Souris
IODEM : Impact Synergique de la Carence Iodée et des Perturbateurs Endocriniens sur le Développement Neurocognitif de la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Exposées à un mélange de quinze perturbateurs endocriniens et à une carence en iode avant l'accouplement, pendant la gestation puis pendant l'allaitement, 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les mères subissent une ponction sanguine rétro-orbitaire sur animal vigile, geste dont le porteur reconnaît le risque de douleur, d'infection et de saignement. Les 192 souriceaux nés de ces couples sont exposés par le lait maternel, puis tués à trois semaines ou à deux mois pour prélèvement des tissus. Trois tests comportementaux sont annoncés pour évaluer l'odorat, la mémoire et le stress, décrits seulement comme reposant sur l'exploration spontanée, sans qu'aucun ne soit nommé.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les effets à court et à long termes sur les molécules, les cellules et le comportement de l'exposition à un mélange de 15 perturbateurs endocriniens (PE) pendant la gestation en situation de carence iodée. Ces perturbateurs sont connus pour affecter les voies thyroïdiennes (essentielles au bon développement et fonctionnement du cerveau) et le développement neurologique du fœtus, surtout lorsqu'ils sont combinés à une légère carence en iode. Même si de l’iode est ajouté au sel depuis les années 70 pour combattre la carence en iode, celle-ci reste fréquente en Europe pendant la grossesse. L’objectif de ce projet est de recréer en laboratoire deux conditions environnementales courantes chez les femmes enceintes en Europe aujourd'hui : l'exposition de couples reproducteurs à un mélange de perturbateurs endocriniens et une carence modérée en iode. Pour ce faire, dans la procédure 1 nous validerons une méthode pour créer une carence en iode modérée chez des souris adultes (n=36) en 2 semaines. Dans la procédure 2, nous allons exposer des souris adultes mâles (n=20) et femelles (n=48) à un mélange de 15 perturbateurs endocriniens souvent retrouvés dans le liquide amniotique des femmes enceintes, en présence ou en l'absence d'une carence modérée en iode. Cela nous permettra d'étudier les effets à court et long terme sur les souriceaux exposés dès leur développement embryonnaire jusqu'à leur sevrage (via le lait des mères) dans la procédure 3. On aura quatre groupes d’exposition : contrôle (sans carence iodée ni PE), carence en iode modérée seule, mélange de PE seul et effet combinée de la carence en iode et du mélange de PE. Pendant la période de traitement, nous prévoyons de mesurer les niveaux d'hormones thyroïdiennes et d'iode. De plus, nous effectuerons des tests comportementaux sur la progéniture pour évaluer les effets du traitement (2 mois post natal) sur leurs fonctions cognitives (odorat, mémoire et stress). Nous prévoyons également de collecter les organes qui pourraient être affectés par le traitement, tels que le cerveau et la thyroïde, afin d'analyser le développement des cellules du cerveau et l'expression de certains gènes d'intérêt. Le nombre d’animaux dans la procédure 3 s’élève ainsi à 192 (48 souris/group = 12 femelles et 12 mâles dans deux âges : 3 semaines et 2 mois). Au total, 296 souris seront donc utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet a un double bénéfice attendu : d’une part, celui de caractériser les effets d’un facteur aggravant (carence iodée modérée) dans un contexte d’exposition à des perturbateurs endocriniens pendant la gestation et d’autre part de renforcer les données scientifiques sur les effets néfastes des polluants ayant des propriétés de perturbateurs endocriniens/thyroïdiens sur la santé. L’expérimentation sur un modèle mammifère permettra de proposer un modèle au plus proche de la gestation humaine et de faire progresser les connaissances sur l’impact de 2 facteurs présents de façon habituelle dans la vie des femmes enceintes en Europe : carence modérée en iode d’une part et exposition aux perturbateurs endocriniens de l’autre. Cela permettra de renforcer les politiques de prévention des troubles du neurodéveloppement actuellement en augmentation de façon préoccupante en accompagnant les femmes enceintes afin d’éviter toute carence iodée pendant la grossesse et en particulier la phase précoce, et les aider à limiter leur exposition aux perturbateurs endocriniens.
Procédures
Une fois pendant la gestation, chez les mères, une ponction sanguine sera effectuée après anesthésie locale par gel, afin de doser les taux de hormones thyroïdiennes et d’iode et évaluer l’effet des traitements. La procédure de prélèvement dure environ 1 minute par souris. Les reproducteurs seront exposés 2 semaines avant accouplement, pendant accouplement et pour les femelles pendant la gestation (3 semaines) et lactation (3 semaines) Trois tests du comportement, qui se basent sur l’exploration spontanée des souris, sont envisagés dans ce projet. La durée des tests sont 5 min, 1h, quatre fois 8 min et trois fois 10 min pour une souris, un test du comportement par jour pendant cinq jours. Les souris issues des reproducteurs traités seront euthanasiées à la fin de l'expérience pour la collection de tissus à l’âge de 21 jours et 2 mois.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins en rétro-orbital causent un risque de douleur, infection et saignement. En plus, les animaux risquent être stressés car prélèvements sont faits sur animale vigile. Les tests de comportement peuvent également causer de stress aux souris.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour la collection des tissus, ils ne peuvent donc pas être utilisés pour une autre étude expérimentale.
Remplacement
Pour comprendre les troubles du développement du cerveau et de la thyroïde pendant la grossesse et l'enfance, nous devons utiliser des modèles animaux dans notre recherche. Ces modèles nous aident à étudier comment différents facteurs, comme les hormones thyroïdiennes, l'iode et les produits chimiques perturbateurs endocriniens, affectent le développement du cerveau. Le développement du cerveau est très complexe et dépend de nombreux facteurs. Il est difficile de reproduire cette complexité en laboratoire, car il y a de nombreuses cellules et de processus impliqués. De plus, certains produits chimiques perturbateurs endocriniens peuvent agir comme des hormones et avoir des effets similaires, donc nous devons étudier ces effets dans un organisme complet pour les comprendre pleinement. Il est également important de tenir compte du sexe des animaux dans nos expériences, car nous savons que les réponses aux perturbateurs endocriniens peuvent varier selon le sexe. Nous devons donc analyser les résultats en fonction du sexe pour chaque expérience que nous menons.
Réduction
Le projet impliquera un total de 296 animaux : 36 animaux (6 femelles et 6 mâles par groupe) pour établir la carence d’iode modérée, 68 pour les animaux reproducteurs (48 femelles et 20 mâles) afin de produire 192 souriceaux répartis entre 4 groupes expérimentaux (48 souriceaux /groupe, 2 sexes, 2 âges = 3 semaines et 2 mois) : contrôle, carence modérée en iode seule, mélange de PE seul et effet combiné de la carence en iode et le mélange de PE. Les effets hormonaux varient dans les 2 sexes, raison pour laquelle il est nécessaire d’étudier autant de mâles que de femelles. De plus, compte tenu de la variabilité individuelle, un nombre d’animaux plus faible ne permettrait pas de déterminer avec précision si le traitement a eu l’effet escompté et serait donc dommageable dans l'exploitation de nos données.
Raffinement
Pour garantir le bien-être des animaux tout au long de notre étude, nous avons mis en place des procédures qui limitent la douleur et le stress. Les conditions de vie des animaux respectent les réglementations, avec accès à de la nourriture et de l'eau à volonté. Nous enrichissons leur environnement avec du coton et des nids en carton, car nous évitons l'utilisation de matériaux plastiques en raison de notre recherche sur les perturbateurs endocriniens. Nous surveillons attentivement les signes de détresse chez les animaux, tels que la prostration, la diminution de la consommation alimentaire, les comportements inhabituels comme l'irritation ou l'agitation. Si un animal montre des signes de détresse significatifs, il sera retiré de l'étude et éventuellement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile. Nous veillons également à enrichir l'environnement des animaux avec des matériaux à ronger pour les aider à exprimer leur comportement naturel. En résumé, notre priorité est le bien-être des animaux tout au long de notre étude, et nous prenons des mesures pour garantir leur confort et leur santé.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont ainsi permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques et comportementaux impliqués dans le fonctionnement des voies thyroïdiennes et de leur potentielle perturbation suite à une exposition à un mélange de substances chimiques perturbateurs endocriniens ou bien à une carence iodée. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Les expériences porteront sur des souris adultes âgées de 3 mois afin de simuler la situation de carence iodée et l’exposition au mélange de 15 perturbateurs endocriniens. Les couples reproducteurs seront ainsi exposés 15 jours avant l’accouplement, puis les femelles gestantes seront exposées pendant la gestation et la lactation. Les effets des traitements sur la descendance, exposée de façon indirecte via la mère, seront évalués à court terme à 21 jours de vie ou à long terme à l’âge de 2 mois.
