Souris
Mécanismes moléculaires assurant la production d’énergie dans les cellules immunes, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 195 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 135 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 060 un niveau léger. Elles sont infectées par un virus inoculé par inhalation sous anesthésie profonde, trente secondes par narine, et certaines subissent un prélèvement de sang par mois pendant douze mois avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'enjeu déclaré est de comprendre quelles sources d'énergie utilisent les cellules immunitaires dites tueuses au cours d'une infection virale, avec l'espoir d'identifier des cibles thérapeutiques et d'affiner l'usage de certaines classes d'antibiotiques. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'organisation spatiale de la réponse immunitaire rend son étude "impossible" in vitro et que la littérature montre une consommation énergétique différente en culture.
Objectifs
Le système immunitaire permet de protéger l’organisme face, entr’autres, à des infections virales. Certaines cellules du système immunitaire sont capables de reconnaitre spécifiquement les cellules infectées et de les détruire. Ces cellules appelées “cellules tueuses” ont besoin d’énergie et différentes sources d’énergie sont disponibles dans l’organisme. De manière intéressante, les “cellules tueuses” peuvent, au cours de leur vie, utiliser différentes sources d’énergie pour fonctionner, mais les mécanismes moléculaires qui les contrôlent restent peu, voire pas, connus. Ce projet vise ainsi à étudier les mécanismes moléculaires qui permettent de fournir l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des “cellules tueuses”, afin de garantir une bonne défense de l’organisme contre les infections virales. Pour cela, nous utiliserons différents modèles de souris génétiquement modifiées. Ces souris seront infectées par un virus que nous utilisons en routine au laboratoire et les souris seront utilisées différents temps après infection. Après mise à mort des animaux, des organes seront prélevés pour des analyses de biologie moléculaire et cellulaire.
Bénéfices attendus
Les “cellules tueuses” sont très importantes pour combattre les infections et les cancers. Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances concernant l’utilisation d’énergie au cours d'une infection virale, et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler leurs fonctions. De plus, beaucoup d’antibiotiques ont pour effet secondaire de moduler l’utilisation de ressources énergétiques dans l’organisme. Les résultats de cette étude pourraient aider à affiner l’utilisation de classes d’antibiotiques afin de limiter les effets délétères sur les réponses immunes.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par animal – durée 30 secondes ; - Injection (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes; - Infection par inhalation (sous anesthésie profonde) - 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine; Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par mois pendant 12 mois ou 1 fois, juste avant la mise à mort – durée 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont: i) une légère douleur et un stress généré par les prélèvements sanguins; ii) une légère douleur générée par les injections (pour l’anesthésie profonde); iii) le stress généré par la procédure d’inoculation du virus par inhalation; iv) une perte de poids transitoire générée par l'infection virale qui sera contrôlée; v) un léger délai de cicatrisation en cas de blessure qui pourrait survenir suite à une bagarre.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes et effectuer des analyses cellulaires et moléculaires afin de comprendre l’origine des apports énergétiques des cellules tueuses.
Remplacement
La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, les données de la littératures indiquent que l’étude des cellules tueuses in vitro ne reproduisent pas les utilisations énergétiques observées in vivo.
Réduction
Nous avons calculé par des approches statistiques, le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans toutefois compromettre une analyse robuste des résultats. De plus, une optimisation des protocoles a été réalisée in vitro en amont, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux requis pour les analyses moléculaires (qui demandent beaucoup de matériel cellulaire). Enfin, les nombres estimés d’animaux requis pour chaque procédure sont des nombres maximum d’animaux. En fonction des résultats obtenus à certains points temps, ces nombres pourront être réduits, comme indiqué pour chaque lot d’animaux au sein de chaque procédure.
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue jusqu’au réveil de l’animal; ii) les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie gazeuse après application d’un anestésique local; iii) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux; iv) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé ou muté, sur les réponses des "cellules tueuses". De plus, la souris est une espèce dans laquelle un grand nombre d'outils sont disponibles, permettant des analyses précises. Adultes de 6 semaines à 12 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (entre 6 et 12 semaines, le système immunitaire des souris est stable, selon nos expériences antérieures) et certains animaux seront gardés jusque 1 an après infection. Pour la procédure d’élevage, des adultes à partir de 6 semaines seront utilisés et gardés jusqu’à l’âge de 8 mois maximum (changement des couples reproducteurs tous les 6 mois).
Impact de l’enzyme ELOVL5 sur le développement de l’athérosclérose chez la souris dans un contexte riche en oméga 3
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Irradiées pendant trente minutes puis greffées par injection intraveineuse, 120 souris reçoivent ensuite un régime riche en cholestérol pendant seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées par ponction intracardiaque sous anesthésie pour prélever les plaques formées dans leurs vaisseaux. L'irradiation détruit les cellules de leur moelle osseuse et provoque une immunodépression compensée par quatre semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, avec des atteintes intestinales possibles, une perte de poids, de la fatigue et un grisonnement des poils. Le porteur écrit par ailleurs que "l'irradiation est quant à elle indolore".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires et notamment les complications aigues de l’athérosclérose restent la première cause de mortalité chez l’homme dans le monde. L'athérosclérose est une maladie où des plaques se forment dans les artères, bloquant le flux sanguin et augmentant les risques cardiaques. Dans ces conditions, une réponse inflammatoire s’établit au niveau de la paroi des vaisseaux sanguins entrainant l’activation des cellules immunitaires, qui absorbent alors de grandes quantités de lipides et de cholestérol entrainant alors la formation de la plaque. Les stratégies thérapeutiques existantes ne permettent de réduire que partiellement le risque cardiovasculaire. Il est donc urgent de trouver de nouvelles approches thérapeutiques. Certains types de lipides, notamment les oméga-3 et oméga-6 auraient un rôle important dans la réponse inflammatoire associée à la formation des plaques. Ces lipides en particulier représente alors une piste d’intervention nutritionnelle et thérapeutique prometteuse. Le but du projet est d’étudier l’influence d’une modification de la composition en lipide spécifique au système immunitaire sur développement de l’athérosclérose chez la souris, par un enrichissement plus ou moins important de lipides du type oméga-3, tout en étudiant l’impact du rapport de quantités d’oméga-3/oméga-6. Le développement de l’athérosclérose sera examiné dans un modèle de souris génétiquement modifiées prédisposées à la maladie, dont le système immunitaire sera spécifiquement soit enrichi en lipides de type oméga-3, soit fortement enrichi en lipides oméga-3 au détriment des lipides oméga-6 . Ces souris seront nourries avec un régime riche en cholestérol, nécessaire au déclenchement de la maladie. Ce modèle d’athérosclérose est similaire au développement de la maladie chez l’Homme.
Bénéfices attendus
L'athérosclérose est une maladie vasculaire résultant de l'accumulation de lipides dans les artères, formant alors des plaques dans ces vaisseaux sanguins. Les plaques empêchent la circulation sanguine et provoquent des maladies cardiovasculaires. Chez l’homme, l’athérosclérose est un facteur de risque majeur dans les maladies cardiovasculaires, qui est la première cause de mortalité. Il existe de nombreux types de lipides différents qui composent cette plaque. Certains de ces lipides auraient un rôle protecteur, notamment les lipides dit de type « oméga-3 ». La composition relative des différents types de lipides les uns par rapport aux autres auraient également un impact, notamment le rapport des quantités des lipides oméga-3 sur les lipides oméga-6. La composition en oméga-3, et plus largement une composition relative enrichie en oméga-3 sur les autres types de lipides permettraient de limiter la formation de la plaque. Cet effet serait médié par un impact sur les cellules du système immunitaire présentent dans la plaque, en limitant l’inflammation néfaste associée. Modifier la composition de ces plaques, par exemple par des approches médicamenteuses ou nutritionnelles, semble alors une piste thérapeutique prometteuse. Cependant, avant de pouvoir arriver à ces approches, il est nécessaire de comprendre si une modification de la composition des lipides est capable d’impacter réellement la formation des plaques, en modifiant positivement le comportement des cellules inflammatoires impliquées dans la formation des plaques, limitant ainsi la maladie et le risque cardiovasculaire. La mise en place d'un protocole expérimental impliquant une greffe de moelle osseuse après irradiation permettra de simuler un environnement riche en oméga-3 spécifique aux cellules immunitaires dont font partie les macrophages et d'évaluer les effets protecteurs potentiels des oméga-3 contre cette maladie. En fin de compte, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter ou prévenir les maladies cardiovasculaires associées à l'athérosclérose.
