Souris
Évaluation de Stratégies Thérapeutiques Innovantes pour le traitement antitumoral en utilisant des modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Le criblage d'anticorps et de cellules immunitaires modifiées détenus par le laboratoire tient lieu d'objectif, avec l'évaluation un à un de "candidats médicaments" anticancéreux puis de leurs combinaisons. 2 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de la tumeur et du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est pucée, reçoit une greffe de tumeur humaine ou murine sous la peau ou dans le cerveau, puis jusqu'à trois injections sur trois mois, le suivi pouvant durer neuf mois. Les greffes sous-cutanées peuvent se développer jusqu'à l'inflammation, la nécrose ou l'ulcération, et le porteur conclut que le recours aux modèles animaux est "indispensable" tout en revendiquant un engagement à minimiser leur nombre.
Objectifs
Il est essentiel de rechercher de nouvelles thérapies contre le cancer pour améliorer les chances de survie des patients et réduire les effets secondaires des traitements actuels. Dans cette perspective, notre projet se concentre sur l'évaluation de divers médicaments potentiels pour le traitement du cancer Dans le domaine des traitements médicaux contre le cancer, il existe une approche qui consiste à exploiter le potentiel du système immunitaire pour combattre le cancer. Cette méthode comprend l'utilisation d'anticorps, qui sont essentiellement des protéines conçues pour cibler et neutraliser des substances spécifiques dans le corps, y compris les cellules cancéreuses. En outre, il est possible de manipuler génétiquement certaines cellules du système immunitaire pour qu'elles soient équipées d'un récepteur spécial, appelé récepteur antigénique chimérique (CAR), qui leur permet de reconnaître et d'attaquer spécifiquement les cellules cancéreuses. En somme, ces approches thérapeutiques visent à armer l'organisme pour qu'il puisse mieux lutter contre le cancer. Nous évaluerons également des thérapies combinées, en associant les traitements les plus prometteurs, sur des modèles murins portant différentes formes de cancer. Le projet se divise en trois phases : (1) Évaluation de l'efficacité des médicaments candidats, y compris les anticorps traditionnels et les formulations modifiées, ainsi que les approches innovantes avec les cellules immunitaires modifiées. (2) Évaluation des médicaments candidats en combinaison, pour maximiser leur efficacité en utilisant différents types d'anticorps et/ou en y ajoutant les cellules immunitaires modifiées. (3) Si nécessaire, création de nouveaux modèles animaux pour approfondir la recherche sur les thérapies anti-cancéreuses
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et promettent de contribuer de manière significative à la recherche et au traitement du cancer : 1- Compréhension des capacités thérapeutiques de chaque « candidats médicaments » : Ce projet permettra une évaluation complète des différents formats d'anticorps en notre possession, , ainsi que des cellules du système immunitaire modifiées. Cette compréhension approfondie des avantages et des limites de ces « candidats médicaments » guidera le développement de thérapies plus efficaces contre le cancer. 2- Optimisation des traitements anticancéreux : En identifiant les « candidats médicaments » les plus prometteurs pour cibler spécifiquement les cellules tumorales, ce projet contribuera à l'optimisation des traitements anticancéreux. 3- Diversité des approches thérapeutiques : L'évaluation de diverses approches élargira le champ des options thérapeutiques disponibles pour les patients atteints de cancer. Cela ouvre la porte à des traitements plus personnalisés et adaptés aux caractéristiques spécifiques de chaque tumeur. 4- Amélioration de la recherche en cancérologie : Les données générées par ce projet enrichiront la base de connaissances en cancérologie. Elles serviront de référence pour d'autres chercheurs. 5- Réduction de la toxicité des traitements : En développant des thérapies plus ciblées, ce projet vise à réduire la toxicité des traitements anticancéreux, ce qui améliorera la qualité de vie des patients. Les résultats de ce projet pourraient déboucher sur des traitements anticancéreux innovants et prometteurs qui devront être évalués dans des essais cliniques ultérieurs. En fin de compte, ce projet contribuera à faire progresser la lutte contre le cancer en élargissant notre compréhension des stratégies thérapeutiques et en ouvrant la voie à des traitements plus efficaces, mieux tolérés et plus adaptés aux besoins individuels des patients.
Procédures
Les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une série d'interventions destinées à évaluer l'efficacité de divers "candidats médicaments" dans le traitement du cancer : - Pose de puce en souscutané pour l’identification des animaux (moins de 1 minutes - 1 fois) -Xénogreffes sous-cutanées et intracérébrales (moins de 1minutes - 1 fois par animal) : Les animaux seront implantés avec des xénogreffes portant des lignées tumorales humaines ou murines. Les xénogreffes peuvent être sous-cutanées ou intracérébrales, en fonction des modèles expérimentaux. - Administrations des candidats médicaments : Les candidats médicaments seront administrés aux animaux, et la manière dont cela se fait dépendra de leur formulation. Jusque 3 injections sur une période de 3 mois seront réalisées (durée injection moins de 1 minutes). - Suivi de l'efficacité thérapeutique (au cours de l’étude – durée environ 2 minutes par animal) : L'efficacité thérapeutique sera évaluée en mesurant la régression tumorale dans le cas des xénogreffes sous-cutanées, la survie des animaux pour les xénogreffes intracérébrales, ou une combinaison de ces deux indicateurs. Un maximum de 2380 animaux seront engagés dans cette procédure pour une durée maximal de 9 mois par expérimentation.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus comprennent des réactions comportementales telles que l'agitation ou l'apathie en réponse aux procédures ou aux traitements, ainsi que la possibilité de douleur et de détresse causées par des interventions chirurgicales ou autres procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu une xénogreffe intracérébrale peuvent présenter une perte de poids et des déséquilibres lors de l'évolution de la tumeur. Les xénogreffes sous-cutanées peuvent se développer de manière significative, entraînant des problèmes tels que des inflammations, des nécroses ou des ulcérations au site de la greffe. De plus, les traitements expérimentaux peuvent influencer négativement l'alimentation et la croissance des animaux, certains pouvant perdre l'appétit ou subir une perte de poids, ce qui affecte leur santé générale.
Devenir
A la fin des procédures les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem de la tumeur et du cerveau.
Remplacement
Dans un premier temps, nous effectuons des analyses in vitro des "candidats médicaments" sur des modèles cellulaires tumoraux pour évaluer leur impact sur différentes lignées tumorales. Cette étape est cruciale pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Nous soumettons toutes nos stratégies thérapeutiques à une évaluation in vitro visant à confirmer l’efficacité des « candidats médicaments » in-vitro Cette approche permet de réduire considérablement le recours aux tests sur animaux. Cependant, il est important de noter que les modèles in vitro ne peuvent pas totalement reproduire l'interaction complexe entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Pour approfondir nos recherches, l'utilisation de modèles animaux est indispensable, tout en respectant notre engagement de minimiser leur nombre. Notre objectif principal est de contribuer de manière significative à la compréhension des mécanismes tumoraux et au développement de nouvelles thérapies, en tenant compte du bien-être des animaux de laboratoire.
Réduction
Une simulation statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs.
Raffinement
La surveillance quotidienne des souris logées en groupe dans un environnement enrichi, qui offre une variété de stimulations cognitives et motrices, ainsi que l'application de critères d'arrêt à la fois en phase d'élevage et lors des expérimentations, sont essentiels pour garantir leur bien-être. En cas de manifestations inattendues, le vétérinaire de l'installation sera immédiatement informé afin de mettre en place des traitements appropriés, qu'il s'agisse de soutien nutritionnel ou de l'administration de médicaments. L'état de santé des animaux sera étroitement surveillé tout au long de l'expérience. Le protocole d'anesthésie et d'analgésie lors des procédures chirurgicales a été élaboré de manière précise afin d’assurer que les animaux ne souffrent pas. Les animaux bénéficieront d'une période d'adaptation lors de leur arrivée à l'animalerie, de temps de récupération après une intervention chirurgicale, et d'une familiarisation progressive avec les manipulations nécessaires pour leur traitement quotidien. Tout cela vise à maintenir des conditions physiologiques optimales et à minimiser le stress et la souffrance pendant le déroulement du protocole.
Choix des espèces
Les souris sont des espèces fréquemment utilisées en recherche translationnelle, notamment dans le domaine de l'évaluation de traitements anti-cancéreux. Notre laboratoire possède une expertise avancée dans la mise en place de protocoles de xénogreffe des cellules tumorales in vivo, qu'il s'agisse d'implantations orthotopiques ou hétérotopiques, et nous maîtrisons pleinement ces modèles animaux. Les souris, en raison de leur petite taille, de leur développement rapide et de leurs similitudes marquées en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme, offrent une plateforme idéale pour étudier les réponses aux traitements anti-cancéreux. Le présent projet a pour but d'étudier les effets d’un traitement anticancéreux sur des sujets pleinement matures. Les animaux étudiés seront donc des adultes (2-4 mois) au moment des expérimentations.
Impact du microbiote implanté à la naissance par une supplémentation anténatale en Human Milk Oligosaccharides (HMO) sur la prévention de l’allergie alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des souris gestantes, nourries pour une partie d'un aliment enrichi en oligosaccharide du lait maternel humain, sont tuées au 19e jour de gestation pour une césarienne, et leurs petits confiés à des mères adoptives dont les propres portées sont tuées. 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les descendantes femelles reçoivent deux injections dans l'abdomen pour les sensibiliser à un allergène, puis, à 45 jours, un gavage du même allergène destiné à déclencher chute de température, irritations de la bouche et des oreilles et isolement, avant d'être tuées. L'équipe veut savoir si la protection contre l'allergie alimentaire qu'elle dit avoir démontrée chez la descendance passe par le microbiote transmis à la naissance. Les mères adoptives sont tuées après le sevrage, les descendants mâles aussi ou bien placés dans d'autres protocoles, et les souris surnuméraires sont tuées ou employées pour des travaux in vitro.