Évaluations de molécules à propriétés antithrombotiques ou anti inflammatoires dans des modèles précliniques murins.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Canulées à la trachée et à la jugulaire sous anesthésie profonde, le muscle crémaster ouvert pour filmer la formation des caillots dans leurs vaisseaux, 138 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil. Chaque séance dure jusqu'à trois heures pour la thrombose et jusqu'à sept heures pour l'inflammation, à raison d'une procédure par animal. Toutes sont tuées par surdose d'anesthésique en fin d'expérience, le porteur écrivant qu'elles "ne seraient pas viables en l'état". L'activité relève de la prestation de service, le laboratoire annonçant être sollicité chaque année par une équipe académique et une entreprise pour tester leurs molécules, et revendiquant être le seul en France à maîtriser ces modèles.
Objectifs
Nous estimons être contacté par une équipe académique et une compagnie par an pour un des deux protocoles précliniques murins. Toutes prestations ou collaborations impliquant des animaux transgéniques fera l’objet d’une demande de projet specifique au comité d'ethique. Nous sommes en général amenés à tester des molécules dans des modèles précliniques murin que nous sommes les seuls à maitriser en France (evaluation de la thrombose ou de l'inflammation en temps réel).
Bénéfices attendus
Ce type d’expérimentation permet d’évaluer, dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotiques et/ou anti-inflammatoires de molécules d’intérêt. Il permet notamment de mettre en évidence un élément clé pour la poursuite de l’étude de molécules : la stabilité du thrombus plaquettaire et donc sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des accidents vasculaires cérébraux. Ces expérimentations, en complément d’expérimentations in vitro, permettent de sélectionner les meilleurs candidats possibles pour poursuivre leurs évaluations selon la réglementation en vigueur.
Procédures
Les animaux sont canulés au niveau trachéal et veineux sous anesthésie profonde, avec exposition du muscle crémaster pour visualiser les veinules et les artérioles, afin d’étudier la thrombose et l’inflammation. Ces expérimentations sont sans réveil, les animaux restent sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasiés par excès d’anesthésique. Il y a une seule procédure expérimentale par animal. Seule l’anesthésie intrapéritonéale et l'injection de d'analgesique en sous-cutanée pour le protocole d'inflammation sont réalisées sur un animal vigile. Les animaux seront euthanasiés par excès d'anesthésiques. La durée maximale d'une expérience de thrombose est de 3 heures et de 7 heures pour une expérience d'inflammation.
Impact sur les animaux
La totalité de la procédure dure maximum sept heures pour les expériences d’inflammation et trois heures pour celles de thrombose. Les deux procédures sont sans reveil, les animaux sont canulés en trachéal et au niveau de la jugulaire, le muscle cremaster est exposé pour visualiser les artérioles et le veinules. Les animaux sont maintenus sous anesthésie profonde grace à des injections d'anesthesique minutées en intraveineux et d'analgesiques préchirurgie en sous cutanée. Les animaux sont euthanasiés par exces d'anesthesique.
Devenir
Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose et l’inflammation. Les animaux ne seraient pas viables en l’état, il est nécessaire de les euthanasier.
Remplacement
Les neutrophiles, les plaquettes et les cellules endothéliales sont des cellules clefs dans l’immunothrombose. A ce jour, Aucune lignée cellulaire immortalisée ne permet de produire dans des proportions satisfaisantes des neutrophiles et des plaquettes. D’autre part, Il n’est pas possible de reproduire à l’heure actuelle l’intégrité du vaisseau (incluant la contractibilité, la perméabilité, les cellules musculaires lisses) ni l’activation des cellules endothéliales in vitro.
Réduction
Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux anoncée a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'experimentations supplémentaires. Dans la mesure du possible dans les experimentations de thrombose plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. Cela nous permet de minimiser le nombre d’animaux par exemple au lieu de réaliser un lot pour l’accumulation de plaquettes et un autre pour l’accumulation de la fibrine. Nous pouvons quand les fluorochromes sont compatibles suivre les deux cinétiques dans le même animal. Pour éviter toute influence de l’expérimentateur sur les résultats les expériences sont réalisées en aveugle (anonymisation des échantillons par un autre expérimentateur).
Raffinement
Pour les deux types d'expérimentation, thrombose et inflammation, les animaux sont anesthésiés Les points limites dans les deux types d'expérimentations sont une perte sanguine excessive et un flux sanguin irrégulier au niveau du crémaster, ainsi qu'une décanulation de la jugulaire, entraînant dans tous ces cas l'euthanasie des animaux par excès d'anesthésiques. L'administration d'anesthesique est minutée et avec une posologie précise. Compte tenu de la durée prolongée des expérimentations anti-inflammatoires pouvant aller jusqu'à 7 heures, nous avons choisi de traiter les animaux avec un analgésique supplémentaire avant l'anesthésie par voie intrapéritonéale.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus et le dévelopement d'une inflammation dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 12 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures.
Voies de synthèse d’un agent majeur du métabolisme énergétique, le nicotinamide adenine dinucléotide (NAD), au cours de l’insuffisance rénale : modulation et interventions thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Un rein retiré et le pédicule vasculaire de l'autre serré par un clamp, ou les deux pédicules bloqués pendant vingt-cinq minutes : 590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent une perfusion intraveineuse de cinq heures sous anesthésie pour une partie des animaux, des prélèvements d'urine répétés par massage abdominal et une mesure de filtration rénale demandant deux anesthésies séparées de deux heures. L'insuffisance rénale ainsi provoquée entraîne douleur, perte de poids et déshydratation, atteintes que le porteur décrit comme impossibles à éviter complètement puisque l'induction de la maladie est "absolument indispensable" au projet. Sur le remplacement, il indique que les organoïdes de rein existants n'ont pas de vascularisation et ne permettent donc pas de mesurer une fonction rénale.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant chez 10% des patients hospitalisés et 50% des patients en réanimation. Un épisode d'insuffisance rénale aiguë est un facteur de risque pour le développement d'une maladie rénale chronique, qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Il n’existe actuellement aucun traitement de l'insuffisance rénale aiguë. La production d'énergie par les cellules rénales est fortement perturbée pendant une insuffisance rénale aiguë. Des études ont notamment décrit un blocage de la synthèse de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l'alimentation. La supplémentation en vitamine B3 permet de restaurer la production de NAD et de limiter les conséquences d'une insuffisance rénale aiguë. Ces résultats sont très prometteurs mais, avant une application en clinique, il reste beaucoup de questions, qui constituent nos objectifs : - existe-t-il une corrélation entre la sévérité de l'insuffisance rénale aiguë et l'atteinte de la synthèse de NAD ?. - quelle est l'évolution de la synthèse de NAD après insuffisance rénale aiguë ? Les résultats publiés ne portent que sur la phase aiguë, précoce. Il faut maintenant compléter ces études en caractérisant l'évolution de cette synthèse la phase de récupération et la phase de transition vers la maladie rénale chronique. - la vitamine B3 est-elle bénéfique lorsqu'elle est administrée après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë ? Les études publiées ont uniquement rapporté le bénéfice d'une administration commencée avant l'insuffisance rénale aiguë . Il faut maintenant déterminer si la vitamine B3 est efficace après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë. Au cours de ce projet, nous caractériserons également l'évolution du rapport de deux molécules impliquées dans la synthèse de NAD, à savoir le rapport quinolinate/tryptophane. Ce rapport varie très tôt pendant l'insuffisance rénale aiguë, beaucoup plus tôt que les tests utilisés actuellement pour diagnostiquer une insuffisance rénale aiguë. La caractérisation de son évolution pendant les différentes étapes menant de l'insuffisance rénale aiguë à la maladie rénale chronique nous permettra de déterminer si ce rapport peut avoir un intérêt diagnostique et pronostique.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement aucun traitement spécifique de l'insuffisance rénale aigue. L'administration de vitamine B3 est particulièrement prometteuse. Le projet décrit ici doit nous permettre de définir quand doit être administré ce traitement dans le contexte de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique. Le deuxième objectif du travail est la caractérisation d'un outil (le rapport quinolinate/tryptophane) diagnostique et/ou pronostique précoce de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique, qui manque aujourd'hui. Cet outil pourrait également permettre de déterminer le moment et le temps pendant lequel il faut administrer la vitamine B3. Ensemble, ces deux aspects du projet permettront de limiter l'administration de vitamine B3 à la période strictement nécessaire, réduisant ainsi non seulement le risque d'effets secondaires connus, comme la toxicité vis-à-vis du foie, mais également les effets nocifs potentiels sur le rein d'une activation à long terme de la production de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) dans la phase de réparation après insuffisance rénale aigue ou lors de la transition vers la maladie rénale chronique.