Procédures
- Prise de sang (2 prélèvements ponctuels espacés de 5 semaines) - Transport (1h, 1 aller-retour) - Irradiation (30 min) - Injection intraveineuse caudale unique et ponctuelle (greffe, 1 injection bolus) - Régime riche en cholestérol (16 semaines) - Ponction sanguine intracardiaque terminale sous anesthésie gazeuse
Impact sur les animaux
De faibles douleurs peuvent être occasionnées après les prises de sang et l’injection intra-veineuse, ainsi qu’un inconfort ponctuel pendant la contention des animaux lors de ces manipulations. Un tube de contention sera utilisé pour l’injection intra-veineuse afin d’éviter tout mouvement indésirés de l’animal, minimiser le temps de la procédure et favoriser le bon déroulement de l’injection. Cette contention entraine une gêne provisoire de quelques minutes et peut être stressant pour l’animal. Les animaux seront manipulés de manière hebdomadaire pour effectués les pesées. L’irradiation peut entrainer les effets suivants : - Immunodépression : Destruction des cellules de la moelle osseuse entrainant un risque infectieux augmenté. Cet effet sera compensé une fois la prise de la greffe effectuée. Les souris seront soumises 4 semaines à une antibiothérapie, pouvant entrainer certains effets secondaires propres à l’antibiotique (principalement des réactions allergiques, cependant rares). - Affaiblissement général se traduisant par une perte de poids et de la fatigue. - Atteintes intestinales : L'irradiation peut endommager les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal, pouvant entrainer des troubles digestifs et une absorption réduite des nutriments (contrôlé par une pesée régulière) - Altération de la peau et des poils : Grisonnement localisé des poils possible et ralentissement de la repousse. Le transport est stressant pour les souris, mais tout sera fait pour limiter l’inconfort des souris.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire pour la détermination des lésions. Les plaques dans les vaisseaux sanguins seront prélevées pour en déterminer la composition.
Remplacement
L’athérosclérose est une maladie complexe qui ne peut pas être mimée in vitro. Elle implique des interactions entre l’inflammation, les lipides, le cholestérol, le flux sanguin, mais également entre différents tissus comme le foie ou le tissu adipeux. Il est possible in vitro d’étudier ces différents acteurs impliqués dans cette maladie séparément, mais seule l’utilisation de modèles animaux présentant une athérosclérose proche de celle de l’Homme peut permettre de tenir compte de tous ces éléments ensembles, et ainsi permettre une meilleure compréhension globale de cette maladie. Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces.
Réduction
Un modèle mathématique, tenant compte de nos variables d’intérêts ainsi que les différences nécessaires afin de pouvoir conclure à de réelles différences entre nos groupes, nous a permis de réduire le nombre d’animaux à 15 par groupe, ce chiffre correspondant au nombre minimum nécessaire pour avoir des données exploitables par la suite. Les différences attendues sont des différences dans la formation des plaques dans les vaisseaux sanguins ainsi que des paramètres qui lui sont associées. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles afin de tenir compte du dimorphisme sexuel. Enfin les expériences seront répétées une deuxième fois afin de confirmer la reproductibilité des résultats obtenus.
Raffinement
Le transport est stressant pour les souris. Tout sera fait pour limiter l’inconfort et le stress des animaux pendant cette étape (Enrichissement, gel diet, voiture climatisée). L’irradiation est quand-a-elle indolore. Les souris seront transférées dans de nouvelles cages propres à leur retour et un temps de repos de 2h minimum sera respecté pour limiter un stress trop important. Ce délai est nécessairement court puisque la greffe doit être rapidement effectuée. L’irradiation supprime le système immunitaire. 2 à 4 semaines sont nécessaire à la greffe pour fournir de nouveau un système immunitaire entièrement fonctionnel. Ceci sera pallié par 4 semaines d’antibiotiques, dilués dans l’eau de boisson et renouvelés quotidiennement, pour limiter le risque infectieux. Durant cette période, et pendant l’injection de la greffe, tout sera fait pour garder les souris dans un environnement propre et exempt de pathogènes. L’injection et les différentes prises de sang se feront après application d’un anesthésique local. Un tube de contention conçu pour restreindre le temps de confinement et le risque de mouvement indésirable de la souris pendant l’injection sera utilisé afin de réduire le temps de manipulation des souris. Le prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque se fera sous anesthésie gazeuse, la souris sera maintenue à 37°C via un plateau chauffant le temps de la ponction, de la lidocaïne sera appliquée localement sur le site d’insertion de l’aiguille. L’animal sera ensuite euthanasié pour effectuer les différents prélèvements. Le milieu d’hébergement sera enrichi (objet pour se cacher, nid). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10. La mise sous régime riche en cholestérol entrainera la formation de plaque dans les vaisseaux sanguins des souris, celles-ci sont indolores et asymptomatiques.
Choix des espèces
Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces. Des animaux adultes (8 semaines) seront utilisés, l’athérosclérose étant une maladie s’installant sur le temps et touchant la population adulte.
Etude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de nouvelles approches thérapeutiques dans un modèle murin d’amylose AL
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées portent un gène humain pathogène prélevé chez un patient, et la moitié seulement développe les dépôts amyloïdes recherchés après induction. 334 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Chacune peut recevoir jusqu'à quatre injections intraveineuses de fibrilles amyloïdes, des injections hebdomadaires pendant deux mois, cinq prélèvements sanguins, et passer tous les un à deux mois une échographie cardiaque après épilation ainsi qu'une imagerie SPECT-CT, un suivi qui peut durer vingt-quatre mois. L'effectif s'explique par ce rendement de 50 % et par l'absence d'outil validé pour détecter la maladie du vivant de l'animal, ce qui conduit à tuer les souris par séries pour vérifier après coup lesquelles étaient atteintes.
Objectifs
Nous avons développé un modèle murin transgénique d’amylose AL qui reproduit en partie la maladie humaine. Ce modèle est basé sur l'expression dans la souris d’une protéine humaine pathogène issue d'un patient. Les dépôts amyloïdes apparaissent principalement dans le coeur suite à une induction par l'injection de fibrilles amyloïdes, et dans des délais variables, allant d’une semaine à quelques mois, dans environ 50% des animaux. Nous ne maitrisons donc pas complètement l’apparition des dépôts d'amylose et nous ne disposons pas encore d’outils fiables nous permettant de les détecter de façon certaine avant la mise à mort de l'animal. Nous voulons donc mettre au point des techniques d'imagerie non-invasives pour détecter l’apparition de l’amylose dans nos souris. La première technique est par échographie cardiaque, déjà testé et qui a révélé un intérêt potentiel. La deuxième est par imagerie nucléaire in vivo (scintigraphie) en utilisant des protéines radiomarquées qui est à priori la méthode la plus sensible et qui est une méthode déjà utilisée chez l'homme et validée chez la souris. Ainsi, l’objectif de ce projet est donc d’une part d’améliorer la reproductibilité de l’induction de l’amylose AL dans notre modèle afin d’en faire un meilleur outil pour des tests pré-cliniques, et d’autre part de mettre au point des techniques de détection de l’amylose in vivo par imagerie afin de s’assurer de la présence de la maladie avant toute procédure supplémentaire (thérapeutique, exploratoire). Une fois que l’on sera en mesure de discriminer les souris positives, des tests thérapeutiques seront réalisés afin de tester leur efficacité.
