Rongeurs
Evaluation préclinique de nouvelles sondes d’imagerie TEP/ IRM 19F polyfluorées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées en fin de protocole pour que leur sang soit analysé, 40 souris Swiss saines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la moitié menées sous anesthésie sans aucun réveil. Chacune reçoit une injection intraveineuse d'une sonde fluorée, radioactive ou non, puis reste anesthésiée jusqu'à deux heures pour une séance d'imagerie TEP et IRM d'environ quatre-vingt-quinze minutes. Le projet sert à valider ces sondes et à régler les séquences d'IRM au fluor 19, sur des animaux sains, avant d'éventuels modèles pathologiques dans un projet ultérieur. Le calcul statistique présenté justifie un minimum de 20 souris, là où le projet en déclare 40, sans expliquer le doublement.
Objectifs
La tomographie par émission de positrons (TEP) est une technique d’imagerie in vivo non invasive de référence pour la visualisation, la caractérisation et l’évaluation quantitative de processus biologiques via des radio-traceurs spécifiques. Le fluor-18 (18F) est le radio-isotope le plus commun pour développer des radio-traceurs TEP. De nombreux radio-traceurs radio-fluorés sont produits régulièrement pour les examens précliniques et cliniques dans le domaine des cancers, des maladies neurologiques ou cardiaques. Cependant, la production de ces radio-traceurs nécessite une infrastructure lourde qui limite leur disponibilité. Sous sa forme non radioactive (19F), le fluor est un noyau stable possédant les propriétés magnétiques appropriées pour être détectable en Imagerie par Résonance Magnétqiue (IRM). Si l’utilisation de sondes fluorées stables (pouvant être préparées à l’avance, conservées, stockées et suivies in vivo sur plusieurs jours) est un avantage par rapport aux sondes radioactives, la sensibilité de l’IRM 19F est assez faible, limitant son exploitation à ce jour. Plusieurs conditions doivent être remplies pour générer des sondes fluorées efficaces, telles qu’une concentration importante de 19F tous magnétiquement équivalents. Nous avons développé une nouvelle famille de sondes polyfluorées originales qui répondent à ces critères, et qui ont, en plus, la possibilité d’être radiomarquées au fluor-18 en une seule étape. Le projet est d’exploiter ces sondes bimodales pour la double imagerie TEP/IRM 19F, la TEP permettant, par sa grande sensibilité, de suivre aisément le devenir in vivo des sondes et d’évaluer rapidement leur pharmacocinétique, leur biodistribution et leur stabilité in vivo, pour ensuite faciliter l’optimisation des séquences IRM 19F sur la base des images TEP. Ainsi, l’objectif est double : d’une part, évaluer/valider les sondes fluorées originales, et d’autre part, optimiser l’IRM 19F sur la base de la TEP utilisée comme référence.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus concernent d’une part la validation des sondes fluorées radioactives ou non AA* et/ou BB* par TEP-IRM 19F, et d’autre part l’optimisation de l’IRM 19F. Au-delà de ces bénéfices, les perspectives attendues sont l’identification d’une nouvelle famille structurale de sondes fluorées pour l’IRM 19F comme alternatives aux radiopharmaceutiques radiofluorés TEP.
Procédures
Pour chaque animal : 1 injection iv d'une sonde radioactive ou non radioactive, 1 anesthésie (2 h maximum), une acquisition imagerie TEP/IRM 1H ou IRM 1H/19F (95 min maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont faibles: stress à l’induction de l’anesthésie, éventuelle douleur au point d’injection (mais encore jamais observée jusqu’à aujourd’hui dans nos expériences antérieures). Lors de l’administration transcutanée du produit, une analgésie complémentaire grâce à l’utilisation du N2O avec l’oxygène et isoflurane pourra être mise en place.
Devenir
En fin de protocole d'imagerie, les animaux seront mis à mort. Le sang sera prélévé pour des analyses de (radio)métabolites par (radio)HPLC.
Remplacement
L’avantage de l’imagerie moléculaire préclinique in vivo (TEP ou IRM) utilisée en mode dynamique est qu’elle est la seule technique qui permet d’accéder à l’ensemble des données pharmacocinétiques et de biodistribution des sondes d’imagerie, avec une grande fiabilité. Aucune étude in vitro ne peut être utilisée en remplacement. De plus, l’animal entier est visualisé en imagerie, il n’est donc pas possible de faire abstraction aux animaux.
Réduction
L’imagerie moléculaire (TEP ou IRM) est un outil puissant pour évaluer un nouvel agent d’imagerie avec un nombre limité et minimisé d’animaux et selon un protocole peu invasif. Le projet est organisé de façon à optimiser le nombre d'animaux par groupe. Le nombre d’animaux prévu par condition expérimentale est restreint (minimum 5, portant le nombre total d’animaux nécessaires de 20 minimum), et reste suffisant pour les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations interindividuelles.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle respectant leurs besoins physiologiques et comportementaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Les cages sont enrichies par la présence d’un dôme de cellulose et de lanière de papier kraft permettant de réaliser des abris. Les imageurs TEP/IRM ainsi que l'ensemble de l'environnement technique, sont adaptés aux rongeurs. Afin de limiter leurs mouvements durant l'imagerie et de maintenir des conditions physiologiques correctes, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane dans un mélange O2/N2O) avec un monitoring de température et un suivi de la fréquence respiratoire. Les injections se feront sans recours à la chirurgie, et aucune douleur n'est attendue. Les animaux seront surveillés durant les 24 heures suivant les expériences d’imagerie afin de contrôler l'absence de signes visibles de douleur (prostration, perte de poids, état anormal du poil ou des yeux) ou de problème au niveau du point d'injection (démangeaisons, état anormal de la peau). En cas d’apparition de ces signes, il est prévu un traitement analgésique à la buprénorphine adapté. La non-résolution de cette douleur est considérée comme un point limite et entrainera une mise à mort de l'animal. Nous n’avons jamais eu besoin de recourir à des antidouleurs dans les protocoles d’imagerie TEP réalisés jusqu’à ce jour.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront tous, dans le cadre de ce projet d’évaluation préliminaire des sondes d’imagerie, exclusivement des souris Swiss sains, mâles ou femelles indifféremment. L’utilisation de d’animaux sains est indispensable en première évaluation de nouveaux agents d’imagerie pour obtenir les données de référence avant l’étape suivante (dans un projet ultérieur si résultats positifs) d’évaluation dans des modèles pathologiques. Le laboratoire dispose de l’infrastructure nécessaire pour les expérimentations chez les rongeurs. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (à partir de 8 semaines), de tailles et poids raisonnables et compatibles avec le volume du berceau de l’imageur.
Etude des structures et fonctions neurales pour l’orientation spatiale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour cartographier les neurones de l'orientation spatiale, 480 souris vont être tuées par perfusion intracardiaque afin que leur cerveau soit prélevé. 250 d'entre elles subissent d'abord une chirurgie stéréotaxique d'une heure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des dommages osseux et tissulaires puis une attente de deux jours à cinq semaines. Les 230 autres sont anesthésiées et tuées sans avoir rien subi d'autre, leur cerveau servant de matériel pour des enregistrements sur tranches ex vivo. Le porteur renvoie les bénéfices au diagnostic précoce de la maladie d'Alzheimer, de l'épilepsie du lobe temporal et de la sclérose en plaques, loin de l'objet immédiat du projet.
Objectifs
Une meilleure compréhension des fonctions cognitives comme l'orientation dans l'espace et dans le temps est un défi majeur en neuroscience. Le cortex, l’hippocampe, et le thalamus jouent un rôle important dans l’orientation spatiale et la mémoire. Ce circuit est une des premières régions du cerveau affectée dans la maladie d’Alzheimer, et de l’épilepsie du lobe temporale. La myélinisation du circuit peut être déficiente dans le cas de la sclérose en plaque. Ce projet vise à mieux comprendre les aires du cerveau qui sont impliqués dans l'orientation. Notamment, nous étudions ces aires au niveau cellulaire, c’est à dire, au niveau des neurones qui transmettent les signaux. On s’intéresse à leurs propriétés intrinsèques et à leurs propriétés synaptiques, qui ensemble déterminent le fonction du circuit. Notre recherche vise à élucider la connectivité anatomique et fonctionnelle. Nous souhaitons mieux comprendre comment les informations sensorielles de l’oreille interne et les informations visuelles sont intégrées pour permettre l'orientation spatiale de l'individu. Nous examinerons la contribution des interneurones inhibiteurs pour la stabilité et la flexibilité du réseau et de la mise à jour du signal de l'orientation. Et nous allons apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques de la myélinisation du circuit de l'orientation spatiale.