Objectifs
La vie prénatale constitue la première période au cours de laquelle l'environnement maternel, comme l’alimentation, peut influencer le système immunitaire du fœtus , via des transferts mère-enfant de facteurs immunitaires et nutritionnels, ou de facteurs bactériens. Le concept de l'origine développementale de la santé et des maladies (DOHaD) suggère que l’environnement maternel pendant la grossesse conditionne le développement du fœtus et influence le développement de futures maladies chez la descendance. Dans ce contexte, notre équipe a démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse avec un oligosaccharide majeur du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide) pendant la gestation protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. De plus, les femelles gestantes ainsi que leurs descendances possédaient un microbiote modifié par rapport aux souris sous-alimentation standard. Les HMOs sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le microbiote intestinal bénéfique pour la santé. Lors d’un accouchement naturel, il existe un transfert du microbiote maternel vers le nouveau-né. Au cours de ce projet, nous souhaitons savoir si lors d’une supplémentation gestationnelle en HMO, les transferts lors de la grossesse sont suffisants à protéger la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire ou si le microbiote implanté lors de l'accouchement est nécessaire. L’objectif de ce projet est de supprimer le transfert du microbiote maternel aux souriceaux lors de l'accouchement en réalisant des césariennes et d’évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en HMO sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse en HMOs protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son fœtus in utero ainsi qu'un microbiote spécifique transmis de la mère au souriceau. Cependant nous ne savons pas quelle est la part du microbiote et celle du système immunitaire dans la prévention de l’allergie alimentaire. Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier chez la souris le rôle du microbiote implanté lors de l'accouchement sur la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance.
Procédures
L’observation d’un bouchon vaginal (quelques secondes) sera réalisée lors des sorties de reproduction, pouvant induire une légère gêne chez la souris. Une partie desfemelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les descendantes femelles au jour 21 et 45 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer 4 à 5 fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendantes femelles 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur les descendantes femelles. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Afin de limiter ce stress, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle avant de placer les nouveau-nés dans la cage de la femelle adoptante. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.
Devenir
Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes et les descendants mâles seront mis à mort après le sexage et la fin du sevrage. Les descendantes femelles seront mises à mort après le challenge à 45 jours de vie.
Remplacement
Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.
Réduction
Ce projet a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Afin de limiter le nombre d’animaux, un test en amont sera réalisé afin de sélectionner la souche de souris adoptante (Balb/cJRj ou SWISS) la plus adéquate. Ce test permet de former certains utilisateurs certifiés à l’hystérectomie et à valider le choix de la femelle adoptante afin de garantir la qualité de l’adoption et la survie des nouveau-nés. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test sera réalisé en amont du protocole afin de choisir la souche des souris adoptantes et donc de valider celle permettant la meilleure qualité d’adoption, mais aussi à former le personnel aux hystérectomies et à valider l’organisation du protocole. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée impliquant une euthanasie en fonction du tableau des points limite. Il est aussi possible d’observer une adoption problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendantes femelles) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Dans notre animalerie, nous avons observé lors des différents protocoles de reproduction que les mâles, une fois entrés en reproduction, deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Afin d’assurer le bien-être de nos animaux, les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet.
Choix des espèces
Nous avons démontré chez la souris Balb/cJRj que les prébiotiques et les HMO administrés lors de la grossesse protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études nous devons rester sur la même espèce de souris. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 8 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les césariennes. Si la reproduction n’a pas été efficace, les souris non enceinte seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes arriveront à l'animalerie au 15ème de jour de grossesse. Ces femelles accoucheront 1 ou 2 jour avant les césarienne. Le jour des césarienne, les nouveau-né seront adoptés par ces souris adoptantes. La portée des femelles adoptantes seront mis à mort, une fois le remplacement réalisé. Les descendants mâles ne seront pas utilisés dans ce protocole. Après le sexage réalisé à 21 jours de vie, les descendants mâles seront soit mis à mort, soit utilisé dans d'autres protocoles mis en place dans notre animalerie.
Etudes des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement et la prévention de l’insuffisance cardiaque post-ischémique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
D'abord une échographie cardiaque de vingt minutes sous anesthésie, puis une opération de cent dix minutes pour provoquer un infarctus, puis des échographies à deux jours et à deux, quatre, huit, douze et seize semaines. Selon le groupe, chaque souris reçoit aussi jusqu'à vingt-six injections sous-cutanées. 1 504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, le porteur indiquant que l'insuffisance cardiaque installée provoque une baisse d'énergie, une perte de poids et un essoufflement modérés sur le long terme. Le bénéfice annoncé, un meilleur pronostic pour les patients ischémiques, reste au conditionnel, quand les seize semaines de défaillance cardiaque, elles, sont programmées.
Objectifs
L’infarctus cardiaque est caractérisé par une quantité de sang insuffisante transportée jusqu’au muscle cardiaque ce qui entraîne une réduction d’apport en oxygène aux cellules du cœur. Il est une cause importante du développement vers l'insuffisance cardiaque. Malgré des progrès significatifs dans la prise en charge des patients, l'insuffisance cardiaque continue d'avoir des taux de mortalité élevés. Avec une disponibilité limitée d'options de traitement, un pronostic précis reste un objectif thérapeutique important, en particulier dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le remodelage cardiaque, qui devrait avoir un effet protecteur contre le développement progressif vers l’insuffisance cardiaque. L'infarctus induit des modifications de la taille, de forme et de fonction du cœur qui sont considérées comme des indices précurseurs dans le développement de l’insuffisance cardiaque. Par conséquent, il est primordial de clarifier les mécanismes moléculaires sous-jacents afin de comprendre le développement de l'insuffisance cardiaque et d'améliorer le pronostic des patients atteints d’un infarctus du myocarde. Dans ces conditions, notre projet vise dans un premier temps à corréler la dysfonction du coeur, aux différentes atteintes tissulaires et cellulaires après un infarctus. Dans un deuxième temps, différentes stratégies seront testées pour proposer de nouveaux traitements pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de notre projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre aux besoins des cliniciens et des chercheurs sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de l’insuffisance cardiaque après un infarctus. 2) Élaborer la preuve de concept de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’en expliquer les mécanismes. À terme, la compréhension de la pathologie de l’insuffisance cardiaque grâce à notre approche qui combine plusieurs niveaux d’analyses (fonctionnelle et structurelle), devrait aider à concevoir des stratégies thérapeutiques pertinentes pour traiter précocement les patients ischémiques et éviter d’évoluer vers une insuffisance cardiaque sévère invalidante.
Procédures
Les animaux insuffisants cardiaques seront suivis jusqu’à 16 semaines. Chaque animal sera soumis sous anesthésie profonde à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 2 jours, 2-4-8-12-16 semaines postopératoire (20 min). Selon le groupe d’étude, les animaux recevront à la reperfusion : 1) une injection intracardiaque et intraveineuse de chlorure de sodium (1 minute, 2 injections totales) 2) une injection intracardiaque et intraveineuse de vecteurs viraux (1 minute, 2 injections totales) 3) une injection intracardiaque et intraveineuse d’un peptide (1 minute, 2 injections totales) 4) une injection sous cutanée du traitement classique contre l’insuffisance cardiaque (
Impact sur les animaux
La contention de l’animal induit un stress léger de courte durée. Les piqures de l’aiguille pour les traitements entrainent une douleur légère de courte durée. L’incision de la peau entraine une douleur légère de courte durée. L’incision musculaire entraine une douleur légère, de courte durée. Les piqures des sutures entrainent une douleur légère, de courte durée. Le réveil de l’animal après chirurgie entraine un stress léger, de courte durée. Le développement de l’insuffisance cardiaque entraîne une baisse d’énergie, une perte de poids et une dyspnée modérées à long terme.
Devenir
A l’issu des procédures 1 et 2 du projet, tous les animaux seront mis à mort par un personnel compétent pour effectuer les prélèvements et les analyses prévus dans le protocole.
Remplacement
L‘étude d’un modèle de souris d’insuffisance cardiaque mimant la pathologie clinique est cruciale pour comprendre la pathologie et mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans le processus de développement de la maladie. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles animaux. Par ailleurs, l’isolement de cellules contractiles du cœur des souris de cette étude permettra de réaliser de nombreuses analyses en limitant le nombre d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistique. Le nombre d’animaux du projet de recherche tient compte également de la perte d’animaux liée au stress ischémique. Par conséquent, au maximum 1504 animaux seront utilisés dans ce projet pour caractériser finement le développement de l’infarctus vers l’insuffisance cardiaque et proposer de potentielles thérapeutiques. Une première cohorte aura pour but de tester le pouvoir thérapeutique des traitements testés sur la fonction cardiaque de l’animal. Le nombre d’animaux a été évalué à 32 animaux par groupe, soit pour 9 groupes (dont 1 groupe sham opéré), un total de 288 souris. En cas de réussite du traitement testé, une seconde cohorte sera envisagée pour déterminer les mécanismes moléculaires impliquées. Le nombre d’animaux a été évalué à 16 animaux par groupe (sauf les basales n=12) pour chacune des deux cohortes, soit pour 8 groupes, un total de 1216 souris au maximum. Les prélèvements prévus pour le dernier temps du protocole (16 semaines) seront issus des animaux en fin de protocole de la première cohorte, optimisant de ce fait les animaux étudiés. Pour chaque expérience des groupes homogènes d’animaux seront constitués pour permettre une évaluation statistique plus pertinente. Dans la mesure du possible, le groupe d'animaux utilisé pour l'étude de la fonction cardiaque va également contribuer à l'étude des aspects moléculaires.