Procédures
(1) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à exciser le rein droit et à poser un clamp autour du pédicule vasculaire rénal gauche Cette chirurgie dure entre 20 et 30 minutes. (2) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à clamper les deux pédicules vasculaires rénaux pendant 25 minutes. Ce protocole dure 45 minutes (exposition puis pose des clamps sur les pédicules, ischémie et sutures). (3) Une partie des animaux sera soumise à la mesure du débit de filtration glomérulaire qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intra-veineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que 2 minutes. (4) Tous les animaux recevront au moins une injection intrapéritonéale. Cette procédure, effectuée sur animal vigile, dure moins d'une minute. (5) Une partie des animaux sera soumise à une perfusion intra-veineuse pendant 5h sous anesthésie gazeuse. (6) Des prélèvements de 50 microlitres d'urine seront effectués avant la chirurgie et à plusieurs temps après la chirurgie (miction spontanée ou léger massage abdominal). La durée de cette procédure, effectuée sur animal vigile, est de 1-2 minutes. Tous les animaux y seront soumis. (7) Tous les animaux seront soumis prélèvement sanguin effectué sous anesthésie suivi de l’euthanasie des animaux par une méthode réglementaire. Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale associée à une analgésie. Un traitement analgésique sera également appliqué toutes les 6-8h après chirurgie pendant 48 heures.
Impact sur les animaux
La chirurgie et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : (1) douleur provoquée par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose du clamp vasculaire (ouverture des plans cutané et musculaire, sutures); (2) complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique); (3) altération de l'état général : perte de poids, déshydratation; (4) stress induit par les manipulations quotidiennes. Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont en effet nécessaires post-mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Le rein est un organe complexe, composé de plusieurs types de cellules chargés chacun d'une mission spécifique, qu'il est actuellement difficile de reconstituer en dehors d'un organisme vivant. Si des équipes ont décrit la génération d'organoïdes ("organes dans une boîte") rénaux, elles n'ont pour l'instant pas réussi à mettre en place un système de vascularisation, indispensable pour reproduire fidèlement la situation de l'organisme. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique de la vitamine B3 est l'amélioration de la fonction rénale, qui ne peut pas être mesurée sur un organe sans circulation sanguine. Enfin, le foie joue un rôle crucial dans la synthèse et le métabolisme du NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide), une des sources d'énergie que nous étudions. Il est donc essentiel pour notre étude que l'interaction entre le foie et le rein soit présente.
Réduction
Le nombre total d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est 590. Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité qui existe entre individu dans les deux modèles d'insuffisance rénale aigue que nous utilisons. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques appropriés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux) et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage. Des points limites ont été définis. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
L'étude d'un modèle expérimental de mammifère est indispensable puisque le but de notre travail est de pouvoir transposer un jour le résultat de nos études à la clinique humaine. Nous avons choisi la souris car nous maîtrisons parfaitement les protocoles expérimentaux dans cette espèce. Les procédures seront menées chez des souris mâles et femelles de 9-10 semaines, c'est-à-dire des animaux adultes. L'insuffisance rénale aigue touche en effet majoritairement des adultes.
Etude du rôle des canaux chloriques dans la survie des neurones transitoires du cortex de la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Nés dans l'élevage des lignées génétiquement modifiées du projet, tatoués et amputés d'un bout de queue pour génotypage dans leur deuxième semaine de vie, 1 344 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 288 d'entre eux reçoivent des injections d'anesthésiant et d'analgésique avant d'être vidés de leur sang par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi certaines cellules nerveuses transitoires du cortex meurent entre le huitième et le vingt-cinquième jour après la naissance, leur maintien étant associé chez l'humain à des crises d'épilepsie. Les 1 056 autres souriceaux ne subissent que le tatouage et la biopsie, puis sont tués, leur seul rôle ayant été de faire naître les animaux réellement étudiés.
Objectifs
Le cortex cérébral contrôle la perception sensorielle ainsi que les fonctions motrices et cognitives (mémoire, pensée, réflexion…) et joue donc un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau des mammifères. La mise en place de cette structure au cours du développement embryonnaire nécessite une coordination très fine de la génération des différents types cellulaires, du contrôle de leur migration et de leur positionnement final. Il est également de plus en plus reconnu que l’élimination de certains types de cellules neuronales au cours du développement périnatal est fondamentale pour la mise en place d’un cortex cérébral normal. Le maintien de ces cellules au stade adulte chez l’homme est associé notemment à des crises d’épilepsie. Certaines cellules transitoires du cortex spécialisées dans le développement du cerveau jouent un rôle clef dans la migration neuronale et la mise en place des aires corticales. Chez la souris, elles sont divisées en 3 sous-populations selon leurs origines et meurent massivement entre 8 jours et 25 jours après la naissance. Nos travaux ont impliqué l’activité électrique comme étant responsable de la mort de seulement une fraction de ces cellules. La concentration intracellulaire de chlore joue un rôle critique dans l’activité des neurones corticaux, et change drastiquement après la naissance suite à des variations importantes dans l'expression de protéines impliquées dans le transport du chlore. Or, nos cellules transitoires d'intérêt ne réalisent pas ce changement, ce qui pourrait aussi être à l’origine de leur mort. Ainsi, ce projet vise à identifier l'impact de l'expression des protéines impliquées dans le transport du chlore sur la mort des cellules transitoires d'intérêt grâce à l'utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la mort de nos cellules transitoires d’intérêts au cours du développement du cerveau chez la souris et ainsi de mieux appréhender leur importance dans l’apparition de pathologies neurologiques chez l’homme.
Procédures
Le tatouage pour l’identification (1 minute) et un prélèvement de la queue pour génotypage (10 secondes) seront réalisés sur tous les nouveaux-nés du projet, à l’état vigile, dans leur deuxième semaine post-natale. Parmi les 1344 animaux du projet, 288 animaux subiront deux injections successives intrapéritonéales (10 secondes chacune) d'analgésiques et d'anesthésiants avant de subir une chirurgie d'exsanguination intracardiaque par perfusion de paraformaldehyde (10 minutes).
Impact sur les animaux
Les nouveaux-nés subiront un stress léger lié à la contention, au tatouage et une douleur légère liée à la biopsie de queue. Les animaux subiront un stress et une douleur légère liés aux injections intrapéritonéales
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet, soit afin d'être prélevés pour les besoins des études histologiques. soit après avoir permis de générer les animaux nécessaires auxétudes histologiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées que sur des cerveaux de mammifères. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère car nos cellules d'interêt n'existent que chez les mammifères. Le développement du cerveau des mammifères et de son fonctionnement est de mieux en mieux caractérisé chez la souris avec de nombreux modèles génétiques, ce qui en fait un modèle de choix. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniques. Nous étudions à la fois les mâles et les femelles et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, les effectifs ont été déterminés pour mettre en évidence une différence statistique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi (bâtonnet à ronger et coton pour la nidification) avec eau et nourriture ad libidum. La mise à mort est effectuée en limitant le plus possible la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Des points limites ont été mis en place afin d'arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ou la détresse d’un animal d’expérimentation à l’aide de mesures telles que l’euthanasie, l’arrêt du processus qui le fait souffrir, ou l'application d'un traitement visant à le soulager.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cerveau entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence des cellules transitoires d'intérêt. Nous allons étudier les rôles de l’expression des deux protéines impliquées dans le transport du chlore sur la survie des cellules transitoires d'intérêt soit 8 jours après lar naissance (au début la période de mort de nos cellules d'intérêt) soit 25 jours après lar naissance (à la fin de leur période de mort).