Bénéfices attendus
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l’environnement. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’intégrer les informations sensorielles venant de plusieurs modalités sensorielles, et comment s’effectue la mise à jour de ces informations du monde externe par rapport à une représentation interne. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures du circuit de l’orientation spatiale est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs et à des déficits d'orientation. Une partie du projet vise à déterminer l'impact fonctionnel des oligodendrocytes et de la myéline au niveau physiologique et cellulaire. Il permettra de mieux comprendre le rôle de la myéline pour l'intégration multisensorielle de signaux de différentes régions cérébrales. De plus, chez les patients atteints de sclérose en plaques, maladie inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central, des troubles cognitifs sont associés à des lésions de régions cérébrales impliquées dans l'intégration multisensorielle. Nos travaux pourront apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques des déficits cognitifs dans la sclérose en plaques.
Procédures
Les 480 souris de cette étude subiront une perfusion intracardiaque. Une partie des animaux (250 souris en total) subiront d'abord une chirurgie (durée 1 heure, surveillance 1 à 3 jours) et après un interval de 2 jours à 5 semaines, une perfusion intra-cardiaque (durée 2-5 minutes). L'autre partie des animaux (230 souris en total) subiront uniquement une perfusion intracardiaque (durée 2-5 minutes). Dans tous les cas, la mort des animaux suit la perfusion intra-cardiaque. Les cerveaux sont prélévé sur animal mort.
Impact sur les animaux
Les injections stéréotaxiques dans le cerveau prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 jour, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments.
Devenir
Tous les animaux sont mise à mort par perfusion intra-cardique avec dosage des anesthésiques pour prélèvement d'organes et analyses histologiques.
Remplacement
L’intégration des signaux sensorimoteurs se produit à travers de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions au niveau neuronal, gliale, et circuit du système de l’orientation spatiale, il est nécessaire de travailler avec des neurones marqués au préalable. Il s’agit d’un projet de physiologie des neurones et des systèmes, qui ne peut être conduit que sur le tissue ex vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude prévoit d’enregistrer plusieurs neurones sur les tranches issue d’un seul animal. Nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible. Les testes statistiques que nous appliquerons seront adaptés aux analyses. Malgré le fait que nous utilisons des lignées de souris spécifiques, on doit veiller à un nombre suffisant d’animaux pour détecter des possibles sous-populations. Par exemple, deux sous-populations de neurones VIP+ sont décrit dans certaines régions corticales. Le nombre de sous-populations de neurones du thalamus anterieur n’est pas défini à priori. Néanmoins, nous allons réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire pour détecter des potentielles sous- populations.
Raffinement
Les souris sont maintenues par groupes. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est contrôlé avant et après une injection stéréotaxique. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris a été choisie car en combinant souris transgénique et injections virale nous serons en mesure de mesurer la connectivité anatomique et fonctionnelle dans des populations neurales spécifiques. Les souris transgéniques avec des déficits de la myélinisation sont disponibles, pour clarifier le rôle de la myélinisation pour la maturation des neurones et des circuits. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à l’âge où le système de la direction de la tête est en train de se développer au niveau thalamique et corticale, soit à partir de 12 jours, et jusqu’à 12 semaines (3 mois) pour les animaux les plus âgés, pour connaître les structures myelinisées et matures.
Impact de l’hétérogénéité des macrophages associés aux tumeurs sur le développement tumoral et l’évolution du cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales injectées sous la peau ou directement dans le pancréas par chirurgie, puis jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur reconnaît une douleur modérée au réveil et pendant la croissance de l'adénocarcinome pancréatique, et justifie l'effectif par le "standard de la littérature internationale". Il écrit que les organoïdes remplaceront l'expérimentation animale "à moyen/long terme", tout en concluant que le recours aux animaux non-humains revêt ici "un caractère obligatoire".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants. Il a été établi depuis des décennies que l’abondance des macrophages dans les tumeurs était un marqueur de pronostic pour les patients atteints de cancer et ce quel que soit le cancer considéré. En clair, plus la tumeur contient de macrophages, plus le pronostic est mauvais. Mais ces observations cliniques restent en grande partie inexpliquées en raison de notre méconnaissance des fonctions des macrophages associés aux tumeurs (TAM). Récemment, des approches moléculaires ont révélé une très grande plasticité des macrophages dans les tissus sains mais également dans les tumeurs avec la co-existence de diverses sous-populations de TAM. L’objectif principal de ce projet est la caractérisation des phénotypes et fonctions de tous les TAM dans différents modèles murins de cancer. La cartographie des TAM murins sera ensuite utilisée pour analyser les données humaines existantes afin d’identifier ces différentes sous-populations et mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chirurgies sous anesthésie générale pour l'injection orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas. Cette injection durera moins de 15 minutes et sera faite une seule fois. Les injections sous la peau de cellules tumorales seront faites sous anesthésie, une seule fois et dureront moins de 5 minutes. Les animaux pourront avoir des prélèvements de sang sous anesthésie, durée moins d'une minute, nombre maximum: 6.
Impact sur les animaux
L'injection en sous-cutanée de tumeur entraînera une gêne légère et transitoire à l'injection puis modérée après croissance. L'injection dans le pancréas pourra entraîner une douleur modérée au réveil et lors de la croissance des tumeurs. Etant donné que la tumeur croit en orthotopique dans le pancréas, les conséquences seront modérées pour les animaux (adénocarcinome pancréatique), légère perte d'appétit possible avec perte de poids. Les prélèvements de sang entraîneront un inconfort léger et transitoire dû à la préhension et à l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour analyses des tumeurs et organes post-mortem.
Remplacement
Ce projet nécessite l’établissement de tumeurs dans des conditions réelles pour la mise en évidence de sous-populations d’intérêt. Nous travaillons d’ailleurs en parallèle sur une approche de type « organoïdes » avec laquelle des tumeurs sont re-créées en 3 dimensions dans des boites de Pétri pour créer des avatars de patients. Bien que ces approches soient très clairement vouéés à un développement exponentiel et remplaceront à n’en pas douter l’expérimentation animale à moyen/long terme, elles ne peuvent à l’heure actuelle s’y substituer et il est très difficile de résumer le microenvironnement tumoral naturel qui engendre la diversité de phénotypes cellulaires observés chez les patients. De plus, notre stratégie de suivi temporel de la différentiation de monocytes naïfs en macrophages associés aux tumeurs nécessite l’interaction de ces cellules avec les cellules tumorales tout au long du développement de la maladie. L’utilisation de modèles animaux pour ce projet revêt donc un caractère obligatoire.
Réduction
Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expériementaux est réduit à son minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides des expériences proposées. Il est conforme au standard de la littérature internationale. Même si cela nécessite l'utilisation de nombreux animaux, cela garantit la validité scientifique des résultats obtenus et justifie ce nombre. Les nombres minimuax ont été déterminés gra^ce à des tests statistiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi (sizzlenests + maisons en carton). Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour une évaluation clinique adaptée. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale ou générale . Les souris auront un examen clinique et seront pesées quotidiennement. Les points limite seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
- Génétique proche de celle de l’Homme - Modèles de devenir des types cellulaires impliqués dans le cancer performants et originaux - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients.
Rôle du facteur de transcription suppresseur de tumeur Wilms (Wt1) dans la réparation cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant cinq injections intrapéritonéales en cinq jours, deux échocardiographies de trente minutes sous sédation et une ligature de l'artère coronaire gauche sous intubation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie provoque un infarctus du myocarde, dont le projet veut suivre la réparation en inactivant un gène chez l'animal adulte. Les retombées annoncées pour les cœurs humains endommagés sont renvoyées au long terme. Le porteur écrit s'attendre à "une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal".