Raffinement
Pour pallier toute perte de poids durant la première semaine d’hébergement après chirurgie, de la nourriture hydratée sera mise à disposition. La chirurgie utilisera une voie d’abord par une ouverture du muscle du thorax limitant la douleur et l’inflammation dues à la chirurgie. Le réveil de l’animal sera fait en couveuse, pour permettre une meilleure récupération après la chirurgie. L’utilisation de fils résorbable permettra une meilleure acquisition et quantification de la fonction cardiaque par échographie réduisant de ce fait la variabilité et le nombre d’animaux nécessaire pour montrer des différences statistiques. Les souris en expérimentation seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L'état général de la souris fera l'objet d'une observation minutieuse : aspect des yeux, apparence physique, modification du comportement et respiration. Tous ces signes, une fois combinés et pondérés par la grille de score, nous renseigneront sur le niveau de souffrance de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, dont la planification de protocole pour éviter le stress et la mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure utilisée. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection, l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Par ailleurs, pour la problématique de ce projet, tous les modèles ont déjà fait leurs preuves pour l’insuffisance cardiaque. Au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, la souris est largement utilisée pour étudier les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 10 à 16 semaines au moment de la chirurgie. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.
Mécanismes astrocytaires et neuronaux de la mémoire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Maintenues à plus de 85 % de leur poids normal par une restriction alimentaire, et isolées en cage individuelle de deux à cinq semaines, les souris de ce projet doivent rester motivées par la récompense alimentaire des tâches de mémoire. 400 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant cérébral posé au cours d'une chirurgie de quatre à six heures, puis son activité cérébrale est enregistrée environ deux semaines, jusqu'à quatre heures par jour pendant son sommeil, pour étudier le rôle des astrocytes dans la consolidation de la mémoire. Le porteur qualifie la restriction alimentaire de légère et affirme, littérature à l'appui, que cette restriction et l'exercice dans les labyrinthes sont bénéfiques pour la santé et le vieillissement des souris.
Objectifs
Le but de ce projet est de tester le rôle des astrocytes dans la théorie standard des mécanismes de formation et de consolidation de la mémoire, qui attribue un rôle critique à l'hippocampe et à ses partenaires corticaux et sous-corticaux, notamment pendant le sommeil. Notre attention sera portée sur le rôle des astrocytes dans l’émergence de certains rythmes du sommeil afin de comprendre leur rôle dans la plasticité de l’hippocampe. Nous entraînerons donc des souris à effectuer des tâches de mémoire impliquant ces systèmes, nous enregistrerons l’activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil qui précède et qui suit l’apprentissage, et nous tenterons également d'altérer les performances mnésiques en modifiant la dynamique cérébrale au moyen de mutations ciblées au niveau des cellules gliales astrocytaires. Nos expériences incluront également des groupes contrôles. Des souris seront utilisées pour toutes les étapes de ce projet. La souris est un modèle standard pour l’étude de la mémoire aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires de la formation et de la consolidation de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, nos travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.
Procédures
Ce projet utilisera au maximum 400 souris. Pour étudier les bases neurales de la mémoire, les animaux sont entraînés à effectuer des tâches de mémoire spatiale dans une cage ouverte ou dans des labyrinthes. Si l’accomplissement de ces tâches repose sur la motivation des animaux à obtenir des récompenses alimentaires, une légère restriction alimentaire est nécessaire à leur motivation. Pour permettre une restriction précise, les animaux sont maintenus dans des cages individuelles, à proximité directe de leurs congénères, dans des cages transparentes pour assurer une contiguïté visuelle, auditive et olfactive. La littérature scientifique montre que la légère restriction alimentaire (>85% du poids normal à l’âge de l’animal) et l’exercice physique dans les labyrinthes sont bénéfiques pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. Les animaux reçoivent un implant chirurgical (1 fois, typiquement 4–6 h) pour pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (typiquement pendant 2 semaines) pendant l’accomplissement de la tâche (typiquement 1h/jour d’enregistrement) ainsi que pendant le sommeil lorsque la mémoire se stabilise à long terme (typiquement 2–4h/jour d’enregistrement). Les tâches d'apprentissage peuvent inclure de phases courtes (familiarisation de 20minutes) ou longues selon la capacité de l'animal à apprendre la tâche (durée des tests : jusqu'à 2h, une fois par jour, pendant au maximum 1 mois). Dans le cas d'un apprentissage court, la phase de test dure 10 minutes et la tâche comportementale peut-être répétée 2 fois à 2 semaines d'intervalle. Les animaux concernés sont isolés de 2 à 5 semaines. Les animaux concernés par la restriction alimentaire le sont pendant 5 semaines maximum. Pour les animaux concernés, une expression intracérébrale de protéines d'intérêt sera également pratiquée (1 fois, typiquement 1–2h). Une analyse histologique permettra de vérifier les sites d’enregistrement ou d’expression.
Impact sur les animaux
Certains animaux, qui subissent une chirurgie longue, peuvent souffrir d'effets indésirables comme l'hypothermie, la déshydratation et des douleurs post-opératoires. Certains animaux peuvent être maintenus dans des cages individuelles pendant une durée limitée et peuvent être soumis à une restriction alimentaire précise. Les animaux seront étudiés pendant leur période de repos car nous souhaitons aussi enregistrer leur sommeil. Ceci constitue un désagrément mineur puisque la tache comportementale dure relativement peu de temps et leur sommeil est naturellement fragmenté comparé à l'humain.
Devenir
À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique.
Remplacement
Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Dans le laboratoire, nous avons développé un modèle in vitro d’ondes hippocampiques qui a permis d’élaborer notre hypothèse de l’implication astrocytaire dans les ondes cérébrales du sommeil. Cependant, in vitro il n’est ni possible de reproduire un apprentissage comportemental ni de créer de façon satisfaisante un état comparable au sommeil. Tous deux nécessitent un réseau plus large que l’hippocampe qui n’est pas réalisable in vitro. De plus, certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico (modèles computationnels) mais les propriétés des astrocytes ne sont pas assez connues pour pouvoir en déduire des informations fiables biologiquement. In fine, l’étude des mécanismes de réseau de formation et de consolidation de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer à la fois un grand nombre d’astrocytes et des nombreux sites cérébraux (32 canaux répartis entre le circuit thalamocortical et l'hippocampe) simultanément ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. L'approche statistique tirera profit des tous derniers développements statistiques et analytiques du domaine. Ainsi, nos approches analytiques s’appuient sur de nombreux tests statistiques : tests paramétriques standards et tests non paramétriques.
Raffinement
Après les chirurgies, les souris seront surveillées et les points limites évalués quotidiennement pendant une semaine afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur validée pour éviter toute souffrance des animaux. Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotiques, analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux soit anesthésiés pour l’ajustement et l’optimisation de la position des sondes d’enregistrement, soit vigiles, libres de leurs mouvements (et non tête fixée) pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pour limiter le stress dû à l’isolement, nous utiliserons des cages transparentes placées à proximité les unes des autres, de façon que les animaux puissent rester en contact visuel, auditif et olfactif.
Choix des espèces
Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés (électrophysiologie à grande échelle, vecteurs viraux, optogénétiques). En outre, les souris peuvent porter une mutation génétique capable d’exprimer un marqueur fluorescent sensible au calcium et de marquer ainsi l’activité calcique des astrocytes, ce qui est à ce jour le seul moyen de suivre leur activité pendant la dynamique du cerveau au cours du sommeil. Nous utiliserons des souris adultes (2-8mois) pour lesquels, l'apprentissage et le sommeil sont bien caractérisés.
Création et caractérisation d’un modèle de souris pour l’étude d’un syndrome de retard mental d’origine génétique EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatorze femelles gestantes subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie, et 140 souriceaux une chirurgie sans réveil pour préparer des coupes de tissu. Au total, 1 064 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, pour créer une lignée modifiée reproduisant un syndrome de retard mental. Le porteur écrit que les nuisances sont inconnues puisque la lignée n'existe pas encore, puis énumère celles qu'il juge possibles : mortalité embryonnaire ou périnatale, retard de croissance, hydrocéphalie, et compétition pour l'accès à la nourriture au sein de la portée. Toutes les souris sont tuées, aucune ne pouvant être placée ailleurs, le porteur prédisant un "phénotype dommageable".