Etude pré-clinique de nouvelles biothérapies dans un modèle murin de myopathies nécrosantes auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
792 souris vont être utilisées, toutes tuées au quatorzième jour pour examens histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sept injections intrapéritonéales d'anticorps humains, subit un test d'effort, deux microprélèvements sanguins sous anesthésie et une opération du mollet destinée à mesurer la perte de tonus musculaire. La maladie est provoquée par transfert d'autoanticorps prélevés chez des patients atteints de myopathie nécrosante auto-immune, et le porteur souligne que les souris malades ne montrent aucun signe visible, la faiblesse n'étant détectable qu'à l'appareil de mesure. Le compte de 792 découle du protocole retenu, 22 souris rendues malades et 22 témoins par modèle, appliqué aux neuf molécules candidates.
Objectifs
L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux anticorps thérapeutiques permettant de soigner des pathologies autoimmunes du muscle. Celles-ci sont dues à un dérèglement du système de défense du corps impliquant des protéines . Il est donc important de neutraliser l'attaque du système immunitaire contre ces deux constituants pour relancer la fabrication de fibres musculaires solides et saines. Dans le cadre du remplacement, les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans cette maladie. Aujourd’hui, nous devons confirmer l’aspect préventif et/ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de la pathologie. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux bio-médicaments permettant de soigner les pathologies autoimmunes du muscle.
Procédures
Chaque animal subira : 7 Injections intra-péritonéales d'anticorps humain d’une durée de 30 secondes chacune, 1 test d'effort d’une durée de 1 à 2 minutes et enfin 1 intervention chirurgicale pour l'évaluation de la perte du tonus musculaire au niveau du gastrocnémien d’une durée maximum de 10 minutes. Les animaux seront soumis à 2 microprélèvements de sang (J0 et J7), prélèvements sous anesthésie, durée de l'acte moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris présenteront une perte de force musculaire symptomatique de la maladie. Dans de rare cas une fonte musculaire et donc une perte de poids seront observées.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie jusqu'à j14 où ils seront mis à mort pour examens histologiques.
Remplacement
Dans le cadre du remplacement les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro de fibres isolées, d’organoïdes ou de myoblastes en culture. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans les MNAI. Aujourd’hui nous devons confirmer l’aspect préventif et ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de MNAI. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.
Réduction
Nos modèles de maladies du muscle expérimentales chez la souris ont été optimisés et calibrés. Par expérience nous savons qu’il faut utiliser 22 animaux induits et 22 animaux témoins pour obtenir un résultat significatif et fiable pour chaque modèle de maladies du muscle. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement . Dans le but de réduire au maximum les animaux utilisés pour chacune de nos 9 molécules d’intérêt thérapeutique nous commencerons le test par le pouvoir préventif dans l’induction de maladies du muscle. En cas d’échec la capacité curative ne sera pas testée. En effet, selon le principe de fonctionnement de nos molécules, notre expertise nous permet de prévoir qu'il n'y aura pas d'effet thérapeutique.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement, notre unité a développé deux modèles de maladies du muscle expérimentales modérées en utilisant des autoanticorps issus de patients . La maladie se développe en 7 jours et présente des atteintes modérées au niveau des muscles squelettiques. Les animaux malades ne présentent aucun signe visible de la maladie et nécessite l’utilisation d’appareils de mesure de force non invasif pour détecter la maladie . Pour étudier l’aspect préventif de nos molécules les animaux seront traités à J-1 avant l’induction et la perte de force musculaire sera évaluée à J7 et J14. Pour l’effet curatif les animaux seront traités à J7 post induction et la force sera évaluée à J7 post traitement. La durée de la pathologie ne sera donc que de 7 jours afin de limiter au maximum tout inconfort de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 dans des cages adaptées avec un enrichissement à base de nids cartonnés et de tampons de ouate. De la nourriture sous forme de bouillie sera distribuée en plus des granulés afin de soulager toute atteinte des muscles masticateurs. Une surveillance quotidienne basée sur le grimace scale sera effectuée du début à la fin de l’expérimentation. Le grimace scale est un système d’évaluation de l’état de stress d’inconfort et de la douleur ressentie pour chaque espèce animale. Il est basé sur l’observation de 5 critères : Contraction orbitaire, gonflement du nez, gonflement des joues, position des oreilles et position des moustaches. Pour chaque item un score de 0 à deux est appliqué en fonction de l’état. Il permet d’obtenir des scores cliniques chiffrés. Au delà de 4 les animaux concernés seront sortis de l'étude et mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en sous-cutané).
Choix des espèces
La souris est un animal de choix pour l’étude des maladies auto-immunes. Les lignées établies en consanguinités permettent d’obtenir des modèles de pathologies calibrées et reproductibles. De plus un nombre important d’outils tel que les anticorps dirigés contre les différents marqueurs de populations hématopoïétiques nous permettent de « décortiquer » les phénomènes immunologiques qui interviennent dans la maladie. De plus nous avons développé depuis peu un modèle murin standardisé et optimisé de maladies du muscle par transfère d’autoanticorps issus de patients. Les souris seront agées de 8 à 10 semaines (en début de protocole) pour posséder un systême immunitaire complet et pleinement actif.
Etude du rôle du système à peptide RFamide PrRP/GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur à l’aide de souris génétiquement modifiées. (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à 84 tests nociceptifs par animal, répartis sur six semaines, après une chirurgie de la patte droite ou des injections d'agent inflammatoire. 1 754 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 008 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent d'abord une biopsie de la queue entre cinq et sept jours pour le génotypage, et celles qui n'ont pas le génotype recherché sont tuées sans autre usage. Le porteur indique qu'aucune réutilisation n'est possible, les modèles de douleur infligés fausseraient les résultats d'une procédure ultérieure.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur, ce qui sous-entend des points communs entre l’hyperalgésie induite par les opiacés et le développement de l’hyperalgésie induite par les douleurs chroniques. Les données de la littérature ainsi que nos premiers résultats indiquent qu’un récepteur spécifique serait impliqué dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré une lignée de souris chez qui nous pouvons désactiver ce récepteur. L’étude de cette lignée nous permettra notamment de mieux comprendre l’implication de ce récepteur dans la modulation de la douleur et le développement de l’hyperalgésie, mais aussi d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Ce projet est un projet multi-site se déroulerant dans 2 Etablissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet, combinés aux résultats précédemment obtenus par une approche pharmacologique avec un ligand exogène (molécule synthétique pouvant se fixer au récepteur), permettront d’affiner le rôle de ce récepteur ainsi que de son ligand endogène (molécule naturellement synthétisée par les neurones et pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception et le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ce projet pourrait permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie unique sur animal vigil à l'âge de 5 à 7 jours afin de réaliser leur génotypage (réalisée dans l'EU1). 1248 animaux du projet subiront une injection de tamoxifène et un phénotypage comportemental (réalisée dans l'EU1). Un 1er lot d’animaux subira 1 à 2 tests nociceptifs d’une durée de 15 min environ par jour pendant 12 jours ; puis 2 tests de confort nociceptif d’une durée d’1h (1 test par jour dans ce cas)(EU2). Un 2nd lot d’animaux subira 4 injections à raison d’une injection toutes les 15 min. Ces animaux subiront au total 36 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 22 jours (EU2). Un 3ème lot d’animaux subira des injections pendant 11 jours. Ces animaux subiront au total 66 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 4 semaines (EU2). Un 4ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 48 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 25 jours (EU2). Un 5ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 84 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 42 jours. Un 6ème lot d’animaux subira deux tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 4 tests maximum (espacés de 4h minium) par semaine, pendant 7 semaines (EU2). Un 7ème lot d’animaux subira 2 tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 2 tests par jour (espacés de 4h minium) pendant 3 semaines. Un dernier lot d’animaux subira un test nociceptif d’une durée de 3 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une injection avant de réaliser le même test nociceptif, tous les 15 min pendant 90 min (EU2).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont une douleur modérée après la biopsie, l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, inconfort transitoire au point d’injection.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage ayant le génotype d'intérêt continue vers les procédures de phénotypage comportemental et ceux n'ayant pas le génotype d'intérêt sont mis à mort. Les animaux avec le génotype d'intérêt inclus dans les procédures sont mis à mort à l'issue de chacune d'elles. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la modulation de la nociception et de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons pu estimer par une analyse statistique que 12 animaux de chaque sexe/groupe sont requis pour obtenir des résultats exploitables. Ainsi chaque étude de base comportera un groupe transgénique témoin et un groupe transgénique cKO GPR10 dans lequel la délétion du gène aura été induite par un traitement de 4 semaines avant la procédure, de chaque sexe, de 12 sujets chacun soit 48 animaux. Les animaux utilisés dans des études similaires n’étant pas disponibles, en cas de réussite avec ce nouveau modèle, les animaux prévus pour les deux autres études ne seront pas utilisés. De par notre expérience de maintien de lignée, nous connaissons aussi le nombre optimal de couples reproducteurs qu'il nous faut, pour pouvoir à la fois maintenir les lignées et fournir les animaux nécessaires au bon déroulé des expériences.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Pour le transport des animaux, vu la courte distance entre les 2 EU (5 km), celui-ci sera effectué par véhicule personnel. Les cages seront positionnées de manière à ce qu'elles ne puissent bouger ni se renverser pendant le transport. Les conditions environnementales seront maintenues pendant le transport (on vérifiera la température du véhicule avant le transport). Les cages de transport contiendront de l'eau et la nourriture gélifiés ainsi que des enrchissements (frissure et morceaux de bois à ronger). Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et les injections d'agent inflammatoire sous anesthésie gazeuse. Pour les tests comportementaux mesurant les seuils de douleur, les animaux gardent le contrôle sur le test: le retrait de la patte de l'animal ou de la queue met fin au test, ou l’animal change de compartiment. Le test est de toute façon toujours arrêté au seuil nociceptif de l’animal et des points limites spécifiques ont été défini pour éviter toute lésion des tissus. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle du récepteur GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Par ailleurs, la souris permet des délétions conditionnelles qui est la base d’étude de ce projet. Des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g) car l’étude des comportements dans nos différents modèles nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés entre 5 et 7 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits.