Objectifs
La cardiopathie ischémique et l’infarctus du myocarde sont des causes majeures de mortalité dans nos sociétés. Nous proposons d’étudier l' impact du gène de notre intéret dans le processus de réparation tissulaire post infarctus du myocarde. La létalité embryonnaire des animaux deficients du gène a empêché la vérification de cette hypothèse. Nous allons développer plusieurs modèles de souris transgéniques permettant l’induction d’une inactivation spécifique du gène de notre interet chez les souris adultes, permettant ainsi de répondre à ces objectifs et de mener les études par: - un suivi clinique et échographique des animaux, - une étude des processus de régénération cellulaire, de néovascularisation, de régulation de l’inflammation par la définition des types cellulaires et des voies de signalisation moléculaires impliqués. Notre projet représente une analyse approfondie de la signalisation médiée par ce gène dans le processus de l’homéostasie du myocarde et la réparation du coeur. Nous étudierons le rôle du gène au cours de l’infarctus du myocarde par une multitude d’approches génétiques: en induisant une délétion conditionnelle du gène de notre interet dans 1) les cellules progénitrices myéloïdes et vasculaires, 2) les cellules vasculaires uniquement, et 3) les cardiomyocytes, en utilisant un système inductible pour le knock-out chez les animaux sains et adultes.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ces expériences permettront de déterminer les voies de signalisation dépendant du gène de notre interet après un infarctus du myocarde et impliquées dans la régénération et la réparation du coeur et d’identifier les processus moléculaires activés par ces voies de signalisation. A long terme, ces données permettront de développer de nouvelles approches pour le traitement des coeurs endommagés suite à un infarctus du myocarde.en
Procédures
Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min).
Impact sur les animaux
Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Les injections intra-péritonéales sont des gestes n'impliquant qu'une contention de courte durée (30 secondes) et une douleur légère. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. Nous n'avons jamais constaté aucune nuisance grave du à ce examen. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min). Apparition possible de angoisse, du stress, et des douleurs suite à l'intervention chirurgicale. On peut s'attendre à une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal.
Devenir
Au terme de l'examen final, les souris sont mises à mort , le coeur est prelevé, pésé puis conservé pour analyses (immuno)histochimiques et moleculaires ulterieures.
Remplacement
L’homéostasie et le remodelage cardiaque sont des processus complexes. Bien qu’il existe des modèles in vitro, l’interaction entre différentes populations cellulaires (cardiomyocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ne peut être mimée par une approche in vitro. Après avoir déclenché un infarctus, il est important de suivre le coeur dans son environnement, ses échanges avec d’autres organes. En outre, les lignées transgéniques utilisées nous permettent d’observer, après l’infarctus, l’activation immédiate de voies de signalisation, d’identifier les cellules répondant à ces voies de signalisation. L'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant la physiopathologie du coeur chez le mammifère est donc essentiel, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. En effet, nous essayons de comprendre la fonction de gènes spécifiques dans la réparation du coeur. Notre projet s'appuie fortement sur des organismes génétiquement modifiés. La communauté scientifique a déjà généré un grand nombre de souches génétiquement modifiées qui peuvent être utilisées en combinaison avec des lignées générées dans notre laboratoire pour répondre à ces questions scientifiques (analyse de tissus-spécifiques de la fonction des gènes par l'intermédiaire du système Cre-lox). Notre stratégie est bien conçue pour une prise en compte des objectifs de remplacement, car nous avons déjà validé toutes les analyses moléculaires dans des systèmes de culture cellulaire ou purement biochimiques.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés à la fois pour les études echocardiographiques et la réalisation des analyses histologiques et moléculaires.
Raffinement
Dans le sens du raffinement, l’anesthésie et l’analgésie seront utilisées comme premières méthodes pour limiter autant que possible la souffrance potentielle des animaux. Des points limites (PL) précises et adaptés seront évalués quotidiennement. Ils permettent l’arrêt de la procédure (mise à mort) dans tous les cas d’aggravation ou d’anomalies cités.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées comme modèle car leur physiologie et leurs mécanismes de réparation correspondent étroitement à ceux de l'homme. Les animaux adultes seront utilisés (25g, âgés de 24 à 30 semaines). Le choix de animaux adultes est justifie par le fait que les maladies cardiovasculaires concernent en majorité des adultes. L'autre raison pour le choix de souris adultes concerne la chirurgie d'un IDM laquelle est possible que avec des animaux adultes pour raison de leur plus grande taille.
Production et caractérisation de souris transgéniques FMC1 KO (2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Porteuses d'une mutation qui reproduit le syndrome NARP, ces souris présentent un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire attendus. 313 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à un, deux, quatre et six mois, des tests de force musculaire, de coordination et d'endurance sur tapis de course, rotarod et grip test, ainsi que des IRM et des échocardiographies sous anesthésie. Une grille de score commande la suite : entre 6 et 7, un antidouleur puis la mise à mort si rien ne s'améliore en vingt-quatre heures, entre 8 et 9, la mise à mort immédiate.
Objectifs
Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.
Bénéfices attendus
Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.
Procédures
Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.
Impact sur les animaux
Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.
Délivrance de nanoparticules diagnostiques et thérapeutiques pour l’imagerie moléculaire par IRM et le traitement de tumeurs dans des modèles rongeurs
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 255
Des cellules cancéreuses sont implantées dans le cerveau, le sein, le côlon ou la peau de 635 souris et 255 rats, dont 575 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal passe une à trois séances d'IRM par semaine sous anesthésie, reçoit des nanoparticules d'or, de fer, de titane ou de platine, et peut voir sa barrière hémato-encéphalique ouverte par ultrasons jusqu'à trois fois par semaine pendant deux à trois semaines. Le suivi se poursuit jusqu'à trois mois, jusqu'à l'atteinte des points limites ou la régression de la tumeur. Le porteur écrit que l'IRM, les ultrasons et l'hyperthermie à 44 °C n'entraînent pas de douleur, sans préciser ce qui vaut à 575 animaux un classement en souffrance sévère, et 45 souris sont annoncées comme réutilisées.
Objectifs
Les stratégies utilisées pour le traitement de certaines tumeurs restent inefficaces en raison notamment de l'absence de délivrance spécifique des molécules thérapeutiques dans le tissu tumoral. Pour répondre à cette problématique, nos travaux s’orientent vers l’internalisation de différentes nanoparticules (NPs) dans des tumeurs (peau, sein, colon, cerveau) grâce à un ciblage de biomarqueurs spécifiques. Ces NPs permettent de visualiser l’évolution de la tumeur par imagerie, et/ou d’être utilisées pour induire une délivrance ciblée de principes actifs (fonctionnalisation), et/ou enfin d’induire un effet anti-tumoral. Pour les tumeurs cérébrales, notre laboratoire a développé un dispositif ultrasonore transcrânien permettant une perméabilisation non invasive, temporaire (moins d’une heure) et localisée de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cette technique permet de contrôler la délivrance de molécules diagnostiques et thérapeutiques dans les zones pathologiques du cerveau. Dans ce projet, nous mettrons en place des modèles tumoraux et nous utiliserons ces modèles ainsi que ceux déjà développés précédemment pour évaluer par IRM le ciblage et l’accumulation de différentes NPs (or, silicium, titane, fer, fluor, platine, gadolinium) dans le tissu tumoral. Des techniques de stimulation seront appliquées pour induire un effet anti-tumoral par thermothérapie. L’IRM sera également utilisée pour suivre la croissance tumorale et mesurer l’efficacité thérapeutique. Pour certains modèles de tumeurs, la biodistribution des cellules cancéreuses sera directement visible en fluorescence infrarouge grâce à un scanner FMT (microtomographie de fluorescence). La thermothérapie consiste à chauffer localement un tissu pathologique entre 40 et 44°C dans le but d’induire des dommages cellulaires. Plusieurs modalités (magnétique, optique) peuvent être utilisées pour induire un effet thermique. Certaines de ces techniques peuvent engendrer localement des effets mécaniques supplémentaires favorisant l’apoptose des cellules cancéreuses ou l’immunogénicité de la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’améliorer le ciblage de tumeurs (tous modèles confondus) par des nanoparticules spécifiques et ainsi d’améliorer le diagnostic, ainsi que de déterminer l’action thérapeutique des NPs sur ces modèles, afin d’apporter une alternative théranostique aux patients humains.