Bénéfices attendus
L'amylose cardiaque est un problème clinique majeur à l'origine du décès des patients à très brève échéance. Aucun traitement éliminant les dépôts dans le myocarde n'est actuellement disponible. Bien qu’imparfait, notre modèle est le seul permettant de reproduire les phases précoces de la maladie. D'une part, il nous a déjà permis d’élucider une partie des mécanismes physiopathologiques d’apparition de l’amylose AL in vivo, et d’étudier la toxicité des fibrilles amyloïdes dans le cœur. D’autre part, nous avons aussi pu commencer à faire des tests thérapeutiques. Nos résultats ont obtenu un accueil très enthousiaste de la part de la communauté scientifique et nous avons été sollicités par de nombreuses équipes qui souhaitent travailler avec notre modèle. Ce projet vise à la fois à optimiser l’induction de l’amylose (procédure 1) et à développer des outils de détection précoce de la maladie (procédures 1 et 2) afin d'en faire un bon outil pour des tests thérapeutiques (procédure 3). Ces optimisations sont indispensables car une meilleure induction associée à un dépistage précoce de la maladie permettra de fait de diminuer la taille des cohortes nécessaires pour valider les tests thérapeutiques. Enfin, la démonstration de l'efficacité d'un traitement ciblant les dépôts amyloïdes cardiaques chez l'animal (procédure 3) pourrait permettre d'améliorer le pronostic vital des patients. Les résultats de cette étude seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Les souris de ce projet seront soumises aux procédures décrites précédemment : prises de sang par voie sous-mandibulaire, injections par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, ainsi que des techniques non-invasives d'imagerie. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter leur stress, à l'exception des injections par voie intraveineuse ou intrapéritonéale qui seront conduites sur animaux vigiles. Si plusieurs procédures sont réalisées sur un même animal, elles seront espacées dans le temps autant que possible. Chaque souris sera soumise à plusieurs interventions : le prélèvement de sang : 5 fois maximum espacé d'au moins 1 mois, les injections intra-veineuses pour induction : 4 fois maximum espacé de 2 semaines entre chaque injection ; les injections intra-péritonéale et sous-cutanées : une fois par semaine pendant 2 mois maximum ; imagerie par échocardiographie (épilation des souris avant imagerie sous anesthésie) : 1 fois tous les 1 à 2 mois ; imagerie par SPECT-CT : 1 fois tous les 1 à 2 mois.
Impact sur les animaux
Chez l’humain, les signes cliniques de la maladie sont la fatigue, l'essoufflement lors de l’effort physique et la perte de poids. Toutefois, à ce jour, nous n’avons pas constaté d’insuffisance cardiaque symptomatique et/ou de souffrance et/ou de mortalité chez nos animaux en dépit des dépôts amyloïdes, même sur des animaux suivis sur 18 mois après induction. Les dépôts amyloïdes, souvent légers, présents dans le cœur et la rate principalement, semblent asymptomatiques. Cependant, avec l'amérioration de l'induction de la maladie que nous espérons obtenir, un suivi régulier des animaux induits sera effectué (voir grille d'évaluations et points limites) et des mesures seront prises si des effets indésirables sont observés. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins peuvent aussi entraîner des hématomes.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour réaliser des analyses anatomopathologiques.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiopathologie des amyloses. D’autre part, les approches thérapeutiques que nous souhaitons tester ont pour objectif de cibler les dépôts amyloïdes et de stimuler la réponse immunitaire, elles nécessitent de cette façon la totalité de l’organisme dans sa complexité pour pouvoir en étudier l’efficacité.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en tenant compte qu'en l'état actuel de nos connaissances, seulement 50% des animaux développent une amylose après induction, et d'autre part qu'il est nécessaire, en l'absence d'outil de suivi validé sur notre modèle, d'euthanasier de façon séquencielle les animaux pour réaliser des analyses anatomopathologiques. La valeur statistique de nos résultats sera analysée avec un test statistique dédié à de faibles nombre d'animaux. Ce test a été utilisé dans nos études précédentes ce qui nous a permis de valider de façon robuste nos résultats. Le meilleur protocole d'induction sera déterminé statistiquement et permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés par la suite. Le suivi longitudinal de nos animaux, grâce au développement de l'imagerie non-invasive, permettra aussi de maîtiser l'évolution de la maladie et de n'utiliser que des animaux réellement positifs pour les tests thérapeutiques.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être et la règlementation (contrôle de la température et de l’hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie et antalgique en cas de douleur). Les souris seront surveillées quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
Certaines amyloses ont déjà été reproduite avec succès chez la souris. Les études in-vivo chez la souris permettent de mieux évaluer le potentiel thérapeutique des molécules, même si elles ne préfigurent pas des résultats qui seront obtenus chez l'humain. Les animaux seront utilisés à partir de 4 mois et jusqu'à 24 mois en fonction de la vitesse d'apparition des dépôts et des lésions associées qui sont des mécanismes relativement long.
Rôle des protéines eEF1A et dynamique des vésicules synaptiques dans la syncléinopathie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sur plusieurs pesées consécutives sont mises à mort, tout comme celles qui développent un comportement stéréotypé. Ces points limites encadrent l'utilisation de 180 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, 70 par exsanguination pour des études sur tranches de cerveau et 110 pour prélever des synaptosomes sur tissu frais. Chaque animal subit une chirurgie d'environ une heure sous anesthésie, avec un risque de douleur aiguë pendant la récupération et une perte de poids attendue. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans les stades précoces de la maladie de Parkinson et de la démence à corps de Lewy, et le porteur écrit qu'il "pourrait" ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques, tout en affirmant qu'il n'existe "aucune alternative" à l'utilisation d'animaux.
Objectifs
La maladie de Parkinson et la démence à corps de Lewy sont des conditions neurodégénératives connues sous le nom de syncléinopathies. Ces maladies se caractérisent par une accumulation anormale d'une protéine appelée alpha-synucléiine dans le cerveau. Ce projet vise à explorer les stades précoces de ces maladies afin de trouver de nouvelles cibles de traitement et d'améliorer la compréhension de leur progression. Les syncléinopathies se développent lentement, commençant par des stades subtils, presque sans symptômes. Pendant cette période, des changements significatifs se produisent à des niveaux cellulaire et moléculaire. L'alpha-synucléiine, principalement trouvée au niveau de la présynapse (une partie des cellules nerveuses), est suspectée de jouer un rôle dans la préparation des vésicules synaptiques pour la libération de neurotransmetteurs, bien que sa fonction exacte demeure floue. La perte de synapses (connexions entre les cellules nerveuses) et le dysfonctionnement synaptique sont des signes précoces de ces maladies. Ce projet se concentrera sur ces changements précoces, car ils sont étroitement liés aux problèmes de mémoire et au déclin cognitif.
Bénéfices attendus
Comprendre le rôle de l'eEF1A aux stades précoces des syncléinopathies a un potentiel important pour de nombreux patients souffrant de la maladie de Parkinson, entre autres. eEF1A (Facteur d'Élongation 1A des eucaryotes) est une protéine essentielle impliquée dans la synthèse des protéines (traduction) dans les cellules. Elle fait partie des mécanismes qui permettent aux ribosomes, les usines de fabrication de protéines des cellules, de transformer les informations génétiques en protéines.En 2018, on estimait à 9,1 millions le nombre de personnes de plus de 60 ans vivant avec une démence dans les États membres de l'UE, contre 5,9 millions en 2000. Environ 10 millions de personnes dans le monde (dont 1,2 million en Europe) souffrent de la maladie de Parkinson, et ce chiffre devrait atteindre 13 millions d'ici 2040. Ce projet pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes précoces causant la maladie et ouvrir de nouvelles voies pour des approches thérapeutiques innovantes. Les syncléinopathies représentent un fardeau important pour les systèmes sociaux. L'identification de voies clés impliquées dans les premiers stades de la pathologie conduira indirectement au développement de soins appropriés, ce qui allégera une partie de la charge pesant sur nos systèmes sociaux.
