Recherche fondamentale

1 282 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères sont soumises à une alimentation grasse hypercalorique pendant la gestation et la lactation, puis mères et descendance subissent des gavages, des prélèvements sanguins répétés et des tests de tolérance au glucose sur animal vigile, pour étudier l'effet d'une supplémentation en une vitamine. La plupart sont tuées pour prélèvements, seules 80 souris adultes du groupe témoin pouvant être conservées pour l'élevage selon les besoins de l'unité. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes de substitution" pour étudier ces paramètres métaboliques et conclut à un usage "indispensable" de la souris.

Objectifs

Rechercher par quels mécanismes biologiques la supplémentation orale en molécule M chez la mère pendant la grossesse et la lactation améliore la santé métabolique de la descendance.

Bénéfices attendus

Identification du mode d’action de la molécule M lors de la supplémentation orale pendant la gestation et la lactation, en vue de la mise en place d'un protocole de supplémentation systématique chez la femme enceinte et réduire ainsi les facteurs de risque d'obésité chez l'enfant.

Procédures

Ce projet nécessite l’exploration fonctionnelle du contrôle glycémique chez la souris. Les animaux seront ainsi soumis à des tests de performance métabolique, comparables à ceux utilisés chez l’Homme, permettant d’apprécier le rôle physiologique de l’insuline et de détecter des états pré-diabétiques et diabétiques, caractérisés par une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline, voir une hyperglycémie à jeun. Ces tests nécessitent des administrations pharmacologiques et des prélèvements sanguins. Les animaux recevront une charge soit de glucose (2g/kg) soit d’insuline (0,75u/kg) par voie intrapéritonéale et un relevé des excursions glycémiques sera réalisé après administration. Pour cela, des prélèvements sanguins (10 microlitres) seront réalisés afin de mesurer la glycémie et l’insulinémie des animaux. En pratique, 7 prélèvements seront réalisés sur une durée de 135 minutes. Comme chez l’Homme, ces tests de performance métabolique sont réalisés impérativement sur sujet vigile car les anesthésiques sont hyperglycémiants et sont incompatibles avec les paramètres physiologiques mesurés. Les procédures de ces tests sont parfaitement maitrisées et le mode opératoire est parfaitement cadré et partagé par la communauté scientifique.

Impact sur les animaux

Le modèle expérimental de mise sous régime HFD maternel pendant la gestation et la lactation provoque un stress métabolique qui se traduit par une adiposité supérieure voir une intolérance au glucose (cette dernière est recherchée dans ce projet). Il n'y a pas de dystocie, et la taille des portées et le sex-ratio à la naissance est conservé dans ce modèle. D'autre part la consommation en molécule M exogène n’a pas d’effet indésirable connu. La supplémentation orale en molécule M, qui est une vitamine, vise au contraire à contrer une carence induite expérimentalement par une alimentation maternelle appauvrie (modèle conventionnel HFD semi-synthétique). La supplémentation orale en molécule M dans ce contexte a donc un effet bénéfique attendu. Les tests de tolérance au glucose pourront provoquer soit une hypoglycémie (injection d'insuline) ou une hyperglycémie (injection de glucose). Enfin les tests de prélevements sanguins au bout de la queue sont succeptibles de générer un inconfort.

Devenir

Tous les animaux soumis au régime hypercalorique et/ou à la molécule M sont soit mis à mort au cours de la procédure (pour prélèvements post-mortem) ou en fin de procédure (par inhalation de CO2) car ils ne peuvent être conservés pour d'autres études de l'unité, du fait de cette programmation nutritionnelle obésogène. En revanche les 80 souris adulte (mâles et femelles) soumis au régime standard et qui participent au projet uniquement pour produire une descendance F1 controle (qui sera quant à elle étudiée), seront soit mises à mort (par inhalation de CO2) soit éventuellement conservées à des fins d'élevage, en fonction des besoin de l'équipe ou de l'unité. Le choix sera donc fait par la responsable de l'animalerie.

Remplacement

Les animaux de laboratoire nous permettent de modéliser l’obésité nutritionnelle et ses complications. Leur utilisation est indispensable pour décrire les processus qui se déroulent pendant l’installation de cette maladie, souvent asymptomatique dans sa phase précoce, et qui ne sont pas encore totalement élucidés à ce jour. Il n’existe pas de méthodes de substitution permettant d’étudier les paramètres physiologiques complexes recherchés dans nos études (prise alimentaire, dépense énergétique, thermogenèse, glycémie, adiposité, etc). Ces paramètres mettent en jeu des arc-réflexes, des rétrocontrôles, et des dialogues entre les organes qui ne peuvent être modélisés complètement. De plus, ces paramètres sont l’expression d’une perception et intégration cérébrale de signaux nutritionnels et métaboliques qui ne peut être étudiée que dans un organisme vivant.

Réduction

Les procédures décrites dans ce projet, ainsi que la stratégie expérimentale, ont été optimisées, standardisées et validées lors d'une précédente étude. L’optimisation des procédures réduisent la variabilité interindividuelle et évitent des études pilotes supplémentaires, ce qui finalement réduit les effectifs nécessaires au projet. Cela permet également de déterminer le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour mener à bien les analyses statistiques et donc là encore d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Le personnel a été formé et maitrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les aliments et l’eau de boisson sont fournis ad libitum. Les animaux sont surveillés quotidiennement et des soins vétérinaires peuvent être donnés au besoin selon l’avis d’un vétérinaire. Les conditions d’hébergements sont enrichies (maison et matériaux de nidation) et apportent des conditions optimales permettant l’expression de comportements innés (vie sociale, gestation, enfouissement, nidation, protection, lactation).

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Sa taille est compatible avec la dissection de tissus et organes d’intérêt permettant des analyses biochimiques, cellulaires, moléculaires, et histologiques. Cet animal permet d’obtenir des analyses pertinentes du comportement alimentaire. La réalisation de différents tests fonctionnels explorant les performances métaboliques est aussi possible chez cet animal, comme la recherche de la tolérance au glucose et la sensibilité à l’insuline, du fait de nombreuses similarités qui existent avec le métabolisme de l’espèce humaine. Les stades de développement étudiés sont les suivants : Stade postnatal P5, P8, P12 (descendance) : ce stade permet d’étudier le rôle neurotrophique de l’insuline (cf procédure 3) Stade postnatal P2 (descendance) : ce stade permet d’étudier le développement sensoriel des animaux (cf procédure 4) Stade postnatal P17 (descendance) : ce stade permet d’étudier la maturation du système neuronal à mélanocortine (cf procédure 5) Stade postnatal P60 (descendance) : ce stade permet d’étudier le contrôle glycémique des animaux (cf procédure 6) Stade adulte (mère) : ce stade permet de caractériser le modèle expérimental et d’évaluer le contrôle glycémique (cf procédure 2)

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de dérivés de la kétamine puis passent une série de tests comportementaux, dont le test de la nage forcée, le labyrinthe en croix surélevé, l'open field et le splash test, pour évaluer un possible effet antidépresseur. Le porteur retient la souche Balb/C pour son "phénotype naturellement anxieux", ce qui lui évite d'infliger un stress supplémentaire. Il affirme que les réponses comportementales et la pharmacodynamie de ces molécules ne sont "pas modélisables" sans animaux.

Objectifs

Notre projet vise à édudier les effets antidépresseurs des dérivés de la kétamine (NPS) sur des souris Balb/C de phénotype anxieux. Ces effets seront étudiés d'un point de vue pharmacocinétique et comportemental.

Bénéfices attendus

Le potentiel thérapeutique des dérivés de la kétamine (appelé nouveaux produits de synthèse, NPS) n'a jamais été étudié. Cette étude pharmacologique et comportementale permettra d'identifier un potentiel candidat médicament ayant une activité pharmacologique "antidépresseur".

Procédures

Etude pharmacocinétique : 1 prélèvement sanguin/animal : 2 min (n=200); Comportement: 5 à 10 minutes (n=180) : 1-Test de la nage forcée : Les souris sont placées dans des bocaux de 10 cm de diamètre et de 30 cm de profondeur remplis d’eau tiède (25°C). Ce test de 6 minutes, mesure le temps de nage ainsi que le temps d’immobilité (n=45) 2- Test du labyrinthe en croix surélevé : Ce labyrinthe est composé de 2 bras ouverts et de 2 bras fermés reliés par une plateforme centrale, à 50 cm au-dessus du sol et éclairée par une lampe de faible puissance. Les souris peuvent explorer librement l’ensemble du labyrinthe pendant 5 minutes. Une caméra permet l’enregistrement des déplacements. Un phénotype anxieux se caractérise par une diminution du temps passé dans les bras ouverts par rapport au temps passé dans les bras fermés (n=45). 3- Test de l'openfield : L’animal est placé dans une enceinte étrangère en plexiglas à 2 dimensions (43x43 cm). Les souris peuvent explorer librement l’ensemble de l'enceinte pendant 10 minutes. Des cellules photoélectriques infrarouges permettent l’enregistrement automatique des déplacement de l'animal. Ce test est caractéristique d’un phénotype de type anxieux en évaluant le temps passé et le nombre d’entrées dans le centre de l’enceinte (n=45). 4- Splash test : Les souris sont aspergées avec un spray par environ 500 microlitres d’une solution de sucrose à 10%. La latence et fréquence de toilettage est alors mesurée pendant 5 minutes(n=45).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont très faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations I.P seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour le test de la nage forcée les animaux ne subiront pas ce test jusqu'à épuisement car limité à une durée de 6 minutes.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure pour analyses tissulaires et biochimiques des prélèvements.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui iduisent une réponse comportementale n'est à ce jour pas modélisable. De façon similaire, les analyses de pharmacodynamique des traitements après administration i.p. ne sont pas modélisables non plus.

Réduction

Le calcul de puissance est effectuée pour les expériences de pharmacologie a été réalisé avec le logicile biostatGV. Un écart type de 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 30% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 10 animaux par groupe. Une approche statistique sera envisagée par analyse de la variance (ANOVA) entre les différents groupes d'animaux suivis pas des tests post-hoc adéquat. Les seuils de significativité seront fixés à *p

Raffinement

Le choix de la souche de souris Balb/C constitue un raffinement du protocole dans la mesure où il n'est pas nécessaire d'induire un stress à ces animaux pour évaluer l'activité antidépressive des différents traitements. Par ailleurs, l'évaluation pharmacocinétique effectuée avant la partie comportementale permet de déterminer parvance la dose intéressante de NPS à laquelle l'effet de type anxiodépressif.

Choix des espèces

L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet en particulier la souche Balb/C de par son phenotype naturellement anxieux. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une uvéite auto-immune leur est induite par injection d'une toxine et transfert de cellules immunitaires, avec un suivi par imagerie de la rétine sous anesthésie, pour évaluer le récepteur P2X7 comme cible thérapeutique. Le porteur décrit une maladie qui n'entraînerait pas de douleur perceptible, tout en prévoyant la surveillance de signes tels que prostration, abattement ou perte de poids. Il justifie l'effectif élevé par la "grande variabilité" du développement de la pathologie entre souris et affirme que les études in vitro ne permettent pas d'étudier les signes cliniques.

Objectifs

Le projet vise à induire un modèle d'uvéite, l'Uvéite Autoimmune Expérimentale (EAU) chez des souris et d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées. Nous allons donc induire une EAU chez des animaux n'exprimant pas ce récepteur de manière constitutive ou de manière induite sur certains types cellulaires spécifiquement ou traiter des animaux qui développent une uvéite avec des agonistes ou antagonistes de ce récepteur afin de déterminer l'effet potentiellement bénéfique de cette cible pour inhiber la réponse immunitaire au cours de l'uvéite.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées.

Procédures

Induction de l’Uvéite Auto-immune Expérimentale (EAU) par injection d’une toxine, transfert adoptif de cellules immunitaires par injection IV et suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (imagerie rétinienne (fond d’œil) et OCT (tomographie en cohérence optique). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.

Impact sur les animaux

Avec ce projet les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). L’évolution de la maladie est surveillée par des actes non invasifs qui n’engendrent donc pas de douleur ou de détresse. Les animaux sont anesthésiés au cours de ces explorations également pour le maintien de l’animal immobile.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.

Réduction

Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Certains ne développeront pas la maladie, d’autres la développeront à un stade plus avancé ou la sévérité de l’inflammation sera différente. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 900 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

La seule anesthésie mise en oeuvre sera la gazeuse à base d'un mélange dioxygène/isoflurane. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de l’EAU, tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les critères absolus sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6J sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour l'EAU. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée le modèle d'invalidation génique conditionnelle et le modèle de uvéité, EAU. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie. Les animaux sont identifiés par bague numérotée ou tatouage. Les animaux sont génotypés par PCR après prélèvement d’un bout de leur queue.