Souris

Quatre mesures de débit de filtration glomérulaire de quarante-cinq minutes chacune, six prélèvements de sang à la queue, six prélèvements d'urine, une irradiation du corps entier et une chirurgie de clampage de l'aorte rénale : 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est transportée entre deux établissements pendant le protocole. L'objet du projet est de comprendre le rôle d'une protéine, CD99, dans l'insuffisance rénale aiguë et chronique, repérée d'abord dans les urines de patients opérés du cœur. Les souris sont tuées à la fin de la procédure pour le prélèvement de leurs reins, ou avant si elles perdent plus de 25 % de leur poids ou restent prostrées au-delà de vingt-quatre heures.

Objectifs

Récemment, nous avons identifié un peptide CD99 prédictif du développement d'une insuffisance rénale aigue (IRA) dans les urines obtenues 4h après un pontage cardiaque provenant d’une cohorte humaine. CD99 est une protéine principalement identifiée sur la membrane des cellules endothéliales et immunitaires. Dans la cohorte de patients utilisée pour identifier le ratio CD99 (peptide/protéine entière) comme nouveau biomarqueur de l'insuffisance rénale aiguë, l'expression du CD99 sur les cellules immunitaires circulantes (monocytes, neutrophiles, cellules B, cellules T) était similaire chez les patients ayant développé ou non une insuffisance rénale aiguë. Il est donc nécessaire de caractériser la façon dont les CD99 endothéliales et immunitaires modulent le risque de développer une insuffisance rénale aiguë avant de mettre en œuvre une approche thérapeutique ciblant les CD99. Ce projet est un projet multisite qui se déroule sur deux EU (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Mieux caractériser le rôle respectif de CD99 endothélial et immunitaire dans le développement d’une insuffisance rénale aiguë et chronique afin de développer ensuite une approche thérapeutique ciblant CD99.

Procédures

1/prélèvements sanguins à la queue (sous anesthésie) avant chirurgie et avant mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal (anesthésie et prélèvement compris) 2/prélèvement d'urine lors de la contention de l'animal avant chirurgie et avant la mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal. 3/Mesure du Débit de Filtration Glomérulaire avant chirurgie et avant sacrifice (placement du capteur et injection en retro-orbitaire sous anesthésie) (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 4 mesures seront réalisées (J0, J7 ou J14 J21 et M1). Chaque mesure dure environ 45min par animal (placement du capteur, injection en retro-orbitaire sous anesthésie et mesure) 4/irradiation (EU2). Une seule irradiation par animal est réalisée, la totalité de la procédure ne dépasse pas 2h (mise en cage, irradiation et retour en cage animalerie) 5/Induction d’une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) (EU1). Une seule chirurgie est effectuée par animal, la procédure dure entre 30 et 45min (anesthésie, chirurgie, clampage d'aorte rénale (le temps varie en fonction du sexe et de la souche) et souture).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront : 1/Une irradiation

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ou si l'un des points limites était atteint. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever de l’urine, du sang et différents organes (dont le rein) en vue de leur analyse.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë est impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 960 Souris.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 25% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’agression rénale ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront mis à mort. Concernant le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, il sera effectué sur des animaux aptes à supporter le voyage qui sera effectué dans des conditions telles qu'ils ne puissent être blessés ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué par une société agrée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU2 et l'EU1.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes

930 souris vont être utilisées, chacune recevant cinq injections en dix jours puis deux par semaine pendant dix semaines, avec un prélèvement de sang au coin de l'œil sous anesthésie chaque semaine du traitement. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, pour l'analyse de leur système immunitaire et de leurs organes. La plupart développent spontanément un lupus, avec des atteintes rénales possibles dans les formes avancées, un autre groupe recevant une injection d'huile pour déclencher la maladie. Le porteur indique que le nombre d'animaux nécessaire à la puissance statistique est de dix par groupe, sans expliquer comment il parvient à 930.