Procédures
Les acquisitions IRM (30-45 minutes/session, sous anesthésie) pour l’étude des nanoparticules (NPs), pour le suivi tumoral et le protocole de perméabilisation de la BHE sont des procédures n’entraînant pas de souffrance spécifique. Etape 1 : test de NPs sur animal sain : injection par voie intraveineuse (quelques secondes) ou par perfusion (2h) ou par implantation d’une pompe sous cutanée (quelques minutes) et imagerie IRM répétées 2-3 fois/ semaine pendant 3 semaines. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (3 maximum, quelques minutes/prélèvement, sous anesthésie). Etape 2 : Développement de modèles tumoraux, sous antalgie et anesthésie : - Cerveau : implantation intracérébrale par chirurgie (20 minutes), une injection - Peau, colon : implantation sous cutanée (flanc, 1 minute) une injection ré-itérée 3 fois si la tumeur ne prend pas. - Sein : implantation sous cutanée (sein, 1 minute), une injection réitérée 3 fois si la tumeur ne prends pas ou régresse complétement. - Modèles métastasique de cancer de sein dans le cerveau : par intraveineuse (quelques secondes) ou en implantant comme précédemment. Suivi de la croissance tumorale par IRM (cerveau, métastases) ou par mesure au pied à coulisse (tumeurs sous cutanée), la durée du suivi dépend de la croissance du modèle qui peut être rapide (cerveau) ou très lent (sein). Une à deux sessions d’imagerie IRM par semaine sont prévues. Etape 3 : Utilisation des NPs sur les modèles tumoraux appropriés. Mise en place du modèle tumoral choisi, traitement par la NPs et suivi par imagerie IRM de la biodistribution des NPs dans la tumeur (1-3 fois/semaine), éventuellement avec ouverture de la BHE par ultrasons focalisés (modèle de tumeur cérébrale uniquement). L’ouverture de la BHE implique une injection intraveineuse (30 secondes) de microbulles réalisée sous anesthésie. Cette ouverture pourra être ré-itérée plusieurs fois en cas de traitement multiples (jusqu’à 3 fois/semaine, pendant 2-3 semaines en fonction de la croissance tumorale). Etape 4 : Utilisation des NPs sur les modèles tumoraux et traitement par hyperthermie. Mise en place du modèle tumoral, traitement par la NPs et suivi par imagerie IRM de croissance tumorale ainsi que de la biodistribution des NPs dans la tumeur (1-3 fois/semaine) puis traitement par hyperthermie et suivi de la croissance tumorale par imagerie le temps nécessaire soit d’atteindre les points limites soit que le traitement ait fait régresser la tumeur (maximum 3 mois).
Impact sur les animaux
Toute injection (cellules, NPs) peut entrainer une douleur très transitoire. Toute plaie peut entrainer une infection (chirurgie, pose de cathéter). Les NPs peuvent induire des effets indésirables (toxicité, allergie, accumulation dans un organe non souhaitée). L’induction des modèles tumoraux cérébraux nécessite une chirurgie, entrainant une légère inflammation et une douleur transitoire. La croissance tumorale peut entrainer une perte de poids, une apathie ou une prostration et des difficultés neurologiques lorsque la tumeur atteint une taille supérieure à 3-4 mm de diamètre (mesurée par imagerie). L’induction de modèles tumoraux sous cutanés (peau, colon, sein) se limite à une piqure sans plus d’effets indésirables. La croissance des modèles sous cutanés peut être lente (sein) et non douloureuse ou au contraire plus rapide (peau, colon) et potentiellement entrainer des lésions cutanées susceptibles de s’infecter, une difficulté à se déplacer si la tumeur devient gênante. Les modèles métastatiques peuvent entrainer l’apparition de tumeurs secondaires non désirées, à enlever chirurgicalement entrainant une inflammation et une douleur transitoire. L’examen par IRM nécessite une anesthésie générale mais n’entraine pas par lui-même d’effets indésirables. L’utilisation de la technologie d’ultra-sons focalisés nécessite l’injection de microbulles par voie intraveineuse, à la veine caudale, réalisée sous anesthésie à l’isoflurane, sans effets indésirables. La thérapie par hyperthermie magnétique nécessite un examen IRM sous anesthésie, cette technologie entraine une augmentation de la température de l’animal, localisée et transitoire (44°C), durant la stimulation, mais n’entrainent pas de désagrément pérenne pour l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour recueillir les organes d’intérêt et réaliser des études histologiques ou des études de biodistribution des NPs. L’imagerie IRM permet la quantification in vivo des NPs accumulées dans les tumeurs ou les organes mais il est nécessaire de vérifier les résultats IRM à l’aide d’une analyse histologique ou par spectrométrie. Les images IRM n’ont pas la résolution nécessaire pour identifier les cellules ayant incorporées les nanoparticules, seule l’analyse post-mortem permet d’observer finement la répartition des particules par type cellulaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de valider in vivo l'efficacité diagnostique et/ou thérapeutique de NPs après une accumulation optimisée dans une tumeur et activées par une stimulation externe. Des expériences in vitro ont permis de caractériser l’interaction de NPs isolées avec différents types cellulaires, mais elles ne sont pas prédictives des propriétés in vivo d’affinité, de spécificité et d’effet thérapeutique des NPs pour les cellules cancéreuses ciblées. Avant d’envisager un transfert à l’homme, il est nécessaire d’étudier dans un organisme vivant les relations entre le devenir des NPs (pharmacocinétique), notamment après une accumulation et la modulation de la pathologie (pharmacodynamique), d’évaluer les propriétés thérapeutiques de ces NPs. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in vitro ou in silico.
Réduction
Le suivi longitudinal in vivo avec des dispositifs d’imagerie non invasifs (IRM) permet d’utiliser le même animal à différents temps, et ainsi d’acquérir une grande quantité d’information sur la croissance tumorale et la réponse à un traitement tout en limitant le nombre d’animaux. Le protocole est construit avec différentes étapes permettant de stopper l’étude si les premiers résultats ne sont pas satisfaisants. La quantification des NPs dans les tumeurs sera évaluée par IRM puis la présence des particules sera évaluée en post mortem par histologie (semi-quantitatif). Une analyse statistique tenant compte des différents paramètres étudiés (nombre de facteurs, données répétées), a été utilisée pour définir le nombre d’animaux nécessaires à l’atteinte de chaque objectif.
Raffinement
Les animaux utilisés pour l’implantation de cellules tumorales recevront une antalgie préopératoire 30 minutes avant le début de la chirurgie (modèle cérébral), puis seront anesthésiés (tous les modèles). Durant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter toute hypothermie, puis pendant la phase de réveil, seront maintenus dans une couveuse thermostatée pour favoriser la récupération. Des soins post opératoires seront réalisés, ainsi qu’un suivi tout au long de la durée de vie de l’animal pour évaluer l’état sanitaire (poids, comportement, motricité, et diamètre tumoral mesuré par IRM). Une grille de scoring permettra d’évaluer l’état général de l’animal et de définir des points limites. L’imagerie IRM, l’utilisation d’ultrasons et l’hyperthermie sont réalisés sous anesthésie et n’entraine pas de douleurs.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs représentent les modèles les plus utilisés en oncologie, notamment parce que les études comparatives sont facilitées par l’existence de nombreuses souches qui fournissent des animaux génétiquement similaires. II existe des modèles immunodéficients permettant d’étudier des tumeurs issues de lignées cellulaires humaines sans risque élevé de rejet de la greffe tumorale. Les animaux seront tous des animaux adultes, pour corréler avec l’apparition des pathologies chez l’homme.
Etudes mécanistiques pour caractériser, chez le rongeur, les changements physiopathologiques induits par des substances actives sur le métabolisme des sphingolipides
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 70
140 rongeurs mâles, 70 souris et 70 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant sept jours et peut être saigné une fois par jour à la queue, à la saphène ou sous la langue, puis est tué pour l'autopsie de ses organes. Le composé testé a déjà tué ou conduit à mettre à mort des animaux à partir du soixantième jour lors d'une étude antérieure de quatre-vingt-dix jours, et la durée est ici limitée à moins de trente-cinq jours pour "garantir l'absence d'effets indésirables". Les animaux écartés après randomisation peuvent être gardés vivants et replacés, ou utilisés pour entraîner le personnel aux gestes techniques. Sur le remplacement, le porteur affirme que seule une mesure dans un "organisme entier" permet d'établir une dose sans effet.