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement (TND) concernent près d’une naissance sur 10 dans les pays développés. Ils constituent un groupe hétérogène d’atteintes du développement du système nerveux qui regroupe des maladies souvent invalidantes et avec peu de perspectives thérapeutiques, tels que des syndromes de retard mental, ou des déficits musculo-squelettiques. Les TNDs sont très fortement influencées par la génétique, mais plusieurs centaines de gènes de prédisposition ont été identifiés, ce qui rend indispensable la compréhension de la fonction de ces gènes pour trouver les dénominateurs communs expliquant la symptomatologie et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet a pour finalité de créer des modèles de souris pour étudier une maladie causée par la mutation d'un gène qui a jusqu'à présent quasi exclusivement été étudié dans le contexte de son rôle dans la progression tumorale. Les fonctions de ce gène dans le développement du système nerveux et musculaire sont pour l’heure quasiment inconnues. L'objectif est de caractériser les fonctions de ce gène dans les neurones et les muscles pour comprendre la pathologie humaine. Pour cela, en collaboration avec une équipe américaine, nous allons générer une lignée de souris dite KO spécifique (uniquement dans les neurones) et caractériser cette lignée. Nous utiliserons également des souris pour des études cellulaires et pour des procédures chirurgicales pour étudier la connectivité cérébrale. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) où auront lieu respectivement l'élevage et la production des animaux, et le prélèvement de tissus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les causes du syndrome de retard mental en identifiant les fonctions du gène d'intérêt de l'étude, fonctions qui sont pour l’instant inconnues. Ces données permettront de mieux comprendre l’évolution de la maladie et d’améliorer le conseil génétique fourni aux familles de patients. Grâce au contact avec une association de patients, les connaissances issues de ce projet bénéficieront directement aux patients. De façon plus large, ce projet permettra de mieux comprendre les bases du développement cérébral et fournira des hypothèses pour d’autres maladies (retard mental etc...) causées par des mutations dans des gènes proches du gène d'intérêt.
Procédures
Le projet comprend la création d'une nouvelle lignée qui implique des accouplements pour créer les animaux (2 générations), puis des accouplements réguliers pour produire les animaux (nombre variable, étalé sur la durée du projet). Les animaux seront manipulés quotidiennement pour des observations non invasives et pesées. Des animaux seront mis à mort pour du prélèvement de tissus. Des animaux (14 femelles au maximum) subiront une procédure chirurgicale, d'une durée de 30 minutes, une fois pendant le projet. Des animaux (140 souriceaux au maximum) subiront une procédure chirurgicale sans réveil pour la préparation de tissus pour l'histologie.
Impact sur les animaux
S’agissant de la création d’une nouvelle lignée, les nuisances sont inconnues. Sur la base de ce qui est connu du syndrome de retard mental chez l’homme, nous pouvons émettre l’hypothèse que les nuisances ci-après peuvent survenir : mortalité embryonnaire ou périnatale, retard de croissance, hydrocéphalie. Ces nuisances peuvent entraîner du stress lié à la compétition avec le reste de la portée pour l’accès à la nourriture. Les animaux subiront une biopsie dans le but de leur identification, qui entraîne une douleur temporaire. Les animaux seront manipulés régulièrement pour le suivi de la lignée et les accouplements, entraînant un stress léger. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une dystocie. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. La chirurgie peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). Dans l'EU1, les animaux seront produits et manipulés. Au moment de la mise à mort, les animaux seront transférés dans l'EU2, dont les locaux sont situés à un autre étage du même bâtiment (durée de transport 2 minutes).
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées et nous prédisons un phénotype dommageable. Nous ne pouvons donc pas replacer les animaux à l'issue de l'étude.
Remplacement
Ce projet est consécutif à des expériences in vitro du gène d'intérêt qui ont démontré son importance pour le développement des neurones. Les données in silico (études transcriptomiques) et les données de la littérature ont été croisées avec les données de patients. Il est à présent nécessaire de confirmer les fonctions de ce gène dans le développement cérébral en générant un modèle animal, qui permettra de reproduire les atteintes retrouvées chez les patients souffrant du syndrome. Ce modèle permettra à terme de réaliser des expériences qui ne peuvent pas être reproduites in vitro telles que des tests des fonctions cognitives ou du comportement social. Par ailleurs, l’architecture cérébrale (développement et connectivité des neurones corticaux) ne peut pas être complètement reproduite à l’aide des cultures d’organoides, qui ne permettent notamment pas d’étudier la connectivité cérébrale. Par conséquent, la création d’un modèle murin est nécessaire pour compléter les études in vitro déjà réalisées.
Réduction
Ce projet vise à créer une nouvelle lignée, par conséquent il n'est pas possible de savoir à quoi s'attendre et de faire un test de puissance statistique préalable. Pour calculer un nombre d’animaux à inclure dans le projet, des hypothèses réalistes ont été émises sur la base notamment de l'expérience préalable avec d’autres lignées. Les calculs ont été optimisés pour utiliser le moins d'animaux possibles et maximiser les informations revueillies. Selon les données collectées, nous comparerons des proportions (génotypes), ou nous comparerons des valeurs moyennes (poids en fonction de l’âge), à l'aide de tests statistiques adaptés. Concernant la génération d’animaux en vue du prélèvement de tissus, le nombre d’animaux a été calculé afin d’avoir une quantité suffisante de tissus pour conduire les expériences tout au long du projet, sans avoir d’animaux surnuméraires. Pour certaines expériences, les souriceaux seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental et de ne pas réaliser de procédure inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. Les points limites sont basés sur les phénotypes attendus d’après la pathologie chez les patients, afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, l’équipe de recherche utilise des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information concernant les patterns de connectivité corticale. Le transport des souriceaux entre établissements utilisateurs est rapide puisque les deux sont situés dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport et mis dans un sac opaque, amenés dans l’EU2 (transport 2 minutes), où la mise à mort sera réalisée immédiatement afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.
Choix des espèces
La souris présente les avantages suivants : - un cerveau comparable au cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation du cortex cérébral, - un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), - Une petite taille adaptée à des préparations histologiques, - la possibilité de modifier l’expression de gènes par croisement de lignées transgéniques déjà existantes. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines chez les mâles, 7 semaines chez les femelles) et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés à des âges standards dans la communauté scientifique, et selon les phénotypes exprimés : jour embryonnaire E15.5 , jour postnatal P1, jour postnatal P10-P12, au moment du sevrage , et au jour P45 ou au-delà. Pour les expériences de culture de cellules musculaires, les animaux seront utilisés entre le jour postnatal P4 et P7.
Mécanismes d’échappement immunitaire du parasite Toxoplasma gondii au cours de la phase chronique de l’infection
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Deux gavages par jour, cinq jours par semaine, pendant quatre semaines, soit jusqu'à quarante administrations forcées par animal, après une infection par Toxoplasma gondii. 931 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélever le cerveau. En phase aiguë, le porteur indique que les souris peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids et présenter une forte prostration, l'objet du projet étant de tester des molécules censées rendre les neurones infectés à nouveau détectables par le système immunitaire. Aucun analgésique ni anti-inflammatoire n'est prévu, y compris la buprénorphine, au motif que ces molécules modifieraient les résultats.
Objectifs
Toxoplasma gondii (T. gondii) est un parasite intracellulaire très répandu, auquel environ 1/3 des êtres humains on été exposés. Des réponses immunitaires se développent suite à l’infection mais elles sont incapables d’éliminer le parasite qui persiste ensuite de manière latente dans les muscles, la rétine et le cerveau, sous forme de kystes intra-neuronaux. Plusieurs études suggèrent que des mécanismes d’échappement sont mis en place pour limiter la détection des neurones infectés par les lymphocytes T CD8+, ce qui favorise la persistence à long-terme du parasite dans le cerveau. L’infection chronique par T. gondii est problématique pour la santé car en cas d’immunosuppression, le parasite peut se réactiver et provoquer une encéphalite. De plus, un faisceau d’évidences récentes suggère que cette infection du cerveau, et la neuroinflammation chronique qui l’accompagne, perturbe les fonctions cognitives et accélère le déclin cognitif au cours de la maladie d’Alzheimer. Les traitements disponibles contre T. gondii sont efficaces contre la forme réplicative responsable de la dissémination au cours de l’infection aigue. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun traitement capable d’éliminer les formes enkystées, responsables de la chronicité de l’infection. Ainsi, ce projet vise à : (i) mieux comprendre les mécanismes moléculaires permettant à T. gondii d’échapper à la détection par les lymphocytes T CD8+ ; (ii) tester des molécules thérapeutiques pour lever les mécanismes d’échappement afin d’accentuer la détectabilité des neurones infectés par T. gondii vis-à-vis des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau et d’aboutir à une élimination (clairance) du parasite.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre (i) comment les formes persistantes de T. gondii dans les neurones interfèrent avec les neurones infectés pour limiter leur reconnaissance par les lymphocytes T CD8+, et (ii) à tester de nouvelles pistes thérapeutiques pour inverser les effets modulateurs du parasite dans le cerveau. Une meilleure compréhension des réservoirs parasitaires qui persistent en phase chronique de la toxoplasmose est essentiel car il n’existe actuellement aucun traitement contre les kystes. Cette forme latente du parasite peut se réactiver et causer une encéphalite potentiellement mortelle. De plus, l’infection latente chez l’immunocompétent est associée à des troubles neuropsychiatriques (e.g. schizophrénie), diverses altérations cognitives et une accélération du déclin cognitif. A terme, nos résultats pourraient identifier une nouvelle voie thérapeutique conduisant à l’élimination du parasite (clairance) en s’appuyant sur l’immunité naturelle des individus infectés et en rendant plus efficace l’action des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau. Ce projet pourrait avoir des retombées majeures et bénéfiques sur la prise en charge des personnes à risque de développer une encéphalite (e.g. porteuses du VIH ou subissant un traitement immunosuppresseur) ainsi que des individus touchés par des démences de type Alzheimer.
Procédures
Selon les procédures, les animaux seront infectés par : (i) injection intra-péritonéale, une fois ou (ii) gavage per os en 1 fois, qui est le mode naturel d’infection avec T. gondii. Ensuite, en phase chronique de l'infection, les animaux seront seront soumis à soit (i) des injections per os 2 fois par jour, à raison de 5 jours par semaine pendant 4 semaines, soit (ii) des injections intra-péritonéales à raison de 2 fois par semaine, pendant 4 semaines. A l'issue de ces procédures, les animaux seront éventuellement soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil, pour prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
La phase aigue de l'infection par T. gondii est symptomatique entre J7 et J15 pi (phase aigue) chez la souris. Pendant cette phase, les animaux peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial et présenter une forte prostration. Après récupération suit la phase chronique qui, dans les modèles d’infection latente que nous utilisons, est cliniquement asymptomatique (à l’exception de déficits mnésiques). Les symptomes d’ataxie/syndrome vestibulaire (tête ‘désaxée’, mouvements circulaires récurrents, ataxie) ne sont observés que dans les conditions ‘encéphalite’, rarement en condition latence. Dans les différentes conditions expérimentales que nous projetons de tester, nous nous attendons à observer un meilleur controle, voire une élimination, du parasite lors de la phase chronique, donc nous nous attendons à une moindre nuisance par rapport à l'infection controle. Enfin, les souris subiront des injections intrapéritonéales (i.p.) et des gavages (per os). Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et transitoire (secondes).
Devenir
Tous les animaux dans chaque procédure expérimentale seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses ex vivo ou in vitro.
Remplacement
Notre projet se focalise sur les interactions entre le parasite Toxoplasma gondii et des cellules du système nerveux (neurones) et immunitaire (lymphocytes T CD8+), qui assurent la surveillance du parasite dans le cerveau. Au lieu d'être propagé in vivo dans des souris comme c'était le cas auparavant, nous cultivons maintenant les tachyzoïtes sur des fibroblastes humains, ce qui contribue à l’objectif de remplacement. En outre, nous avons dédié une partie du projet (cf procédure 1 sans réveil) à l’étude de ces phénomènes in vitro grâce à des cultures de neurones primaires, ce qui limite le nombre d’animaux infectés passant en procédure sévère. Ces expériences in vitro permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de l'échappement immunitaire par les neurones infectés mais elles ne suffisent pas pour appréhender les conséquences réelles sur la physiopathologie de la toxoplasmose, ni la pertinence des traitements envisagés. Des infections expérimentales in vivo sont indispensables pour compléter ce projet car la complexité des systèmes immunitaire et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences in vitro) la ‘connectique’ de toutes les populations cellulaires mises en jeu. Par conséquent, il n’est actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (cf détails ci-dessous). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Basé sur nos précédentes études portant sur des modèles animaux similaires et sur la variabilité inter-individuelle, des lots de 8 animaux (groupes-tests vs. contrôles) sont nécessaires pour assurer la fiabilité de nos résultats, chaque expérience devant être répétée 3 fois. Le nombre d’animaux prévus correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations inter-expérimentales et les variations inter-individus.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), s’assurera de l’enrichissement de leur environnement et du respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). Lors des phases plus sévères (phase aigue de l’infection), l'expérimentateur vérifiera le poids et apportera une aide à l’alimentation quotidiennement (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)). Il/elle évaluera aussi l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation de la santé d’un animal atteignant les points limites d’arrêt de la procédure définis plus haut. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ces molécules sont connues pour interférer avec les processus inflammatoires et pourraient donc modifier les résultats de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique (buprénorphine) ont des propriétés immunomodulatrices.
Choix des espèces
T. gondii peut infecter tout animal homéotherme mais les rongeurs sont des hôtes naturels du parasite. Compte tenu des nombreux outils qui existent chez la souris, cette espèce est pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions entre l’hôte et Toxoplasma gondii. De plus, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit plusieurs caractéristiques retrouvées chez l’être humain : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite en cas d’immunosuppression, modifications comportementales.
Impact du procédé de fermentation sur l’allergénicité du gluten dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 500 souris femelles Balb/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées au gluten une fois par semaine pendant huit semaines, par injection dans l'abdomen ou par application sur la peau après provocation d'une inflammation cutanée. Un gavage déclenche ensuite la réaction allergique, avec chute de la température corporelle et douleurs stomacales attendues, la température étant relevée par voie rectale, et six prélèvements de sang sont faits au bout de la queue. Sur le remplacement, le porteur affirme que le modèle in vivo reste "irremplaçable" pour comparer les voies d'exposition et qualifie l'expérimentation animale d'"élément vital" du projet.
Objectifs
Les allergies sont répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. L’allergie au blé est l’une des allergies alimentaires les plus fréquentes, due principalement à un ensemble de protéines, nommé gluten. Le gluten est composé des allergènes majeurs de la céréale. Certaines études tentent de montrer l'intérêt des procédés de transformation dans la réduction des allergies. La fermentation appliquée lors de la fabrication du pain au levain peut engendrer une dégradation des protéines du gluten par certaines bactéries ou enzymes supposant ainsi une diminution de la réponse allergique. Cependant, le nombre d'études reste très limité. L'objectif de ce projet est d'évaluer la réponse allergique du gluten fermenté par une combinaison de bactéries lactiques, d'une levure ou d'une enzyme de grade alimentaire. En effet dans nos précédentes études, une bactérie et une enzyme ont été identifiées pour leur capacité à dégrader le gluten. L'influence de la voie d'exposition (percutanée ou intra-péritonéale) reste également largement à explorer. De ce fait, lors de ce projet, ces deux voies d'exposition sur le développement de l’allergie alimentaire au gluten sera évaluée. Pour cela, un examen approfondi des mécanismes immunologiques impliqués dans l’allergie au gluten et de l'influence du procédé de fermentation sera mené.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer l'impact du procédé de fermentation sur l'allergie au gluten. De ce fait, la réponse immunitaire précise sera élucidée pour chaque voie de sensibilisation (intra-péritonéale et percutanée). A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie du développement de l’allergie au gluten permettant d’améliorer la prise en charge des sujets atteints. Aussi, des solutions préventives pourront être proposées.
Procédures
Les souris seront sensibilisées 1 fois par semaine pendant 8 semaines par une injection intraperitonéale ou une application cutanée sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, 7 jours après la fin de la phase de sensibilisation. Pour une injection intrapéritonéale ou un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’injection ou d’administration (soit environ 10 secondes). Pour l’application cutanée sur l’abdomen ou le dépôt sur les narines, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie (soit 15 à 20 minutes). Toutes les souris auront également un prévèlement de 50 microlitres (3 à 4 gouttes de sang) à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 8) soit 6 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce protocole, il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, les différents moyens de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances notamment en raison de la répétabilité des gestes (1 fois par semaine pendant 8 semaines). Les souris sensibilisées par voie percutanée pourront ressentir un inconfort abdominal suite à la réalisation d’une inflammation cutanée pour permettre le passage de l’allergène. Les sensibilisations réalisées par voie intra-péritonéale peuvent également provoquer une gêne abdominale au niveau du point d’injection. La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), peut également contribuer à des nuissances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les organes pour analyse de la réponse immunologique et des marqueurs de l'allergie.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, dans le cas de l’étude de l’influence des différentes voies d'exposition, le modèle in vivo reste irremplaçable. Dans notre étude, les fermentas ont pu être testés sur un type de cellule mimant le processus de provocation, ces tests permettent de mettre en avant l'intérêt de certains échantillons. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, les allergies alimentaires sont caractérisées par des symptômes que seuls des modèles animaux, et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire. Ce projet présente enfin un réel intérêt dans la mesure où il modélise le développement de la réaction allergique au gluten et étudie l'impact d'un procédé de transformation.
Réduction
Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes et des tests statistiques, le nombre de souris a été déterminé à 20 souris par sous-groupe (hormis pour l'étude pilote, 10 souris par groupe seront utilisées). Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permettront de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 3 à 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi, une étude préliminaire sera effectuée sur un nombre de souris restreint par groupe (10 souris/groupe soit 20 souris au total), pour observer l'effet de l'application/d'injection de bactéries. Cela permettra d'affiner le protocole et la prise en charge de la douleur le cas échéant.
Choix des espèces
Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires (cellules spécifiques de l'allergie) seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et 4 semaines de vie au début des interventions. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.
Optimisation de la thérapie génique pour une maladie métabolique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Tatouées aux pattes, injectées par voie intraveineuse dès la naissance et amputées d'un bout de queue pour génotypage, les souris subissent ensuite des prélèvements d'urine quotidiens et des prélèvements de sang hebdomadaires, le suivi allant jusqu'à douze mois. 2 700 vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. La plupart sont tuées pour analyse des tissus, une partie restant en vie pour l'entretien de la lignée. Le projet compare plusieurs versions d'une thérapie génique contre une maladie métabolique rare de l'enfant, que le porteur décrit comme mortelle en l'absence de régime strict et qu'il reproduit chez la souris, tout en rangeant le risque de mortalité des animaux parmi de simples "nuisances ou effets indésirables".
Objectifs
Notre projet consiste à optimiser la thérapie génique pour une maladie métabolique génétique rare de l'enfant, mortelle en l’absence d’un régime alimentaire strict dans un modèle de souris développant la maladie de façon similaire à l’Homme. Nous testerons et comparerons différentes versions de la thérapie génique dans ce modèle pour sélectionner la plus efficace, capable de guérir la maladie.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer le meilleur produit de thérapie génique chez la souris, étape préalable indispensable avant de réaliser un essai clinique chez l’Homme.
Procédures
Les souris recevront une injection en intraveineuse, un tatouage sur pattes, un prélèvement unique de queue pour génotypage et des prélèvements d’urine et de sang seront effectués de façon quotidienne (urine) ou hebdomadaire (sang). Ces différents actes pratiqués par du personnel expérimenté seront le plus bref possible (1 minute/injection, 1 minute/prélèvement de sang ou d’urine).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus chez les animaux sont : un risque de mortalité chez certains animaux ; douleur de courte durée pendant le tatouage et prélèvement de queue ; douleurs de quelques minutes des suites d’injections IV et de prélèvements de sang sur souris vigile ; stress lié aux prélèvements d’urine.
Devenir
Animaux gardés en vie : animaux nécessaires à la seule fin du maintien de la lignée. Mis à mort pour analyse des tissu : animaux des expériences (tous sauf animaux nécessaires à la seule fin du maintien de la lignée)
Remplacement
Nous avons déjà testé les différents produits in vitro sur des cultures de cellules en laboratoire. Ceci permet d’évaluer l’efficacité des différents produits et de sélectionner les meilleurs. Cependant, l’utilisation d’animaux modèles reste indispensable. Il n’est en effet pas possible de prédire si les produits sélectionnés in vitro seront suffisamment efficaces pour traiter la maladie. De plus, seule l’utilisation d’un modèle animal permet d’étudier le développement éventuel d’une réaction de défense contre le traitement qui peut en diminuer l’efficacité. Ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour l’expérimentation est basé sur la base d’études publiées ayant développé une approche similaire et d’outils statistiques. Nous étudierons les réponses à nos traitements à la fois sur les mâles et les femelles réduisant ainsi le nombre d’accouplements et de souris malades non utilisées.
Raffinement
Les souriceaux malades seront surveillés 2 fois par jour de façon étroite, en particulier pour s’assurer de la prise en charge adéquate par la mère. Lors des injections du traitement chez les souriceaux, la mère sera éloignée afin de minimiser son stress. Les souriceaux seront recouverts de sciure de la cage de la mère et replacés rapidement dans la cage. Les quantités minimales de sang et d'urine seront prélevées par du personnel expérimenté et spécifiquement formé à ces procédures. Une nourriture enrichie pourra être introduite selon les besoins. Les souris seront gardées dans des portoirs ventilés dans lesquels nous ajouterons du coton en quantité suffisante, une maisonnette et des bâtonnets à ronger.
Choix des espèces
Le modèle de souris est préférentiellement utilisé car c'est un modèle de référence pour le développement des thérapies géniques au stade préclinique, indispensable avant passage à l’Homme. De plus, le modèle de souris utilisé est un excellent modèle de la maladie humaine étudiée. Les souris mâles et femelles seront traitées dès la naissance car les signes cliniques de la maladie apparaissent précocement pendant les deux premières semaines de vie. Les souris traitées seront suivies jusqu’à 12 mois de vie pour évaluer l’efficacité du traitement à long terme.
Rôle de la protéine NF2/Merlin dans la formation et la plasticité de la myéline chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 085 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour la quasi-totalité, une partie dès le sevrage parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché. À dix jours, chacune subit le prélèvement d'un millimètre de queue pour génotypage. Les souris retenues reçoivent ensuite un produit par injection intrapéritonéale ou par gavage, une fois par jour pendant quatre à cinq jours, puis passent trois tests comportementaux étalés sur trois semaines, portant sur l'intérêt social, la coordination motrice et la mémoire. Le porteur indique que le rôle de la protéine étudiée a déjà été caractérisé sur des cellules en culture, et conclut qu'il est "essentiel" de passer à l'animal pour observer la myéline en place et mesurer l'effet sur le comportement.
Objectifs
Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon acheminement de l’information nerveux, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacent de façon coordonnée. L’objectif de ce projet est de permettre la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la formation des gaines de myéline. La myéline étant une structure modulable tout au long de la vie, l’identification de cibles moléculaires permettant d’actionner cette dynamique au cours du développement et chez l’adulte, représente un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Il a été démontré qu’une protéine, que nous appellerons protéine A, exprimée dans l’oligodendrocyte, contrôle la formation de la myéline dans des oligodendrocytes mis en culture. Nous souhaitons donc étudier en profondeur le rôle de cette protéine dans le déclenchement de la formation de la myéline chez l’animal, in vivo, au cours du développement et à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation au cours du développement et à l’âge adulte et de la remyélinisation permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la formation de myéline. En effet, en identifiant les conséquences de la suppression de l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline, nous apporterons une meilleure compréhension de comment est régulée la formation de la myéline.
Procédures
Afin de connaitre le génotype des animaux générés pour cette étude (animaux dont trois gènes ont été modifiés pour supprimer l’expression de la protéine A dans les oligodendrocytes à l’âge adulte), un petit bout de tissu de 1mm sera prélevé sur chaque souris, une seule fois au niveau de la queue. Ce geste sera effectué sur des souris âgées de 10 jours (moins d’une minute par animal). De jeunes souris en développement ou adultes seront injectées par voie intrapéritonéale (dans le péritoine au niveau du ventre) ou administrées par voie orale par gavage (avec un produit conçu pour induire la délétion de la protéine A dans les oligodendrocytes), une fois par jour pendant quatre ou cinq jours consécutifs maximum, 1-2min/animal. Les tests comportementaux auxquels seront soumises les souris (pour apprécier l’intérêt social, la coordination motrice et la mémoire/flexibilité cognitive) sont non invasifs et seront effectués du moins au plus stressant, espacés d’une semaine entre chaque test. Chaque test dure au maximum 1 heure, entre le moment où la souris est sortie de sa cage et le moment où elle y retourne. Les animaux seront soumis à 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 3 semaines. Le 1er test sera réalisé une fois par jour pendant 5 jours, chaque animal réalisera 3 essais, et le test durera 1h par animal maximum. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le 2ème test qui sera réalisé 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (maximum 5 jours. Une période de repos de 3 jours sera respectée avant de commencer le dernier test composé de trois jours d’apprentissage et un jour de test (total 4 jours). Le placement de l’animal dans l’espace de test peut être une source de stress. En fin d’expérience, les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Les animaux âgés de 10 jours ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique (1mm de tissu).Un stress et/ou douleur de courte durée peut être observé chez les souris à la suite de la contention (prise de la souris dans la main de l’expérimentateur) et à l’injection d’un produit permettant d’induire la délétion de la protéine A dans les oligodendrocytes en intrapéritonéal (piqure) ou par gavage (avec une paille en métal ou en plastique). Ce traitement aura lieu quotidiennement pendant cinq jours. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire : - Soit au moment du sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt. Soit à des fins expérimentales nécessitant le prélèvement des cerveaux pour une étude structurelle et développementale de la myéline (A noter que lorsque cela est possible, les animaux non porteurs du génotype d’intérêt seront proposés aux autres équipes de recherche de l’institut.
Remplacement
La gaine de myéline est une structure en trois dimensions : c’est une extension de la membrane de l’oligodendrocyte qui s’enroule autour d’un axone (bras du neurone). Suivant le principe de remplacement, le rôle de la protéine A a bien été caractérisé sur des cellules mises en culture. Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le système nerveux central et surtout l'activité électrique des neurones. De plus, afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles et physiques, nous voulons analyser l’impact sur le comportement cognitif de l’animal.
Réduction
Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux (4085). En raison de l’inclusion de l’élevage et des aléas inhérents aux aspects zootechniques et au fait que nous étudions séparément les mâles et les femelles (la répartition des naissances n’étant pas contrôlable et pas toujours équivalente entre les deux sexes), notre calcul d’effectif doit comprendre une marge. Nous produirons et utiliserons uniquement le nombre strictement nécessaire d’animaux pour générer les lots expérimentaux. Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillerons en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés.
Raffinement
L’animalerie est agréée : les conditions d’hébergement (stabulation en portoirs ventilés dans des conditions de température, hygrométrie, éclairage et espace maintenus dans les références recommandées) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (matériel de nidification et à ronger adaptés aux besoins des aniamux), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale. Toutes les injections seront faites par des personnes compétentes. Des points limites sont mis en place et respectés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement par l’équipe de zootechnie et deux fois par semaines par notre équipe, pesés régulièrement au cours de leur procédure. Si les animaux présentent des signes de souffrance (plaie, amaigrissement, posture anormale, poil non soyeux, prostration, signes de douleur, zone d’injection gonflée ou indurée, petits exclus de la nichée, non pris en charge par sa mère), l’avis du vétérinaire référent sera immédiatement demandé et les traitements nécessaires seront appliqués. Si besoin pour éviter toute souffrance, l’animal pourra être euthanasié.
Choix des espèces
La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes recherchés présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. Dans un premier temps, nous avons choisi d’induire la délétion de la protéine A très tôt au cours du développement (à partir du jour 1 ou 14 post-naissance). Ainsi nous pourrons étudier dans le temps les conséquences de la perte de la protéine A dans les oligodendrocytes sur la formation de la myéline au cours du développement. Nous avons pour cela choisi 5 stades à étudier : 21 jours de vie et 30 jours de vie (différenciation oligodendrocytaire et myélinisation intenses), 60 jours de vie (jeunes adultes, fin du développement), 120 et 180 jours de vie (souris adultes âgées). Un âge avancé nous permettra de vérifier les modifications de la myéline induites par la modification génétique. Dans un second temps, nous induirons la délétion de la protéine A à 60-90 jours de vie, donc chez l’adulte, un stade où le paysage myélinique est globalement formé. Ainsi, nous pourrons évaluer l’impact sur la myéline de la perte de la protéine après 1, 2 et 3 mois post-induction du modèle afin d’évaluer si les voies protéiques contrôlées par A sont indispensables au maintien des gaines dans le temps, mais également les conséquences sur le comportement des souris.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire humain
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 000 souris immunodéficientes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune recevant dans la veine de la queue une injection de cellules sanguines humaines destinée à lui faire développer un système immunitaire humain. Celles de la phase de validation subissent des prélèvements de sang jusqu'à une fois par semaine et sont tuées quand les points limites sont atteints, entre quatre et douze semaines après l'injection. L'effet secondaire attendu est la maladie du greffon contre l'hôte, que le porteur décrit comme une réponse inflammatoire sévère avec altération de la peau, des organes et des poils, perte de poids et douleur. Les souris de la phase de production, elles, ne restent que deux à trois jours avant d'être expédiées à des partenaires académiques et industriels, le nombre produit correspondant au nombre commandé.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines pour obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles développent un système immunitaire humain après la greffe des cellules humaines. Le développement et la production de souris humanisées par injection de cellules du sang humain consiste à proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptées en recherche biomédicale sur les maladies inflammatoires aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). En effet, ce type de modèle permet l’étude de nombreuses pathologies dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle majeur chez l’Homme dans des domaines tels que la production de cellules du sang, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccination, l’oncologie et les maladies auto-immunes. Ces modèles permettent également l’amélioration de traitements et des méthodes de diagnostics notamment en oncologie, le cancer étant la première cause de mortalité prématurée, mais aussi les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies d’origines infectieuses. Parmi les traitements, l’immunothérapie fait partie de ces nouveaux traitements innovants qui a révolutionnée la prise en charge des patients atteints de cancer. L’oncologie n’est pas le seul domaine dans lequel l’immunothérapie a eu des effets prometteurs et encourageants, les maladies inflammatoires chroniques ainsi que certaines maladies d’origines infectieuses sont sensibles à l’immunothérapie. Le recours à ces souris humanisées devrait permettre d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques nécessitant des modèles expérimentaux au plus proche de la situation humaine et permettant l’étude des réactions inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le développement des souris humanisées pour le système immunitaire permet d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques et immunologiques, d’identifier des marqueurs biologiques caractéristiques et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. Les modèles de souris « humanisées » sont donc des modèles très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques. L’un des avantages de ce modèle est le développement rapide du système immunitaire chez son hôte et la multiplication des cellules d’intérêt capable de déclencher une réponse inflammatoire. Depuis quelques décennies, le modèle humanisé est notamment très présent dans les études de nouvelles thérapies innovantes, dites immunothérapies. Il s’agit de thérapie qui se basent sur le fonctionnement du système immunitaire et de sa compréhension afin de combattre la pathologie du patient. Il n’est plus question de viser directement l’infection ou la tumeur, mais d’activer/booster le système immunitaire. De grand espoirs sont fondés notamment sur la médecine dite « personnalisée », pour laquelle ces modèles permettraient de greffer le système immunitaire et la tumeur d’un patient à des souris pour tester plusieurs thérapies avant l’administration du traitement le plus efficace au patient.
Procédures
Pour la phase de validation, une injection unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue et, des prélèvements sanguins seront effectués à plusieurs reprise jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation dans la veine sous-mandibulaire. Pour la production, une injection intraveineuse unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue. Chaque geste sera réalisé en moins d’une minute pour diminuer au maximum le stress et la douleur.
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les souris vont être déplacées pour être envoyées en zone de production, ou lors du transport chez le partenaire. Ces déplacements peuvent induire un certain stress par la manipulation et les bruits inhabituels. Les souris recevront une injection dans la veine de la queue, ce qui pourra engendrer un bref stress et/ou douleur. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés sur de petit volume et au maximum une fois par semaine, ce qui pourra aussi induire un stress et/ou une douleur transitoire. Un effet secondaire lié à l’injection de cellules humaine du sang à la souris est l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte, amenant de graves lésions tissulaires à travers une réponse inflammatoire sévère (altération de la peau, des organes, des poils, perte de poids et douleur).
Devenir
Les animaux de la phase de validation seront mis à mort lorsque les points limites auront été atteints. Les animaux de la production seront expédiés.
Remplacement
Pour le moment, ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe mimant le système immunitaire humain, mélangeant de nombreux mécanismes encore méconnus qui nécessitent encore des avancées en recherche fondamentale. Actuellement, il n’existe pas d’équivalent aussi complet in vitro, ex vivo ou in silico. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique afin de déterminer le nombre d’animaux à inclure dans nos sous-groupes. Les paramètres utilisés sont tirés de la recherche bibliographique et de nos données internes relatives au processus. Nous avons établi qu’un groupe d’un minimum de 60 souris sera planifié pour chaque modèle animal immunodéficient et scindé en deux groupes qui seront eux-mêmes divisés en 2 ou plusieurs sous-groupes pour tester les différentes quantités de cellules à injecter. Soit un nombre de 15 animaux par sous-groupe. Le nombre de souris à tester a été calculé en prenant en compte : • que le test devra être répété. • qu’il est possible que la greffe ne soit pas concluantes chez certains animaux. Deux paramètres nous permettrons de déterminer la quantité de cellules du sang humain à injecter la plus adaptée : • Le taux d'humanisation • Le temps d’apparition des points limites. Plus le temps d’apparition des points limites sera tardif et plus cela laissera du temps aux partenaires de faire ses études. Grâce aux résultats obtenus nous pourrons faire des analyses statistiques. Si les résultats ne sont pas concluants, des tests complémentaires pourront être menés pour évaluer la dose administrées ou l’impact d’un donneur sur l’humanisation. Grâce à la validation du protocole et à son optimisation pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine par modèle, nous réduirons d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris souhaitées. Pour la production, ce protocole sera exclusivement réalisé après réception d’une commande du partenaire afin de limiter le nombre d’animaux humanisés. Le nombre de souris produits correspondra donc au nombre de souris commandées.
Raffinement
Un hébergement sous barrière sanitaire de niveau élevé est appliqué (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. Concernant les prélèvements sanguins, les animaux seront prélevés de manière répétée jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation au niveau de la veine sous mandibulaire pour que le prélèvement soit le moins invasif possible. Le volume maximal prélevé respectera les recommandations de 7.5% du volume sanguin de la souris afin que les souris puissent être prélevées 1 fois par semaine. L’apparition de la maladie du greffon chez les souris humanisées est également un point important. Les animaux seront donc observés quotidiennement et évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique. Une attention particulière sera apportée à tout animal présentant des signes potentiellement avant-coureurs de la maladie du greffon pour appliquer des points limites. Pour un état observé dit « normal », les souris seront pesées 1 fois par semaine. Si l’état général de la souris se dégrade un examen clinique de la souris sera appliqué avec la mise en place d’une pesée plus régulière en fonction du développement de la maladie du greffon contre l’hôte. Après production, les souris seront expédiées aux partenaires. Pour limiter le stress occasionné par le transport, des processus d’envoi ont été établi. Pour des transports de moins de 24 heures à 48heures, tous nos colis contiennent de la litière, des l’enrichissement de l’aliment et un gel de transport. Pour les transports plus longs comme ceux en avion, la quantité d’aliment et de gel de transport est doublé.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets de nos partenaires. La souris est simple à élever, relativement peu coûteuse à reproduire, à entretenir en grand nombre et à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. La souris est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, sa courte gestation, de sa durée de vie et de la nécessité en réactifs expérimentaux en plus faibles quantités. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de souris génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. Que ce soit pour la validation ou la production, les souris entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge jusqu’à l’atteinte des points limites pour la phase de validation, ce qui peut représenter plusieurs semaines après l’injection des cellules (entre 4 et 12 semaines post humanisation en fonction de la quantité de cellules injectées). Les souris de la phase de production entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge. Elles seront ensuite envoyées aux partenaires deux à trois jours après l’injection des cellules humaines. S’agissant d’un modèle pour des études à court terme avec un développement rapide de la maladie du greffon, nous choisissons d’envoyer rapidement les animaux afin qu’ils puissent commencer leurs protocoles expérimentaux le plus tôt possible.
Evaluation de la physiopathologie de la drépanocytose au niveau centrale et périphérique dans le modèle murin Townes
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Porteuses de la drépanocytose, les souris du modèle Townes sont utilisées ici pour étudier les défauts de production des globules rouges et les obstructions de vaisseaux qui accompagnent la maladie. 524 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection puis une série de cinq ou vingt prélèvements sanguins sous anesthésie espacés d'une semaine, ou subissent une chirurgie du muscle crémaster. Le porteur range parmi les atteintes attendues la piqûre de l'aiguille et l'angoisse liée aux pesées, sans dire ce que produit la drépanocytose elle-même chez ces souris, et indique qu'elles seront tuées pour caractériser leur moelle osseuse et leurs vaisseaux.
Objectifs
L’objectif de notre étude porte sur la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la survenue de la drépanocytose. Ce projet s’articule autour de trois objectifs principaux : 1. Evaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à des défauts d’hématopoièse, l'ensemble des mécanismes qui assurent la production des différentes cellules sanguines, et d’érythropoïèse, l'ensemble des mécanismes qui assurent la production des globules rouges; 2. Disséquer les mécanismes cellulaires associés à la survenue des crises vaso-occlusives,des obstructions locaux de la circulation sanguine; 3.Evaluer le mécanisme d’action et l’efficacité de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés à la drépanocytose et d’identifier les mécanismes d’action et l’efficacité de candidats médicaments afin d’offrir dans un futur proche un nouvel arsenal thérapeutique dans la prise en charge de cette maladie.
Procédures
En fonctions des groupes expérimentaux d'appartenance, les animaux subiront: 1. une injection et une série de 5 ou 20 prélèvements sanguins sous anesthésie (3min) tous espacés de 1 semaines; 2. une chirurgie sur le cremaster sous anesthésiée.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins, les injections et l'anesthésie constitueront une nuisance pour les animaux. La piqure d'aiguille pour l’injection ainsi que les prélèvements sanguins entraînent une douleur légère de courte durée. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Les souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une caractérisation de leur système hématopoïétique et vasculaire qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques d’hématopoïèse, d’érythropoïèse et de thrombose nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
En nous appuyant sur un test d'effectif, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir d’étudier la physiopathologie de la drépanocytose dans la moelle osseuse et dans les vaisseaux sanguins. Le calcul d’effectif sera réalisé sur la base d’une expérience pilote qui implique elle-même un nombre minimum d'individus déterminé sur la base de données de la littérature. La comparaison des différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés à ces petits effectifs.
Raffinement
Le suivi des traitements se fera par des mesures utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés et afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proches de l’homme pour sa physiologie. Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour adresser les questions relatives à l’hématopoïèse, à l’érythropoiese et à la thrombose. En effet les caractéristiques moléculaires des cellules hématopoïétiques murines sont très semblables aux cellules hématopoïétiques humaines. Chez l’Homme la drépanocytose est une maladie qui se déclare dès la naissance et qui nécessite une prise en charge thérapeutique précoce. Nous utiliserons des individus sevrés avec un suivi de 4 à 24 semaines post-naissance (de jeunes à adultes).
Nouvelle combinaison thérapeutique dans le traitement de la stéatohépatite non alcoolique chez la souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Deux injections par semaine pendant dix semaines, chacune précédée d'une incision de deux millimètres au bout de la queue pour prélever une goutte de sang : 90 souris sur les 133 utilisées suivent ce protocole, après un régime enrichi en lipides et en sucre. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour prélever leur foie et leurs autres organes. L'objectif est de tester la combinaison d'un peptide médicament et de molécules issues de cellules souches contre la stéatohépatite non alcoolique. Sur les atteintes attendues, le porteur décrit ce que produit la maladie chez le chat et chez l'être humain, note que ces symptômes n'ont pas été décrits chez les rongeurs, et ne dit pas ce que les souris elles-mêmes vont ressentir.
Objectifs
La maladie du foie gras encore appelée NAFLD est une pathologie hépatique couramment retrouvé chez l'Homme, sans qu'il y ait eu d'abus d'alcool. La forme la plus grave correspond à l'accumulation de graisses associée à un dépot excessif de substances cicatritielles dans le foie, que nous résumerons sous le terme de NASH. La NASH, corrélée à l’obésité et au diabète, représente un problème majeur mondial de santé. Environ 20 % des personnes atteintes de foie gras évoluent vers la NASH, qui dans les cas les plus graves, évolue vers une cirrhose voire, vers un cancer hépatique. Acctuellement, la transplantation hépatique est le seul traitement efficace. Notre objectif principal est de combiner deux traitements pharmacologiques : un peptide médicament et de molécules bioactives (MB) issues de cellules souches. Nous prévoyons que ces deux traitements exerceront un effet complémentaire pour limiter la progression de la NASH, réparer le tissu hépatique et le rendre de nouveau fonctionnel. Ensemble, cette combinaison vise à traiter les causes profondes de la maladie en amont de la cicatrisation exacerbée, offrant ainsi une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour prévenir la progression de la NASH. Les modèles de souris reproduisent les conditions cliniques pour une compréhension intégrative de la maladie et des complications associées dans les autres organes. Ceci rend difficile de simplifier l'étude par des systèmes cellulaires. Notre modèle murin nourri avec un régime enrichi en lipides/ sucre, se rapproche de la pathologie humaine et de son évolution et sera moins de nuissances que les modèles déjà décrits dans la littérature où une perte de plus de 20% du poids corporel est décrite associée à un effet hépato-toxique. Le peptide médicament utilisé,est aujourd'hui testé chez le patient pour une autre pathologie. L'absence d'effets secondaires, observée dans ce dernier cadre tant chez l'homme que chez la souris, en fait une molécule sure pour notre étude sur la NASH. L'injection MB a été décrites dans la littérature comme ayant des effets secondaires limités chez l'homme et l'animal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont importants. D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes pathologiques et notamment inflammatoires dans la NASH et leur potentiel résolution. D’un point de vu clinique, cette étude permettrait d’apporter des données majeurs et solides pour l’utilisation de cette thérapie combinée chez les patients atteints de NASH et pourrait s’avérer être une alternative efficace aux futurs traitements en cours de développement.
Procédures
Sur les 133 souris ulisées, 111 souris seront soumis à un régime enrichi en lipides/sucre. Parmi ces dernières, 90 seront soumis au traitement anti-NASH avec le peptide médicament ou avec du liquide physiologique et/ou avec les MB., sur une durée de 10 semaines à raison de 2 injections hebdomadaires (100 µL maximum). Avant chaque injection, un prélèvement sanguin ( 1min max) de 10 µL au niveau de la queue (incision 2 mm) sera réalisé pour controler le niveau du sucre dans le sang.
Impact sur les animaux
Chez le chat, la NAFLD est associé à un jaunissement et une perte de poids sévère et à des vomissements. Ces symptomes n'ont pas été décrits à notre connaissance dans la littérature chez les rongeurs. Selon les données cliniques, la NASH ne présente pas de symptômes chez l'homme. Dans quelques rares cas, un état d’inconfort dans l’abdomen au niveau du foie, de la fatigue, une sensation générale de malaise et un vague inconfort sont décrite. Une diminution progressive de la fonction hépatique pourrait potentiellement être à l’origine de l’apparition d’un jaunissement, d’un œdème. Un état d'incofonrt de la locomotion expliquée par la prise régulière du poids de la souris pourrait etre observée. Une douleur légère de courte durée de la piqure de l'aiguille sera ressenti lors de l'evaluation de la glycémie hebdomadaire.
Devenir
A la fin de chqcune des 2 procédure les animaux seront anesthésiés avant d'être euthanasiés afin de prélever leur tissus et leurs organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses moléculaires.
Remplacement
L'utilisation de modèles murins est indispensable en raison de la complexité de cette maladie qui implique plusieurs organes comme la rate, le foie, le tissu adipeux, etc. Notre stratégie thérapeutique repose sur la modulation 1- du système immunitaire pour atténuer la progression de la NASH, 2- d’une réduction de l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui rend indispensable l'étude de ces interactions complexes. A ce jour, il n'existe aucun modèle in vitro fiable et adapté pour une telle étude intégrative. Cependant, nous avons réalisé des tests in vitro sur une lignée cellulaires cultivées en milieu enrichi en graisses, où nous montrons un effet protecteur du peptide médicament, et un effet réparateur des MB. Ces essais nous rendent confiants sur l'efficacité combinée du peptide et des MB sur notre modèle murin mimant la NASH. Les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète de la maladie et de l'effet de la modulation immunitaire sur son évolution ce qui rend difficile de simplifier l'étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d'analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n'existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement, statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n= 7 souris (procedure 1) et de n = 15 souris (procedure 2). Elle a été calculée, en tenant en compte du risque de décès prématurés et en utilisant un logiciel statistique adapté. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, les procédures seront interrompues pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Pour la procedure 2; l'expérimentation sera réalisée en 3 fois afin que scientifiquement nous ayons 3 expériences indépendantes (soit 5 animaux/groupe/ période expérimentale). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant 1- qu'en cas des points limites atteints, d'arreter la procedure, de la revoir (i.e. temps d'injection, quantité injectée du peptide, age des souris...) après discussion avec le comité d'éthique... voire de stopper définitivement la procedure; 2- qu'en cas d'obtention de résultats statistiquement significatifs apres le 1er et/ou le 2e essais, les essais suivants (2 et 3, respectivement) pourront alors ne pas avoir lieu. Les variables quantitatives seront analysées par des tests statistiques. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d'animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d'autres projets en cours ou futurs.
Raffinement
La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de production d'urine excessive des souris NASH (valable surtout en fin de procédure pour les souris NASH non traitées). Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux du même sexe seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte, 30 minutes maximum) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées lors de certaines méthodologies (injections) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention (prise de sang). Cela devrait réduire le stress au minimum. Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de gain de la masse corporelle) ou d'un taux élevé de sucres dans le sang (> 6g/l ) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de l'euthanasie de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases des injections, des anesthésiques généraux seront administrés. Une grille de score définie nous permettra d'évaluer l’état dans lequel se trouvent les individus. Afin de limiter les perturbations locomotrices, l'age de 2 mois post-natals des souris pour le début du traitement et la durée de 10 semaines (pour le traitement) ont été choisis afin que le phénotype dommageable ne soit pas atteint. Ainsi cette nuisance devrait être limitée dans la durée de la procédure (10 semaines). Au moment de l'euthanasie, de part l'expérience que nous avons de ce modèle nous estimons que les souris non traitées ne devraient pas atteindre le phénotype dommageable (e.i poids >40 g). Si c'est le cas avant la date d'euthanasie, initialement déterminée, alors nous interromprons l'ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors euthanasiées pour l'analyse tissulaire.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et le meilleur compromis entre les besoins expérimentaux et le respect du critère de choix de l’espèce. Deux souches seront nécessaire à l'étude, les souris obèses qui subiront les traitements et des souris controles non diabétiques, non obéses, non traitées qui représenteront le témoin négatif et la référence de poids normal. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation des procédures.