Procédures
180 animaux vont subir ce dispositif chirurgical: il faut procéder à une chirurgie sur animal anesthésié qui dure environ 1h avec utilisation d'antalgique. 70 seront prélevés après exsanguination pour les études sur tranches et 110 seront prélevés après euthanasie pour les études des synaptosomes sur tissus frais
Impact sur les animaux
1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie (pris en charge avec des analgésiques), 2/ un risque de perte de poids lié à la récupération post-chirurgie (pris en charge par une nourriture enrichie et gel hydrique)
Devenir
Euthanasie pour des etudes moleculaires et histologiques
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement.Il n’y a donc aucunealternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux et leurs interactions sont modifiées dans ces préparations.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par une approche statistique.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter leurs points limites (week-ends, vacances et jours fériés inclus) : poids (pesés quotidienne), si plusieurs pertes de poids consécutives, avec une perte >20% par rapport à la pesée de référence à raison d’une pesée par jour, les animaux seront sacrifiés. Si l’animal présente un comportement stéréotypé ou à des comportements anormaux (Agressivité, cachexie, stéréotypie, prostration) il sera dans un premier temps isolé et surveillé. En premier lieu ajout d’enrichissement adapté comme une roue d’activité et des bâtons et en deuxième lieu l’animal est sacrifié si pas d’amélioration après 48h. Les animaux seront sacrifiés, dès les premiers signes neurologiques détectés (tremblements, problème de mobilité)
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 à 12 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Analyse des effets de deux antalgiques après une blessure musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Toutes tuées pour que leur tissu musculaire passe en analyse histologique, 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une toxine leur est injectée dans la patte arrière pour provoquer une lésion du muscle, avec jusqu'à trois injections sous-cutanées et deux injections intramusculaires, puis huit jours d'isolement en cage individuelle dont quatre-vingt-seize heures en cage à roue d'activité. Le protocole prévoit jusqu'à quatre évaluations de la sensibilité mécanique, dont la mesure sert justement à estimer la douleur que la lésion provoque. L'objet du projet est de comparer deux antalgiques pour raffiner ce modèle de blessure, et le porteur conclut que "l'expérimentation animale est indispensable" pour y parvenir.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Le modèle standard de blessure musculaire est celui de l'injection d'une toxine dans la patte arrière de l'animal. Ce modèle est très courant et très standardisé. La lésion musculaire induit une douleur qui n'est pas quantifiable en analysant le comportement de l'animal. En vue de raffiner le protocole, l'étude vise à analyser l'effet de deux antalgiques sur l'activité motrice des animaux, indicative de la douleur, à la suite de l'induction de la lésion.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de définir le meilleur protocole pour raffiner le modèle expérimental. Il s'agit d'une part de valider l'impact de la blessure sur l'activité et la nociception des animaux, d'analyser l'impact des analgésiques sur cette activité (les analyses seront réalisées en aveugle) et d'autre part de s'assurer que la prise d'antalgique n'impacte pas le processus de régénération musculaire.
Procédures
Les souris seront installées dans des cages individuelles équipées de roues d'activité pendant 96h puis maintenues en cages individuelles jusqu’à la fin du protocole expérimental (soit une durée totale de 8 jours). Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutané (3 au maximum) et en intramusculaire (2 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10-20 secondes (contention totale 30-40 secondes). Les souris seront soumises à une évaluation de la sensibilité mécanique (4 maximum, durée maximale du test: 15-20 minutes).
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections intramusculaire, injections sous-cutanées, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur et de l'isolement des animaux pendant 8 jours.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires
Remplacement
L'analyse de la régénération musculaire peut être en partie étudiée in vitro. Cependant, la coordination des processus biologiques qui la régule ne peut se faire qu'in vivo. L'étude de composés favorisant la régénération musculaire ne peut se faire qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale. En outre, cette étude ayant pour but de raffiner un protocole expérimental in vivo, l'expérimentation animale est indispensable.
Réduction
L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Les deux pattes des animaux sont utilisées, réduisant par deux le nombre d'animaux utilisés, car des analyses différentielles peuvent être réalisées sur les deux pattes (e.g., histologie pour une patte, cytométrie pour l’autre).
Raffinement
L'étude vise à évaluer la meilleure prise en charge de la douleur à la suite d'une induction de lésion musculaire. L'évaluation de la douleur sera donc estimée par la mesure de l'activité physique des souris et en réponse à une évaluation de la sensibilité mécanique. Lors de l'induction de la lésion, des anesthésiques sont utilisés, et différents analgésiques seront comparés. Des points limites suffisamment prédictifs et précoces sont mis en place pour limiter la douleur.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux sont utilisés entre 6-8 semaines, à l'âge adulte car nos précédents travaux et ceux de la littérature ont été majoritairement conduits à ce stade de maturation.
Développement d’anticorps chimériques en vue d’une production industrielle en alternative aux produits dérivés du sang humain pour l’industrie du diagnostic médical et pour la recherche
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Pour fournir aux kits de diagnostic vendus dans le commerce un contrôle positif standardisé qui remplace le sérum humain, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Chaque souris reçoit des injections intrapéritonéales d'antigènes puis subit des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, avant d'être tuée pour que sa rate serve à créer une lignée cellulaire productrice d'anticorps. Le porteur prévoit 200 antigènes différents. Il affirme qu'une réponse immunitaire spécifique reste "impossible" à reconstituer en culture cellulaire, qu'une immunisation animale est donc "nécessaire", et situe l'enjeu du côté de l'approvisionnement des "demandes du marché du Diagnostic".
Objectifs
Les kits de diagnostic immunologique clinique consistent en la recherche d’un anticorps donné spécifique d’une cible donnée (bactérie, virus, moisissure, allergène alimentaire, marqueur métabolique, marqueur tumoral, marqueur d’auto-immunité…). Ces kits nécessitent la présence d’un contrôle positif représenté actuellement par un sérum humain. Il est parfois difficile d’obtenir, de façon récurrente, ou à un coût raisonnable ou prévisible, un sérum humain ayant la spécificité souhaitée et ces problèmes de reproductibilité voire d’approvisionnement constituent souvent un frein à la commercialisation.
Bénéfices attendus
Cette production permettrait une production robuste industrielle, respectueuse des contraintes règlementaires, s’appuyant sur des procédés de bioproduction en culture cellulaire, une évolution dans la production d'anticorps car la législation va dans le sens de la suppression progressive de ces produits d’origine humaine, une standardisation des contrôles positifs proposés. Ceci est une garantie de reproductibilité des tests dans un souci de participer à l’amélioration du diagnostic médical. L’offre du développement « sur mesure » de l’anticorps, d'optimisation et de validation limitent au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour chaque développement. En parallèle, ce type de technologie permet la mise au point d’anticorps pouvant servir de médicaments contre le cancer, l’immunothérapie, ou servir aussi en diagnostic lorsqu’ils sont couplés à des radioisotopes.
Procédures
Tous les animaux vont être soumis à des prélèvements sanguins efféctués sous anesthésie gazeuse afin de réduire la douleur et le stress de l'animal ainsi qu'à des injections en intra-péritoneale.
Impact sur les animaux
L'anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant et après chaque procédure/prélèvement. Les animaux auront seulement le stress de la manipulationainsi qu'une douleur résiduelle de faible intensité et de courte durée dûe à l’introduction de l'aiguille.
