Rongeurs

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie générale une chirurgie qui obstrue le flux urinaire d'un rein pour provoquer une maladie rénale chronique, puis un prélèvement de sang rétro-orbital le jour de sa mise à mort. Le porteur indique que la plaie peut s'infecter et que l'animal peut souffrir, se désorienter et perdre du poids. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'insuffisance rénale, sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant d'évaluer le rôle d'un récepteur de l'immunité innée. Sur le remplacement, il affirme que les cultures de tubules rénaux ne reproduisent ni la vascularisation ni le flux urinaire, et conclut qu'aucune approche in vitro ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises. Le rein va subir de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein et à son remplacement progressif par un tissu cicatriciel aboutissant à sa destruction. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale qui nécessite le recours à la dialyse et la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Plusieurs études ont montré le rôle délétère de l’immunité innée dans le développement des lésions rénales dans différents modèles murins de maladies rénales chroniques. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer le rôle d’un récepteur de l’immunité innée dans l’apparition de lésions rénales dans un modèle murin chirurgical de maladie rénale chronique. Ce modèle utilise une chirurgie rapide sous anesthésie générale sur animaux adultes qui permet d’obstruer le flux urinaire d’un des 2 reins et ne compromet pas la fonction rénale du rein restant. L’invalidation génétique de ce récepteur de l’immunité innée sera évaluée à différents temps après la chirurgie : 1, 4 et 14 jours.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre d’élucider le rôle d’un récepteur de l’immunité innée sur le développement des lésions rénales en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de freiner la progression des maladies rénales chroniques.

Procédures

L’ensemble des animaux (120 souris) sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale. L’acte chirurgical en lui-même est d’environ 5 minutes. Le temps global de la procédure de chirurgie (préparation, anesthésie, chirurgie, suture et réveil) est de 2 heures. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement de sang (30secondes) sous anesthésie générale le jour de la mise à mort. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir 2 injections pour l’anesthésie pré-opératoire et lors de la mise à mort ce qui peut induire un stress momentané lors de la contention et une douleur aigüe lors de l’injection. Le modèle chirurgical n’induit pas par lui-même de nuisance puisqu’un seul des 2 reins étant obstrué, l’autre rein maintient une fonction rénale normale. En revanche, suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir (désorientation, éventuelles douleurs, perte de poids) et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection (douleur aigüe). Le prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie générale peut induire une douleur aigüe.

Devenir

L’ensemble des 120 animaux sera mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro ne permettent pas l’étude intégrée d’un rein ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Il n’est donc pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors de l’évaluation des points limites par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Les souris présentant une infection de la plaie se verront appliquer une solution de désinfection ainsi qu’une pommade anti-septique jusqu’à disparition des symptômes. A l’issue de la procédure, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les souris utilisées sont déficientes pour une protéine de l’immunité innée. Ces souris ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour étudier la voie de l’immunité innée dont le rôle est questionné dans cette étude. Les animaux subiront une chirurgie à l’âge adulte (8-12 semaines) après la fin de maturation des reins.

Pour voir si un anti-inflammatoire ajouté à l'immunothérapie retarde le cancer du foie, 104 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à des semaines différentes selon leur groupe. Deux jours après leur naissance, elles sont séparées de leur mère le temps d'une injection de streptozotocine, puis nourries au régime gras dès le sevrage jusqu'à développer une cirrhose puis un carcinome hépatocellulaire à partir de la seizième semaine. Suivent de quatre à quarante injections dans le ventre sur animal éveillé selon les groupes, trois anesthésies gazeuses, deux scanners du foie et deux allers-retours de cinq cents mètres entre l'animalerie et le service d'imagerie, le porteur qualifiant d'"indolore" cette évolution vers le cancer. La seule limite décrite pendant l'examen tient au monitoring respiratoire, l'animal en détresse étant retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu'à son réveil.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.

Remplacement

A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.

Réduction

Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.

Raffinement

Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.

Choix des espèces

Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.