Objectifs
Le projet consiste en des études mécanistiques pour étudier chez le rongeur des changements physiopathologiques lié au métabolisme des lipides (notamment en sphingolipides et céramides) potentiellement induites par un composé en développement. Dans cette série d’étude, on cherche à confirmer in vivo la modulation lipidique observée sur des modèles in vitro et à établir éventuellement une relation dose-réponse. Ce projet s’inscrit dans une investigation globale des effets du composé d’intérêt pour comprendre les effets cliniques toxiques observés après dosage répété dans des études chez l’animal et prévenir le risque chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ces études sont de confirmer, in vivo, une modulation des lipides suite à un traitement puis d’établir pour le composé d’intérêt une dose sans effet sur le métabolisme lipidique, ainsi que l'établissement d’une relation dose-réponse tissulaire et éventuellement plasmatique. Ainsi les études menées pourront répondre à la question suivante : quelle méthode et quels marqueurs moléculaires peuvent être utilisés pour prédire un effet clinique néfaste chez les animaux pour établir une dose sans effet ? Ces études mécanistiques apporteront des informations sur la méthodologie à utiliser pour prédire l’origine d’effets toxiques liés à des modulations lipidiques pour des molécules de la même famille ou avec le mode d’action biologique. Au final, ces études courtes avec un nombre réduit d’animaux permettront de décider si la molécule peut être développée dans un contexte de risque chez l’homme avec une forte probabilité de réussite. En cas de réponse négative, les études longues avec un plus grand nombre d’animaux ne seront pas réalisées.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à une injection péritonéale quotidienne sur 7 jours, l'injection ne dure que quelques secondes et la manipulation des animaux moins de 2 minutes. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins en accord avec les recommendations éthiques (effectué 1 fois par jour au maximum via la veine caudale ou la veine saphène, ou bien la sublinguale sous anésthesie, en moins de 3 minutes). Tous les autres prélèvements seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Aucun effet toxique majeur n’est attendu sur ce projet, la sélection des doses étant fondée sur les résultats des études précédentes notamment de l’étude de 90 jours chez le rat. Une attention particulière sera portée à l’apparition d’effets toxiques potentiellement liés à la diminution de l’efficacité de l’alimentation et aux points limites observés dans l’étude 90 jours ayant mené à la mort ou au sacrifice des animaux à partir du soixantième jour. La forte dose choisie ne doit pas excéder la dose maximale tolérée chez l’animal (et définie au préalable). La forte dose choisie est fondée sur les résultats des études 28 jours et 90 jours. A cette dose, pendant 35 jours, aucun signe clinique n’a été constaté ce qui n’avait pas été le cas au-delà (diminution de l’efficacité alimentaire, puis signes clinique pouvant conduire à des points limites et à la mort. Pour les études de ce projet, le choix des doses et la durée limitée des études (moins de 35 jours) doit garantir l’absence d’effets indésirables. Les injections intrapéritonéales prévues pour l’étude 1 et l’éventuelle étude 4 peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement. En cours d’étude, un prélèvement de sang pourra être effectué 1 fois par jour au maximum via la veine caudale ou la veine saphène, ou bien la sublinguale sous anésthesie. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin d’étude pour évaluer l’effet des subtances chimiques sur les organes lors de l'autopsie. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.
Remplacement
Des essais in vitro et in vivo ont été réalisés pour déterminer le profil toxicocinétique et le profil toxico-dynamique de la molécule d’intérêt et de certains métabolites mais ces essais ne permettent pas de répondre à l’établissement d’une dose réponse fondée sur les changements lipidiques dans un organisme entier. Les résultats des essais mécanistiques in vivo seront analysés en regard des résultats des essais in vivo exploratoires et réglementaires.
Réduction
Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. Un minimum de 5 animaux par groupe est prévu d’après l’expérience du laboratoire et de la littérature. Ce nombre pourra être affiné en fonction des résultats. Un total estimé de 140 animaux pourra être utilisé pour ce projet, seulement sur les mâles afin de limiter l'emploie d'animaux (les éventuels effets attendus devraient être plus ou moins similaires entre les deux sexes). De plus, en fonction des résultats obtenus dans ce projet les études de cancérogenèse pourraient ne pas avoir lieu.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés tous les jours (week-ends compris). Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Toutes ces observations sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés par le laboratoire, qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en administrant les produits à des doses appropriées basée sur la littérature ou sur les précédentes études conduites. On retiendra donc des doses inférieures à la dose maximale tolérée chez l’espèce utilisée.
Choix des espèces
Les études sur les animaux décrites dans ce document sont réalisées chez le rongeur mâle pour permettre d’établir une dose sans effet sur le métabolisme des lipides. Le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel, les autres études de toxicologie étant réalisées sur ces espèces. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes (à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.
Validation du passage systémique après administrations orales de vecteurs peptidiques et protéiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Rats : 320
Mis à jeun douze heures, gavés une fois par voie orale, saignés à l'extrémité de la queue deux minutes plus tard : 640 souris et 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans anesthésie jusqu'à la mise à mort. Le protocole vérifie si des peptides vecteurs franchissent la paroi intestinale pour passer dans le sang, une technologie que la société veut étendre du cerveau à l'intestin. Le porteur reconnaît un risque de fausse route et de complication respiratoire si le gavage est mal exécuté, et présente le recours aux animaux non-humains comme le "principal désavantage" de sa demande. Tous reçoivent une dose létale d'anesthésique, puis leurs tissus sont prélevés.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration parentérale. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et utiliser notre technologie pour franchir de nouvelles barrières cellulaires de l’organisme, cette fois-ci au niveau intestinal, en améliorant l’adressage de médicaments administrés par voie orale. Il s’agira dans cette demande de démontrer qu’après administration orale chez le rongeur, nos protéines et peptides vecteurs seront capables de résister aux contraintes et attaques du tube digestif (Enzymes, pH), puis de valider leur passage spécifique à travers la barrière épithéliale, de l’intestin vers le sang.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur de la délivrance systémique par voir orale. Notre objectif sera donc de relever ce nouveau challenge et de transposer notre savoir-faire et technologique sur de l’application « Drug-Delivery » par voie orale. Ainsi, nous pourrions proposer de nouveaux concepts et alternatives thérapeutiques facilitant le quotidien des soignants et des patients par un meilleure accessibilité (traitements devenus trop coûteux ou trop contraignants), conservation et praticité. L’application de notre stratégie de vectorisation pourrait également servir de levier dans bon nombre de pathologies à enjeux de santé publique.
Procédures
Au cours de cette procédure, nous n'aurons pas d'anesthésie, ni d'étape chirurgicale. Les animaux seront uniquement manipulés éveillés et de manière délicate. L'absence de stress est ici un garant du succès et bon déroulement de la procédure. En point final, les animaux seront d'abord mis à mort avant le prélèvement tissulaire final. -Constitution des cohortes d'animaux : Manipulation douce et unique pour la pesée et l'annotation codale des animaux, pour une durée de 2 minutes. -Administration par voie orale : Gestes et manipulations ultra-précis pour réaliser correctement cette étape. Administration simple et unique sans intervention parentérale, pour une durée de 1 minutes. -Prélèvements sanguins intermédiaires : A l'extrêmité de la queue afin d'y collecter quelques gouttes de sang. Geste contentionné expert et précis qui réduit considérablement le stress. Durée Approximative 2 minutes. -Mise à mort pour prélèvements (sédatoin à dose létale + contastation du décès) : Contention manuelle rapide et précise pour réaliser l'injection intrapéritonéale du mélange d'anesthésique à dose létale.