Objectifs

Pour qu'un cancer puisse se dévelloper les cellules tumorales doivent produire des composés inhibant le système immunitaire. Partant de ce constat notre équipe a réussi à isoler, à partir de secretion de cellule tumorale, des composés ayant des capacités inhibitrice de l'immunité et permettre de trouver de nouveau outils thérapeutiques dans les maladies caractérisé par un excés d'activation de l'immunité contre son hote, les maladies auto-immune. Un composé a démontré une efficacité particulierement efficace dans des systèmes simplifié de l'immunité notamment sur les lymphocytes B. Le but de se projet et de montrer l'efficacité de cette molécule dans des modèles plus complet récapitulant toute la complexité du système immun. Afin de mieux comprendre les mécanismes d'actions de ce composé les souris seront vacciné contre différentes substance, le but étant d'induire différent type de réponse vaccinal et voir quelles types de cellules sont impactés par ce composé et comment est modulé la réponse vaccinale. Du fait de son potentiel sur les lymphocytes B nous allons nous concentré sur le lupus qui est une maladie auto-immune ou l'implication des lymphocytes B n'est plus a démontré. Le lupus étant une maladie complexe dépendant d'énormément de facteur nous allons utilisé différent modèle murins de lupus permettant de modéliser different aspect de la maladie et essayer de les traiter avec notre composé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront d’une part de comprendre les mécanismes par lesquelles les cellules tumorales peuvent inhiber le système immunitaire et proliférer et potentiellement développer de nouvelle thérapeutique afin de lever cette inhibition. D'autre part la description des ces mécanismes permettront de dévellopé de nouveaux outils thérapeutiques pour pathologies avec un excès d'activation du système immunitaire tel que les pathologies auto-immunes. En effet les thérapies actuellement disponibles, non spécifiques ou spécifiques du lymphocytes B vont engendrer de sérieux effets secondaires mais ont aussi un coût socio-économique non négligeable. Il y a donc une nécessité à développer de nouvelles voies thérapeutique à cibler.

Procédures

L'injection dans le ventre, dite intra-péritonéal est un moyen efficace pour diffuser un produit dans le système de la souris en n'entrainant quasiment pas d'incomfort et peut donc être effectué sur souris vigile. C'est cette voie qui est prévilégié pour toutes les injections dans nos différentes expériences. Pour la partie vaccination, les souris seront injecté 1 fois avec le vaccin et traité avec 5 injections pendant 10 jours. La majorité des souris vont dévellopé spontanément un lupus, cependant l'un des modèles va nécessiter une fois l'injection d'une huile pour induire un lupus. Les souris seront traité par notre composé par 5 injections pendant 10 jours puis 2 fois par semaines pendant 10 semaines. De plus afin de suivre l'évolution de la maladie le sang des souris sera prélévé 1 fois par semaine pendant toutes la durée du traitement. Ce prélévement se faisant au niveau du sinus au coin de l'oeil et pouvant être désagréable pour les souris, ils seront effectué sur souris sous anethésie générale par des professionnels formés. De plus afin de limité toutes séquelles sur l'animal une altéranance d'oeil gauche-droite sera effectué.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent entraîner une legère douleur de courte durée. Les modèles murins de lupus vont modéliser différents aspects de la maladie avec des degrés de sévérité variables en fonction des modèles. Dans les cas les plus avancé de la pathologie les souris peuvent dévelloper des atteintes rénales. Les souris seront prélevées une fois par mois pour l'urine sur la souris vigile et pour le sang par prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale. Ce geste peut entraîner une legère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasié afin de permettre d'une part une analyse détaillé du système immunitaire et évaluer l'inflammation ainsi que l'activité de la maladie et les atteintes d'organes.

Remplacement

Des études préliminaires de culture cellulaire in vitro ont été mises en place afin de minimiser au maximum l’utilisation de souris. Cependant seuls des modèles in vivo permettront d’une part d’étudier l’effet de ces nouvelles thérapeutique sur un organisme complet. D’autre part seuls des modèles in vivo permette de récapituler la dérégulation d’un système immunitaire complet ainsi que le phénotype délétère des pathologies auto-immune et donc de pouvoir d'évaluer l’intérêts thérapeutiques de ces nouveaux outils.