Une injection de cellules cancéreuses sous la peau sous anesthésie, cinq injections dans le ventre sur animal éveillé, une injection dans une veine, une injection directement dans la tumeur, neuf séances d'imagerie : 1 600 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur qui pousse peut provoquer des douleurs, une gêne, une nécrose et une perte de poids, et les anesthésies répétées de l'imagerie ajoutent fatigue et stress. Le porteur présente le suivi par fluorescence comme non invasif et fait valoir que chaque animal est son propre témoin, argument de réduction avancé pour un projet qui en utilise 1 600. Sur la raison de la mise à mort, il écrit que les souris seront tuées parce qu'elles auront une tumeur sous la peau.

Objectifs

Le développement de nouvelles sondes d’imagerie en cancérologie, que ce soit pour la détection de tumeur ou pour la thérapie (ou les 2 combinés), est en plein essor. Afin d’étudier leur potentiel thérapeutique et leur devenir dans l’organisme une fois injectées, une étude préclinique est nécessaire.

Bénéfices attendus

Evaluer le potentiel diagnostic et/ou thérapeutique de nouvelles sondes d’imagerie en préclinique dans le but de développer de nouvelles thérapies dirigées contre le cancer ou de nouvelles sondes améliorant le diagnostic.

Procédures

Injection sous la peau sur animal anesthésié : injection de cellules cancéreuses, durée 1 minute, geste réalisé 1 fois. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé 5 fois. Injection dans la veine sur animal anesthésié : durée inférieur à 1 minute, geste réalisé 1 fois. Injection dans la tumeur sur animal anesthésié : durée 30 secondes, geste réalisé 1 fois. Imagerie : 1 min, 9 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection des cellules cancéreuses sous la peau : infection au niveau du site d’injection. 2. La présence d’une tumeur : douleur, gêne occasionnée, nécrose. Perte de poids liée à la croissance tumorale. 3. Suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention. Mauvaise réaction suite à l’injection des sondes d’imagerie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car elles auront une tumeur sous la peau.

Remplacement

Nous souhaitons développer de nouvelles sonde d’imagerie qui permettraient d’améliorer le diagnostic et/ou la thérapie dans le cadre du cancer. Même si le potentiel thérapeutique, la validité de la sonde et l’absence de toxicité seront testés en amont sur des modèles de cultures cellulaires ou d'organoides quand cela est possible, la finalité est le test sur des modèles animaux avant d’envisager un passage chez l'homme.

Réduction

Les sondes seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les sondes validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de fluorescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal. Chaque animal est son propre contrôle.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour leur permettre de s'habituer à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille), dans une environnement contrôlé en température et en hygrométrie. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Des points limites ont été mis en place afin de limiter les possibles douleurs chez l'animal.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.

Le flanc rasé sous anesthésie gazeuse, 176 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de pancréas sous la peau, puis deux ou trois injections d'anticorps dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, tumeurs, rates et ganglions prélevés. Il s'agit de tester l'inhibition de trois composants d'une voie moléculaire soupçonnée de faire progresser le cancer du pancréas et de le rendre résistant aux immunothérapies. Ni la voie, ni les protéines, ni les anticorps ne sont nommés, et le nombre de souris par groupe est dit défini "à minima" sans qu'aucun chiffre ni calcul n'apparaisse.

Objectifs

Le cancer du pancréas touche près de 500.000 personnes chaque année, et est la 4e cause de décès par cancer dans le monde. Malgré la révolution apportée par les immunothérapies dans certains types de tumeurs, les cancers de ces patients sont généralement résistants à ces traitements. Afin de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques, il apparaît indispensable de comprendre les mécanismes moléculaires supportant la progression de ces cancers. Nos données préliminaires, ainsi que les connaissances dans d’autres types de cancers, suggèrent qu’une voie particulière pourrait jouer un rôle crucial dans la progression du cancer du pancréas et la résistance aux immunothérapies. Nous souhaitons donc investiguer l’effet de l’inhibition de trois composants de cette voie dans la progression de ces cancers, dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un nouveau mécanisme moléculaire permettant la progression du cancer du pancréas, et l’échappement au système immunitaire, constituant de fait une cible thérapeutique potentielle.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – injections intrapéritonéales d’anticorps (2 ou 3x 5 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’administration d’un des médicaments, peut induire une perte temporaire de poids légère, qui est restaurée rapidement après l’arrêt du traitement.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la voie d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que la voie d’intérêt est impliquée dans la prolifération des cellules de cancer du pancréas, mais aussi dans leur expression de certaines molécules impactant la réponse immunitaire. Cependant, la pertinence préclinique de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour valider la fonction de ces protéines. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de cancer du pancréas, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent des cellules de mélanome sous la peau du flanc puis des lymphocytes en intraveineuse, et sont transportées pour une irradiation de dix minutes qui peut leur faire perdre du poids et affaiblir un temps leurs défenses immunitaires. La tumeur est mesurée trois fois par semaine, l'objectif étant de voir si des lymphocytes modifiés pour surexprimer un facteur cellulaire deviennent efficaces contre les tumeurs solides, là où les thérapies par transfert de lymphocytes échouent aujourd'hui. Le porteur écrit que les interactions entre cellules immunitaires et microenvironnement "ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables", après avoir mené in vitro les expériences qui ont suggéré l'intérêt de ce facteur.