Impact sur les animaux
Les possibles effets ou effets indésirables sont ici listés pour chacunes des manipulations/expérimentations. -Transport et adaptation : Le transport est une source de stress non négligeable dont il faudra tenir compte avant d'envisager les tests. -La stabulation peut engendrer un temps d'adaptation, du stress, ayant un impact sur l’alimentation et le comportement, donc la prise de poids. -Mise à jeun des animaux : Nécessaire à la bonne réalisation de l'étude, les animaux seront mis à jeun 12h avant le début des administrations. Cette phase relativement courte, induira un léger stress transitoire, mais n’aura pas de réel impact sur la santé des animaux. En effet, les données de la littérature démontrent une absence d’effets significatifs sur le poids et l’activité métabolique en cas de mise à jeun inférieure à 18h. -Administration per os (Gavage par voie orale) : Réalisée sur animal éveillé et contentionné manuellement, il est ainsi immobilisé, ce qui génère un certain stress. L'acte de gavage est une gêne évidente mais très brève. Si le geste n’est pas bien réalisé, il y a cependant un risque notable de fausse route et de complication respiratoire. -La manipulation pour la réalisation des prélèvements sanguins intermédiaires : De même que pour le gavage, cette étape sera réalisée sur animal éveillé, après immobilisation en contention spécialisée. L'animal n'aimant pas être coincé, c'est une source de stress (≤2 min). -La manipulation pour l’administration d’une dose létale d’un mélange d’anesthésique : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale, le geste rapide sera totalement maîtrisé par le manipulateur.
Devenir
L'issue de l'étude étant le prélèvement de tissus, tous les animaux seront mis à mort en point final, par administration d'un anesthésique à dose létale.
Remplacement
Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués sur des études in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires cibles (cultures cellulaires, mesure d'affinité pour le réceptuer cible), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de transposer notre modèle de pharmacologie pour de la voie orale nous devrons absolument envisager de réaliser notre administration orale sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (rat et souris). En effet, la physiologie complexe du tube digestif nous impose l’utilisation de modèle vivo. Des modèles prédictifs ex vivo existent mais nécessitent également le sacrifice d’animaux, sans pour autant intégrer l’ensemble des mécanismes physiologiques périphériques précédemment cités. Afin d’éviter une utilisation encore plus importante d’animaux, notre procédure simple, sur de courtes cinétiques, avec des prélèvements optimisés (intermédiaires et finaux), restera la plus avantageuse en termes de résultats scientifiques pour un nombre d’individus utilisé. Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.
Réduction
Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 5 groupes par test et 8 études par an, ce qui représente 160 individus/an (80 mâles + 80 femelles) pour chacun des fonds et espèces utilisées. Tel que largement décrit dans la littérature pour un modèle « oral delivery », nous utiliserons dans un premier temps le modèle souris sur fond albinos, à raison de 160 individus par an. En parallèle nous voudrons vérifier nos données obtenues sur un autre modèle souris, de fond consanguin, pour un nombre équivalent d’animaux (maximum 160/an). En effet ce modèle utilisé dans nos précédentes études Pharmacologiques sera précieux pour de futurs essais sur récepteurs humanisés en vue d’une transposition à l’homme. Enfin, le modèle souris présentant certaines divergences fonctionnelles et un modèle plus développé, sera indispensable dans nos investigations. Nous travaillerons à la suite des deux précédents, sur rats de fond albinos standard, pour un gros maximum de 160 individus/an. Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Maximum 1 prélèvement caudal/individu ≤50 μl) en cours de cinétique, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe 2 : grille scores et points limites). Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 14 jours dès réception. 7 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une pièce cyclée spécifique rats ou souris (cyclée12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en plastique + cartons déchirés). Les animaux y seront visités régulièrement afin d’être sensibiliser à l’expérimentateur. A J0, les manipulations et administrations se feront sur animaux éveillés, il n’y aura pas d’anesthésie en cours d’étude jusqu’à la mise à mort en point final. En cours d’étude, les pesées, administrations et prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min). Des points limites seront malgré tout établis, afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques en intrapéritonéale permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques, sur fonds albinos ou consanguins et non génétiquement modifiés.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques périphériques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure et les trois lignées d’animaux (rat x1 et souris x2) nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 10 semaines pour les souris et 6 à 8 semaines pour les rats. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 25-27g environ chez la souris et 120-140g chez le rat, ce qui s’avère plus économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses).
Etude de l’accumulation dans la rétine d’une molécule thérapeutique ciblant le mélanome en fonction de différentes voies d’administration
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Trois instillations oculaires sous anesthésie, une injection de cellules de mélanome sous la peau, une injection intraveineuse de produit radioactif et jusqu'à six examens d'imagerie en deux jours : 120 souris C57BL6J femelles vont être utilisées, dont 108 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit n'attendre aucune nuisance de l'instillation oculaire, ni de l'imagerie, ni des anesthésies, et classe pourtant la quasi-totalité de l'effectif en souffrance modérée. Leur litière devenue radioactive est changée vingt-quatre heures après l'injection, puis chaque semaine, pour limiter leur surexposition aux rayonnements. Aucune n'est gardée vivante, en raison du produit radiomarqué qu'elles ont reçu et du prélèvement de leurs organes.
Objectifs
La mélanine représente une cible de choix dans le traitement du mélanome. De ce fait, un radiopharmaceutique (médicament contenant un radioisotope à usage médical) a été développé afin de permettre le traitement des cibles tumorales de petite taille, nombreuses et dispersées grâce à son injection par voie intraveineuse. Cette molécule qui fait actuellement l’objet d’un transfert clinique (autorisé par l’agence du médicament) semble montrer des résultats prometteurs. Cependant, la mélanine est exprimée également au niveau de cellules non tumorales telles que celles situées au niveau de la rétine de l’oeil. Aussi, afin de prévenir la fixation du radiopharmaceutique et réduire sa toxicité au niveau de l’oeil, nous souhaitons évaluer une méthode qui empêcherait/limiterait sa fixation au niveau de l’oeil. Une piste envisagée est d’appliquer par dépôt de gouttes ophtalmiques la molécule non radioactive au niveau de l’oeil, avant le traitement par voie intraveineuse, afin d’y bloquer la fixation de la molécule radioactive. Ce projet permettra de tester cette possibilité dans un modèle expérimental de mélanome. En complément, une étude de la distribution dans l’organisme de cette molécule sera réalisée selon différentes voies d’administration. Si ce projet démontre la pertinence de cette approche, il sera adapté pour être proposé en complément de l’approche clinique chez le patient. Ces expériences seront réalisées dans le respect de la règle des 3Rs, utilisant des conditions de stabulation, de bien-être animal et un nombre de souris optimisé. L’ensemble du projet inclura 120 souris sur 5 ans.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’évaluer la pertinence d’une méthodologie (par instillation oculaire sous la forme de gouttes) visant à empêcher la fixation du radiopharmaceutique administré par voie intraveineuse, au niveau de la mélanine des yeux, afin de limiter une potentielle toxicité oculaire du traitement. Ce projet expérimental est complémentaire d’une étude clinique en cours visant à adresser spécifiquement vers les cellules tumorales (mélanome) un radiopharmaceutique (médicament contenant un radioisotope à usage médical) permettant le traitement des cibles tumorales de petite taille, nombreuses et dispersées. Si ce projet démontre la pertinence de cette méthode, il sera adapté pour être proposé en complément de l’approche clinique chez le patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à : * Inoculation sous cutanée de cellules de mélanome : une injection par animal (durée < 3 minutes) sur animal sous anesthésie gazeuse. * instillation ophtalmique de la solution : 3 administrations par animal (durée : environ 10 minutes/animal sous anesthésie gazeuse. * administration iv du radiopharmaceutique : 1 administration/animal (durée < 3 minutes). * imagerie : 5 à 6 examens / animal sur 2 jours et pour 6 animaux de chaque groupe (durée= 30 à 40 minutes/animal sous anesthésie gazeuse. * prélèvement des organes après mise à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont un inconfort modéré lors de l’injection intraveineuse de la molécule (réduite à quelques dizaines de secondes car réalisée par un expérimentateur expert). A ce jour, nous pensons que l’instillation oculaire de la molécule thérapeutique n’engendrera pas de nuisances, de par sa formulation, son pH et sa faible concentration. Aucune nuisance liée à l’imagerie in vivo ou aux anesthésies n’est attendue. Pour les animaux porteurs de tumeur, les nuisances peuvent être relatives à une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur.
Devenir
Ce projet comporte 2 procédures : aucun animal n’est maintenu en vie car les animaux recevront un produit radiomarqué et dans la majorité des groupes, des prélèvements d’organes sont réalisés.