Réduction

Les test statistiques approprié seront utilisé pour comparer les différents groupes. et le nombre d’animaux nécessaires pour avoir la puissance statistique necessaire est de 10. La cinétique des réponses immunitaires ainsi que les modèles murins de lupus présentent de la variabilité expérimentale, elles seront répétées pour renforcer l'approche statistique. Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux à utiliser afin de pouvoir conclure avec une confiance suffisante. Afin d’éviter tout biais expérimentaux les cohortes seront randomisées et afin d’éviter les effet cage les animaux d’une même cage recevront des traitements différents en fonction des groupes expérimentaux. De plus afin de réduire le plus possible le nombre d’animaux tous les organes d’intérêt seront recueillis à chaque fois et utilisé ou congelé.

Raffinement

Le principe de raffinement décrit au second de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime sera appliqué. Le bien-être des souris sera prise en compte tout au long de la procédure expérimentale. Les souris seront hébergées dans des cages de 2L à 5 animaux par cage. Chaque cage recevra un enrichissement du milieu de type nids de woodwoll. Pour réduire la douleur et la souffrance, les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel habilité et chevronné. De plus tout le long des procédure l’état générale des animaux sera évalué selon une grille de score objective permettant d’évaluer le stress et la détresse des animaux.

Choix des espèces

Les modèles murins de lupus sont les seuls disponibles permettant de récapituler certains aspects de la physiopathologie humaine. De plus, les modèles murins offrent le meilleur équilibre entre la capacité de produire des résultats satisfaisants et la susceptibilité à induire de la douleur, du stress ou des dommages durables. Les stades de développement ont été choisis afin de modéliser différents moments dans l'évolution de la maladie. Ainsi, dans certains cas, des souris jeunes seront utilisées afin de modéliser l'apparition de la pathologie, tandis que pour modéliser des états plus avancés de la pathologie, nous utiliserons des souris âgées.

Cinq séances hebdomadaires de neurostimulation par ultrasons, doublées d'une électromyographie, puis dix minutes d'échographie cérébrale avec agent de contraste et d'imagerie photoacoustique : 320 souris et 320 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués après la cinquième semaine. Le projet compare des sondes ultrasonores pour trouver la configuration la plus efficace, l'espoir déclaré étant de stimuler le cerveau "sans générer de lésions". Le groupe témoin reçoit de la cocaïne, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer des troubles locomoteurs, une modification de la prise alimentaire et une hausse de l'anxiété. La pose d'un cathéter et la suture de la peau du crâne apparaissent seulement dans la liste des douleurs attendues, sans figurer dans la description des procédures.

Objectifs

Dans le cadre de cette étude nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore non-invasive, précise et efficace chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Nous espérons trouver une configuration de sondes et paramètres ultrasonores donnant le plus d'efficacité de stimulation cérébrale, sans générer de lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions comme la neurostimulation ultrasonore, pour une durée de 5 minutes, répétee 5 fois à raison de 1 fois par semaine. L'electromyographie sera réalisée en parallèle de cette neurostimulation avec la même durée et fréquence. Une échographie cérébrale avec agents de contraste ainsi qu'une imagerie photoacoustique seront réalisées successivement après la neurostimulation pendant 10 minutes et en suivant la même fréquence de 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Enfin, l'injection de puces d'identification sera effectuée une fois pour une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances ou effets indésirables, il est possible que l'animal ait des douleurs au réveil suite à la pose du cathéter. Une gêne peut aussi être ressentie après l'apposition de la sonde ultrasonore de stimulation. Il est aussi possible que la suture de la peau sur le crâne soit douloureuse. L'injection de cocaïne au groupe contrôle afin de vérifier la capacité de l'imagerie ultrasonore d'observer les modifications vasculaires peut induire des problèmes locomoteurs, une modification de la prise de nourriture et une augmentation de l'anxiété des animaux.

Devenir

Nous conservons les animaux en vie jusqu'à la 5ème semaine de traitement par neurostimulation ultrasonore. Après les dernières imageries échographique et photoacoustiques, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore précise et efficace chez la souris et le rat. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.

