Souris
Approche de thérapie génique dans le modèle murin de la leucodystrophie métachromatique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une injection intraveineuse pratiquée à proximité de l'œil, avec un risque d'hémorragie ou d'atteinte oculaire, puis jusqu'à sept prises de sang mensuelles sous anesthésie générale : une partie des 1 350 souris de ce projet suit ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les autres servent à l'élevage de la lignée et sont prélevées d'un bout de queue entre sept et dix jours pour génotypage. Il s'agit de tester une thérapie génique contre la leucodystrophie métachromatique, une atteinte grave de la gaine de myéline. Le porteur indique que les souris développent le phénotype dommageable à partir de dix-huit mois et qu'il ne le prend pas en compte puisque toutes seront tuées avant cet âge, celles de bon génotype qui échappent à ce projet passant dans d'autres travaux du laboratoire.
Objectifs
L’objectif du projet sera d'établir un élevage de souris d’une lignée modèle d’une atteinte grave de la gaine de myeline (leucodystrophie métachromatique) pour ensuite évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique sur cette pathologie chez ces animaux modèles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet sera d’établir la preuve de concept de l’efficacité de nouvelles thérapies pour la leucodystrophie métachromatique afin de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l’Homme et un essai de phase I/II (environ 150 patients par an en France).
Procédures
Dans le cadre de l’élevage pour obtenir nos lots expérimentaux il sera nécessaire de réaliser un prélèvement de l’extrémité de la queue une fois sur animal vigile entre 7 et 10 jours d’âge (durée 1 minute par animal environ), pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux. – Une partie des animaux auront une injection intraveineuse (durée 5 min) sous anesthésie générale suivie de prises de sang mensuelles sous anesthésie générale (maximum 7 et durée 2 minutes) associée à une injection sous cutanée de sérum physiologique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage - un risque cardio-respiratoire et hypothermique pris en charge durant l’anesthésie - Légère douleur pour la prise de sang (picotement) - un stress de l'animal lors des contentions. - Une légère douleur liée à la piqure de l’aiguille suite à l’injection intraveineuse (durée 5 mn, sous anesthésie générale) – un risque rare d’hémorragie ou d’atteinte oculaire ou d’infection suite à l’injection intraveineuse réalisée à proximité de l’oeil . Les animaux développent un phénotype dommageable à partir de 18 mois mais non considéré ici puisqu'ils seront tous euthanasié avant cet âge.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux injectés seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité. Les animaux d’élevage seront maintenus au cours du projet jusqu’à l’âge de 8 mois maximum. Les animaux non porteurs des genotypes d’intérêt seront euthanasié. Les autres animaux de génotype souhaité seront en utilisation continue dans nos autres projets de recherche.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier la biodistribution et l’expression des thérapie génique dans l’ensemble de l’organisme. Cet organisme doit être comparable à la complexité que l’on retrouve chez l’Homme. Choisir la souris et notamment le modèle murin de la pathologie permet de collecter des données cruciales avant de passer chez le gros animal puis l’Homme pour application clinique.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 15 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 1350 souris sera produit au cours de ce projet pour nos permettre d’évaluer l’effet thérapeutique de notre approche, de renouveler nos reproducteurs et de générer les animaux pour nos autres projets de recherche.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation.. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture (adaptée à leur stade physiologique) à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement réglementaire adapté à l’espèce. Les animaux d’etude seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) avec des maisonnettes rajoutées dans ce cas en plus de l’enrichissement classique. Pour l’élevage, nos souris seront en trio. L’injection intraveineuse et les prises de sang sont faites sous anesthésie pour éviter tout stress de l’animal. Au moment de l'euthanasie, un sédatif sera administré à l'animal avant d'injecter le composé euthanasiant. La lignée peut présenter un phénotype dommageable mais nos animaux seront euthanasiés avant sa manifestation. Une période d'acclimatation de 7 jours est réalisée pour les animaux provenant d'élevage extérieur.
Choix des espèces
Nous utilisons pour ce projet le modèle de souris génétiquement modifiées qui reproduit le phénotype présent chez l’Homme et nous permet donc d’évaluer l’effet thérapeutique de notre approche. Pour l’élevage, les animaux seront mis en accouplement à partir de l’âge de 2 mois environ jusqu’à l’âge de 8 mois. Les petits produits seront prélevés d’un fragment de queue à l’âge de 7 à 10 jours pour connaitre leur patrimoine génétique. Pour l’évaluation de notre thérapie génique, les souris sont utilisées à partir de l’âge de 6 mois minimum et jusqu’à l’âge de 15 mois maximum. A cet âge les animaux présentent des atteintes tissulaires au niveau du cerveau, ceci nous permettant de suivre l’efficacité de notre thérapie à différents stades de la progression de la pathologie chez notre modèle de souris.
Élevage de lignées murines permettant l’exploration du développement du cerveau.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tuées si leur génotype n'est pas celui attendu, ou une fois qu'elles ont servi à la reproduction, les souris de cet élevage qui portent le bon génotype partent vers d'autres projets. 30 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né est maintenu une minute pendant qu'on lui tatoue un ou deux coussinets et qu'on lui prélève un bout de queue, et des mâles peuvent être hébergés seuls jusqu'à trois semaines. Le porteur justifie l'effectif en une phrase, indiquant que les accouplements ont été calculés d'après ses expériences antérieures pour produire un nombre suffisant d'animaux, sans autre élément sur ces 30 600 individus.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent la formation du cortex cérébral dans le contexte normal mais aussi pathologique. L’utilisation de modèles souris génétiquement modifiées nous aident à mieux caractériser notamment les mécanismes de génération, de migration et de mise en place de l’identité cellulaire des différents types neuronaux.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’augmenter la connaissance scientifique sur la formation du cerveau en condition normale ou pathologique.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle un ou deux coussinet des pattes seront tatoués et une biopsie de queue sera prélevée. Des mâles pourront être hébergés individuellement pendant un maximum de 3 semaines.
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une légère souffrance chez l’animal. L’hébergement individuel des mâles peut entrainer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure si leur génotype n'est pas celui attendu ou après accouplement, les autres seront utilisés dans des projets scientifiques.
Remplacement
Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent pas être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon nos expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien à nos expériences.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social tout au long de leur vie. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien ré-acceptés par leur mère.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le developpement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme.
Traitement d’une maladie auto-immune des reins dûe à la production anormale d’anticorps par des thérapies ciblées.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
Pour tester des traitements contre la maladie de Berger, une atteinte rénale auto-immune, 372 souris porteuses de gènes humains qui la déclenchent vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang dans la veine de la joue et des prélèvements d'urine deux fois par mois, des injections dans la veine de la queue chaque semaine pendant un mois puis chaque mois pendant six mois, un gavage par sonde gastrique, et pour une partie d'entre elles une biopsie du rein. Le porteur écrit que la maladie de Berger n'entraîne aucune nuisance, alors qu'il décrit des souris accumulant des anticorps dans les reins, avec du sang et des protéines dans les urines dès douze semaines. Toutes sont tuées pour analyser l'inflammation rénale, et il précise que l'industrie pharmaceutique a sollicité son laboratoire pour ces études.