Remplacement
Dans la mesure où ce projet a pour objet d’évaluer la distribution in vivo d’une molécule dans l’organisme, suivant différentes voies d’administration, il n’existe aucune méthode de remplacement. Ici, l’objet est d’évaluer l’inhibition la fixation oculaire de la molécule, sans pour autant compromettre sa fixation tumorale, ce qui nécessite de travailler sur organisme entier. L’utilisation d’animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs du projet, les méthodes in vitro (sur cellules) ne rendant pas compte des phénomènes d’absorption, de distribution, d’élimination et de ciblage des molécules administrées. L’imagerie in vivo permettra de visualiser et de quantifier simultanément ces phénomènes.
Réduction
Le modèle animal comme la molécule étudiée ont déjà fait l'objet de nombreuses études au sein du laboratoire. Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Le nombre d’animaux est calculé de façon à pouvoir réaliser des observations permettant de mettre en évidence une différence significative entre les groupes, avec un risque de première espèce de 0,05 et une puissance statistique de 0,9. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée (les données seront évaluées sur le plan statistique par test t). Dans la procédure 1, il est prévu de tester notre hypothèse chez des animaux sains, permettant ainsi i) de valider l'approche sans induire inutilement des tumeurs chez les souris et ii) de justifier l'utilité de la procédure 2 chez des animaux porteurs de mélanome. De plus, les examens d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux grâce à la possibilité d’un suivi longitudinal où un animal est son propre contrôle au cours du temps. Le nombre total d’animaux est de 120 souris maximum sur une période de 5 ans.
Raffinement
Afin de raffiner l’expérimentation, et de limiter le stress des animaux, les souris seront soumises à un processus d’habituation à l’expérimentateur et à la procédure (chauffage et contention) quotidiennement la semaine précédant la réalisation de la procédure. Les animaux seront hébergésdans des cages contenant de l’enrichissement de milieu (cabane coton bois à ronger) afin de favoriser leur comportement naturel et de limiter ainsi leur angoisse. Les cages seront placées dans des portoirs ventilés respectant les normes d’ambiance optimale pour l’espèce. Un changement fréquent (minimum 1/semaine) des litières sera réalisé afin de limiter le risque infectieux. Un changement des litières devenues radioactives (via le circuit des déchets radioactifs) sera également réalisé 24h après injection puis une fois par semaine afin de limiter la surexposition inutile des animaux aux rayonnements La surveillance quotidienne permettra également de réagir rapidement en cas de signe d'inconfort, de stress atteinte des points limites, ou de souffrance des animaux. Si besoin, une injection d'antalgiques sera réalisée (Rimadyl 5mg/kg sous-cutané 1 fois par jour pendant 5 jours maximum). Les examens d’imagerie permettent de raffiner l’étude grâce d’une part au caractère non invasif de la technique et d’autre part à la possibilité d’un suivi longitudinal ou un animal est son propre contrôle au cours du temps.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle murin syngénique de mélanome pigmenté B16. Ce modèle est développé et validé par les experts chez la souris C57BL6J. Ce projet sera réalisé sur des souris C57BL6J femelles, âgées de 4-6 semaines et ayant un poids moyen de 20 g. Les animaux utilisés seront des adultes ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liées à la puberté. Des souris femelles seront utilisées du fait d’une moindre agressivité, permettant de garder plusieurs animaux dans la même cage et donc de favoriser leur hébergement en groupe afin de respecter leur instinct grégaire. Le stade de développement correspond à celui fréquemment utilisé pour ce modèle et pour lequel la prise tumorale a été validée au cours de nos différentes études.
Etude de l’efficacité thérapeutique de nouveauxcomposés dans des modèles murins de cancers.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à trois injections intraveineuses par semaine, deux administrations orales par jour, une pompe osmotique posée sous la peau et une injection intrapéritonéale hebdomadaire pour l'imagerie : 1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Neuf cents d'entre elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses dans l'organe d'origine de la tumeur, avec un suivi allant jusqu'à huit semaines. Le porteur écrit que la croissance des tumeurs "n'entraîne pas de gêne" et décrit par ailleurs des nécroses, des dysfonctions d'organe et des difficultés à se déplacer. Les souris utilisées sont immunodéprimées pour accepter des lignées humaines sans rejet, et âgées de cinq semaines, avant le pic de production des lymphocytes NK.
Objectifs
Selon l’OMS, on estime à 19 millions le nombre de nouveaux cas de cancer et à 10 millions le nombre de décès liés au cancer survenus en 2020. Les cancers les plus fréquemment diagnostiqués dans le monde sont ceux du poumon (avec 2,2 million de cas), du sein (2,3 million de cas) et le cancer colorectal (1,9 million de cas). Dans ce cadre, nous proposons d’évaluer l’effet thérapeutique de composés choisis dans des modèles murins de cancers. Ces modèles animaux fournissent un moyen de simuler le développement du cancer chez les humains dans un environnement contrôlé et permettent d'obtenir des données préliminaires avant les essais cliniques sur les humains. Ces tests préliminaires aident à identifier les candidats médicaments les plus prometteurs, à déterminer les doses efficaces, et à minimiser les risques potentiels pour les patients.
Bénéfices attendus
Développement de nouveaux traitements pour le cancer.
Procédures
Dans le cadre des études de toxicité, les animaux subiront des injections intraveineuses (jusqu’à 3 fois par semaine) ou intra-péritonéales (jusqu’à une fois par jour) ou des administrations de produits per os (jusqu’à 2 fois par jour). Ils pourront également subir une intervention chirugicale de pose de pompes osmotiques sous la peau ou dans le péritoine (durée environ 10 minutes, au maximum 300 animaux). Les tests de toxicité durent en moyenne 3 semaines (5 semaines au maximum). Dans le cadre des tests d'effets thérapeutiques sur souris porteuses de tumeurs sous-cutanées, les animaux subiront une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses puis le traitement comme décris lors des études de toxicité (au maximum 600 animaux, sur une durée maximale de 5 semaines post implantation). Dans le cadre des tests d'effets thérapeutiques sur souris porteuses de tumeurs dites orthotopiques, les animaux subiront des procédures chirurgicales d'implantations de cellules cancéreuses dans leur environnement d’origine, sous anti-douleurs et sous anesthésie gazeuse (durée de 10 à 20 minutes, au maximum 900 animaux). Ces souris subiront ensuite le traitement comme décris lors des études de toxicité (au maximum 900 animaux, durée maximum 8 semaines post implantation). Ces animaux subiront également une injection intrapéritonéale par semaine pour l'imagerie de bioluminescence (durée 10 minutes, au maximum 900 animaux), et une anesthésie pour le rasage et l'épilation du ventre avant imagerie échographique (durée environ 15 minutes, au maximum 900 animaux).
Impact sur les animaux
Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées. Risques d'effets indésirables liés à la toxicité directe des molécules testées ou celle des solvants utilisés. Risques d'effets indésirables liés à la croissance d'une tumeur sous-cutanée (gêne, nécrose.. ). Risques d'effets indésirables liés à la croissance d'une tumeur orthotopique (gêne, dysfonction de l'organe d'intérêt..)
Devenir
Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes, les imager et les conserver pour des analyses anatomopathologiques.
Remplacement
A partir d’une chimiothèque (collection de molécules chimiques), nous aurons par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les molécules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires (dont des tests de génotoxicité in vitro) ainsi qu’une analyse approfondie de la littérature disponible concernant la toxicité des classes chimiques des molécules considérées, nous nous focaliserons sur une trentaine de composés, constituant les candidats les plus prometteurs. Les paramètres de toxicité et d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.
Réduction
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés/particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les molécules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. La toxicité des molécules sera au prélable testée sur un petit nombre d'animaux. Les molécules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 10 individus pour le suivi de croissance tumorale afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation de l’effet du traitement. Les molécules dont le principe actif et/ou la formulation s'avèrent toxiques, ne seront pas retenues pour être évaluées sur des animaux porteurs de tumeurs.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63). Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson stérile sont fournies ad libitum. Les souris les plus immuno-déprimées seront hébergées dans des cages stériles. Les chirurgies implantatoires se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. Nous utiliserons des souris immuno-déprimées qui permettent l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs n’entraîne pas de gêne et sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie de bioluminescence.