Réduction

Sur la base de nos études antérieures et en raison des variables mesurées, notre étude nécessite 320 souris et 320 rats. Les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 8 animaux. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si les effets de la neurostimulation induisent une modification significative des variables mesurées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 8 pour les souris et par 2 pour les rats en présence d'un ou plusieurs objets d'enrichissement. L'ensemble des stimulations et imagerie sur animaux endormis seront faites sous anesthésie gazeuse pour réduire les douleurs des animaux. Des points limites adaptés à chaque intervention seront suivis au cours du temps.

Choix des espèces

Le choix de ces deux espèces se justifie pour l'analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le rongeur et l'humain. Certains aspects de la stimulation ultrasonore chez la souris et le rat ont également été validés dans la littérature. Des animaux de sexe mâle seront utilisées afin d’éviter toute altération des résultats par le cycle menstruel femelle. Les souris BALB/cByJRj et les rats Sprague-Dawley seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets d’une stimulation ultrasonore chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

Immunodéprimées pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de carcinome à cellules de Merkel leur sont injectées sous la peau, suivies d'une injection intrapéritonéale quotidienne pendant quatre semaines, molécule testée ou solvant. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé lors des études précédentes. Toutes sont tuées à l'issue, la pesée finale des tumeurs imposant leur mise à mort.

Objectifs

Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané agressif avec une survie estimée à 50 ans de seulement 40%. Il survient principalement chez le sujet agé de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffes d'organe, infection par le VIH). Dans 80% des cas les CCM sont dit viro-positifs et sont dus à l'intégration du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCpV), les 20 % restants sont dis viro-négatifs et sont principalement dus aux expositions UV. Actuellement, au stade métastatique inopérable, une seule option thérapeutique efficace est disponible, l'Avelumab, mais des phénomènes de résistances primaires et acquises à ces traitements entrainent une réponse objective durable chez seulement 25% des patients, soulignant la necessité d'identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques dans ce domaine. Des méthylations abérrantes de l'ADN ont été démontré comme étant des modifications importantes et fréquemment retrouvées dans les cellules cancéreuses. Il a été démontré dans plusieurs types de cancers que l'utilisation de molécules hypométhylant l'ADN permettait de reprogrammer les cellules tumorales vers un état "normal", re sensibilisant ces cellules à la chimiothérapie et à l'immunothérapie. Par exemple, les premières générations d'agent hypométhylant l'ADN, tel que l'azacitabine et la decitabine sont utilisés en routine pour le traitement des leucémies myeloïdes. Une nouvelle molécule hypométhylante, la guadecitabine, est actuellement en essai clinique. Nos données préliminaires démontrent que cette molécule est capable in vitro de diminuer la prolifération cellulaire et la viabilité des CCM. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer in vivo l'efficacité anti tumorale de cette molécule sur les CCM.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d'évaluer l'efficacité anti tumorale d'un agent hypométhylant, la guadecitabine, dans l'indication Carcinome à cellules de Merkel. Actuellement, au stade métastatique inopérable, seul l'immunothérapie, Avelumab est efficace, mais l’utilisation de ce traitement, du fait des mécanismes de résistance innés ou acquis, ne permet d’obtenir une réponse objective durable que chez 25% des patients. La capacité à ré induire une expression des immunes check point, tel que PDL-1, cible de l'immunothérapie par l'Avelumab, sera également évaluée. Ainsi la guadecitabine pourra ensuite être évaluée en combinaison avec des inhibiteurs d'immune checkpoint (Avelumab) dans le cas du CCM.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de CCM (carcinome à cellules de Merkel) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés 1 fois par jour en intrapéritonéal avec la molécule ou le véhicule pendant 4 semaines. Ces deux types de gestes ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutané et une contention quotidienne pour l'injection en intrapéritonéale. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intrapéritonéale. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes. Une sédation avec injection en intrapéritonéal d'acépromazine sera effectuée avant la mise à mort par élongation cervicale afin de limiter toutes douleurs chez l'animal.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité de la guadécitabine a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de CCM. L'obtention de l'efficacité de la molécule sur ces différentes lignées et les données déjà publiées sur des molécules similaires de première génération dans l'indication des CCM, limitent le nombrer de souris à utiliser, en nous permettant de tester une dose unique de guadécitabine. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de l'efficacité de cette nouvelle molécule sur la réponse anti-tumorale et sur sa capacité à re sensibiliser les cellules à de l'immunothérapie. Ces éléments, essentiels pour la validation de l'utilisation de cette molécule dans l'indication CCM nécessitent le passage par un modèle in vivo.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les injections en intrapéritonéales sont rapides et peu douloureuse, le geste technique est déjà maitrisé par les personnes qui manipuleront les souris. De plus, bien que les injections soient quotidiennes, elles se feront en alternance entre le côté gauche et le côté droit pour éviter d'engendrer des douleurs répétées au même point d'injection. Une friandise sera proposée aux souris après chaque injection en intrapéritonéal. Tout au long de l'étude, le bien être des animaux sera évalué à l'aide d'une grille de score, si les animaux atteignent les points limites définis antérieurement, ils seront sortis de l'étude afin de limiter toutes souffrances. De plus, pour éviter tout stress inutile, lors de la mise à mort un sédatif, sera injectée en intrapéritonéal avant l'euthanasie.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.

Colite provoquée par un produit dans l'eau de boisson, par sensibilisation de la peau suivie d'une administration rectale, ou par injections répétées pendant douze semaines : 6 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes entiers. Certaines lignées ont un système immunitaire déficient, ce qui les rend plus sensibles aux infections. La douleur liée à l'inflammation intestinale est estimée "légère à modérée au maximum", dans un texte qui décrit par ailleurs un risque de péritonite lié à la répétition des injections abdominales. Le porteur indique recourir en première intention aux organoïdes et aux systèmes d'intestin artificiel, puis conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".

Objectifs

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélé à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de cette enzyme dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle des certains métabolites dans les processus inflammatoires. Notre approche est basée sur la modulation de certaines voies métaboliques, perturbées dans les maladies inflammatoires, afin de restaurer la production normale de métabolites anti-inflammatoires tout en diminuant la production de métabolites pro-inflammatoires. Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients.

Procédures

Certains modèles subiront un traitement préalable pour induire le modèle transgénique à raison d’une injection intrapéritonéale quotidienne sur animal vigile (moins de 10 secondes) pendant 5 jours consécutifs. Certains modèles animaux utilisés dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Par la suite, nous mettrons en œuvre les différents modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les souris pourront être suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) Une colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) par jour pendant 7 jours à 12 jours. ii) Une colite induite par sensibilisation de la peau sous anesthésie (5 minutes) suivi d’une administration rectale sous anesthésie (5 minutes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) ou un gavage intragastrique (moins de 10 secondes) pendant 3 jours. iii) Une colite induite une injection intrapéritonéale de cellules (moins de 10 secondes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) au maximum une fois par jour pendant un maximum de 12 semaines. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formé avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

Le projet comprend différentes techniques d’administrations (gavages, injections intra-péritonéales) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entrainer un risque de péritonite (très rare). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également des prélèvements sanguins de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). De plus, certains modèles utilisés dans le projet disposent d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera donc un maximum de 6840 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte.

Raffinement

permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées murines simples, doubles et triples transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites. Justification du sexe : Nous utiliserons des mâles et femelles selon les productions en interne car nous étudierons les deux sexes qui sont relevant pour la pathologie en question.

Écartées des projets de l'animalerie et jugées non replaçables, 260 souris de réforme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une biopsie de peau de 4 mm suivie de deux points de suture posés par un stagiaire, se réveille, puis est réutilisé le lendemain pour la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, cette fois sans réveil. Le porteur écrit que les gestes pratiqués par des personnes en formation "ne permettent pas de garantir un confort de vie aux animaux", ce qui justifie l'injection létale à la fin du cathétérisme. La formation est réglementaire, agréée par le ministère de l'Agriculture et obligatoire pour toute personne concevant ou réalisant des procédures chirurgicales.

Objectifs

La prise en compte du bien-être animal nécessite la sensibilisation, la formation et l’acquisition des compétences pour le personnel concevant ou appliquant des procédures expérimentales. L’acquisition de ces compétences est un prérequis et leur mise à jour et leur adéquation avec les besoins des projets scientifiques est obligatoire. Nous proposons une formation d'initiation à la chirurgie expérimentale qui est une formation réglementaire agréée par le ministère de l’Agriculture. Elle est obligatoire pour les personnes concevant des projets comprenant des procédures chirurgicales ou réalisant ces procédures. Le but de cette formation est d’acquérir des notions élémentaires et des gestes de base nécessaires à l’expérimentateur pour réaliser une procédure définie avec une prise en charge satisfaisante de l’anesthésie, de l’analgésie et du bien-être animal. Chaque session de formation comprend un enseignement théorique de 15h et un enseignement pratique de 10h30 dont 7h00 sur animal anesthésié et 3h30 sur matière inerte. Elle permet tout d'abord de mettre en évidence les contraintes liées au choix du matériel et à l’organisation du champ opératoire puis de faire acquérir au manipulateur les bonnes pratiques pour intervenir sur l’animal dans les étapes pré, per et post-opératoires. Le stagiaire est initié aux étapes et techniques chirurgicales en réalisant de manière encadrée et après entrainement sur matière inerte, une biopsie cutanée et la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire.

Bénéfices attendus

Etre sensibilisé et initié aux bonnes pratiques chirurgicales est essentiel, et obligatoire d'un point de vue réglementaire, pour concevoir ou mettre en oeuvre des actes de chirurgicaux. Cette initiation passe par une formation réalisée par des experts (vétérinaires et ingénieurs/techniciens compétents) et doit être complétée ensuite par un encadrement adapté pour la mise en oeuvre d'une procédure chirurgicale en particulier dans le cadre d'un projet autorisé. Cette formation n’a pas vocation à transformer les stagiaires en chirurgiens accomplis mais doit leur permettre d'acquérir les notions élémentaires et les gestes de base fondamentaux pour réaliser une procédure chirurgicale associée à une prise en charge per-opératoire satisfaisante.

Procédures

Les ateliers proposés dans cette formation sont l’anesthésie, l’analgésie, l'asepsie, les points de suture et une expérience chirurgicale simple : une biopsie cutanée de 4 mm2 ou "punch biopsie"avec réveil et suivi de l'animal. L'intervention chirurgicale dure environ 1/4h. La grande partie du temps de la procédure est consacrée à la préparation de l'animal (Anesthésie, tonte, désinfection, préparation du matériel). Le lendemain, la pose d'un cathéter à la veine jugulaire (temps chirurgical 1/2h-1h max) sous anesthésie générale et analgésie appropriée est réalisée sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress léger lié à la préhension et contention d'un animal et une injection IP pour l'administration de l'anesthésie Les effets indésirables attendus sur les animaux sont légers et liés à la biopsie cutanée. Le choix des gestes mis en oeuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) et en minimisant l'impact pour les animaux. C'est pour cela qu'une biopsie cutanée est proposée (degré de contrainte léger attendu, pas d'ouverture de cavité abdominale ou thoracique) avec réveil des animaux puis le lendemain réalisation d'intervention, toujours sans ouverture de cavité, avec suivi de l'anesthésie et analgésie adaptée et sans réveil des animaux après pose du cathéter et suture cutanée. Les effets indésirables attendus sont donc très limités et pourraient correspondre à l'inconfort d'une éventuelle plaie cutanée de petite taille (4 mm de diamètre) si les 2 points de sutures réalisés par les stagiaires lâchaient dans les 12h suivant l'intervention. Le protocole anesthésie pour la mise en place du cathéter comporte un antalgique et la dose d'anesthésique est adaptée pour la durée de l'intervention attendue.

Devenir

Les interventions réalisées sur les animaux (biopsie cutanée et cathéterisme) par des personnels en formation ne permet pas de garantir un confort de vie aux animaux. Le choix d'administrer un euthanasique aux animaux encore anesthésié à la suite du cathétérisme de la veine jugulaire est donc fait pour éviter un inconfort post-chirurgical. De plus, les animaux utilisés dans cette formation sont des animaux de réforme de l'animalerie. C'est-a-dire ne pouvant pas être utilisés dans un projet ou replacés.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux pour la formation à la chirurgie expérimentale permet la mise en situation des participants afin de les former aux bonnes pratiques face à un animal et de gérer notamment le suivi post-opératoire. Au préalable, ils réaliseront les gestes chirurgicaux sur de la matière inerte. Sur l'animal les gestes réalisés avec réveil sont mineurs (biopsie de peau sur 1à 4mm2 et suture). Les gestes plus invasifs sont limités, effectués sous anesthésie générale et analgésie et sans réveil. Il n'y a pas ouverture de cavité (thoracique ou abdominale) même sous anesthésie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre au strict nécessaire dans le cadre de la formation, à savoir les animaux sur lesquels les participants auront pratiqué une biopsie cutanée suivie d'une suture seront reutilisés après leur réveil 24h plus tard pour la réalisation du catheterisme de la veine jugulaire avant l'injection d'un sous anesthésie. Un seul animal par expérimentateur sera utilisé, sachant que les animaux utilisés sont des animaux de réforme de l’animalerie n’ayant subi aucune procédure.

Raffinement

Comme tous les autres animaux de l’animalerie ils sont suivis quotidiennement pour évaluer leur comportement général (prostration, perte de fourrure, auto-aggression) et s’assurer de leur bien-être. Les souris sont utilisées dans cette formation sous anesthésie générale avec un antalgique. Seules les souris subissant une biopsie cutanée et des points de suture seront réveillées, chauffées et surveillées pendant le réveil. Tout comportement anormal des souris au réveil, même s'il est rare chez des souris ayant subi une biopsie cutanée et des points de suture, conduira à leur mise à mort sans réalisation de la deuxième procédureLa pose d'une voie d'abord au niveau de la veine jugulaire avec un est réalisée sous anesthésie générale et antalgique et les animaux reçoivent une injection létale à la fin de la procédure, en étant toujours anesthésiés.

Choix des espèces

Les souris sont largement utilisées à des fins scientifiques (statistiques MESR). Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons. La souris est le modèle le plus utilisé dans la recherche préclinique et la littérature à son sujet est donc abondante. Nous utiliserons des souris adultes de 6 à 8 semaines d'âge. Le stade de développement de ces animaux est largement utilisé dans la recherche in vivo et leur taille, à ce stade, est optimale pour la réalisation des gestes chirurgicaux décrits dans les procédures de ce projet.

Une lésion du nerf sciatique ou une injection d'agent inflammatoire installe chez 180 souris une douleur persistant plus de six semaines, avec allodynie mécanique, hyperalgésie au chaud et au froid et douleur spontanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant envisageable après la chirurgie. Chaque animal passe trois séances d'IRM d'une heure sous anesthésie et des tests comportementaux de deux heures, deux jours par semaine, pour cartographier les régions du cerveau activées selon le type de douleur. Le porteur écrit qu'en dehors de la douleur induite aucune procédure n'entraîne d'effet indésirable majeur, et présente la mise à mort finale comme un moyen d'éviter aux souris "toute souffrance inutile".

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux subiront une analyse par IRM de leur activité cérébrale. Les animaux seront analysés par IRM fonctionnelle pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 6 à 12 semaines, chaque séance durant environ 1h. Chaque animal subira 3 sessions d'IRM, espacées de 10 jours chacune, afin d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. Ces tests comportementaux permettront d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. Chaque session de comportement dure environ 2h. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des procédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeurs. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio- dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistantes. La douleur induite par les modèles de douleurs inclut : -une allodynie mécanique statique et dynamique persistante -une hyperalgésie thermique au chaud et au froid persistante -une douleur spontanée persistante. L'expérience du laboratoire avec ces modèles reporte que ces douleurs persistent environ 1 semaine dans le modèle CFA, et plus de 6 semaines dans le modèle SNI.

Devenir

L'ensemble des animaux ayant subi une procédure chirurgicale, il n'est pas envisageable de les réutiliser dans un autre projet. Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de chaque procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par MEMRI.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans des cages contenant au maximum 4 males ou 5 femelles dans une pièce thermorégulée (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein d'une plateforme d'imagerie ayant une expérience reconnue dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

L'utilisation du manganèse est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modèle souris en lien avec les données préliminaires obtenues au laboratoire. Nous utiliserons des souris adultes pour comparaison avec les autres données de la littérature