Etude des effets de nouvelles molécules dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, compliquée de diabète
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris qui perdent 20 % de leur poids de départ ou qui présentent des lésions cutanées sont retirées de l'étude. 978 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection de peptide directement dans le cerveau sous anesthésie, un jeûne de seize heures par semaine pendant quatre semaines, des incisions de la queue pour des prélèvements sanguins étalés sur trois heures, et un test d'évitement passif qui délivre un stimulus aversif dans les pattes. L'objet réel est de mesurer chez des souris rendues amnésiques et diabétiques l'effet d'une molécule tirée d'une plante, dont le passage en clinique reste une perspective annoncée.
Objectifs
Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer est aujourd’hui une priorité. La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative liée au grand âge et est souvent compliquée de pathologies associées. Parmi celles-ci, le diabète est un facteur de risque et de complication de la maladie. Des processus neurodégénératifs communs s'expriment dans les cellules nerveuses (neurone, glie) et dans les cellules du pancréas. Parmi les cibles communes,nous étudions au laboratoire de nouvelles molécules, qui s'avèrent d'excellents neuroprotecteurs. Le but de notre projet est de caractériser ces nouvelles molécules dans des modèles de souris présentant des symptomes Alzheimer compliqués de diabète.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mesurer l'efficacité d'une molécule neuroprotectrice d'origine naturelle sur des modèles murins de maladie d'Alzheimer compliquée de diabète et permettre un développement clinique. Le projet permettra également d'établir des modèles complémentaires de comorbidité Alzheimer-diabète afin d'explorer des pistes thérapeutiques spécifiques, notamment reposant sur un molécule issue de plante.
Procédures
Les injections des molécules à tester seront faites en intrapéritonéal sur animal vigile quotidiennement pendant deux semaines (moins d'une minute). Les animaux subiront un jeûne (durée 16 h) chaque semaine durant 4 semaines. Une incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale par une crème anesthésiante) sera faite pour prélèvements sanguins (6 gouttes de sang sur une durée de 3h avec un animal remis dans sa cage entre chaque prélèvement) une fois par semaine et durant 6 semaines pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique. Les autres animaux auront une chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau. Cette intervention est d'une durée de 2 minutes maximum entre le début de l'anesthésie gazeuse et la fin de l'inoculation du peptide. Ensuite, durant une semaine, les animaux recevront une injection par voie intrapéritonéale des molécules à tester une fois par jour (moins d'une minute) pendant 1 ou 7 jours. Suite à ces traitements, les capacités de mémoire des animaux seront analysées, en effectuant des tests comportementaux (entre 90 secondes et 10 minutes selon les tests).
Impact sur les animaux
La chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau afin d'induire les symptômes de la maladie d'Alzheimer se fait sous anesthésie. Cette procédure sera suivie par 7 jours d'injections intrapéritonéales qui pourra engendrer une légère douleur de courte durée et du stress chez l'animal. Le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme va délivrer un stimulus aversif au niveau des pattes de la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer tous les tissus d'intérêt et procéder à des tests biochimiques post- mortem.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins de la maladie d'Alzheimer pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la toxicité touchant le cerveau dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.
Réduction
Les molécules sont testées sur une gamme de doses réduite (4 doses seulement). Les animaux subiront différents tests comportementaux de façon à mesurer différents types de mémoire . Enfin, les analyses statistiques sont optimisées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (généralement 15 souris/groupe pour les tests comportementaux). Ce nombre de 15 souris par groupe a été déterminé en tenant compte de la force des tests statistiques appliqués aux réponses comportementales.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi quotidiennement en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait immédiatement interrompu et, si nécessaire, l'animal serait retiré de l'étude. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.
Choix des espèces
Les modèles de souris utilisées dans cette étude présentent rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer et permettent d'obtenir des données préliminaires transférables en essai clinique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que les effets de la molécules ont été caractérisés dans les projets antérieurs
Optimisation des traitements antibiotiques dans des modèles souris d’infections bactériennes
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent sous anesthésie une injection rétro-orbitaire de staphylocoque doré multirésistant, puis jusqu'à six injections intrapéritonéales d'antibiotiques par jour sur animal vigile, pendant deux à cinq semaines. L'infection du sang et des articulations ainsi provoquée entraîne douleur et troubles du déplacement, et les prélèvements réalisés après la mise à mort servent à compter les bactéries restantes. Sur le remplacement, le porteur écrit que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier l'élimination des bactéries dans une infection générale et que le "modèle animal est indispensable" au projet.
Objectifs
Le staphylocoque doré est une bactérie responsable d'infections graves. Certaines bactéries sont dites multi-résistantes car résistantes à plusieurs familles d'antibiotiques et posent de nombreux problèmes thérapeutiques. Nous proposons une approche innovante avec l'association de deux antibiotiques qui leur permet un meilleur accès au site infecté pour traiter les infections graves à staphylocoque doré multi-résistant. Il a été identifié plusieurs combinaisons antibiotiques dont l'action est efficace en laboratoire. Ce projet vise à tester ces combinaisons d'antibiotiques dans des modèles souris d'infections sévères du sang et des articulations.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de meilleures stratégies thérapeutiques contre les infections sévères à staphylocoque. Le projet déterminera l’efficacité de nouvelles combinaisons d'antibiotiques administrées de manière à mieux accéder directement au site de l'infection.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une anesthésie d'une durée de 5 à 15 minutes. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse rétro-orbitaire d'une durée de 5 secondes réalisée sous anesthésie. Les animaux recevront des injections sous-cutanées d'analgésiques tous les 3 jours, soit un total de 5 à 12 injections selon les études menées (2 à 5 semaines). Les injections sous-cutanées d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles. Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales quotidiennes d'antibiotiques au nombre de 2 ou de 6 selon l’étude menée. Les injections intrapéritonéales d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Le développement des bactéries sera susceptible de générer un stress chez l’animal dans les 24h qui suivent l’inoculation. L'infection est susceptible de générer douleur et problèmes de déplacement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des deux procédures. Des prélèvements post-mortem seront effectués pour quantifier le nombre de bactéries et évaluer l'efficacité des différents traitement antibiotiques.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la clairance bactérienne et de l’efficacité des traitements antibiotiques dans des modèles d’infection systémique. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet et permettra également de mesurer l’impact des différentes molécules à court terme sur le microbiote intestinal. Les combinaisons d’antibiotiques qui seront testées ont démontré leur efficacité dans des modèles simples de culture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utilisons des animaux de même sexe et même âge obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec nourriture et eau ad libiditum, dans un environnement enrichi avec maisonnette en carton et coton compacté. Ils seront observés quotidiennement, jours fériés et week-end inclus, par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire l'infection du sang et des articulations. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris juvéniles de 7 semaines car elles disposent d'un système immunitaire mature.
Modèle de neurofibromatose pour l’évaluation de la réponse thérapeutique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules tumorales humaines sont injectées directement dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes anesthésiées une heure, puis la tumeur est suivie par imagerie chaque semaine pendant quatre semaines. 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem, 170 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit de tester des combinaisons de médicaments contre les neurofibromes plexiformes de la neurofibromatose de type 1, un traitement approuvé existant déjà mais ne fonctionnant que partiellement. Le porteur annonce une douleur pouvant persister pendant la croissance de la tumeur et une perte de poids limitée à 20 %, seuil dont l'atteinte déclenche la mise à mort de l'animal.
Objectifs
La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique caractérisée par une modification de la séquence génétique qui inactive la fonction du gène NF1 (Neurofibromine 1). Cette pathologie se caractérise par diverses manifestations cliniques qui peuvent affecter le système nerveux, la peau, les os, les yeux, ainsi que d'autres organes, entraînant entre autres le développement de tumeurs appelées neurofibromes plexiformes (PNF). Le PNF est une tumeur bénigne rare de la gaine des nerfs périphériques, dont les conséquences peuvent être variées, en fonction de leur localisation. La seule option de traitement des PNF est le traitement des symptômes ou la résection chirurgicale, bien que cette approche soit rarement complète en raison de la relation étroite entre la tumeur et les nerfs. En 2020, le Selumetinib a été approuvé pour le traitement en clinique aux Etats-Unis pour les patients pédiatriques âgés de 2 ans et plus, atteints de neurofibromes périphériques symptomatiques et inopérables. Toutefois, la réponse à ce traitement est partielle. Notre objectif est de valider un traitement alternatif et plus efficace pour les neurofibromes plexiformes. En résumé, ce projet vise à confirmer l'efficacité et la synergie de ces médicaments dans les cellules tumorales du neurofibrome plexiforme, dans le but de trouver un traitement alternatif plus efficace que celui actuellement approuvé et réduisant les risques secondaires.
Bénéfices attendus
La neurofibromatose est une maladie pour laquelle il existe peu de traitement efficace. Par ailleurs, une fraction importante des patients souffrants de neurofibromatose va subir une évolution maligne vers la Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNST). Cette tumeur, particulièrement agressive, est très résistante à la chimiothérapie et est donc associée à un très mauvais pronostique. Elle constitue la principale cause de mortalité chez les patients atteints de la NF1. Il est donc crucial d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour soigner la neurofibromatose et éviter son évolution en MPNST. Nous avons identifié des combinaisons thérapeutiques prometteuses sur des modèles de lignées cellulaires qui reproduisent la neurofibromatose. L’étape suivante pour pouvoir progresser vers leur utilisation en clinique est de valider ces résultats dans un modèle, in vivo, plus proche de la complexité du patient.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le nerf sciatique de souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 60 minutes ). 3 jours et 5 jours après l’intervention chirurgicale, les animaux anesthésiés seront imagés pour vérifier l’implantation de la tumeur (durée de l’anesthésie : 10 minutes) Dans un second lot, les animaux vigiles recevront des traitements par voie orale à raison d‘une fois par jour (5j/7) pendant 30 jours. Dans un troisième lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le nerf sciatique de souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 60 minutes ). 3 et 5 jours après l’intervention chirurgicale, les animaux anesthésiés seront imagés pour vérifier l’implantation de la tumeur (durée de l’anesthésie : 10 minutes). Puis les souris seront traitées 1 fois par jour pendant 30 jours. En parallèle, les animaux anesthésiés seront suivis par imagerie à raison d’une imagerie par semaine pendant 4 semaines (durée d’anesthésie : 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les principaux gestes qui seront effectués sur les animaux impliquent la greffe de cellules humaines dans le nerf sciatique des souris puis le traitement des animaux avec les différents médicaments que nous avons identifiés. Les nuisances attendues sont donc la douleur liée à l’intervention chirurgicale au niveau du nerf sciatique (douleur qui peut persister lors du développement de la tumeur) et une perte de poids ne dépassant pas 20 % du poids corporel normal . Lors de l’administration des produits par injection, une douleur de courte durée et d’intensité légère liée à la piqûre elle-même est attendue au point d’injection.
Devenir
À la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous avons effectué un grand nombre d’expériences préliminaires sur des lignées cellulaires afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Toutefois, en raison de l’importance des interactions avec le microenvironnement, l’étude de la progression tumorale dans un contexte aussi proche que possible de celui du patient reste une phase indispensable avant de passer aux essais cliniques impliquant des patients. L’objectif de cette demande est de pouvoir valider un traitement sur une tumeur dans son environnement ‘naturel’ donc au niveau des nerfs.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser une cohorte limitée à 10 animaux par condition expérimentale. L’efficacité de la greffe orthotopique est estimée à près de 90% chez la souche de souris immunodéficiente que nous utiliserons, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux par condition expérimentale ou « bras » a été déterminé de façon à d’une part obtenir une puissance statistique optimale et d'autre part éviter tout gaspillage en termes d'animaux. Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'outils statistiques.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, les procédures techniques seront limitées au strict nécessaire. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec recours aux analgésiques. Dans le cas où un animal présenterait des signes d'inconfort ou de douleur au cours de l'expérience, de l’analgésique sera administrée, conformément aux protocoles établis de gestion de la douleur. De plus, nous avons établi des points d'arrêt pour chaque expérience, l'expérience se terminant au plus tard 6 semaines après le début du traitement ou plus tôt, selon les objectifs spécifiques de chaque phase expérimentale. Cette approche garantit que l'exposition des animaux à un éventuel inconfort soit minimisée. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective, l’état des animaux. Dès l’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour tester le développement de nouvelles cibles thérapeutiques en environnement contrôlé. C’est un mammifère dont la physiologie est suffisamment proche de celle de l’espèce humaine. Les souris immunodéprimées permettent de créer un modèle de xénogreffes de tumeurs humaines, sans provoquer de rejet de la greffe. Les xénogreffes de tumeurs de patients chez les souris immuno-déficientes récapitulent remarquablement bien les tumeurs humaines et constituent donc un modèle idéal pour l’étude des gènes impliqués dans la progression tumorale.
Evalution d’une thérapie par transfert de gène sur les fonctions motrices d’un modèle murin de dysferlinopathies
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Porteuses d'une mutation du gène de la dysferline qui dégrade progressivement leurs muscles, 222 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection locorégionale de virus porteur d'une mini-dysferline sous anesthésie gazeuse de dix minutes, puis passent chaque mois un test de force musculaire de cinq minutes, jusqu'à l'âge de douze mois. Le porteur affirme que la myopathie n'aura qu'un impact histologique, aucun animal n'étant gardé au-delà de l'âge où les signes cliniques apparaissent. Sur les 222 souris comptées, 126 entrent dans les groupes expérimentaux et les 96 autres relèvent de l'élevage de la lignée.
Objectifs
Les dysferlinopathies sont un groupe de maladies musculaires rares et héréditaires caractérisées par des mutations dans le gène de la dysferline, ce qui entraîne une altération de la fonction de cette protéine. Les atteintes cliniques dans les dysferlinopathies incluent généralement : - une faiblesse musculaire progressive. Cette faiblesse affecte principalement les muscles des membres, en particulier les épaules, les hanches et les cuisses. - une perte de la force et de la fonction musculaire : Avec la progression de la maladie, les patients peuvent éprouver une diminution de la force musculaire, ce qui entraîne des difficultés à effectuer des activités quotidiennes telles que monter les escaliers, se lever d'une chaise, ou porter des objets lourds. - une dystrophie musculaire : La dégénérescence progressive des muscles peut conduire à une dystrophie musculaire, caractérisée par une perte de masse musculaire et une détérioration de la structure des fibres musculaires. Ces atteintes cliniques peuvent varier en gravité d'un individu à l'autre. Les souris présentant une mutation dans le gène de la dysferline présentent une atteinte musculaire très progressive avec un impact clinique pour l'animal au-delà de 13 mois. Au cours d'un projet antérieur, nous avons testé une approche thérapeutique par injection intramusculaire d'un AAV (adeno associated virus) codant pour une mini dysferline fonctionnelle (protéine plus courte que la forme normale mais ayant conservée sa fonction). Ces traitements ont permis d'améliorer le phénotype histologique du modèle murin Ce nouveau projet, a pour objectif de tester l'efficacité de cette thérapie génique par administration par voie loco-régionale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce travail seront principalement pour les patients atteints de ce type de myopathie. En effet si notre hypothèse s’avère valide la thérapie génique va pouvoir éviter la dégénérescence des fibres musculaires observée chez les patients et offrir une thérapie potentielle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection locorégionale sous anesthésie générale gazeuse. La durée de cette anesthésie est de l’ordre de 10 minutes. Ils seront également soumis une fois par mois à un test de force musculaire ("grip test") ce test durera 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés au cours de ce projet vont développer une atteinte musculaire progressive ayant surtout un impact histologique puisqu'aucun animal ne sera gardé au délà de l'âge auquel la myopathie clinique se déclare.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures car nous prélèverons les échantillons nécessaires pour notre étude.
Remplacement
Les techniques in vitro ne peuvent être utilisées qu’afin de voir un effet à l’échelle cellulaire de l’administration de la mini-dysferline. La récupération fonctionnelle permise par l’administration de cette mini-dysferline ne peut être explorée que sur des modèles vivants. Les premières étapes de notre projet ont démontré que cette approche était fonctionnelle nous devons maintenant étendre cette étude à des injections loco-régionale. Malheureusement, l’approche thérapeutique envisagée ne peut pas éviter un essai sur un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons une approche statistique qui nous a permis de définir que nous aurons besoin d'au moins 9 souris par groupe expérimental. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 10 souris par groupe maximum, pour les souris traitées sur un an ce nombre est légèrement augmenté pour pallier les pertes, nous aurons donc 12 souris soit au total 126 souris. En prenant en compte les souris pour l’élevage ce nombre atteint 222 souris.souris
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 5. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton. Les animaux seront hébergés seul lors de la procédure mais avec un double enrichissement (dôme et/ou roue). La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contentionà faible stress (mains en coupelles et tunnels). Les procédures seront réalsiées avec un protocole d'anesthésie et d'analgésie adaptées. Le modèle que nous allons utiliser a été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous connaissons l’âge d’apparition de signe de souffrance ou de détresse qui est très tardif. Nous allons étudier les animaux avant l’apparition des phénotypes. Les points limites nous permettront de limiter au strict minimum l’apparition de souffrance. Des approches thérapeutiques seront mises en places dès les premiers signes d'inconfort des animaux.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction des muscles squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leurs physiopathologies et de leurs causes génétiques. Afin d'étudier l'évolution naturelle de la pathologie, les animaux seront étudiés de l'âge de 1 mois jusqu'à l'âge de 12 mois.
rôle des miRNA des myofibres
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Chaque souris est immobilisée huit fois pour un test d'agrippement, gavée sept jours d'affilée à l'âge de huit mois, puis privée d'un quart de son volume sanguin juste avant d'être tuée. 288 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La lignée a été construite pour supprimer dès la naissance une protéine servant à fabriquer les micro-ARN dans les fibres musculaires, ce qui produit vers huit mois une faiblesse musculaire et une inflammation. Le porteur classe la contention, les gavages répétés et la ponction sanguine comme un "stress léger de courte durée", et renvoie l'apport pour l'humain à une meilleure compréhension future des myopathies inflammatoires.
Objectifs
Les micro-ARN (miRNA) sont de petites molécules qui régulent l'expression des gènes en empêchant certains ARN messagers de produire des protéines. Ils jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques, comme le développement et la réponse aux maladies. Dans le muscle squelettique, la quantité de micro-ARN (miRNA) change avec l'exercice physique et les maladies musculaires, suggérant qu'ils régulent les fonctions musculaires. Un modèle murin, où la protéine d’étude (nécessaire à la synthèse des miRNA : impliqués dans l'inactivation et la régulation de l'ARN) est supprimée à l'âge adulte, ne montre pas de réduction des miRNA. Notre équipe a créé un modèle où cette protéine est supprimée dès la naissance, réduisant fortement les miRNA dans les muscles dès 3 semaines. L'étude de la force musculaire, de la créatine kinase sanguine (marqueur de lésions musculaires) et de l'histologie musculaire chez ces souris nous aidera à comprendre le rôle de ces régulateurs dans la physiologie des muscles squelettiques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
L’absence de modèle animal viable présentant une diminution de la quantité de microARN (miRNA) dans la cellule musculaire squelettique a empêché l’étude du rôle des miRNA de la myofibre après la naissance. Notre équipe a pu mettre au point une lignée de souris chez qui l’expression de la protéine d’intérêt est éteinte dans la myofibre après la naissance. Nos données préliminaires ont montré que ces souris présentent une diminution importante de la quantité de miRNA dans les muscles squelettiques dès l’âge de 3 semaines, indiquant que ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des miRNA de la myofibre après la naissance. Ces souris d’études âgées de 3 semaines présentaient une force et une histologie musculaire semblable aux souris contrôles du même âge. Au cours de notre étude préliminaire, nous avions suivi un groupe de souris d’étude sur une période d’un an. La masse corporelle des souris d’étude était semblable à celle des souris contrôles pendant toute la durée du suivie. Entre deux et huit mois après la naissance, la force musculaire des souris contrôles avait augmentée de 15% alors que celle des souris d’étude était restée inchangée. Les analyses histologiques ont montré des infiltrats de cellules inflammatoires dans les muscles squelettiques et une internalisation du noyau des myofibres chez ces souris âgées de 8 mois. Ces données mettent en évidence que, après la naissance, les miRNA de la myofibre pourraient avoir un rôle dans le maintien de la structure de la myofibre et/ou un rôle anti-inflammatoire. L’étude des muscles des souris d’étude nous permettra de comprendre le rôle des miRNA de la cellule musculaire. En plus d’améliorer les connaissances sur la physiologie musculaire, ces données pourraient, à terme, améliorer la compréhension des maladies inflammatoires du muscle squelettique telles que les myopathies inflammatoires.
Procédures
La force musculaire des animaux sera mesurée tous les mois par test d’agrippement, soit 8 fois au long de la vie de l’animal, ce test nécessite une contention de 15 secondes pour l’identification de l’individu, la force de chaque animal sera mesurée en triplicat, soit une manipulation totale de 2 minutes par individu et par test. Les animaux seront gavés à l’âge de 8 mois pendant 7 jours, le gavage nécessite une contention de 30 secondes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis à un prélèvement sanguin. Cette procédure ne nécessite pas de contention de plus de 30 secondes. Le prélèvement sera réalisé une seule fois, via la veine temporale superficielle, juste avant la mise à mort des animaux, et représentera 25% de leur volume sanguin corporel.
Impact sur les animaux
Une étude préliminaire avait mis en évidence une faiblesse musculaire modérée chez les souris d’étude. A 8 mois, les souris seront gavées quotidiennement durant 7 jours. Le prélèvement sanguin au niveau de la veine temporale superficielle nécessite la contention de l'animal. Les actes sont effectués sur animal vigile, la contention génère un stress léger de courte durée, la répétition de gavages peut entrainer une irritation et le prélèvement sanguin peuvent générer un stress, ces actes sont donc considérés comme modérés.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Pour comprendre le rôle des miRNA de la myofibre dans la physiologie du muscle squelettique, le recours à un organisme entier est nécessaire. Le muscle squelettique est composé de plusieurs types de cellules, et pas uniquement de myofibre, et il n’existe actuellement aucun système in vitro qui permettrait de modéliser l’interaction entre la myofibre et les autres types cellulaires. L’utilisation d’un modèle in vivo est donc nécessaire.
Réduction
Le laboratoire a l'expertise nécessaire pour réaliser des expériences avec peu de souris, tout en garantissant des résultats fiables. Pour étudier le rôle des miRNA dans le développement musculaire après la naissance, nous comparerons des souris d’étude sans miRNA dans leurs muscles à des souris normales. Nous examinerons leur force musculaire, le taux de marqueur de dommage musculaire dans le sang et analyserons les muscles au microscope pour voir la taille des fibres musculaires et détecter des signes de dommage ou d'inflammation. Nous réaliserons aussi des analyses pour comprendre les changements au niveau moléculaire. Les souris seront étudiées à différentes étapes de leur développement : à 4 semaines, 2 mois et 8 mois. Nos études préliminaires ont montré une inflammation musculaire chez les souris d’étude, et cette inflammation varie entre les mâles et les femelles. Pour comparer correctement les mâles et les femelles, il faut assez de souris dans chaque groupe. Comme nos premières données montrent que l'absence de miRNA n'affecte que légèrement la force musculaire, nous aurons besoin de 48 souris par groupe (24 mâles et 24 femelles) pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Notre équipe maîtrise toutes les procédures expérimentales de ce projet. Le bien-être des souris sera constamment surveillé et toute souffrance ou angoisse sera immédiatement discutée avec les responsables du bien-être animal pour prendre des mesures correctives. La démarche des souris sera surveillée pour s'assurer qu'elles se déplacent normalement, sans boitement. Nous suivrons aussi leur posture, tonus, comportement, pelage et poids. Nos données préliminaires montrent que les souris d’étude âgées de 2 à 8 mois n'ont pas de difficultés à se déplacer, manger ou boire. Si la mobilité est affectée, de la nourriture en gel sera ajoutée dans la cage. Le traitement d’une semaine est bien toléré sans effets indésirables attendus. Les prélèvements sanguins, ne dépassant pas 25% du volume total, seront effectués juste avant la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Pour identifier le rôle des miRNA de la myofibre dans la physiologie musculaire, il est impossible d’utiliser des modèles cellulaires : seul un organisme entier permet d’évaluer la fonction musculaire et d’étudier les dialogues entre la myofibre et les autres types de cellules présents dans le muscle. Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. La souris présente un intérêt particulier du fait de sa facilité de manipulation, par exemple pour évaluer sa force musculaire, ainsi du fait de sa similarité avec l’Homme tant au niveau histologique qu’au niveau génétique (99% du génome commun avec l’Homme). Pour comprendre le rôle des miRNA dans la physiologie musculaire après la naissance, nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines à 8 mois. En effet, le développement post-natal de la souris se décompose en 3 phases : la souris jeune (4 semaines), la souris jeune adulte après la puberté (2 mois), et la souris adulte (8 mois). Les mêmes analyses seront réalisées à ces trois stades de développement de la souris.
Formations pratiques à la chirurgie et aux gestes techniques utilisés dans les procédures expérimentales
- Formation professionnelle
Rats : 130
Chirurgies de trois heures au maximum sur 150 animaux anesthésiés, prélèvements et administrations répétés jusqu'à trois fois sur 500 autres : 520 souris et 130 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sans réveil. Ces séances forment le personnel de l'animalerie aux gestes pratiqués en routine, une société extérieure intervenant pour la partie chirurgicale. L'argument avancé est que maîtriser ces gestes évite "un stress et une souffrance animale supplémentaires" et permet de "réduire le nombre d'animaux nécessaires", au prix de 650 animaux non-humains tués pour l'apprentissage. Le porteur précise que la mise à mort fait elle-même partie des gestes à acquérir, "dans le respect du bien-être animal".
Objectifs
Les personnes travaillant avec des animaux de laboratoire doivent maitriser des gestes techniques plus ou moins complexes : administrations, prélèvements, … Leur formation initiale doit parfois être complétée par une formation spécifique en chirurgie, en fonction des études qu’ils seront amenés à réaliser, et suivre un tutorat pour l’acquisition de gestes techniques ou maintenir leur compétence avec l’évolution des connaissances et pratiques. Le but de ce projet est d’acquérir de nouvelles techniques, notamment des techniques chirurgicales, se perfectionner ou de maintenir la maitrise des gestes techniques pratiqués en routine dans les animaleries expérimentales par le personnel utilisant des animaux à des fins scientifiques. Ces formations doivent lui donner les moyens d’optimiser les procédures expérimentales en évitant un stress et une souffrance animale supplémentaires liés à une non maitrise du geste technique et ainsi, réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nous ferons appel à une société extérieure pour la réalisation des sessions de formation de chirurgie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont, à l’issue de la formation, l’acquisition de nouvelles compétences, une maitrise des gestes techniques utilisés en routine ou des gestes chirurgicaux par les utilisateurs de l’animalerie et un maintien accru des compétences.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - des procédures chirurgicales sur animal anesthésié (150 animaux, 3h au maximum) ; - des prélèvements ou administrations sur animal vigile ou anesthésié (500 animaux, quelques secondes à 30 minutes). Chaque geste simple pourra être réalisé 3 fois au maximum, et ce avec au moins deux jours d’intervalle entre chaque geste.
Impact sur les animaux
Une infection peut apparaitre pour tout acte avec une piqure Des saignements peuvent être observés pendant quelques minutes lors des chirurgies ou des prélèvements. Un stress ou une douleur peut être occasionné par un geste non maitrisé. Détresse respiratoire, hypothermie ou hémorragie peuvent être observées lors d’anesthésie et chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des sessions de formation. L’euthanasie fait partie des gestes à acquérir dans le respect du bien-être animal.
Remplacement
La formation aux gestes techniques du personnel travaillant avec des animaux utilisés à des fins scientifiques nécessite de se former sur animaux vivants. Cet apprentissage nécessite de le faire la première fois en présence de personne experte et ayant une excellente maitrise de la technique. Cependant, à chaque fois qu’il sera possible, les stagiaires auront accès soit à des vidéos soit à des systèmes d’entrainement sans animaux vivant. Si les gestes techniques de base peuvent être enseignés et appris sur des systèmes inertes d’entrainement, la mise en condition réelle sur le modèle animal reste essentielle pour l’apprentissage du maintien de l’animal, la mise en place et la gestion du matériel, la dissection des tissus vivants et la gestion des mouvements. La mise en condition sur modèle animal est donc d’une aide fondamentale dans l’apprentissage des conditions réelles d’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Pour la formation pratique, il n’existe pas de méthode de substitution, qui pourraient restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux et/ou la manipulation des tissus vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires aux formations en chirurgie expérimentale et pour la formation du personnel aux gestes techniques a été estimé à minima pour permettre la maitrise des gestes. Seuls les animaux nécessaires seront utilisés, si le personnel et les étudiants en formation acquièrent rapidement les gestes techniques, le nombre total d’animaux utilisés sur 5 ans sera réduit d’autant. La majorité des rongeurs utilisés seront des animaux surnuméraires issus des élevages de l’établissement utilisateur.
Raffinement
Les animaux utilisés pour l’apprentissage de gestes simples ou lors des travaux pratiques de chirurgie seront anesthésiés selon des méthodes appropriées et maitrisées par les formateurs. En fonction des gestes réalisés lors des sessions de tutorat et systématiquement pour les gestes chirurgicaux, une analgésie sera réalisée ainsi qu’une anesthésie locale. Le protocole d’anesthésie sera décidé par le vétérinaire formateur en chirurgie expérimentale ou par le tuteur qui a l’expérience de l’anesthésie la plus adaptée au geste réalisé. Les animaux sont maintenus sur un tapis chauffant tout au long de la chirurgie. Pour la formation chirurgicale, les procédures seront réalisées sans réveil des animaux. Pour les animaux utilisés pour l’acquisition de gestes techniques simples, ils pourront être utilisés plusieurs fois si nécessaire, mais pas plus de trois fois par geste, avec un temps de récupération de 2 jours minimum entre chaque session d’apprentissage. Certains gestes peuvent être réalisés sur animaux vigiles. Après réalisation des gestes, ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bon état général et tout geste potentiellement stressant sera réalisé sous anesthésie générale afin de préserver le bien-être animal et celui du personnel apprenant. Les procédures sont toujours réalisées sous la supervision de personnel ayant la maitrise des gestes. Enfin, la définition de points limites permettra de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Ces formations sont destinées au personnel de l’établissement utilisateur travaillant sur le modèle souris et le modèle rat (bien que plus rarement utilisé). Les gestes techniques seront réalisés, si possible sur des animaux de même espèce/souche/sexe/âge que ceux prévus pour les projets nécessitant des gestes techniques ou de la chirurgie expérimentale.