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Souris immunodéprimées de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, facilement manipulables, avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines. Pour les animaux qui porteront des pompes osmotiques (sous-cutanées ou péritonéales), le poids minimum devra être de 20g.
Etude du microbiote intestinal et vaginal en réponse à des traitements antibiotiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Pour indiquer à des laboratoires clients quel antibiotique perturbe le moins le microbiote, 280 souris vont être gavées chaque jour pendant dix jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées quotidiennement à l'état vigile, isolées trois minutes dans une cage vide pour la récolte des fèces, puis tuées pour le prélèvement de leur côlon. Le nombre de groupes varie selon les molécules et les doses que le partenaire souhaite tester. Le porteur prévoit une irritation possible de l'œsophage par l'aiguille de gavage et écrit qu'aucun analgésique ne pourra être administré, au motif que cela biaiserait la réponse cellulaire mesurée.
Objectifs
Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de différents traitements antibiotiques sur la composition du microbiote intestinal et vaginal. Ils souhaitent grâce à cela définir le traitement et sa dose qui perturbe le moins la composition des microbiotes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer de façon qualitative et quantitative la qualité du microbiote intestinal et vaginal en réponse à différents traitements antibiotiques. Ainsi, le partenaire pourra connaître quel traitement perturbe le moins les microbiotes. Il pourra ajuster les doses pour proposer un traitement efficace tout en préservant le microbiote du patient
Procédures
Les souris seront régulièrement manipulées quotidiennement lors de ce projet pour différentes raisons : - Les suivis de poids auront lieu tous les jours pendant 10 jours sur souris vigile (souris manipulées et déplacées dans une balance à pesée dynamique) - Les administration per os par gavage des composés antibiotiques et de l’eau auront lieu tous les jours pendant 10 jours sur souris vigile. La contention sera utilisée ) - Le prélèvement des féces aura lieu une fois le 10ème jour sur souris vigile dans une cage propre et vide pour récupérer les féces déposés dans la cage (isolement de l’animal d’environ 3 minutes avant sa mise à mort)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l’administration quotidienne des composés par voie orale (gavage) sont : - Stress dû à la contention quotidienne pour l’administration orale (les contentions seront réalisées par du personnel expérimenté et expert dans ces actes afin de limiter les contraintes subies par l’animal) - Une potentielle perte de poids liée aux modifications des microbiotes - Légère irritation potentielle dûe au passage de l’aiguille de gavage dans la cavité orale Les effets indésirables seront limités grâce à l’utilisation de matériel adéquat ainsi que grâce à l’expérience du personnel correctement formé. La mise en place de points limites et d’une grille de score permettent de suivre et de réduire la gêne et l'inconfort des animaux. Les animaux entrant en expérimentation seront clairement identifiés et feront l’objet d’une surveillance quotidienne part le personnel de l’animalerie.
Devenir
Tous les animaux sélectionnés pour immunophénotypage seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des colons et à leur analyse.
Remplacement
Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.
Réduction
Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences sera de 7 animaux par groupe afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules ou doses sont à tester. Les résultats seront ensuite analysés à l’aide du logiciel GraphPad Prism et nous appliquerons selon la taille des groupes différents tests statitistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en zone d’expérimentation. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Un temps d’acclimatation à leur nouvel environnement d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par du personnel. Une grille de score sera utilisée prenant en compte différents critères tel que le comportement de l’animal et la variation du poids. Des points limites seront établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Nous savons que chez l’homme, ces antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées en effet secondaire. Si nous observons la même chose chez les souris, nous donnerons une solution de réhydratation aux animaux et effectuerons plus régulièrement le change des litières. Enfin, les gavages quotidiens peuvent entrainer une irritation de l’œsophage chez la souris. Toute administration d’analgésique ou autres substances ne pourra être réalisé car entrainerait un biais sur la réponse cellulaire observée lors de l’étude. En revanche, nous pourrons suppléer les souris avec de la pâtée énergisante afin de leur faciliter l’accès à la nourriture et les réalimenter.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du microbiote des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, le modèle murin est un modèle de choix pour l'étude des microbiotes grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous utiliserons uniquement des animaux adultes, de plus de 8 semaines, avec un poids supérieur ou égal à 20g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant pour être stable au début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues au protocole.
Etablissement de modèles PDTX (Patient-Derived Tumor Xenografts) en vue de leur caractérisation pour la constitution d’une banque optimisée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées sous la peau avec des fragments de tumeurs prélevées sur des patients, 2 420 souris âgées de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux qui développent une tumeur sont tués, ceux qui n'en développent pas sont gardés un an au maximum puis tués aussi, faute de pouvoir survivre hors d'un environnement dépourvu de pathogènes. Le porteur classe l'ensemble en souffrance modérée tout en listant parmi les signes surveillés la nécrose tumorale cutanée, le prolapsus anal, le dos courbé et le "masque de la douleur". Le projet alimente une banque de 162 modèles tumoraux caractérisés, que l'établissement entend élargir aux tumeurs rares et mettre à disposition d'autres équipes.
Objectifs
Nous avons une collection de 162 tumeurs humaines issues de patients. Cette collection regroupe 5 types de tumeurs : sein, ovaire, pancréas, côlon et sarcomes. Une partie seulement de ces modèles a été caractérisée de façon complète. Ces modèles sont très utiles pour les études de nouvelles molécules anticancéreuses car ils conservent bien les caractéristiques de la tumeur du patient dont ils sont issus. Dans le cadre de ce projet, notre objectif est à la fois d’optimiser la collection existante et de la caractériser. De plus nous souhaitons développer de nouveaux modèles tumoraux, certains très rares, que nous ne possédons pas actuellement dans la banque. A termes, nous souhaitons pouvoir mettre à disposition de chercheurs l’ensemble des modèles pour des projets de recherche en oncologie.
Bénéfices attendus
Les modèles tumoraux développés sont précieux pour tester les réponses à différentes molécules anti-cancéreuses. Ils reproduisent fidèlement les caractéristiques d’une tumeur humaine, les résultats obtenus sur souris peuvent être considérés comme des transpositions fiables de la réponse chez les patients. Notre collection vise à disposer de modèles représentatifs de cancers agressifs et difficiles à soigner. Cette collection de modèles parfaitement caractérisés représentera un outil de recherche pré-clinique puissant.
Procédures
Chaque animal subira une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sous anti-douleur. La durée de l’intervention est en moyenne de 5 minutes anesthésie, chirurgie et réveil compris. En cas de signe clinique pouvant évoquer une toxicité, un prélèvement sanguin (durée < 20 secondes / prélèvement) sera réalisé pour des analyses.
Impact sur les animaux
La chirurgie de greffe de fragments tumoraux peut engendrer chez les animaux : - Douleurs - Faibles pertes de poids - Déshydratations - Risque d’infection au site d’incision Tous les animaux seront surveillés quotidiennement avec une attention particulière quant à l’apparition de signes cliniques pouvant être liés au développement tumoral : - Nécrose tumorale cutanée - Diarrhées - Déshydratations - Dos courbé - Prolapsus anal - Masque de la douleur - Perte de poids
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux ayant développé une tumeur seront euthanasiés. Les animaux n’ayant pas développé de tumeur seront conservés et suivis pendant un an maximum, délai au delà duquel ils seront également euthanasiés car ne pouvant survivre que dans un environnement dépourvu de pathogènes.
Remplacement
Il n'existe pas de possibilité de remplacement. Dans la cadre de ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative permettant de reproduire aussi fidèlement les caractéristiques des tumeurs de patients.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum mais il doit cependant être suffisant afin que les tumeurs générées reproduisent fidèlement les tumeurs de patients.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état des souris utilisées sera assurée en prenant en compte tous les points limites établis dans le cadre de ce projet. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse et sous anti-douleur, afin de réduire tout stress et la souffrance de l’animal. Les antidouleurs pourront être utilisés si nécessaire. L’espace de vie de l’animal est diversifié et enrichi afin d’assurer son confort de vie.
Choix des espèces
La souris est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine. C’est un bon modèle pour l’évaluation de la croissance des tumeurs d’origine humaine. Sur la base de notre expérience dans le domaine, pour favoriser la prise de greffe, les animaux utilisés seront âgés entre 4 et 5 semaines, car la prise de greffe est optimisée à cet âge.