Objectifs

Les traitements d’immunothérapie ont révolutionné la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, les thérapies par transfert de lymphocytes, qui sont très efficaces dans les cancers du sang, ne permettent aujourd’hui pas d’obtenir un bénéfice clinique chez les patients atteints de tumeurs solides telles que le mélanome. Un nouveau facteur cellulaire a été décrite comme importante pour la fonction des lymphocytes dans le mélanome. Nous souhaitons donc évaluer l’effet d’une augmentation génétique de l’expression du facteur d’intérêt dans deux types de thérapies par transfert de lymphocytes, dans le cadre du mélanome chez la souris.

Bénéfices attendus

A ce jour, les thérapies cellulaires par transfert de lymphocytes ne sont que très peu efficaces chez les patients atteints de tumeurs solides. Nos travaux pourraient permettre soutenir le développement d’une nouvelle génération d’immunothérapies par transfert de lymphocytes sur-exprimant le facteur d’intérêt.

Procédures

Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris) – Transport sur le même site et irradiation à faible dose (10 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’irradiation peut entraîner une perte de poids temporaire et une immunodéficience partielle temporaire.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la molécule d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que l’augmentation de l’expression du facteur d’intérêt dans les lymphocytes, améliore leur potentiel thérapeutique. Cependant, le développement pré-clinique de cette thérapie de nouvelle génération nécessitera une série d'expériences in vivo pour confirmer son effet bénéfique. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes , de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies.. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

Constituer et entretenir une collection de tumeurs humaines greffées, mise à disposition d'autres chercheurs et des tests précliniques de médicaments : 9 830 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit sous anesthésie générale, après incision du dos, un fragment de tumeur ou une injection de cellules tumorales, la plaie refermée par deux ou trois agrafes, puis un marquage à l'oreille ou une puce sous la peau. Suivent des mesures de tumeur jusqu'à trois fois par semaine, parfois des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire ou une ponction intracardiaque terminale, et selon les modèles un traitement à la testostérone ou aux œstrogènes. Le porteur juge "indispensable" de développer ces modèles sur un "organisme complexe", et chiffre l'effectif en greffant chaque modèle sur six à dix-huit souris par passage, pour un taux de pousse annoncé à 25 % minimum.

Objectifs

L’augmentation des chances de succès de la mise sur le marché d’un médicament efficace, notamment en oncologie, passe par l’amélioration des systèmes permettant de tester le potentiel thérapeutique de ce médicament avant son application enclinique, et donc par la mise au point de modèles in vivo mieux caractérisés et plus proches des pathologies étudiées. Les modèles de Patient Derived tumor Xenografts (PDX) sont des outils précieux pour la recherche visant à étudier les effets de médicaments en amont des essais cliniques puisqu’ils conservent les caractéristiques moléculaires et histologiques des tumeurs primaires humaines dont ils sont issus. L’établissement de collections de PDX est donc aujourd’hui un enjeu majeur pour l’évaluation des thérapies anti-cancéreuses afin de reproduire au mieux la diversité des cancers humains, de développer des thérapies spécifiques et d’identifier les marqueurs biologiques prédictifs de la réponse à ces thérapies. Le but de ce projet est de développer une collection de modèles PDX fiables, représentant au plus près la maladie humaine, afin de mettre à disposition du plus grand nombre de chercheurs des outils performants permettant de comprendre et de lutter efficacement contre les différents types de cancers. Les modèles PDX seront générés à partir de l’exérèse de tumeurs prélevées chez des patients consentants, ou encore par transfert de modèles primo-implantés par nos collaborateurs. La réalisation d’analyses moléculaires fait partie intégrante du projet afin de caractériser le plus finement possible les modèles développés. Ce sont elles qui permettront de choisir le modèle étudié en préclinique (selon la présence d’une mutation particulière, l’expression d’un gène spécifique,…). La mise en service de modèles PDX couvrant la diversité tumorale permettra de relever les défis actuels rencontrés dans la lutte contre le cancer grâce à une identification rapide des évènements oncogéniques, leur ciblage thérapeutique et l’anticipation des mécanismes de résistance et de toxicité aux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif le développement de modèles de PDX nécessaire pour déterminer l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques développées ou en cours de développement dans un contexte préclinique, dans le but d’améliorer et d'identifier des thérapies efficaces pour le traitement des divers types de cancers. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement, les études précliniques ont une première étape vers l’identification des traitements plus efficaces ou avec des effets secondaires moindres.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une greffe correspondant à l'implantation d'un fragment de tissus tumoral ou de cellules dissociées issues de tissus tumoral. Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale). La peau est incisée au niveau du dos de l'animal après désinfection préalable. La greffe est réalisée par l'implantation d'un fragment tumoral ou l’injection de cellules. Afin d'identifier avec précision le modèle implanté, les souris seront marquées au niveau des oreilles ou avec une puce insérée en sous cutané. L'incision est alors refermée par 2-3 agrafes préalablement aseptisées. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être et de leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Selon les caractéristiques des modèles, un traitement à la testostérone ou une supplémentation en oestrogènes pourront être réalisés. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. La durée de mesure de la tumeur et de pesée est inférieure à 1 minute par animal. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles des prélèvements de sangs pourront être effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale, dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques pourront être pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale. La durée de prélèvement est inférieure à 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie et la chirurgie, une hypothermie, des douleurs post-opératoires et un risque d’infection peuvent être attendus. La xénogreffe de tumeurs peut également provoquer une perte de poids (modèles cachectiques). Un stress induit par les prélèvements sanguins est également une nuisance attendue. Ces nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont transitoires et peuvent donc être classés en modérés. Dans le cas où ces nuisances persisteraient, elles déclencheraient l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral ou de cellules tumorales, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. La réutilisation ne peut pas être possible car les effets des procédures précédentes que les animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, greffe de cellules tumorales, traitement hormonal) pourraient introduire une variabilité indésirable dans les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests pré-cliniques afin de valider leur absence de toxicité et leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives à la réalisation de tests sur les animaux (in vitro, prédictions informatiques…), permettant de réduire la quantité de tests à effectuer en nombres de traitements et en détermination de doses. Cependant, elles n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec une activité du métabolisme d’un organisme complexe pour l’étude de la distribution et de l’efficacité thérapeutique. Ce projet a pour objectif de développer les modèles PDX à partir de tumeurs de patients. Ces modèles sont les seuls représentant le plus fidèlement possible les diversités caractéristiques observée dans les cancers humains, et ce dans un organisme complexes. Ils permettent d’augmenter les chances de succès dans le développement de traitements efficaces et personnalisés pour des populations définies (médecine personnalisée), avant un transfert en étude clinique chez l’Homme.