Objectifs
Nous disposons d'un modèle unique dans le monde, le modèle de souris avec des gènes humains exprimant des anticorps spécifiques et un récepteur pour les anticorps spécifiques. Ces souris développent une maladie auto-immune rénale (c'est à dire qui résulte d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s'attaquer à l'organisme) et ainsi cause l'accumulation anormale des anticorps dans les reins avec de la protéinurie (présence de protéines dans les urines) et d'hématurie (présence de sang dans les urines) à partir de 12 semaines. Comme il n'existe pas de traitement curatif pour cette maladie, notre laboratoire cherche à développer des nouveaux traitements. Nous avons généré cinq anticorps anti-inflammatoires et l'industrie pharmaceutique nous a sollicité pour des études sur l'animal basées sur nos recherches précèdentes . En effet, nous avons démontré une belle efficacité d'une enzyme, une protéine capable de couper les anticorps et ainsi réduire l'inflammation liée à la maladie. Le problème était que comme il s'agit d'une protéine d'origine bactérienne, il y a une réponse immunitaire contre cette enzyme , des anticorps anti-enzymes bloquant son activité. L'objectif de notre étude est de traiter les souris exprimant la maladie avec les anticorps anti-inflammatoires, des ARN messagers (molécule capable d'induire la production d'une protéase qui est une enzyme (=protéine) capable de cliver les anticorps responsable de la maladie) ou avec des nanoparticules (particules de petite taille) permettant d'induire une tolérance au traitement avec la protéase recombinante d'origine bactérienne. Ces traitements sont bien tolérés sans aucun dommage chez la souris (résultats obtenus au laboratoire). L'objectif est d'évaluer l'action de ces traitements sur les anticorps circulants, sur les dépôts rénauxd'anticorps, l'inflammation tissulaire rénale et sur la protéinurie.
Bénéfices attendus
La néphropathie (ou maladie de Berger) est l'une des premières causes d'insuffisance rénale en France et dans le monde. Cette maladie est causée par une accumulation anormale d'anticorps dans les reins. Il n'existe actuellement pas de traitement spécifique de cette maladie, les patients n'ont que des traitements de suppléance (dialyse, greffe). Le développement d'un traitement pourrait éliminer la cause de la maladie et ainsi pouvoir proposer un traitement curatif. Les traitements proposés chez les souris qui développent la maladie seront une étape pré-clinique cruciale avant le passage à l'homme pour des essais cliniques.
Procédures
Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les anticorps anti-inflammatoires : les souris seront soumises à des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (deux fois par mois). Des prélèvements d'urines (2 fois par mois) les prélèvements seront faits sur animaux non anesthésiés, lors de la contention de la souris, la miction est en général spontanée . Des injections d'anticorps par voie intraveineuse (une fois par semaine pendant 1 mois) seront faites principalement par la veine caudale qui est située sur la queue de l'animal. Le gavage par une sonde gastrique (1 fois par mois pendant 1 mois). Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les ARNmessagers (ARNm) : les souris seront soumises à des injections d'ARNm (une molécule retrouvée dans toutes les cellules qui sera traduite en protéine) principalement par la veine caudale (veine sur la queue) une fois par semaine pendant un mois puis une fois par mois pendant 6 mois. Les prélèvements de sang (au niveau de la veine de la joue) se feront à J0 puis une fois par mois pendant 6 mois, en même temps que les urines. Afin d'évaluer la traitement de la maladie par les nanoparticules : les souris seront soumises à des injections par voie intraveineuse (veine de la queue) 3 fois pendant 1 mois puis à des prélèvements sanguins et d'urines à J0, J1 et J7. De plus, une fois la dose et la voie optimale de traitement déterminée pour les anticorps et l'ARNm, une biopsie rénale sera faite avant traitement sur un petit groupe de souris afin de confirmer définitivement l'efficacité du traitement à la dose optimale.
Impact sur les animaux
Les traitements donnés sont très bien tolérés et bénéfiques pour cette maladie de Berger. Les seules nuisances attendues sont celles liées à la biopsie rénale, aux injections intraveineuse des produits, au gavage et aux prélèvements de sanguins et d'urines. Ceux-ci pourraient occasionner un stress et un inconfort pour la souris de courte durée lors de la contention et de l'injection et de quelques jours pour la biopsie. Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger.
Devenir
A l'issue de chaque traitement, les animaux seront euthanasiés et des analyses complementaires seront réalisées au niveau des reins afin d'évaluer l'inflammation rénale.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un organe en entier dans le cas du developpement de la nephropathie. Le travail à l'échelle de l'organisme en entier est nécessaire, compte tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire et de la fonction rénale. Il est indispensable de travailler sur l'organisme entier, vivant et proche de l'homme pour pouvoir ensuite envisager un traitement curatif chez l'homme.
Réduction
Nous avons estimé qu'il faudra 6 animaux par groupe afin obtenir des résultats statistiquement exploitables et mener à bien notre projet. En effet, nos expériences précèdentes nous ont permis de préciser ce nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Dans le but de répondre à la loi des 3R (Raffiner) et dans un souci de bien-être animal de l'enrichissement (coton, Kraft, tunnels) sera mis en place pour les animaux tout au long de l'expérience pour que les animaux puissent faire des nids. Les souris sont placées sur des portoirs ventilés par groupe de 5 individus. La température, l'hygrométrie , la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours par le personnel technique. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour anticiper toute douleur ou angoisse infligée aux animaux. Les gestes experimentaux seront effectués par une personne compétente. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés 1 fois par semaine par l'expérimentateur ( état général, comportement et pesées). Un analgésique sera administré si l'état de l'animal le nécessite et toutes les 12heures et de façon systématique pendant 3 jours après chirurgie. Si l'animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour développer la maladie de Berger car elle n'exprime pas la maladie, ce qui permet après transgénese c'est à dire la fait d'incorporer des gènes humains dans son génome d'induire et d'exprimer cette maladie en question chez ces souris transgéniques. De plus, son comportement et sa génétique sont largement connus ce qui nous permet une meilleure évaluation et prise en charge de son bien-être tout au long du projet. Il est donc indispensable pour nous d'utiliser ce modèle de souris transgéniques exprimant la maladie pour évaluer l'action et l'efficacité des traitements que nous proposons. A 12 semaines d'âge car c'est à cet âge là que les souris développent la maladie rénale.
Elevage de souris modèles de la maladie de Charcot
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses de mutations qui provoquent la maladie de Charcot, deux lignées de souris sont élevées pour fournir des lots à deux autres projets déjà autorisés. 375 souris à phénotype dommageable vont être utilisées sur trois ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réduites pour l'essentiel à une biopsie de queue pour génotypage. Le porteur décrit la maladie comme paralysante, incurable et fatale, et indique que les animaux partent vers le site utilisateur à 70 ou 90 jours, avant les premiers signes moteurs, le stade terminal survenant à 170 jours pour la première lignée. Les souris qui n'ont pas le génotype attendu seront tuées, tout en pouvant servir d'animaux de compagnie aux autres pour éviter les cages solitaires.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière, responsables de la contraction des muscles striés. Environ 7000 patients en France sont touchés par la maladie de Charcot. La maladie commence généralement entre 50 et 70 ans avec une faiblesse musculaire qui évolue rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire entrainant le décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Les modèles de souris de la maladie de Charcot permettent d’explorer des pistes thérapeutiques. Notre objectif est d’élever deux lignées de souris génétiquement modifiées présentant une diminution de leur capacités motrices. Les animaux sont produits dans le but de répondre à des objectifs scientifiques centrés sur deux modèles d’étude complémentaires de la maladie de Charcot. La production des animaux a pour objectif de constituer des lots expérimentaux pour deux projets déjà validés par le ministère de l’enseignement, de la recherche et de l’innovation. Cette présente demande d’autorisation de projet élevage permet de faire suite à la précédente et nous permettra d’assurer une continuité d’élevage. Les lots expérimentaux sont produits pour répondre à deux études thérapeutiques des deux projets connexes. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Nous avons fixé une durée du projet de 3 années pour correspondre aux projets connexes. Ces souris porteuses de mutation causant la maladie de Charcot, issues de cet élevage, sont transférées à l’établissement utilisateur avant l’apparition des symptômes, puis sont incluses dans le cadre des projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
L’élevage de deux modèles génétiques différents de la maladie permettra à terme d'évaluer deux approches thérapeutiques ciblant deux mécanismes distincts lorsque les souris seront utilisées en étude dans le cadre d'un autre projet. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux contextes génétiques différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet. L’élevage sur un site de deux lignées de souris porteuses d'une mutation causant la maladie de Charcot pour générer des lots expérimentaux qui sont étudiés sur un autre site utilisateur permet d’optimiser les espaces des sites utilisateurs. Le maintien de ces deux lignées sur deux sites permet également de réduire tout risque de perte d’une lignée et donc éviter de devoir générer des animaux en plus pour reconstituer une colonie. Les souris porteuses de la mutation (environ 50% de chaque descendance) sont transférées à un âge où aucun symptôme ne se déclare. La gestion du phénotype dommageable sur le second site se fait donc avec un personnel et un cadre spécifique au suivi de ce phénotype.
Procédures
Les animaux des deux lignées décrites seront transférés sur le deuxième site d’expérimentation avant l’apparition du phénotype dommageable. Cependant un suivi quotidien par équipe de zootechnie permet de rendre compte de tout signe lié à la pathologie qui pourrait se manifester de manière inhabituelle : tels que la boiterie d’un membre postérieur chez un premier modèle de la maladie de Charcot ou les tremblements d’un membre postérieur chez le deuxième modèle de la maladie. En examinant rétrospectivement les autorisations précédentes aucun problème lié à la pathologie n’a été signalé dans le délai de transfert que nous proposons. La biopsie pour le génotypage ne prend que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable et fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien phénotypés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation des 3Rs. Le transfert des animaux du site d’élevage se fait à un stade qui exclut toute déclaration de premiers signes moteurs chez les deux lignées. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées est la diminution sélective des capacités motrices. Ces modèles présentent donc une atteinte motrice variable. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.
Devenir
Les individus sont produits uniquement à des fins d’élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans d’une utilisation continue sur un autre site. Les animaux qui ne sont pas du bon génotype ou encore des animaux qui ont atteint un point limite seront euthanasiés.
Remplacement
L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre les neurones moteurs touchés dans la maladie et d’autres types cellulaires qui peuvent être très distants. Une telle interaction se met en place durant des mois et implique de nombreux autres types cellulaires autres que ceux ciblés ici. Notre premier objectif est de développer une approche thérapeutique utilisant des anticorps (immunothérapie) ciblant cette population de globules blancs. L’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle intégratif physiologique complet que seul l’animal offre. La barrière hémato-encéphalique et les méninges, qui sont les lieux où s’effectuent des échanges entre les cellules du système immunitaire et le système nerveux, illustrent la complexité de cette physiologie que l’on ne peut récapituler pleinement in vitro. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique vers la clinique. Notre second objectif est d’explorer une approche thérapeutique ciblant certaines populations de cellules du cervelet. Ces réseaux neuronaux très distants entre la moelle épinière et le cervelet ne peuvent pas être mimés in vitro. Seuls les modèles expérimentaux mammifères présentent la diversité des interactions dynamiques et plastiques entre ces différentes populations de cellules. Les modèles souris de la maladie de Charcot sont donc les seuls modèles qui permettent d’explorer le potentiel thérapeutique des interactions aussi distantes qui peuvent exister dans cette pathologie. La validation d’une approche thérapeutique ciblant des interactions aussi distantes nécessite des modèles animaux. Cependant, afin d’explorer la pertinence des cibles thérapeutiques, nous développons des systèmes de co-cultures in vitro entre les cellules immunitaires et les neurones moteurs purifiés ainsi que des cultures organotypiques du cervelet.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 3 années, un nombre total de 375 souris avec phénotype dommageable. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la maladie de Charcot chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement. Afin de minimiser le nombre d’animaux, les animaux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. La stratégie d’élevage que nous avons permet de produire le juste nombre d’animaux qui répond aux besoins de réduction précédemment validées dans les saisines connexes à cette demande. Nous avons suffisamment de recul sur la gestion des animaux pour assurer une production de lots expérimentaux définis sur le site d’élevage. Nous utilisons également pour nos lots expérimentaux des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’élevage est éviter que le phénotype dommageable survienne lors de l’élevage. Les animaux sont transférés bien avant la possible apparition de premiers signes moteurs. De façon rétrospectives avec nos précédents élevages aucun phénotype dommageable n’a pu être signalé en suivant l’âge limite pour lequel les animaux sont systématiquement transférés sur le second site utilisateur. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur, d’infection et de déambulation anormale compte tenu de l’âge est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. L’utilisation de mâles pour la reproduction permet d’avoir des portées plus robustes, plus nombreuses et de réduire de potentielles faiblesses car les femelles transgéniques sont connues commle étant de mauvaises reproductrices. Les animaux qui n'ont pas le génotype attendu pourront toujours servir d'animaux compagnons pour éviter tout animal isolé.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats : début précoce ou tardif, progression lente ou rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. Nous évaluons deux protocoles thérapeutiques ciblant deux cibles cellulaires distinctes. Le protocole d’immunothérapie et de thérapie génique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie thérapeutique. La complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et des réseaux neuronaux distants et requiert un modèle mammifère à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Les modèles de souris de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits dans la littérature. Les souris sont élevées sur le premier site puis transférées avant l’apparition des symptômes sur un deuxième site où elles seront prises en charge pour l’expérimentation. Pour le premier modèle le début de la maladie se situe à 110 j et le stade terminal à 170 j. Les souris sont transférées à l’âge de 70 j. Pour le deuxième modèle, un défaut de réponse à une sollicitation motrice est détectable à 60 j, mais à cet âge les souris ne présentent pas de défauts moteurs spontanés et prennent plus de poids que les souris contrôles (+15%). A partir de 290 j, stade où des tremblements des pattes postérieures sont présents, c’est le stade symptomatique. La survie des souris n’est pas altérée. Ces souris sont transférées du site d’élevage à l’âge de 90 j vers le site d’expérimentation dans le cadre de l’utilisation continue.
Enregistrement et contrôle optogenetique des activités neuronales néonatales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
276 souris vont être utilisées, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : chaque nouveau-né, âgé de trois à six jours, subit une chirurgie du cerveau de trente minutes pour la pose d'électrodes et d'une barre de tête, puis deux heures d'enregistrement pendant son sommeil. En amont, les mères gestantes sont opérées de l'abdomen pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne. Le porteur range parmi les effets indésirables la douleur, le stress et la faim des nouveau-nés, et le stress ou la douleur des femelles. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour localiser les électrodes, l'apport annoncé étant de servir de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.
Objectifs
Après la mise en place des neurones de l'embryon, le cerveau subit un processus de maturation spécifique impliquant des activités spontanées,ne dépendant pas de stimuli externes à l’individu. Chez l’homme ce processus de maturation se met en place lors du 3e trimestre de grossesse, chez le rongeur, lors des deux premières semaines Post-Natales (PN). Ces activités néonatales (ANs), orchestrées par une catégorie spécifique de neurones, jouent un rôle important dans la mise en place des circuits du cérébraux et leurs fonctions ultérieures. Cependant les mécanismes impliqués sont encore mal connus et sont sujets à controverse. Cette question est d’autant plus importante qu’il existe des pathologies neurologiques graves avec retard mental et épilepsies affectant les enfants dès la naissance. Or, une majorité de ces pathologies affectent de façon directe ou indirecte la classe de neurones qui orchestrent ces ANs. Notre but est donc de comprendre, pendant la première semaine de vie comment s'organise l'activité de ces neurones chez la souris en développement et de comprendre quelle est leur influence sur la mise en place des circuits. Pour ce faire, nous utilisons une technique de biologie moléculaire qui nous permet d'activer ces neurones à la demande par la lumière lors des enregistrements de l'activité cérébrale de la souris nouveau-née en sommeil.
Bénéfices attendus
Pour mieux comprendre comment, dans la période qui entoure la naissance, le cerveau se prépare aux premières expériences sensorielles, il est important de déterminer le rôle respectif des grandes classes de neurones dans la maturation du cerveau et de ses circuits. La théorie en vigueur sur l'action d'une certaine classe neurones (neurones inhibiteurs) à ces âges précoces est de plus en plus remise en cause, ce qui nous interroge sur les mécanismes fondamentaux du développement du cerveau. Or, des dysfonctionnements de cette même classe de neurones sont impliqués dans un tres grand nombre de troubles neurologiques infantiles (troubles du spectre autistique, épilepsies, retard mental). En déterminant la fonction de cette classe de neurones lors du développement du cerveau sain, cette étude servira donc de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.
Procédures
Un groupe de souris gestantes, porteuses des embryons à traiter, subira une chirurgie abdominale sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Leurs embryons, sous l'influence de ces traitements, subiront une injection intracrânienne. Après la naissance ces animaux subiront une chirurgie du cerveau (30 minutes) afin de préparer le placement d'électrodes et d'une barre de tête. Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Une demi-heure plus tard, toujours sous analgésie, l'activité cérébrale sera enregistrée pour un maximum de 2h alors que la souris nouveau-née dort.
Impact sur les animaux
La chirurgie des nouveau-nés peut avoir des effets indésirables, tels qu'une douleur, un stress ou la faim. La chirurgie des souris gestantes peut induire du stress ou de la de la douleur.
Devenir
Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem pour prendre des images des structures cérébrales et reveler la localisation des electrodes.
Remplacement
L'étude des activités neuronales dans la periode de la naissance nécessite l'observation de systèmes neuronaux intacts, en phase de sommeil lent et d'être correlés aux activités motrices de l'individu (contractions spontanées ou sursauts physiologiques du nourisson). Il est donc impossible de la réaliser sur un modèle informatique ou les modèles récents d'alternative à l'experimentation animale (s cellules souches). La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles). A ce jour, aucune étude n'a été faite pour enregistrer et manipuler par électrophysiologie et optogénétique l’activité cérébrale des souris nouveau-nées. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles transgéniques qui nous intéressent ne sont disponibles que chez la souris. La souris présente aussi davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale et la facilité d'élevage.
Réduction
Les chirurgies sont réalisées sous anesthesie gaseuse, locale et sous analgésie pour réduire au minimum la souffrance potentielle causée par ces procédures. Les enregistrements des nouveaux-nés sont ausi faits sous analgésie. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet d’enregistrer un grand nombre de neurones, sur de multiples sites simultanément. Ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont preparés par petites series de 4 ou 5 (une portée à la fois) et les resultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procedure s'arretant des que le nombre d'animaux requis est atteint. Nous utilisons à la fois des males et des femelles. Le nombre d'animaux à utiliser a été déterminé par calculs statistiques (calculs de puissance) établis sur la base de données publiées par notre groupe et d'autres laboratoires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie conventionnelle (température, luminosité, cycle jour-nuit et hygrométrie contrôlée) avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’hébergement respecte les groupes sociaux. Les animaux font l'objet d'un suivi quotidien par les expérimentateurs et les zootechniciens, et leurs conditions d'hébergement sont enrichies (matériaux pour nidification, tunnels, dômes). Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué réguliérement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Nous procédons à un suivi post-opératoire lors duquel le bien être des animaux est évalué et traité (anesthésie et analgésie appropriée). Les nouveau-nés, sont maintenus en condition proche de celles de la portée, (maintien de la température corporelle, contension légère avec du cotton , nourrissage de lait maternisé).
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser les pathologies neurologiques du développement, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilite d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liée aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). Ceci nous permet d'apporter des connaissances complémentaires à la communauté scientifique et permet une reproduction idéale des résultats. Enfin, les patrons électrophysiologiques des souris nouveau-nées sont fortement similaires à ceux observés chez l'enfant prématuré et le nourrisson. Les souris sont étudiées entre 3 et 6 jours post-nataux, inclus.
Recherche de nouveaux traitements pour l’insuffisance cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une pompe micro-osmotique implantée sous la peau diffuse en continu la substance qui provoque l'hypertrophie du cœur, et une souris sur cinq meurt subitement avant la fin du protocole. 3 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec deux échocardiographies sous anesthésie et des injections quotidiennes pendant quatorze jours. Le porteur indique que ces souris ne présentent pas de signes liés à l'hypertrophie, tout en reconnaissant un taux de mortalité élevé par mort subite qu'il déclare impossible à anticiper ou à empêcher. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever le cœur et le sang.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une maladie qui affecte plus d’un million de personnes en France avec un taux de mortalité élevé. Quelle que soit l’origine de l’insuffisance cardiaque (hypertension, vieillissement…), cette dernière est associée à une altération du muscle cardiaque nottamment à cause du développement d'une fibrose cardiaque. Dans le contexte du vieillissement et de l’hypertension artérielle, il existe une augmentation de la masse cardiaque, nommée hypertrophie cardiaque. Ce remodelage hypertrophique est à la source de différentes formes d’insuffisance cardiaque très prévalentes chez les sujets les plus âgés et pourtant sans aucun traitement spécifique. En effet, il n’existe actuellement aucune stratégie thérapeutique anti-fibrotique efficace qui pourrait compléter les traitements actuels pour l’insuffisance cardiaque. Il a été démontré q'une nouvelle population de cellules résidant dans le coeur serait capable de participer à la fibrose en réponse à un stress hypertrophique. Ces cellules expriment à leur surface des récepteurs impliqués dans la fibrose, il y aurait donc interet à les cibler. Les enjeux scientifiques sont donc maintenant d'obtenir des inhibiteurs de ces récepteurs et de tester leur capacité à empecher le developpement de la fibrose cardiaque. Ce projet sera considéré comme un début de programme de développement pré-clinique pouvant soutenir le passage ultérieur chez l'homme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le bénéfice d'une nouvelle approche thérapeutique qui pourrait empecher le développement de la fibrose cardiaque. A terme, ceci conduira à développer des nouveaux traitements pour lutter contre le développement de l’insuffisance cardiaque, une pathologie qui touchent des millions de patients et qui impacte fortement leur qualité de vie au quotidien.
Procédures
Dans un premier temps, réaliser une échocardiographie sous anesthésie générale durant 10 minutes sur tous les animaux afin de mesurer la fonction cardiaque de base. Dans un second temps, implanter une pompe micro-osmotique en sous cutanée pour tous les animaux et sous anesthésie générale, cette intervention dure environ 5 minutes. Injecter le traitement quotidiennement en intrapéritonéal ou bien l'administrer par voie orale pendant 14 jours. A la fin de l'expérience, réaliser une deuxième échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque. Ce geste sera réalisé sur l’ensemble des animaux sous anesthésie générale. Le coeur sera prélevé après mise à mort sous anesthésie profonde pour une étude histologique et moléculaire.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à l’expérimentation, principalement l’inconfort lié à la préhension des animaux et la douleur au point d’injection. Il y a également les effets indérisables liés à la chirurgie (pompes micro-osmotiques) et au stress lié à l’induction de la fibrose. De meme, les souris ne présentent pas des signes liés à l'hypertrophie mais le taux de mortalité est elevé. il s'agit d'une mort subite, qui est impossible à anticiper ou à empecher cette mortalité. L’échocardiographie est un examen non invasive et indolore, cependant, l'isoflurane pourrait induire un stress.
Devenir
A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal sous anesthésie générale et sous couverture analgésique (imagerie échocardiographie, implantation des pompes micro-osmotiques, injection du traitement en intrapéritonéal) tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie profonde dans le but de prélever le coeur et le sang pour différents types d'analyse.
Remplacement
Les molécules à étudier ont fait l’objet de tests prélimaires in vitro qui nous ont permis d’identifier les cibles thérapeutiques impliquées dans l’hypertrophie et d’évaluer la puissance des inhibiteurs dans des tests d’activation cellulaire. Notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo en raison d’une approche physiopathologique du système cardiovasculaire intégrée sur animal entier. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques
Réduction
La physiopathologie ainsi que la cinétique du modèle (hypertrophie) sont bien connues et ont été bien étudiées ce qui permet de mieux définir la durée des expériences et éviter la mise à mort des animaux à différents temps après la chirurgie. Le nombre d'animaux nécessaire a été défini en fonction du type d’analyses nécessaires pour tester l’efficacité des traitements et nous avons pris en compte la mortalité des souris hypertrophiées (20%) durant le protocole de telle sorte que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur l'efficacité de nos approches thérapeutiques. Les données seront analysées avec des tests statistiques non paramétriques. Les analyses sont généralement réalisées avec un nombre minimal de 6 animaux survivants par groupe. Les méthodes d'imagerie qui seront utilisées étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours du temps (J0 et J+14) et les paramètres étudiés seront mesurés chez le même animal.
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associée à une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La recherche clinique sur l’hypertrophie chez l’homme est limitée pour des raisons éthiques, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est devenu indispensable pour élucider les mécanismes mis en jeu. La souris est un modèle de choix, la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. Les mêmes populations de cellules souches sont présentes. Des souris jeunes adultes (agées de 8 à 12 semaines) car leur système cardiovasculaire est bien developpé.
Etude des effets de 25 à 100 composés sur le traitement de la dermatite atopique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Vingt-cinq à cent composés seront criblés en cinq ans par un laboratoire de dermatologie qui vient d'en évaluer 58 sur la période précédente, dont huit sont passés en essais cliniques. 1 400 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le dos rasé sous anesthésie, 1 200 d'entre elles reçoivent vingt-deux applications d'un agent chimique sur quarante-deux jours pour déclencher une dermatite atopique, avec inflammation, œdème, grattage et sécheresse cutanée, puis toutes sont traitées quotidiennement pendant sept jours et placées vingt minutes dans un dispositif qui compte leurs grattages. Un prélèvement de sang précède la mise à mort, et le tri des composés les plus efficaces pour un développement chez l'être humain constitue la finalité déclarée du projet.
Objectifs
Les recherches que nous menons dans le domaine de la Dermatologie contribuent à développer de nouveaux produits permettant le traitement de pathologies telles que l’inflammation cutanée, la cicatrisation, le psoriasis et la dermatite atopique. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans est d’étudier les effets de 25 à 100 nouveaux composés, composés naturels ou non, modifiés chimiquement ou non, sur le traitement de dermatite atopique induite chez la souris, afin de sélectionner les plus efficaces pour un développement en clinique chez l’Homme. Ce nouveau projet fait suite à un précédent projet qui nous a permis, sur 5 ans également, d’évaluer les effets de 58 composés, 8 de ces 58 composés étant actuellement en phase d’essais cliniques chez l’Homme. Ces nouveaux composés à évaluer seront administrés, après induction chimique de la dermatite atopique, par application cutanée ou par voie orale pendant 7 jours consécutifs, à 1 seule ou 4 doses, et leurs effets seront comparés à ceux d’une référence pharmaceutique utilisée chez l’Homme qui sera choisie en fonction de la classe pharmacologique des composés à évaluer et de la voie de traitement envisagée. Un suivi régulier du poids des animaux, du scorage de la sévérité de la dermatite atopique et de l’utilisation de l’enrichissement seront effectués tout au long de l’expérimentation. Les effets des composés seront évalués au niveau comportemental après le dernier traitement effectué. Après cette évaluation comportementale, un prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie générale pour le dosage de biomarqueurs sanguins, puis les animaux seront euthanasiés afin de réaliser un prélèvement cutané pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés en cours de développement sur le traitement de la dermatite atopique, et de sélectionner ceux ayant montré la plus grande efficacité pour leur évaluation chez l’Homme. L’évaluation des effets de ces composés se fera par des observations régulières avec scorage de différents paramètres pour suivre l’évolution de la sévérité de la dermatite atopique, par l’évolution pondérale des animaux, le score d’utilisation de l’enrichissement mis à disposition des animaux et une évaluation comportementale permettant de caractériser les effets de ces composés, notamment sur le nombre de grattages effectués par les animaux. Le dosage de biomarqueurs circulants à partir d’un prélèvement sanguin effectué à la fin des traitements, et des analyses biologiques de prélèvements cutanés effectués au large de la région d’induction de la dermatite atopique permettront également de caractériser les effets de ces composés. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le traitement de la dermatite atopique de ces nouveaux composés in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme. Un précédent projet réalisé sur 5 ans a permis d’évaluer les effets de 58 composés, 8 de ces 58 composés étant actuellement en phase d’essais cliniques chez l’Homme. Compte-tenu de l’augmentation constante de l’incidence de la dermatite atopique dans la population européenne et mondiale, le développement de nouveaux composés présente un enjeu socio-économique certain afin de développer des traitements efficaces contre cette pathologie chez l’Homme.
Procédures
Le rasage du dos de l’ensemble des 1400 souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera effectué sous anesthésie générale afin de ne pas léser le tissu cutané. Il sera réalisé une seule fois en 1 minute environ pour chaque souris. 1200 des 1400 souris seront soumises à l’induction de dermatite atopique par application cutanée répétée d’un agent chimique inducteur de cette pathologie chez la souris. Ces applications, au nombre de 22 au total par souris sur les 42 jours de l’expérimentation, seront effectuées en 1 minute environ sur souris vigiles. La totalité des 1400 souris sera traitée avec les composés à évaluer, les composés pharmaceutiques de référence ou un véhicule neutre (placebo), par application cutanée ou par administration orale. Les traitements seront effectués quotidiennement pendant 7 jours en 1 minute environ pour chaque souris, sur souris vigiles. Une évaluation du comportement de l’ensemble des 1400 souris sera réalisée 24 heures après le dernier traitement effectué afin de caractériser les effets des traitements sur la sphère comportementale au travers de différents paramètres dont le nombre et la durée des grattages et l’activité exploratoire des souris. Ce test sera effectué 1 seule fois pendant 20 minutes, sur souris vigiles. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sur la totalité des 1400 souris placées sous anesthésie générale avant leur euthanasie pour le dosage de biomarqueurs circulants.
Impact sur les animaux
L’induction de la dermatite atopique, pathologie inflammatoire, effectuée après rasage préalable du dos effectué sous anesthésie, va engendrer chez la souris une douleur légère à modérée au cours des 6 semaines d’induction de cette pathologie par applications cutanées d’un agent inducteur, en raison du développement d’une inflammation, d’un œdème, d'un grattage et d’une sécheresse cutanée au niveau de la région d’application de l’agent inducteur de cette pathologie. Une légère perte de poids transitoire sera également observée uniquement au cours de la première semaine d’induction de la dermatite atopique. Les pesées répétées au cours de l’expérimentation engendreront une gêne très limitée dans le temps, ne nécessitant que quelques secondes pour être effectuées. Le traitement quotidien des souris par application cutanée ou par voie orale avec les composés à évaluer au cours de la dernière semaine d’étude va induire un stress passager, quelques minutes quotidiennement, et la réalisation de l’évaluation comportementale effectuée le dernier jour de l’étude, nécessitant de placer les souris individuellement pendant 20 minutes dans le dispositif expérimental utilisé, va engendrer un stress modéré pendant ces 20 minutes de test. Le prélèvement de sang terminal, effectué immédiatement avant l’euthanasie des animaux en une minute environ, sera réalisé sous anesthésie générale profonde.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction de dermatite atopique puis le traitement et le suivi de celle-ci et l’évaluation comportementale, les souris seront euthanasiées. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction de la dermatite atopique pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la réparation du tissu cutané.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Le modèle de dermatite atopique nécessite une durée de plusieurs semaines pour son induction et une période de traitement sur plusieurs jours, il n’est donc pas possible d’utiliser de modèle in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant toute cette durée. De plus, l’évaluation de la dermatite atopique induite se faisant par observation macroscopique de différents paramètres au niveau du tissu cutané, il n’est pas possible de faire ce type d’étude in vitro ou ex vivo qui ne tiendrait pas compte des effets sur la réponse immunitaire via la circulation sanguine ne pouvant être reproduite sur de tels modèles in vitro ou ex vivo.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats des nombreuses études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de dermatite atopique ayant montré des effets "forts" de traitements en première intention sur le score de sévérité de la dermatite atopique et les paramètres comportementaux évalués à la fin des expérimentations. L'utilisation d'un logiciel adapté a permis de définir pour chacune des 2 modalités expérimentales envisagées, que pour 7 groupes expérimentaux, un effectif total de 56 animaux est nécessaire, soit 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée pour comparer les résultats entre les différents groupes expérimentaux.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la dermatite atopique. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, un scorage de la sévérité de la dermatite atopique et de l’utilisation de l’enrichissement seront effectués une fois par semaine avant traitement puis quotidiennement pendant le maintien de l’induction de la dermatite atopique et la période de traitement. Leur poids sera mesuré 3 fois par semaine au cours de la période d’induction de la dermatite atopique avant traitement puis quotidiennement pendant le maintien de l’induction de la dermatite atopique et la période de traitement. Les souris seront hébergées par 2 dans des cages adaptées à leur taille, avec des bâtonnets de coton placés dans leur cage comme enrichissement (2 par souris) pour assurer leur bien-être et permettant également de définir un score d’utilisation de l’enrichissement. Elles seront placées en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), et aussi pour évaluer l’influence des traitements sur leur activité (chronopharmacologie). Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’ulcération cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des pathologies cutanées représentatives des pathologies cutanées à traiter chez l’Homme. La souche de souris utilisée est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la dermatite atopique. Suite à l’induction de cette pathologie elle exprime en effet différents biomarqueurs d’intérêt et paramètres comportementaux, permettant ainsi une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la dermatite atopique (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats représentatifs, reproductibles et significatifs.
Impact des lipides post prandiaux sur l’homéostasie métabolique au cours de la stéatopathie métabolique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 220 après vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses et en sucre. Chacune subit trois à cinq jeûnes de quatre heures, autant de gavages, et six prélèvements de sang en deux heures obtenus en coupant le bout de la queue puis en grattant la croûte à mesure qu'elle se reforme. Le porteur décrit le gavage comme "désagréable mais pas douloureux" et affirme que le régime gras et sucré "n'engendre aucune contrainte" pour les animaux. Le projet promet un dosage prédictif qui "permettrait" un meilleur suivi des patients atteints de stéatopathie métabolique, quand les vingt-quatre semaines de régime et les gavages sont, eux, programmés.
Objectifs
L’obésité peut entraîner des complications hépatiques nécessitant une prise en charge thérapeutique des patients. Ces complications sont regroupées sous le terme de NAFLD pour maladie du foie non alcoolique ou plus récemment MASLD pour dysfonction métabolique associées aux maladies du foie gras. La MASLD s’étend de la stéatose isolée et réversible (accumulation de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes) à l’inflammation hépatique ou stéatohépatite (MASH), la fibrose, la cirrhose et le cancer du foie. Si une stéatose qui reste bénigne est observée chez quasiment toutes les personnes obèses, l’évolution de la maladie vers des formes plus sévères n’est observée que chez certains patients. A l’heure actuelle, il n’y a pas de critères fiables permettant de prédire l’évolution de la pathologie chez les patients présentant des lésions précoces. L’impact de l’alimentation dans la MASLD et en particulier des lipides est clairement démontré. Toutefois, là encore tous les patients ayant des dyslipidémies ne développent pas des formes sévères de MASLD. Or, un des biais dans toutes ces analyses est le fait qu’elles soient toujours faites chez l’individu à jeun. Or après un repas, le métabolisme des lipides peut varier transitoirement en fonction de la sensibilité des patients. Basé sur ce concept, une étude clinique a été faite chez l’homme et à prouvé que les lipides modifiés juste après la prise d’un repas et appelés lipides post-prandiaux sont plus délétères chez des patients avec une MASLD avancée qu’avec une simple stéatose. Notre projet consiste à comprendre dans notre modèle murin, l’effet de ces lipides post-prandiaux sur les différentes cellules et organes métaboliques. La compréhension de ces mécanismes à des stades précoces de la maladie est essentielle pour disposer de marqueurs prédictifs de l’évolution des lésions hépatiques et améliorer le suivi des patients.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à documenter le rôle des lipides post prandiaux et leur impact sur les différents organes métaboliques au cours du développement de la MASLD. Cette compréhension permettrait de proposer ces dosages de lipides post-prandiaux, ou leurs cibles identifiées par notre étude, pour améliorer la prédiction de l’évolution des lésions hépatiques au cours de la MASLD et assurer un meilleur suivi des patients.
Procédures
220 souris seront soumises à un régime enrichi en graisses et sucre pendant 24 semaines. 360 souris seront soumises à un jeun imposé de 4h. Ce jeun sera effectué 3 fois pour 280 souris et 5 fois pour 80 souris. 280 souris auront 3 gavages par voie orale et 80 souris auront 5 gavages. Le temps de gavage tient entre 20 et 30 secondes. Les 360 souris auront un prélèvement de 6 gouttes de sang en l’espace de 2 heures représentant une quantité inférieure à 100 microlitres de sang.
Impact sur les animaux
Les régimes enrichis en graisses et sucre n’engendrent aucune contrainte pour les animaux. Le jeun imposé de 4h, le matin, correspond à une période digestive. Aucun effet indésirable n’est attendu. Le prélèvement de 6 gouttes de sang en 2 heures au niveau de la queue va engendrer pour les animaux un inconfort modéré pendant et après le prélèvement. On évalue la gêne et la douleur à ce qui se passe lors d’une piqure puis lors « d’un grattage d’une croutte ». Le gavage des animaux vigiles pour éviter une fausse route avec des canules souples minimise les lésions mécaniques. Le geste est désagréable mais pas douloureux. Les injections intra-péritonéales correspondent à la nuisance d’une piqure, le produit injecté n’étant pas agressif.
Devenir
A l’issu des procédures, les souris sont euthanasiés, différents tissus sont prélevés (vésicule biliaire, foie, tissu adipeux, muscle, intestins) afin de réaliser des analyses biochimiques, des analyses de sous types cellulaires ou de l'histologie.
Remplacement
Nous étudions dans notre modèle d’obésité l’impact d’un repas et des conséquences métaboliques qu’il engendre. Les approches expérimentales in vivo permettent d’intégrer les interactions entre alimentation, métabolisme et réponse des organes impliqués dans le métabolisme y compris l’absorption intestinale. L’ensemble de ces mécanismes ne sont pas actuellement accessibles par des techniques in vitro ou par des études in silico. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours pour étudier les effets sur ces différents organes est donc l’animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base des quelques données disponibles sur les lipides post-prandiaux. Afin d’observer des différences significatives parmi ces lipides nous avons estimé que 8 souris par groupe d’étude étaient nécessaires pour obtenir des résultats significatifs lorsque l’on suit ces lipides 5 fois après le repas et que ce nombre était de 10 souris par groupe si on limitait à l’étude à 3 temps d’étude après le repas.
Raffinement
Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées par 4 ou par 5. L’enrichissement sera constitué d’un tunnel en plastique et une quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée. Les souris seront pesées toutes les semaines. La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux, si nécessaire. Tout au long des procédures, les souris seront examinées régulièrement pour détecter des signes de de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Le jeûne imposé de 4h sera le matin, en période digestive avec un libre à un biberon d’eau. Lors du prélèvement des gouttes de sang, la coupure initiale au niveau de la queue sera réduite au minimum (de l’ordre du mm) puis comprimée par une compresse qui arrête le saignement. La récupération des 5 autres gouttes de sang se fera en ‘grattant la croûte’ nouvellement formée. Une compresse sera réappliquée en pression après chaque prélèvement. La surveillance de la bonne cicatrisation au point de prélèvement sera faite dans le cadre de la surveillance quotidienne des animaux. L’injection en intra-péritonéale est réalisée sans application préalable de lidocaïne afin d’éviter le stress de 2 contentions successives.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie sont proches de ceux observés chez l’Homme même si le stade n’évolue pas vers les formes les plus sévères. Le modèle de MASLD chez la souris est bien décrit dans la littérature et c’est un modèle largement utilisé par la communauté scientifique pour étudier cette pathologie. Ce projet vise à étudier le rôle des lipides post-prandiaux au cours de l’obésité chez l’adulte. Des souris adulte, agées de 6 semaines seront utilisées.
Effets de l’absence des adipocytes bruns chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Dépourvues d'adipocytes bruns et beiges par modification génétique, ces souris sont plus petites que la normale, inclinent la tête et tournent parfois en rond dans leur cage. 3 902 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont hébergées de une à vingt-quatre semaines à des températures dérogatoires, reçoivent des injections, subissent une intervention chirurgicale sans réveil et un prélèvement de sang juste avant la mise à mort, le porteur écrivant qu'"aucune autre espèce ne peut donc être utilisée". Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs tissus adipeux.
Objectifs
Il existe deux types de tissu adipeux ou graisse corporelle chez les mammifères : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, dont les rôles sont différents. Le tissu adipeux blanc est composé de cellules adipeuses ou adipocytes blancs qui stockent les calories en excès sous forme de graisses et constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Le tissu adipeux brun composé d’adipocytes bruns, au contraire, est spécialisé dans la dépense énergétique : il brûle les graisses et le sucre en produisant de la chaleur. La capacité du tissu adipeux à générer de la chaleur est régulée par le système nerveux. Lors d’une exposition au froid, les nerfs présents dans le tissu adipeux libèrent un messager chimique qui agit sur les adipocytes. Cela va entraîner l’activation des adipocytes bruns dans le tissu adipeux brun, l’apparition dans le tissu adipeux blanc d’adipocytes dits beiges qui sont capables eux aussi de produire de la chaleur, et la dégradation des graisses dans tous les adipocytes pour fournir de l’énergie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris dans lesquelles les adipocytes bruns et beiges sont absents et les adipocytes blancs sont préservés. Nous étudierons ces souris à différentes températures d’hébergement ainsi que leur réponse à différents composés pharmacologiques qui modulent l’activité thermogénique et métabolique des adipocytes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’analyser les conséquences de l’absence des adipocytes bruns et beiges sur la physiologie du tissu adipeux et de dissocier leurs effets métaboliques, à la fois au niveau local et systémique, de ceux des adipocytes blancs. Cela nous permettra de mieux définir leur potentiel thérapeutique pour le traitement des maladies métaboliques comme l’obésité.
Procédures
Une intervention chirugicale sans réveil sous anesthésie et analgésie sera réalisée. Les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : une injection (intrapéritonéale et/ou sous-cutanée), un prélèvement de sang effectué juste avant la mise à mort et un hébergement à température expérimentale pendant 1 à 24 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris dans lesquelles les adipocytes bruns et beiges sont absents sont plus petites, elles présentent un phénotype d’inclinaison de la tête et tournent parfois en rond dans leur cage. La contention pour effectuer les injections et prélèvements sanguins peut entraîner un stress ponctuel. Les injections et prélèvements sanguins entrainent une douleur légère. Les animaux sont hébergés dans des conditions de température dérogatoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les tissus adipeux pour analyse histologique.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro sont réalisées sur des lignées cellulaires d’adipocytes au lieu de cellules primaires isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre les fonctions des adipocytes thermogéniques, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux et entre les différents organes.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été établi en nous appuyant sur les probabilités génétiques et des schémas d’accouplement optimisés. Le nombre minimum d’animaux nécessaire pour les analyses tissulaires que nous envisageons a été déterminé par des calculs statistiques basés sur un calcul de puissance associé à l’utilisation de tests de significativité statistique.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (dont la fréquence est adaptée à la procédure) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse, de détecter l’atteinte des points limites et d’appliquer, le cas échéant, les critères d’arrêt définis dans nos grilles d’observation.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les cellules immunitaires du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et l’élimination spécifique de différentes populations de cellules immunitaires. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Nous utiliserons des animaux âgés de 1 à 24 semaines car le tissu adipeux brun est très actif à la naissance et son activité diminue ensuite avec l’âge.
Etude du rôle d’une protéine vasculaire dans l’insuffisance cardiaque (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
La veille de l'opération, chaque souris subit un prélèvement de sang et une épilation de la zone à ouvrir. Le lendemain, sous anesthésie gazeuse, les expérimentateurs exposent l'artère en sortie du cœur et la rétrécissent, puis recousent l'animal au bout d'une demi-heure. Suivent vingt-huit jours de défaillance cardiaque installée, avec une échographie hebdomadaire sous anesthésie dans un second laboratoire, une mortalité attendue de 20 % à l'opération puis de 5 % pendant la procédure. Les 252 souris de ce second volet, comme celles du premier, sont tuées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, pour que leur cœur et leur sang soient analysés.
Objectifs
Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude d'une protéine vasculaire qui est impliquée dans le changement de morphologie d'autres organes mais dont le rôle dans l'insuffisance cardiaque n'a pas été exploré. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons ce modèle à des souris qui produisent, et à d'autres qui ne produisent pas (souris modifiées génétiquement) notre protéine d'intérêt, afin de les comparer. L'objectif de ce projet est ainsi de déterminer si celle-ci joue ou non un rôle dans l'évolution de l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si notre protéine d'intérêt s'avère être une cible potentielle, nous envisagerons de tester à la suite de ce projet des outils dont nous disposons au laboratoire et qui sont capables de la bloquer. Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.
Procédures
Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie de rétrecissement du diamètre de l'aorte, estimée de l'ordre de 20%, ainsi qu'au cours des 28 jours de la procédure (environ 5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire pendant les 24h suivant la chirurgie, une perte de poids post-opératoire, stress possible lié aux échographies répétées.
Devenir
Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.
Remplacement
La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti-douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas notre molécule d'intérêt, ce qui permet d'étudier son rôle, comparativement aux souris qui la produisent normalement.
Etude du rôle d’une protéine vasculaire dans l’insuffisance cardiaque (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une souris sur cinq environ ne survit pas à l'opération, le porteur chiffrant à 20 % la mortalité attendue lors du rétrécissement chirurgical de l'aorte et à 5 % les morts survenant pendant les vingt-huit jours suivants. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leur cœur et leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La chirurgie dure une trentaine de minutes, elle expose l'artère à la sortie du cœur et la resserre, et l'évolution de la défaillance cardiaque est ensuite suivie chaque semaine par échographie. Le projet cherche à savoir si une protéine vasculaire joue un rôle dans l'insuffisance cardiaque, faute de traitement curatif existant, et le porteur écrit que ses résultats "pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine".
Objectifs
Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude d'une protéine vasculaire qui est impliquée dans le changement de morphologie d'autres organes mais dont le rôle dans l'insuffisance cardiaque n'a pas été exploré. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons ce modèle à des souris qui produisent, et à d'autres qui ne produisent pas (souris modifiées génétiquement) notre protéine d'intérêt, afin de les comparer. L'objectif de ce projet est ainsi de déterminer si celle-ci joue ou non un rôle dans l'évolution de l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si notre protéine d'intérêt s'avère être une cible potentielle, nous envisagerons de tester à la suite de ce projet des outils dont nous disposons au laboratoire et qui sont capables de la bloquer. Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.
Procédures
Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie de rétrecissement du diamètre de l'aorte, estimée de l'ordre de 20%, ainsi qu'au cours des 28 jours de la procédure (environ 5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire pendant les 24h suivant la chirurgie, une perte de poids post-opératoire, stress possible lié aux échographies répétées.
Devenir
Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.
Remplacement
La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti-douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas notre molécule d'intérêt, ce qui permet d'étudier son rôle, comparativement aux souris qui la produisent normalement.
Étude du rôle d’un transporteur de lipides dans la progression du cancer du sein chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
320 souris Nude, dépourvues des défenses immunitaires qui leur permettraient de rejeter des cellules humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales mammaires dans la glande ou dans la veine de la queue, quatre injections de traitement, une mesure de tumeur trois fois par semaine, et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie dans un second établissement. La question posée porte sur le rôle d'un transporteur d'acides gras dans la progression du cancer du sein triple négatif. Le porteur présente la souris Nude comme "l'un des rares modèles" permettant de greffer des tumeurs humaines sans rejet, et justifie l'âge retenu, six semaines, par la comparabilité avec les données déjà publiées.
Objectifs
Le cancer du sein est le premier cancer en termes d’incidence et en termes de mortalité chez les femmes. Dans le contexte du cancer du sein, le constituant majoritaire de l’environnement entourant la tumeur est le tissu adipeux, dont les adipocytes constituent une majeure partie. Le développement tumoral s’accompagne de besoins énergétiques important et les cellules tumorales disposent de plusieurs sources d’énergie, dont les lipides. Il a été montré une expression importante d’un transporteur d’acides gras par les cellules tumorales mammaires les plus agressives entraînant une captation élevée d’acides gras et augmentant leur agressivité. En exprimant ce transporteur, les cellules tumorales pourraient potentialiser leur capacité à former des métastases en favorisant leur captation d’acides gras apportant une source d’énergie importante permettant à ces cellules tumorales de migrer et survivre à distance de la tumeur mammaire. Cette participation au processus métastatique semble être une caractéristique commune à plusieurs types de cancers et, cliniquement, les chercheurs ont observé que la présence de cellules exprimant ce transporteur d’acides gras était corrélée avec des tumeurs très agressives et un mauvais pronostic. Ces résultats suggèrent donc que ce transporteur d’acides gras est une « signature » des cellules qui ont le potentiel de former des métastases. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette protéine dans la progression du cancer du sein. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de l’indisponibilité de certains équipements d’imagerie dans l’établissement principale. Cette demande complémentaire concerne un projet préalablement autorisé dans lequel une étape nécéssite une expertise spécifique non disponible en interne, aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté par rapport au projet principal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier le rôle d’un transporteur d’acides gras dans la progression tumorale et métastatique mammaire. A travers la compréhension de son rôle et des conséquences de son inhibition sur le développement du cancer du sein nous pourrons mettre en évidence que cette protéine est une cible thérapeutique intéressante dans le cancer du sein, particulièrement dans les cancers les plus agressifs et notamment au stade métastatique. Cela ouvrira de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement du cancer du sein triple négatif. De plus, ce transporteur se retrouve surexprimé non seulement dans le cancer du sein mais dans d’autres cancers également, la compréhension de son rôle dans la progression cancéreuse et comme potentielle nouvelle cible thérapeutique est donc également intéressante et potentiellement applicable dans le cadre d’autres types de cancer.
Procédures
Le modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Injections unique orthotopiques (15 seconde/animal) dans la glande mammaire après traitement hormonale dans l’eau de boisson (15 jours) ou ii) intraveineuse de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine sur animal vigile (2 minutes/animal) iv) Injection intrapéritonéale des traitements sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Transport vers un autre établissement et imagerie sur animal anesthésié (12 séance maximum, 30 min) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : 1) L’immunodéficience du modèle animal réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. 2) Le stress de la nouveauté (néophobie) lors des changements de conditions (traitement dans l’eau de boisson, nouveau régime alimentaire, ou encore lors du transport vers un autre site pour l’imagerie) 3) Le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la glande mammaire suite aux injections des cellules tumorales. 4) Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. 5) Les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) durant l’imagerie.
Devenir
A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=320) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements au sein du dernier établissement où ils seront hébergés. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.
Remplacement
Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cultures cellulaires ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe ou d’injection en intraveineux chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.
Réduction
Le projet impliquera un total de 320 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, formation, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, suivi, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce et les cellules injectées pourront proliférer sans être rejetées. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.