Devenir
Tous les animaux immunisés sont sacrifiés afin de récupérer la rate pour la fusionner et créer une lignée cellulaire productrice d'anticorps
Remplacement
Le recours à des techniques totalement en culture cellulaire ou sur organes isolés est impossible car une réponse immunitaire spécifique pour un antigène donné doit être induite dans un environnement immunologique complet, impossible de reconstituer en culture cellulaire, car faisant appel à des mécanismes génétiques , moléculaires et cellulaires mimant une réponse immunitaire humaine. Une immunisation des animaux est nécessaire pour générer des anticorps spécifiques. La technique retenue permet de sélectionner des cellules productrices selon des critères majeurs de productivité, permettant de s'affranchir totalement de toute production en ascite chez la souris. Les animaux retenus permettent la génération de cellules productrices à hauts rendements de production. Les titres obtenus avec des modèles classiques de production en culture cellulaire permettent de répondre aux besoins et d’approvisionner largement les demandes du marché du Diagnostic.
Réduction
Le fait de ne pas avoir à modifier l’anticorps pour le tester dans l’application finale, notamment pour ces caractéristiques humaines permet de réduire le nombre de cohortes d’animaux nécessaires et de ne maintenir en expérimentation que les animaux qui répondent parfaitement aux caractéristiques attendues. Un simple test du sérum permet la validation rapide en immunoessai de ces aspects, limitant les temps d’expérimentation sur l’animal et le nombre d’animaux. L’anticorps produit pour l’utilisation finale est le même que celui sélectionné initialement chez l’animal, sans qu’aucune modification de structure n’y ait été apportée. Les candidats anticorps générés par notre approche sont directement humanisés, de sorte que seuls quelques candidats sont nécessaires initialement pour finalement choisir le meilleur candidat pour l’application visée. Cette approche permet ainsi de limiter le nombre de cohortes et d’animaux nécessaires pour le développement même dans le cas de cahiers des charges et d’exigences très complexes. Nous prévoyons d'utiliser 200 antigènes. En parallèle, tous les prélèvements sanguins ou de queues seront effectués par voie sous-mandibulaire, sous anesthésie gazeuse afin d'éviter le stress et la souffrance chez l'animal.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimation à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court ainsi que pour un coût d’hébergement bas. Cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement reconnues et est facilement modifiable génétiquement. Sur des animaux adultes de 2 à 12 mois. A partir de 2 mois pour que les animaux aient un système immunitaire mature. Pas après 12 mois afin d'éviter des réactions auto-immunitaires.
Étude du rôle des lipides dans l’immunité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Inflammation généralisée, prise de poids et excès de graisse dans le foie sont attendus, et les souris qui franchissent un point limite sont mises à mort. 1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses après la mort, dans des procédures que le porteur classe au niveau de souffrance léger. Une partie reçoit pendant vingt-quatre semaines un régime riche en graisse à partir de l'âge de six semaines, puis toutes reçoivent des injections de dérivés du cholestérol deux jours de suite et deux prises de sang, à quatre puis douze jours. L'objet est de savoir si une protéine de l'immunité innée détecte ces dérivés comme un signal de danger, le porteur utilisant déjà des cocultures et des modèles informatiques mais affirmant avoir besoin de "l'organisme entier".
Objectifs
Des maladies chroniques telles que l’obésité ont énormément progressé depuis le début du siècle. L’obésité, définie comme l’indice de masse corporelle égal ou supérieur à 30 kg/m2 pour les adultes, est un facteur de risque pour d’autres types de maladies, tels que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Il est bien établi, par exemple, que l’obésité est la cause la plus commune de la résistance à l’insuline, ce qui déclenche le diabète de type 2. C’est pourquoi des stratégies biologiques fondamentales ainsi que cliniques sont essentielles pour empêcher la progression de ce type de complications. Au-delà des différences individuelles et comportementales, l’obésité et des maladies associées ont en commun un défaut dans le métabolisme des lipides, ainsi qu’une inflammation exacerbée. Cette inflammation est causée notamment par les cellules du système immunitaire qui migrent aux sites où il y a un excès de lipides, où elles libèrent des molécules solubles qui assurent la communication entre elles. Par conséquent, le système immunitaire joue un rôle essentiel dans les maladies associées aux excès de lipides. Grâce aux expériences de laboratoire dans des lignées cellulaires ainsi que dans des cellules issues de souris, nous avons découvert qu’une protéine du système immunitaire joue un rôle très important dans le déclenchement de l’inflammation causée par des lipides. L’objectif du projet est alors de comprendre si cette protéine du système immunitaire innée fonctionne comme un détecteur des lipides in vivo pour déclencher une réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Très récemment, il a été décrit que le système immunitaire joue un rôle dans l’inflammation déclenchée par des lipides. Néanmoins, notre étude est pionnière à montrer un lien direct entre une protéine précise du système immunitaire inné et une famille de lipides. C’est pourquoi, à court terme, notre premier objectif est de démontrer que cette protéine du système immunitaire inné est essentielle pour que la souris puisse détecter une famille de lipides comme un signal de danger. Cet objectif correspond à mieux comprendre le mécanisme intervenant entre le système immunitaire inné et le métabolisme des lipides. La compréhension de ce mécanisme pourra servir de base pour l’objectif à plus long terme de développer des agents thérapeutiques contre l’inflammation observée dans l’obésité morbide et /ou le diabète de type II. Enfin, étant donné qu’il y a une forte corrélation entre un excès de lipides et la progression des tumeurs à cause de leurs effets dans plusieurs voies de signalisation, et grâce à l’expertise de l’équipe à la fois dans le développement des agents pour l’immunothérapie du cancer et dans les connaissances fondamentales sur la protéine d’intérêt, notre autre objectif à long terme est d’optimiser les agents thérapeutiques contre le cancer en ciblant notre protéine d’intérêt et ainsi réguler le métabolisme des lipides.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, chaque souris vigile sera injectée avec des traitements, une fois par jour pendant deux jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Quatre jours après la première injection, les souris auront un prélèvement de sang. Huit jours plus tard, un autre prélèvement de sang sera réalisé (durée de chaque prélèvement inf à 20 sec). Dans un second lot d’animaux, des souris à l’âge de six semaines suivront un régime alimentaire normal ou un régime alimentaire riche en graisse pendant 24 semaines. Certains de ces animaux seront injectés avec des traitements une fois par jour pendant deux jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Quatre jours après la première injection, les souris auront un prélèvement de sang. Huit jours plus tard, un autre prélèvement de sang sera réalisé (durée de chaque prélèvement inf à 20 sec).
Impact sur les animaux
À la suite des injections avec les oxystérols (produits résiduels du cholestérol) : - une douleur liée à la piqûre elle-même est attendue (gêne de courte durée) - une inflammation est attendue au niveau systémique (= inflammation généralisée) - une augmentation du poids est attendue - une augmentation du pourcentage de graisse dans le foie. Des anomalies hépatiques pourraient être détectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
À la suite des expériences in vitro, nous avons constaté que seulement certains types cellulaires sont l’objet de la régulation par la protéine d’intérêt. Une alternative que nous sommes déjà en train d’évaluer est l’utilisation de cocultures, où deux types cellulaires peuvent être analysés en détail in vitro en même temps. Une autre alternative est la modélisation in silico (modèles informatiques), que nous utilisons déjà pour mieux comprendre le fonctionnement de la voie décrite ici au niveau moléculaire. Néanmoins, pour bien caractériser les propriétés des cellules immunitaires qui sécrètent des molécules solubles assurant la communication entre elles, il reste nécessaire d’utiliser un modèle préservant la complexité des interactions entre tous les types cellulaires et au niveau de l’organisme entier.
Réduction
Pour toutes nos expériences, le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis deux ou trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer fréquemment le stress des souris et des points limites ont été définis. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort
Choix des espèces
L’étude du métabolisme des lipides et leur relation avec l’obésité, ainsi que le rôle de l’immunité innée ont été bien décrits chez la souris. Ces mécanismes sont similaires chez la souris et l’homme. En plus, des données de notre laboratoire montrent que le mécanisme de réponse aux lipides est conservé chez les cellules de souris ainsi que chez les cellules humaines. Nous allons utiliser des souris jeunes à partir de 8 semaines d’âge, quand le système immunitaire de la souris est bien développé, jusqu’à 32 semaines selon la procédure.
Maintien de lignée murine hémophile A et B sous forme respirante
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Un poinçon dans l'oreille au quinzième jour de vie, deux minutes de contention comprises : 312 souris nées hémophiles A ou B en passent par là. 270 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 42 un niveau modéré, 270 sont tuées et 42 réutilisées, les reproducteurs des trios renouvelés tous les quatre mois finissant en banque de tissus. L'objet est l'entretien de l'élevage lui-même, pour alimenter en souris hémophiles A et B d'autres expériences sur la destruction des articulations. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement à la forme humaine de la maladie, ne saigne pas spontanément et ne saigne qu'après un traumatisme, et que les souris de génotype non hémophile sont mises à mort.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Ce projet nous permet donc d’obtenir des souris hémophile A et hémophile B en bonne santé et sans manifestations hémorragiques pour assurer la continuité de la lignée. Ce projet nous permet également d’acquérir des informations d’élevage spécifique aux modèles employés afin de mieux répondre aux critères des 3R.
Procédures
Durant la phase de maintien de la lignée, les souris ne subissent aucunes procédures, lors du bacrossing et génotypage, un prélèvement à l’oreille est réalisé au 15ème jour de vie, durée éstimée à 2min : contention + prélèvement.
Impact sur les animaux
Au cours du maintien, le modèle est maintenu sous la forme hémophile homozygote KO pour les modèles d’hémophilies A et B et ne fait attendre aucune nuisance de type saignement, mortalité foetale ou post-natal, seul les portées des souris hémophiles A sont réduites (4-6 animaux par portée) par rapport aux souris hémophiles B (8-10 animaux par portée). Le poiçon réalisé à l'oreille à 15jours de vie des animaux, selon les bonnes pratiques vétérinaires, se superpose avec l'opération d'identification et ne nous fait attendre aucune douleur. Seule la contention des animaux peut engendrer un léger stress chez les animaux, stress compatible avec la survie des animaux.
Devenir
Au cours de la procédure 1 : les souris sont mise en reproduction et tous les 4 mois les trios sont renouvelés. Les souris issus des anciens trios sont mis à disposition pour la réalisation de prélèvement post mortem et ainsi constituer une banque de tissus contrôle. A la fin de la procédure 2, les animaux sont mis en reproduction et les animaux de génotype non hémophiles sont mis à mort.
Remplacement
Le recours aux modèles in vitro ou in silico est impossbile dans l'étude de l'arthropathie hémophilique, en effet, le modèle d'étude nécessite un système vasculaire et locomoteur fonctionnel et en lien direct.
Réduction
Les animaux nécessaires au maintien de la lignée sous forme respirante sont limités à 3 trios reproducteurs maximum par modèle d’hémophilie soit 6 trios au total la première année. A la fin de cette première année, les données acquises nous permettrons de réviser le nombre de souris.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal par l'application des points limites stricts et spécifiques du projet et l'utilisation d'anesthésie et d'antalgie lors des gestes expérimentaux.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, les souris sont maintenues en élevage jusqu’à leur puberté avant d’être mises en reproduction.
Etude du transfert de la leptine périphérique vers le cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées au terme d'une heure d'expérience pour que leur cerveau soit prélevé, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une instillation dans le nez pendant deux minutes alors qu'elle est éveillée, une injection dans l'abdomen trente minutes plus tard, puis passe sur la table d'opération sous anesthésie. Il s'agit de vérifier qu'un peptide administré par le nez fait passer la leptine du sang vers le cerveau, pour éviter l'injection directe dans le cerveau lors des expériences suivantes et viser, à terme, l'obésité et le diabète. Le porteur affirme que les traitements "ne devraient pas entraîner de douleur, d'inflammation ou de changements de comportement" tant que les doses sont respectées, alors que cette heure se termine par une chirurgie dont les souris ne se réveillent pas.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de valider chez la souris, la voie d’administration intranasale de l'octapeptide OP et de l’antagoniste de son récepteur dans la facilitation du transport de la leptine periphérique vers le cerveau et ses effets. Il s’inscrit dans une étude plus vaste qui vise à comprendre comment le système OP/récepteur influence ce transport en portant un éclairage sur les mécanismes de contrôle du poids et de l'appétit. Ce projet vise plus spécifiquement à proposer la voie intranasale, non-invasive, comme une alternative efficace à l’administration intracérébroventriculaire de l’OP, ouvrant ainsi la perspective d’une approche translationnelle vers une nouvelle stratégie thérapeutique des troubles métaboliques et de l'obésité.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet devraient permettre des avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnelle concernant le mode d'accès de la leptine au cerveau. La littérature rapporte l’efficacité de l’OP, administré par la voie intracerebroventriculaire, à faciliter l’accès de la leptine au parenchyme et à activer sa signalisation. Cette étude pourrait démontrer que l’instillation d’OP favorise, de la même façon, le passage de cette hormone hypoglycémiante périphérique au cerveau pour y produire son effet anorexigène. Cette validation aura des conséquences positives sur les futures expériences pré-cliniques en s’affranchissant définitivement du geste invasif d’administration intracérébroventriculaire stéréotaxique voire clinique avec une voie d’auto-administration facile et acceptable par les patients.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les souris seront soumises à trois gestes techniques sur une durée totale d’une heure. Tout d'abord, une administration intranasale (2 minutes environ) sera réalisée sur des animaux vigiles suivie d'une injection intrapéritonéale (2 minutes) après trente minutes. Enfin, une chirurgie terminale sous anesthésie et couverture analgésique sera effectuée en vue du prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
À priori, nous ne prévoyons pas d'incidents majeurs chez les animaux utilisés dans ce projet qui s’étend sur 1 heure. Cependant, une surveillance accrue sera mise en place dans la seconde demie-heure pour les animaux injectés afin de détecter tout signe d'hypoglycémie. Il est important de noter que les traitements ne devraient pas entraîner de douleur, d'inflammation ou de changements de comportement préjudiciables au bien-être des animaux, tant que les doses définies sont respectées. La chirurgie thoracique terminale est précédée d’une prise en charge analgésique et anesthésique.
Devenir
Mise à mort des animaux pour des analyses post mortem.
Remplacement
Le projet scientifique vise à valider la voie d’administration intranasale d’OP pour faciliter le transport de la leptine produite par le tissue adipeux vers le cerveau afin d’envisager un transfert en clinique humaine comme un nouveau traitement contre l'obésité et le diabète. Dans la mesure où aucun modèle de substitution permettant de mener à bien cet objectif physiologique n’est actuellement disponible et devant la complexité des mécanismes mis en jeu et leur interconnexion, l’étude sera réalisée in vivo chez la souris, puis ex vivo. De plus, de nombreux modèles de souris ont déjà été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.
Réduction
En accord avec nos expériences antérieures et pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’étude est conduite sur des lots de 12 souris (6 males et 6 femelles) par condition de traitement qui suivront l’ensemble des gestes expérimentaux. Ces effectifs nous assurent d’obtenir des données statistiquement comparables, y compris en fonction du sexe.
Raffinement
Les souris sont maintenues en cage standard conformément à la réglementation avec un enrichissement du milieu de vie constitué de nids en copeau de peuplier au moins une semaine avant le début du projet. Les gestes expérimentaux sont menés dans une pièce adjacente de la zone d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont surveillés avant et pendant toute la durée du protocole (1 heure d’expérimentation par animal) et leur score confronté à la grille de score détaillée incluant des points limites adaptés. Les gestes techniques sont réalisés en présence d’une médication appropriée.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré (in vivo sur animal entier) peut nous permettre de comprendre, de façon globale, la contribution du système OP/récepteur dans l’homéostasie énergétique et comment il peut être instrumentalisé pour rééquilibrer les dysfonctions de la leptine liées aux pathologies associées. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie (taille et coûts d’entretien réduits, bonne performances reproductives). De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques de l’altération du comportement alimentaire car elle est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.
Identification des mécanismes moléculaires du développement des cellules épendymaires multiciliées chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Comprendre comment se forment les cellules ciliées qui tapissent les cavités du cerveau, et l'origine de certaines maladies neurologiques : 2 037 souris vont y être utilisées. 1 987 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 un niveau léger, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Des femelles gestantes sont gavées ou reçoivent un traceur sous la peau, leurs petits sont biopsiés à la queue le jour de la naissance, puis certains reçoivent une injection dans le cerveau suivie d'impulsions électriques, deux minutes par animal. Le porteur indique que le gavage peut léser l'œsophage et provoquer des mises bas prématurées ou difficiles, et que l'électroporation peut entraîner des microlésions du cerveau ou le rejet du souriceau par sa mère, tout en estimant à cinq ou dix animaux la taille optimale par stade d'analyse, pour un total de 2 037 souris.
Objectifs
Les objectifs de notre projet de recherche sont d'une part de comprendre comment les cellules souches se développent le long des parois des ventricules du cerveau pour former différents types de cellules gliales. D'autre part, nous cherchons à comprendre l'origine de pathologies humaines telles que les ciliopathies et les maladies psychiatriques. Nous souhaitons donc utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mimer ces pathologies humaines et ainsi identifier l'origine développementale de ces pathologies. A plus long terme, ce projet permettra de mieux identifier l'origine des dysfonctionnements dans certaines pathologies neurologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier les cascades moléculaires complètes du développement des cellule multiciliées du cerveau, les épendymaires qui tapissent les murs ventriculaires et les cellules du plexus choroïde. Nous pourrons ainsi mieux comprendre les étapes qui dysfonctionnent dans des conditions pathologiques telles que les tumeurs cérébrales et les maladies neurologiques (220 000 nouveaux cas chaque année en France). A plus long terme, nous pouvons envisager de nouveaux traitements thérapeutiques pour améliorer les conditions de vie des patients.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques: 1- prélèvement caudal unique sur des souris vigiles le jour de la naissance de quelques secondes pour génotypage, 2- injection sous cutanée unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles d'un traceur afin de réaliser un marquage des cellules d’intérêt chez les embryons puis euthanasie réglementaire des animaux sous analgésie et anesthésie en quelques minutes à différents stades, 3- gavage unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles avec une solution permettant d’induire le modèle expérimental puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire en quelque secondes à différents stades, 4- injection unique au niveau cérébral sous analgésie et anesthésie, application d’impulsions électriques permettant l’introduction du traceur génétique chez les nouveaux-nés (environ 2 minutes par animal) puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire à différents stades.
Impact sur les animaux
Les injections effectuées afin de procéder à un marquage cellulaire, une analgésie ou une anesthésie seront réalisées par voie sous-cutanée et pourront induire un stress pendant la contention ainsi qu’une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille. La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation. L’électroporation à la naissance (injection au niveau du cerveau suivi de l’application de quelques impulsions électriques) peut entraîner des microlésions du cerveau et pourrait dans de rare cas entraîner un rejet par la mère ou un défaut de prise de poids. Concernant les anesthésies, les effets secondaires peuvent être les suivants : détresse respiratoire, réveil de l’animal et stress thermique. Dans le cadre de l'identification génétique des animaux, une biopsie caudale sera réalisée à la naissance. Les effets indésirables peuvent être le stress engendré par la contention/manipulation, la douleur légère et locale ainsi que la possibilité de saignement à la suite de la biopsie.
Devenir
L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Aucune technique ou outil biologique n'est actuellement disponible pour mimer correctement le développement des cellules multiciliées de cerveau de mammifères que nous étudions. En effet, nos résultats expérimentaux de cultures primaires démontrent que seuls certains aspects du développement épendymaire peuvent être étudiés in vitro. Certains mécanismes moléculaires semblent mal récapitulés dus, en partie, à la non-conservation de la structure tridimensionnelle de l'épithélium ventriculaire. De façon similaire, les résultats préliminaires obtenus sur des cultures d'organoïdes démontrent l'absence de cellules épendymaires dans ces modèles.
Réduction
Un total de 2037 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons des mâles ou des femelles indifféremment pour réduire le nombre d'animaux et la taille de chaque stade d'analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Nous estimons à 5 ou 10 animaux la taille optimale par stade d'analyse en fonction de la procédure.
Raffinement
Trois catégories de mesures de raffinement seront mises en œuvre et concerneront les aspects liés aux procédures, l'établissement de points limites ainsi que l'hébergement et l'enrichissement de l'environnement des souris. Nous réduirons au maximum l'inconfort des souris car les procédures que nous mettrons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris ayant subi une procédure pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez les souris consécutivement, ou non, à la réalisation d'un acte et non conduiront à l'arrêt de la procédure en cours. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la règlementation en vigueur à savoir : l’hébergement en surpression, les portoirs avec des cages ventilées individuellement, le nombre d’animaux par cage), eau et nourriture à volonté, change litière et biberon hebdomadaire, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu (papier kraft, coton et maison en carton). L'ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.
Choix des espèces
Le projet a pour objectif d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement des cellules multiciliées des mammifères. Nous utiliserons le modèle murin car la souris présente un développement proche de celui de l’homme. De plus la durée de gestation courte ainsi que la taille des portées permettent de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences et à partir de peu de parents. La disponibilité d’un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées, qui permettent d'induire ou inhiber l'expression de certains gènes d'intérêt, fait du modèle murin un modèle de choix pour répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons des femelles adultes matures sexuellement qui seront rendues gestantes par accouplement contrôlé afin de connaître précisément le stade de gestation afin d’induire les modèles expérimentaux. Par la suite les animaux seront étudiés au cours du développement cérébral (entre le jour de la naissance et 20 jours postnatal) parce que nous avons établi que les cellules d’intérêt sont spécifiées avant le stade embryonnaire et entièrement différenciées et matures au 15ème jour postnatal et constitue donc notre fourchette d’analyses dans ce projet.
Rôles de protéines associées à la neuroinflammation dans les traumatismes de la moelle épinière [EU 1/2]
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Surnuméraires issus de croisements réalisés pour un autre projet, 192 souris sont transférées d'un site à l'autre sur 2,7 kilomètres avant d'être opérées. 96 d'entre elles subissent une section de la moitié de la moelle épinière, trente minutes sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 96 autres un niveau modéré, toutes tuées pour que leurs tissus soient prélevés. La patte arrière du côté lésé reste paralysée, le contrôle du sphincter urinaire est altéré, des escarres peuvent se former, et les souris passent par des tests de marche, de coordination, de force d'agrippement, de qualité du nid sur vingt-quatre heures et de temps de toilettage, échelonnés de sept jours avant la lésion à six semaines après. Le porteur indique que les cultures de cellules nerveuses ne reproduisent pas la complexité de l'organisme et conclut que le recours aux animaux "demeure crucial" pour envisager des applications cliniques.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. . Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines. Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.
Evaluation pré-clinique d’anticorps à domaine unique synthétiques pour la détection et le traitement de tumeurs cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
3 593 souris vont être utilisées, dont 2 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir des injections jusqu'à deux fois par jour et être anesthésiée toutes les deux semaines pour une prise de sang. Des cellules tumorales humaines leur sont greffées sous la peau, dans une veine ou dans un muscle, ce qui produit des tumeurs et des métastases du foie, du péritoine ou des poumons, et, pour l'injection dans le muscle, une tumeur qui peut empêcher la souris de se déplacer. Les souches utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet la greffe de cellules humaines, et la taille des tumeurs comme la perte de poids liée à la réaction du greffon contre l'hôte servent de seuils de mise à mort. Les bénéfices annoncés, une détection plus précoce des micro-métastases et un meilleur pronostic, restent au conditionnel, quand le porteur rappelle que la réglementation impose de tester tout médicament chez deux espèces animales avant l'être humain.
Objectifs
Le cancer reste une des principales causes de mortalité dans le monde, malgré des avancées médicales notables. Les traitements conventionnels rencontrent des limitations, notamment face à des tumeurs résistantes, nécessitant l'émergence de nouvelles approches thérapeutiques. L'immunothérapie se présente comme une révolution, mobilisant notre système immunitaire contre les cancers. Depuis vingt ans, les immunothérapies ont connu un développement rapide avec de nouvelles stratégies utilisant des anticorps (Ab). Ces Ab peuvent reconnaître une cible précise sur une cellule cancéreuse et induire une réponse spécifique. Ils peuvent aussi être exprimés à la surface des cellules immunitaires, redirigeant ces cellules spécifiquement vers leur cible tumorale (thérapie cellulaire). Une autre stratégie dans la lutte contre le cancer consiste à perfectionner les méthodes diagnostiques. En identifiant les cellules cancéreuses tôt, nous pouvons réagir rapidement. À un stade avancé, les métastases résultent de la migration de cellules cancéreuses vers d'autres parties du corps, générant de nouvelles tumeurs. Ainsi, les micro-métastases, bien que non détectables traditionnellement, indiquent le début de la propagation. La détection précoce des cellules cancéreuses est cruciale. Les Ab peuvent être liés à des molécules radioactives, et grâce à leur spécificité ils peuvent améliorer la détection radiologique des cancers. Cependant, les Ab classiques ont des limites en termes de taille. De nouveaux formats d'anticorps, ne possédant que la partie active des Ab, appelés anticorps à domaine unique (sdAb), ont été développés. Ils ont l'avantage d'être dix fois plus petits, ce qui leur permet de mieux pénétrer les tumeurs et d’améliorer à la fois les traitements et les diagnostics. Ces sdAb peuvent remplacer les anticorps classiques et augmenter les chances de survie des patients. Des lignées cellulaires dérivées des tumeurs, représentant la diversité de la maladie chez l'homme, seront utilisées pour tester le rôle diagnostique ou thérapeutique de nos sdAb. L'objectif de ce projet est de développer et tester des sdAb synthétiques afin d'offrir une meilleure solution diagnostique et thérapeutique en clinique.
Bénéfices attendus
Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde et, malgré les traitements classiques et le développement des nouvelles thérapies ciblées, cette maladie dans ses formes métastatiques reste majoritairement incurable. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est nécessaire et représente un réel défi pour la médecine. En développant et testant de nouveaux anticorps thérapeutiques, plus efficaces et/ou plus spécifiques que les anticorps déjà utilisés en clinique, nous pouvons améliorer le pronostic de certains cancers. Il est également important d’augmenter la connaissance et d'améliorer les différentes immunothérapies déjà utilisées en clinique. Une autre manière d'améliorer le pronostic des patients atteints de cancer est d'améliorer la spécificité et la détection précoce des cellules cancéreuses, par exemple lors de l’apparition des métastases. L'utilisation des anticorps comme outil de diagnostic, en les liant par exemple à des marqueurs radioactifs ou fluorescents, permettra la détection de micro-métastases et surmontera les limites des méthodes de diagnostics classiques. Cela signifie qu'il sera possible d'intervenir à des stades plus précoces du développement du cancer, ce qui contribuera à améliorer le pronostic des personnes atteintes de la maladie.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux seront réparties en deux lots. Pour le premier : Des cellules tumorales seront injectées aux souris vigiles ou anesthésiées (1 fois par expérience). Lorsque les animaux sont anesthésiés, l'anesthésie durera entre 30 et 40 minutes. Si l'injection est faite sans anesthésie, le geste durera également 10 à 30 secondes. Le deuxième lot d'animaux suivra une procédure similaire avec des injections et des traitements supplémentaires pour les traitements. Les injections supplémentaires seront effectuées sans anesthésie et prendront environ 10 à 30 secondes. Les injections peuvent être faites une seule fois ou plusieurs fois, par exemple 1 fois par semaine ou 1 ou 2 fois par jour pour certains diagnostiques ou traitements. Un prélèvement sanguin est effectué une fois toutes les 2 semaines sur les animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie inferieure à 5 min). Par la suite, les animaux seront suivis régulièrement. Le suivi des tumeurs sera fait 1 ou 2 fois par semaine. Il sera fait par le pied à coulisse ou par imagerie sous anesthésie générale (durée 20minutes maximum). 10 minutes avant l’imagerie un produit spécifique pour visualiser les tumeurs est injecté aux souris (injection 10 sec). Le suivi par imagerie peut se faire une fois toutes les 2 semaines pour les tumeurs qui poussent lentement.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des injections de cellules selon différentes voies seront celles liées à la piqûre elle-même (gêne de courte durée). A plus long terme, les souris greffées avec des cellules tumorales sous la peau vont développer des tumeurs primaires in situ mais peuvent selon les pathologies développer des métastases dans le foie, le péritoine ou bien dans les poumons. Les cellules injectées par voie intraveineuse vont notamment développer des métastases au niveau des poumons. Les cellules injectées dans le muscle conduiront au développement de tumeur in situ (= dans le muscle) pouvant empêcher la souris de se déplacer.
Devenir
les animaux sont mises à mort, les organes et les tissus tumoraux sont prélevés pour des analyses post-mortem ultérieures
Remplacement
L’efficacité antitumorale de tous les formats d’anticorps, sera préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seuls les anticorps ayant montré une efficacité in vitro seront ensuite testés in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la durée de l’efficacité du traitement, les doses et la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets des anticorps et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance.
Réduction
Le nombre de souris utilisées est basé sur notre expérience avec des sdAb et également sur des études bibliographiques. Ce nombre tient compte du taux de la prise tumorale, de l’hétérogénéité d’efficacité des cellules thérapeutiques et de l’hétérogénéité des réponses animales. Le nombre d'animaux par expérience est déterminé à l'aide d'outils statistiques. Pour les mises au point des expériences le nombre de souris est réduit au minimum en fonction des résultats obtenus in vitro. Afin de réduire le nombre de souris pour un modèle donné: - Les souris utilisées pour étudier la croissance des tumeurs peuvent aussi servir pour la mise au point des sdAb diagnostiques. - Plusieurs thérapies pourront être testées en parallèle et par conséquent les mêmes souris "contrôles" seront alors utilisées. - Si au cours des expériences nous constatons que le sexe n'affecte pas la progression de la tumeur ni le traitement, nous pourrons réduire le nombre de souris initialement prévu.
Raffinement
Les injections peu invasives et seront faites sans anesthésie alors que les injections intramusculaires seront faites sous anesthésie avec traitement antalgique associé. Le suivi tumoral d'une tumeur palpable sera fait par le pied à coulisse sans nécessité d’anesthésie. Le suivi tumoral de tous types d'injections sera effectué par imagerie et sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Evaluation de l’état général de la souris : une grille de score déterminera les points limites. Un suivi clinique approfondi sera réalisé au minimum une fois par semaine et les animaux seront mis à mort dès atteinte des points-limite selon la grille de score. Les points de limite comprennent la taille des tumeurs, lorsqu'elle est mesurable au pied à coulisse, ainsi que la perte de poids liée à la maladie du greffon contre l'hôte. Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et c’est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. - La réglementation demande que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, entre 5 à 8 semaines, les animaux à cet âge supportent mieux le transport depuis l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que les traitements. Par ailleurs, les résultats ne seront pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux.