l'adaptation au stress. Les mères ne retournent pas à la reproduction et sont tuées après le sevrage, parce que la séparation a altéré le fonctionnement de leur système nerveux.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.

Procédures

La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.

Devenir

Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.

Réduction

Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.

Raffinement

Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.

Choix des espèces

Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent