Rats

46 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever et analyser leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection d'antibiotique dans la veine de la queue, puis subit sous anesthésie une ponction de liquide cérébrospinal et un prélèvement de sang, après quatre séances d'habituation au tube de contention. Le porteur signale que l'injection provoque une perte d'équilibre et une attitude prostrée. Tout tient à une mesure de concentration, et les résultats attendus "constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement" de l'antibiotique, formule qui tient le bénéfice pour les patients à bonne distance.

Objectifs

Les infections neuroméningées sont difficiles à traiter de par la présence de barrières physiologiques dans l'organisme protégeant le cerveau. De plus, l'émergence de résistance aux antibiotiques actuels accentuent cette problématique. La recherche de nouveaux antibiotiques pouvant traiter ces infections devient donc un enjeu majeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer la capacité d'un nouvel antibiotique à passer la barrière qui protège le cerveau et à pénétrer dans le liquide cérébrospinal et dans le cerveau. L'antibiotique choisit a fait ses preuves dans des infections rénales ou pulmonaires compliquées.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de cette étude chez l'animal constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement de cet antibiotique dans l’indication des infections neuro-méningées chez l'homme.

Procédures

Tous les animaux recevront au cours du projet une injection d'antibiotique de 30 secondes environ, et 2 prélévements (liquide cérébrospinal et sang) seront réalisés sous anesthésie. La durée de l'anesthésie sera de 5 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Injection caudale :légère douleur, brève et transitoire. Injection antibiotique : Perte d'équilibre et attitude prostrée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse de cerveaux

Remplacement

Dans les premières phases de développement d'un médicament à visée cérébrale, il est possible d'utiliser des cultures de cellules. Cependant ces cultures ne reproduisent pas la complexité des barrières protégeant le cerveau et elles ne prennent pas en compte l'existence d'autres organes dans lequel le médicament se distribue via la circulation sanguine. Les modèles animaux restent donc nécessaires avant de tester le médicament chez l'Homme.

Réduction

L'étude sera faite en deux étapes ; la première permettra de trouver les conditions optimales d'administration sur un rat par condition. Les résultats seront confirmés dans la seconde étape sur des lots de plusieurs d'animaux. En se basant sur des données de la littérature, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux par lot permettant d'obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 10 jours. Une habituation au tube de contention qui permettra l'injection est prévue : 4 séances de 5 min sur 4 jours différents précédents l’administration . Les prélèvements seront faits sur des animaux anesthésiés sous couverture antalgique. Des points limites gradés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations ce qui permettra d'agir sans délai.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé en pharmacologie. Il s’agit d'une lignée consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique observée dans les concentrations d'antibiotiques dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.

1 200 souris et 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections de vaccin sous anesthésie, espacées de quinze jours sur soixante jours, et subit cinq prélèvements de sang, avec une fièvre, une perte d'appétit et un gonflement au point d'injection attendus pendant un à deux jours. Il s'agit de tester de nouveaux adjuvants censés déclencher une réponse cellulaire cytotoxique que les adjuvants autorisés chez l'humain n'obtiennent pas. Le porteur écrit vouloir démontrer que ses modèles cellulaires pourraient à terme remplacer les animaux, et tire de cette comparaison même la "nécessité de l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques".

Objectifs

Les vaccins protéiques sont une classe de vaccins qui utilisent des protéines spécifiques de pathogènes pour stimuler une réponse immunitaire protectrice chez l'organisme. A cette composante protéique est ajouté un adjuvant afin d’obtenir une réponse immunitaire capable de protéger contre le pathogène ciblé. A ce jour, les adjuvants acceptés chez l’homme induisent de bonne réponses anticorps, mais la réponse cellulaire cytotoxique est très faible. Ces vaccins protéiques sont donc à ce jour peu efficaces pour protéger des infections virales. Nous avons développé de nouveaux adjuvants dans le but d’augmenter fortement cette réponse cellulaire cytotoxique. Nous avons développé de plus des stratégies pour limiter les effets secondaires tel que fièvre, inflammation locale… Nous nous proposons maintenant de tester ces candidats adjuvants chez le rongeur sur un modèle de vaccination très classique nous permettant d’évaluer la réponse immunitaire ainsi que vérifier l’absence d’effets secondaires importants.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but premier de trouver de nouveaux adjuvants pour des vaccins protéiques capable d’induire une bonne réponse immunitaire humorale et cellulaire importante sans générer d’effets secondaires importants. Il est important de noter qu’à ce jour il n’y a pas d’adjuvants réellement efficaces pour les vaccins protéiques qui permettent d’obtenir une bonne protection contre les pathogènes viraux. Ce projet pourrait permettre de mettre au point des vaccins contre des maladies virales pour lesquelles il n’existe aucun vaccin efficace à ce jour.

Procédures

Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins (temps injection 1 min max) espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal (temps prèlèvement 1 min maximum) et sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.

Remplacement

Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et la réactogenicité de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires ainsi que nos modèles de diffusion /relarguage in vitro pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 8 groupes de 6 souris. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminer une ou 2 formulations vaccinales optimisées qui seront ensuite testées chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de garder suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Une réaction locale au niveau du site d’injection ou de la fièvre peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Une grille de « scoring » permettra de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. A l’aide de cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude est le modèle immunologique de référence chez la souris. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.

Tremblements, convulsions, posture anormale, absence de réaction à la stimulation : ce sont les signes dont l'apparition déclenche la mise à mort anticipée des rongeurs de ce projet. 300 souris et 300 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés à des situations stressantes et à des chocs électriques, puis soumis à des tests d'anxiété de cinq à quinze minutes et à des administrations pouvant aller jusqu'à deux fois par jour pendant huit semaines, pour construire un modèle de trouble de stress post-traumatique et y tester une dizaine de candidats médicaments. Cent vingt d'entre eux pourront être réutilisés après une période de repos, les autres seront tués en fin d'étude, le porteur expliquant que les effets à moyen et long terme des substances testées sont méconnus.

Objectifs

Dans l'histoire américaine, les troubles de stress post-traumatique (PTSD) ont été reconnus sous divers noms après les guerres : "cœur de soldat de la guerre civile", choc de la Première Guerre mondiale, fatigue de combat de la Seconde Guerre mondiale, stress retardé de la guerre du Vietnam avant d’être formalisés en 1980. Ces dernières années, on a assisté à une augmentation d’intérêt pour ces psychopathologies liées à l’exposition aux traumatismes, en particulier à cause du terrorisme, des catastrophes naturelles ou encore des violences urbaines. La prévalence des troubles de stress post-traumatique serait de 5 à 12% de la population générale. Les patients, suite à leur exposition à un évènement traumatique, souffrent de symptômes sévères tels que la peur intense, des flash-backs, des cauchemars et des pensées imposées et incontrôlables. Malgré les avancées scientifiques importantes dans ce domaine, il n’y a aujourd’hui aucune thérapie réellement efficace sur l’ensemble des symptômes des troubles du stress post-traumatique. Les modèles animaux demeurent indispensables pour mieux comprendre ces troubles et identifier de nouveaux candidats médicamenteux. Ce projet vise à mettre en place un modèle de trouble de stress post-traumatique chez le rat qui intègre la sensibilité au traumatisme observée chez l’humain et de tester l’efficacité d'une dizaine de candidats médicaments existants ou en cours de développement.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à l'amélioration de la qualité de vie des patients et de leur entourage. Un traitement plus efficace pourrait réduire plus rapidement et plus durablement les symptômes des troubles de stress post-traumatique permettant ainsi une meilleure qualité de vie des patients, de maintenir un état de santé stable plus longtemps, de diminuer les taux d'invalidité . Ce projet permettra également d'avoir un impact socio-économique positif en réduisant les coûts de santé (nombre de consultations médicales, d'hospitalisations et de traitements complémentaires nécessaires).

Procédures

Les animaux sont exposés à différentes situations stressantes en fonction des procédures. Les tests comportementaux visant à évalualer le niveau d'anxiété des animaux sont généralement effectués 1 seule fois et leur durée varie de 5 à15 minutes environ. Les administrations de substances pourront être réalisées jusqu’à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration) principalement par voie orale sous cutanée ou intrapéritonéale sur animal vigile. La durée du traitement peut aller jusqu’à 8 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à des situations induisant une état de stress. Les chocs électriques pourront également induire une faible douleur de très courte durée. Les manipulations/contentions réalisées notamment pendant les phases d'administration ou de prélèvements peuvent également entrainer un léger stress. Les candidats médicaments qui seront évalués ont été selectionnés en amont pour leur absence de toxicité sévère.

Devenir

Tous les animaux ayant reçu une substance d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus seront euthanasiés en fin d’étude afin de s’assurer que le traitement expérimental n’induira pas d’effet délétère sur l’animal, ce qui ne serait pas compatible avec un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation chez l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité, réduisant de façon significative le nombre de substances à tester et donc le nombre d’animaux. L'impact des traitements pré-sélectionnés sur le comportement des animaux, et l'amélioration de symptômes liés aux états de stress et d'anxieté ne peut se faire que sur des animaux vigiles. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 12 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte des tests. Le cas échéant, une réutilisation des animaux pourra être envisager après une période de repos entre l'évaluation de différentes molécules. L'analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques de type ANOVA "analyse de la variance" et/ou test de Student selon l'objectif de l'étude. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur et de souffrance (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, tunnels, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions. Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie éthique si nécessaire. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.

Choix des espèces

Les troubles de stress post-traumatique sont largement évalués chez les animaux, en particulier chez le rongeur. Ainsi, divers tests ont été conçus pour mesurer ces différents aspects. L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature. Les symptômes de stress et d'anxiété se retrouvent plutôt chez des sujets adolescents ou adultes, aussi les traitements qui seront appliqués dans ce projet seront appliqués sur des rongeurs dont le système nerveux central a atteint ce niveau de maturité.

L'ablation partielle du pancréas provoque chez le rat des fistules puis une accumulation de liquide dans l'abdomen, que le porteur prévoit de ponctionner ou, à défaut, de traiter par la mise à mort de l'animal. 360 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une laparotomie de trente minutes, jusqu'à deux administrations quotidiennes de traitement pendant quatorze jours, des prélèvements sanguins sous anesthésie et jusqu'à trois séances d'IRM d'une heure, pour mettre au point un modèle de fistule pancréatique et y évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Le choix du rat, le porteur le justifie par ses "facilités d'entretien, de stabulation et de manipulation" autant que par sa proximité physiologique avec l'humain.

Objectifs

Ce projet vise 1) à mettre en place un modèle de fistule pancréatique chez le rat et 2) utiliser ce modèle pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce modèle permettra de vérifier la faisabilité d'une thérapie novatrice pour soigner les patients atteints de fistules pancréatiques et de détecter d'éventuels effets secondaires indésirables.

Procédures

Une chirurgie viscérale avec ablation partielle du pancréas afin de mimer une opération chez l'humain (durée estimée à 30 minutes). Traitements médicamenteux administrés au maximum de 2 fois par jour pour une durée maximale de 14 jours (durée : 1 minute / administration). En cas de prélèvement sanguin, ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à un par jour et à un volume inférieur à 10 % sur 2 semaines. Une imagerie par IRM réalisé 3 fois maximum sur une durée de 14 jours (15 - 60 min par session).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale inclut une laparotomie, l'ablation partielle du pancréas, puis la survenue de fistules pancréatiques. Une analgésie adaptée sera appliquée limitant la gêne au maximum. De l'ascite pourra être consécutif à la génération des fistules occasionnant également une gêne. Afin de limiter celle-ci nous réaliserons des ponctions ou, si cela n’est possible, nous euthanasierons les animaux. Le stress lié à la préhension et à la contention, et les administrations, induiront une gêne inférieure / équivalente à la piqure d’une aiguille.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes / fluides corporels pour analyse.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat, car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) permettant d'évaluer les effets d’une nouvelle approche thérapeutique dans le contexte des fistules pancréatiques. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue une étape obligatoire pour évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux sera inclus au départ pour la mise en place du modèle. Trois séries de dix animaux permettront d'évaluer la robustesse de la procédure expérimentale réalisée. Par la suite, lors des essais de traitements, nous inclurons 10 animaux par groupe, en fonction des résultats attendus, afin de réaliser une analyse valable des données, notamment par approche statistique.

Raffinement

Dans ce projet, l'objectif est d'atteindre un niveau de raffinement élevé grâce à : • La mise au point de procédures rigoureuses ; • La formation du personnel ; • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux ; • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites ; • Le recours à un suivi par imagerie si possible / nécessaire ; • le suivi de l'apparition d'ascite et la ponction de celui-ci si possible ; • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire ; • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire, ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés, afin de permettre une bonne récupération des animaux ; • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements, notamment en raison de leurs facilités d’entretien, de stabulation et de manipulation, ainsi que de leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Les animaux utilisés sont adultes.

Une injection de cellules tumorales sous l'omoplate, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie dont une de deux heures : six souris ouvrent ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite six rats, opérés une heure sous anesthésie pour qu'on leur greffe une tumeur dans le cerveau, puis passés trois fois à l'imagerie. Les douze animaux, tous immunodéficients pour accepter les cellules humaines, sont tués à la fin pour vérifier où le traceur radioactif s'est fixé dans leur corps. Le porteur annonce commencer par trois mâles et n'inclure les trois femelles, puis la phase chez le rat, que si les résultats sont concluants, ce qui pourrait ramener le total à trois animaux.

Objectifs

Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus graves chez l’adulte. Ils sont très difficiles à soigner, car certaines cellules résistent aux traitements et provoquent souvent des rechutes. Pour mieux lutter contre ces cellules résistantes, il est nécessaire de les repérer plus précisément. Une des méthodes actuelles utilise des anticorps, qui sont des composés capables de reconnaître les cellules cancéreuses. Mais ces anticorps sont souvent trop gros pour passer la barrière naturelle qui protège le cerveau. Cela limite leur efficacité. Ce projet s’intéresse à une version plus petite de ces anticorps, appelée fragment d’anticorps, qui pourrait mieux atteindre les cellules malades. En y ajoutant un élément radioactif, ces fragments peuvent être utilisés pour les rendre visibles grâce à une technique d’imagerie médicale appelée TEP (Tomographie par Émission de Positons). L’objectif est de tester ce nouveau fragment pour voir s’il permet de mieux détecter les cellules cancéreuses résistantes dans les glioblastomes. Si cela fonctionne, cela pourrait aider les médecins à suivre plus précisément l’évolution de la maladie et à adapter les traitements à chaque patient. À long terme, cela pourrait améliorer la prise en charge et les chances de survie des personnes atteintes de ce cancer.

Bénéfices attendus

En permettant une détection plus précoce et plus précise des cellules cancéreuses résistantes, les agents d’imagerie développés en amont de ce projet pourraient aider à mieux évaluer la progression de la maladie et à adapter les traitements de manière plus ciblée. À terme, cela pourrait contribuer à une prise en charge plus personnalisée des patients et à une amélioration de leur pronostic.

Procédures

Une injection sous-cutanée de cellules tumorale pour les souris (5min). Une chirurgie de greffe tumorale intracérébrale pour les rats (1h). / 2 examens d'imageries de 10min et 2h pour chaque souris et 3 examens d'imagerie de 15min, 20min et 2h pour chaque rat, sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Chez la souris, la tumeur implantée sur l’omoplate peut gêner légèrement la locomotion. La mesure de la taille de la tumeur sur animal vigile peut induire un stress modéré. Le jeûne avant l'esamen d'imagerie peut entraîner une hypoglycémie. Les examens d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées, de durée variable selon le protocole. Chez le rat, l'implantation de la tumeur peut entraîner des effets secondaires, notamment neurologiques. Les anesthésies seront également répétées et plus longues que chez la souris. Chez les deux espèces, les injections répétées dans la veine caudale peuvent provoquer une inflammation locale, une douleur transitoire.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés afin d'évaluer la fixation du fragment d'anticorps radioactif (diagnostic) dans le corps entier de l'animal.

Remplacement

Des études de biologie cellulaire en laboratoire ont été réalisées au laboratoire et ont montré des résultats prometteurs, néanmoins l’évaluation dans l'organisme du devenir du fragment d'anticorps reste indispensable. En effet, les modèles cellulaires actuellement disponibles ne reflètent pas fidèlement la distribution observée dans un organisme entier. Il est crucial de vérifier que ce produit se fixe bien sur la tumeur, sans accumulation dans d’autres organes, à l’exception de ceux impliqués dans son élimination (comme les reins). Par ailleurs, nos modèles de cellules sont enrichis en cellules souches cancéreuses. Cependant, la proportion de ces cellules varie considérablement d’une tumeur à l’autre. Ainsi, seule une évaluation dans un organisme vivant permet de juger de manière fiable le comportement et la spécificité du composé. De plus, pour savoir si le composé expérimental peut traverser la barrière protectrice du cerveau, il est indispensable d’utiliser un modèle animal de tumeur intracérébrale.

Réduction

Cette étude est conçue comme une étude exploratoire, en 2 phases, visant à évaluer le potentiel de fixation du fragment d'anticorps radioactif au niveau de la tumeur sous-cutanée puis intra-cérébrale. Phase 1 : Tumeur sous-cutanée chez la souris. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six souris nude (trois mâles et trois femelles). Toutefois, seuls les mâles seront utilisés dans un premier temps (car le glioblastome a une prévalence masculine). Si les résultats obtenus sur les mâles sont concluants, les femelles seront incluses. Dans le cas contraire, les femelles ne seront pas testées et l'étude s'arrêtera, réduisant le nombre d’animaux à 3 au lieu de 6. Phase 2 : Tumeur intracérébrale chez le rat. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six rats (trois mâles et trois femelles). Cependant, l’utilisation de ces animaux dépendra des résultats obtenus durant la phase 1. Si les résultats de la phase 1 ne sont pas concluants, la phase 2 ne sera pas initiée et les 6 rats nude ne seront donc pas utilisés. Cette approche progressive,permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des données préliminaires essentielles pour orienter les étapes expérimentales ultérieures. Chaque animal sera son propre contrôle car le côté controlatéral pourra être utilisé comme référence de tissu sain.

Raffinement

Le transport des rats entre l’animalerie et le site d’imagerie, situé à proximité de la plateforme, sans passage à l’extérieur, sera réalisé en maintenant une température optimale par l’intermédiaire de bouillotes chauffantes placées sous les cages. Un suivi quotidien sera assuré pour tous les animaux, avec une attention particulière portée à l’état général, au comportement, à la mobilité et à l’alimentation-hydratation ainsi qu’à la vérification du bon état de la plaie. Des points limites précoces ont été fixés (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement), afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Toute altération du bien-être entraînera une prise en charge adaptée ou une euthanasie anticipée si nécessaire. Toutes les manipulations potentiellement stressantes ou douloureuses (injection du composé radioactif, imageries) seront réalisées sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur et de stress. Les animaux seront sous anesthésie générale de l’injection du composé radioactif et lors des examens d'imagerie, les animaux sont placés dans un lit chauffant avec surveillance respiratoire et cardiaque et le niveau d’anesthésie sera surveillé et adapté si besoin pour garantir un état stable et sécurisé des animaux. Leur réveil se fera dans un environnement calme et sous surveillance. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté.

Choix des espèces

Souris : Au cours de projet, il est indispensable de travailler avec des souris immunodéficientes pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Rats : Il est indispensable de travailler avec des rats immunodéficients pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Ce choix est également motivé par la limite de la résolution des appareils d'imagerie, qui ne permettrait pas d’obtenir une qualité d’image suffisante, pour analyser correctement les lésions tumorales intracérébrales (la tumeur ayant un volume plus réduit en intracérébral) sur des animaux plus petits comme les souris. Phase 1 : Des souris de 6 semaines (stade adulte) à leur arrivée seront utilisées. Elles auront 7 semaines lors de l’implantation des cellules tumorales et entre 8-9 semaines au moment des imageries. Phase 2 : Des rats âgés de 7 semaines au moment de la greffe (6 semaines à la réception) seront utilisées à un stade où la croissance crânienne est achevée.

Produire des parasites pour un réactif de diagnostic exigé lors des mouvements internationaux de chevaux : 735 rats vont être infectés par Trypanosoma equiperdum, l'agent de la dourine, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection les tue en quelques jours. Ce sont d'anciens reproducteurs de plus de 500 grammes, choisis pour la quantité de sang qu'on peut leur prélever, soumis à deux prélèvements quotidiens sous anesthésie gazeuse avant d'être mis à mort. Le porteur indique que la mise à mort intervient quand la parasitémie atteint son maximum et "autant que possible" avant l'apparition de signes cliniques, un rendement élevé par animal réduisant le nombre de protocoles à lancer. La finalité affichée est d'éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait la circulation commerciale des équidés.

Objectifs

Cette demande d’autorisation à expérimenter sur animaux vivants porte sur la production sur rats de parasites Trypanosoma equiperdum, agent infectieux responsable de la dourine. La dourine est une maladie sexuellement transmissible qui affecte les équidés et qui engendre un fort taux de mortalité ; elle est non transmissible à l’homme. Les procédures utilisées sont celles décrites par les instances internationales et ont pour objectif de produire les réactifs nécessaires au diagnostic officiel permettant d’empêcher la propagation de la dourine lors de mouvements internationaux d’équidés. Les parasites produits pourront également être utilisés dans le cadre de projets de recherche ayant pour vocation l’amélioration du diagnostic de la dourine et l’amélioration des connaissances sur cette maladie.

Bénéfices attendus

Bien qu’un résultat sérologique négatif soit exigé vis-à-vis de la dourine pour permettre les mouvements internationaux d’équidés, seuls quelques laboratoires au monde sont en mesure techniquement de produire les réactifs nécessaires à la réalisation de ce test. Ainsi l’approvisionnement en réactif pour le diagnostic de la dourine est une réelle problématique dans de nombreux pays du monde. Ainsi ce bénéfice apporté par ce projet est de maintenir notre capacité de production d’antigènes afin d’éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait le contrôle du statut sanitaire des équidés vis-à-vis de la dourine qui pourrait impacter fortement les mouvements internationaux d’équidés.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection de parasite T. equiperdum sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - deux prélèvements quotidiens d’une goutte de sang sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - une mise à mort sous anesthésie gazeuse complétée par d’une anesthésie profonde (2 min).

Impact sur les animaux

Afin de limiter les signes cliniques causés par le parasite (Trypanosoma equiperdum), la mise à mort est programmée avant que les animaux ne présentent des signes d’affaiblissement. Pour cela un suivi au moins deux fois par jour est réalisé. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort et son sang récolté. Une fiche individuelle de suivi est complétée à chaque intervention sur l’animal.

Devenir

L’infection par le parasite Trypanosoma equiperdum est mortelle au bout de quelques jours pour les rats inclus dans le protocole. Ainsi, pour éviter toute souffrance inutile, des animaux sont mis à mort soit quand la quantité de parasites dans le sang atteint le seuil recherché, soit quand des signes de souffrances sont observés chez l’animal.

Remplacement

Afin de garantir le statut sanitaire des équidés lors de leurs déplacements internationaux, des tests de diagnostic de la dourine sont exigés au niveau mondial. À ce jour, seul le test de fixation du complément (TFC) est reconnu par l’Organisation mondiale de la santé animale (OMSA) pour le diagnostic sérologique de cette maladie. Les quantités de réactifs requis pour la mise en œuvre du TFC, combinés au nombre élevé d’équidés circulant à l’échelle mondiale, font que de grandes quantité de parasites doivent être produites pour répondre à la demande. La seule alternative à l’infection de rats pour produire ces parasites est la culture in vitro. Cependant, les caractéristiques biologiques des parasites limitent fortement les rendements obtenus par cette méthode, rendant la production in vitro insuffisante pour répondre à la demande mondiale en antigènes. Dans le but de réduire (voire de suspendre) le recours à la production sur animaux, notre programme de travail inclut le développement d’un test ELISA standardisé pour la dourine, test pour lequel les quantités d’antigènes utilisés sont compatible avec les capacités de production in vitro. Une fois validé, ce test pourra être proposé à l’OMSA en vue de sa reconnaissance comme méthode officielle de diagnostic, au même titre que le TFC dourine. Dans l’attente de cette reconnaissance, la production d’antigènes sur rats reste à ce jour la seule solution permettant d’assurer la continuité des contrôles sanitaires lors des mouvements internationaux d’équidés.

Réduction

Le nombre d’animaux par production de parasites (21 rats) est défini par les protocoles décrit dans les réglementations internationales. De plus nous apportons un soin particulier à ce que la mise à mort des animaux soit réalisée de manière à obtenir le meilleur rendement de production de parasites, pour permettre de réduire au maximum le nombre de protocoles réalisés.

Raffinement

Les rats sont hébergés en zone de confinement A2, dans une pièce dédiée aux rats, en portoir ventilé, dans des cages permettant la position bipède. Chaque cage possède une plateforme, les rats en fonction de leur poids sont réunis par groupe de 2 ou 3. Pour chaque cage, l’enrichissement du milieu est apporté par : un tunnel, des matériaux de nidification, des os à ronger, ainsi que des buchettes bois à ronger. Afin de limiter la souffrance des animaux, tout acte invasif est effectué sur des animaux anesthésiés. La mise à mort des rats a lieu quand le nombre de parasites comptés dans le sang de l’animal a atteint son niveau maximum et autant que possible avant que les animaux ne développent des signes cliniques. En effet, plus le nombre de parasites collectés par animaux est important, moins nous aurons de protocoles de productions à mettre en place. Pour cela nous surveillons les animaux et réalisons des comptages de parasites de manière régulière. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort (point limite) et son sang récolté ; et ce, indépendamment de sa parasitémie.

Choix des espèces

Notre protocole suit les recommandations internationales quant à l’espèce animale sélectionnée (le rat). Cette espèce a été sélectionnée car elle est assez grande pour récolter des quantités importantes de sang (contrairement à la souris) tout en restant un animal dont l’utilisation est assez répandue pour permettre de standardiser la production d’antigènes. Dans ce contexte les animaux utilisés sont des rats adultes de poids supérieur à 500 grammes (anciens reproducteurs) afin de pouvoir prélever la plus grande quantité de sang possible et ainsi récupérer le plus de parasites par animal.

5 450 nouveau-nés, 3 250 ratons et 2 200 souriceaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant ses quatorze premiers jours de vie enfermé dans une enceinte en hyperoxie pour lui provoquer une hypertension pulmonaire. Leurs mères sont échangées toutes les vingt-quatre heures pour leur éviter l'effet toxique de l'oxygène. Suivent des échographies cardiaques, des mesures de pression cardiaque et une pléthysmographie invasive, sur des animaux gardés jusqu'à un an afin de suivre les séquelles à l'âge adulte. Tous sont tués pour l'extraction du bloc cœur-poumon, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" de comprendre les mécanismes de cette maladie et que "seul l'animal entier" permet les interactions entre organes.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).