Réduction

Le développement de PDX est standardisé et la parfaite connaissance de ce type de modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale utilisant un nombre d’animaux réduit au minimum. Nous estimons développer 40% des modèles primo-implantés (taux de chances qu’un modèle pousse chez la souris à partir d’un échantillon humain) et 100% des modèles transférés par les partenaires du projet, ces derniers ayant été greffés chez la souris au préalable, leur croissance chez la souris a déjà été un succès. Lors de la greffe d’une tumeur sur un animal, les chances qu’elle pousse est de minimum 25% (d’après les données internes et les données de la littérature). Pour maximiser les chances de réussites et espérer la croissance d’au moins une tumeur par passage, chaque modèle est greffé sur 6 animaux à chaque passage. Si, pour un modèle donné, nos analyses montrent que le taux de pousse est supérieur à 25%, le nombre d’animaux greffé à chaque passage pourra être réduit à 4 au lieu de 6. Afin de garantir la conservation des modèles dont le développement a été un succès, et pour analyser leurs caractéristiques biologiques et moléculaires, une banque biologique est créée, nécessitant de greffer chaque modèle sur 18 animaux à un passage donnée. Si le taux de pousse est supérieur à 25%, le nombre d’animaux greffé à ce passage pourra être réduit à 12 au lieu de 18. Afin de vérifier les possibilités de décongélations des modèles, 3 méthodes de décongélations sont testées, cela nécessite l’utilisation de 6 animaux par méthode de décongélation (3x6=18 animaux). Si la première méthode de décongélation testée est un succès, les deux autres méthodes ne seront pas testées permettant de réduire le nombre d’animaux à 6 au lieu de 18.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré. Lors de l’acte chirurgical, la greffe se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter le risque d’hypothermie. De l’antiseptique sera appliqué sur la peau des animaux, les agrafes seront aseptisées et le matériel utilisé sera stérilisé pour éviter les risques d’infection. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. Si une sécheresse oculaire est observée lors des prélèvements, un protecteur oculaire sera administré à l’animal. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.

Choix des espèces

L'objectif du projet est le développement de modèles nécessaires pour la réalisation de tests précliniques, dont le but final est la détermination de l’efficacité de nouvelles thérapies pour le traitement des cancers. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il existe des méthodes alternatives à la réalisation de tests sur les animaux (in vitro, prédictions informatiques…), permettant de réduire la quantité de tests à effectuer en nombres de traitements et en détermination de doses. Cependant, elles n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec une activité du métabolisme d’un organisme complexe pour l’étude de la distribution et de l’efficacité thérapeutique. Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques et qui ont été utilisées lors du pré-développement des modèles par les partenaire du projet. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, de plus de 18g, âgés entre 6 et 10 semaines pour augmenter nos chances de succès

Élevées dans un premier établissement pour ses conditions d'hébergement particulières, puis transportées vers un second uniquement pour y être tuées, 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un composé chimique dans l'eau de boisson déclenche une inflammation intestinale, par trois cycles de cinq jours à concentrations croissantes, entrecoupés de quatre jours d'eau avec ou sans antibiotiques. Le porteur indique que les diarrhées provoquées font perdre environ 25 % du poids initial et que ce poids est retrouvé deux à sept jours après la fin du traitement. Sur le remplacement, il écrit avoir déjà testé in vitro la présentation de l'antigène microbien aux lymphocytes T, et conclut que le rôle de l'interaction entre l'hôte et son microbiote ne peut être établi hors d'un "organisme entier".

Objectifs

Les bactéries du système digestif (microbiote intestinal) assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs : les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote intestinal et dans la réduction de l’inflammation du colon. Décrypter les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains ouen cas d’inflammation intestinale chronique, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Nous souhaitons maintenant déterminer le rôle des bactéries dans l'activation et dans la fonction protectrice des lymphocytes T au cours de l’inflammation du colon. L'étude permettra de mieux comprendre le mécanisme de protection des lymphocytes T au cours de cette inflammation. Le modèle de souris nécessite des conditions d’élevages particulières qui sont disponibles dans le laboratoire 1. L’euthanasie et les prélèvements d’organes seront réalisés dans le laboratoire 2.

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et les bactéries du système digestif. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris recevront dans l’eau de boisson un composé chimique qui génère une inflammation intestinale pendant 3 cycles de 5 jours à des concentrations progressives. Chaque cycle est suivi de 4 jours d’eau avec ou sans traitement d’antibiotiques. Le projet est réalisé sur le site n°1 sauf l’acte de mise à mort qui est réalisé sur le site n°2.

Impact sur les animaux

L’inflammation intestinale est induite par administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson et est associé à des effets indésirables attendus. Elle peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 25% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet, les antibiotiques utilisés n’ont jamais montré d’effet indésirable lorsqu’ils sont utilisés pour éradiquer les bactéries. De plus, la bactérie utilisée pour le projet est une bactérie naturellement présente dans le système digestif. Le transport peut engendrer un stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par histologie ou cytométrie en flux.

Remplacement

Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules dans un organisme entier. Le rôle (bénéfique ou délétère) de l’interaction hôte-microbiote ne peut pas être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.

Réduction

Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (changes de cages etc…) et une observation accrue durant l’inflammation intestinale induite, susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress, et cela plusieurs fois dans la journée pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet délétère. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (3 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport selon leur répartition d’origine afin de ne pas induire un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera rajoutée de la litière, de l’enrichissement et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Le transport se fera dans un véhicule agréé et climatisé.

Choix des espèces

La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature.

Quinze semaines d'un régime gras rendent 288 souris obèses, diabétiques et porteuses d'un foie chargé de graisse, avant sept prélèvements de sang en deux heures le jour du test au glucose. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Le porteur ne décrit comme douleurs que celles des piqûres de la queue et des prélèvements à la veine sous-mandibulaire, qualifiées de légères, l'obésité, le diabète et la stéatose induits restant rangés au titre des perturbations métaboliques attendues. La mise à mort finale sert à récolter le sang et les organes pour identifier les protéines associées à la protéine p85 dans la voie de l'insuline.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie métabolique caractérisée par une concentration élevée de sucre (hyperglycémie) dans le sang. Le nombre de cas est en constante augmentation, en parallèle avec l’augmentation des cas d’obésité. Les patients diabétiques développent fréquemment des maladies chroniques du foie, notamment caractérisées par une accumulation de graisses dans le foie (stéatose). L'hyperglycémie, qui définit le diabète de type 2, est liée à l'action inadéquate de l'insuline. L'insuline est libérée par le pancréas suite à l'ingestion d'un repas. Elle agit avec d’autres protéines en cascade afin de faire entrer le sucre dans les cellules et maintenir sa concentration correcte dans le sang. Parmi les protéines de cette cascade, on retrouve notamment une protéine appelée p85. Afin de mieux comprendre les mécanismes liés au développement d'un diabète et d'accumulation de graisses dans le foie, nous souhaitons identifier les protéines qui participent au maintien de la concentration correcte de sucre dans le sang chez des souris mâles et femelles obèses. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques afin d'identifier les protéines qui sont associées à la protéine p85. Ces souris seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une stéatose chez l'animal. Les études cliniques et précliniques indiquent des différences majeures liées au sexe dans la voie de l'insuline, ainsi nous utiliserons des souris des 2 sexes. A la fin de l'expérience, différents organes seront prélevés afin de purifier la protéine d'intérêt et d'identifier les protéines auxquelles elle est associée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la voie de l'insuline dans les pathologies du diabète de type 2 et du foie gras (stéatose hépatique). La purification spécifique des protéines d'intérêt de la voie de l'insuline permettra d'identifier et de comparer leurs interactions avec d'autres protéines chez des souris saines et des souris obèses. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Les animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Un prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux recevront une fois une solution de glucose par gavage et une fois de l'insuline par injection intrapéritonéale. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes et seront espacés au minimum d'une semaine. Le même jour, des prélèvements d’une seule goutte de sang seront réalisés à la queue toutes les 15 min minutes sur une durée de 2h pour étudier, soit 7 prélèvements prenant moins de 5 secondes chacun. Un prélèvement intermédiaire de sang, prenant environ 15 secondes, pourra aussi être réalisé (1 fois 100 μl), espacé au minimum d’une semaine avec les autres prélèvements. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec les régimes gras deviendront obèses et présenteront des perturbations métaboliques associées à l’obésité telles que le développement d’un diabète (concentration élevée de sucre dans le sang) et d'une stéatose (accumulation de graisses dans le foie). Les prélèvements sanguins (intermédiaire et final) à la veine submandibulaire et les injections de glucose (OGTT) et d’insuline (ITT) peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang (pour la mesure de la glycémie) peut entraîner une légère douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les pathologies étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, dans ces pathologies, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier une version modifiée d'une protéine d'intérêt.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.