Recherche fondamentale

318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un état de mal épileptique est induit par injection de kaïnate et un implant crânien est posé pour l'enregistrement EEG, pour étudier le lien entre crises épileptiques et neurodégénérescence. Le porteur indique que les décharges peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou conduire l'animal à se blesser dans 10 % des cas, et prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle alternatif" pour observer les crises et le déclin cognitif.

Objectifs

L'association entre crise épileptique et neurodégénérescence a été observée en clinique. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles précliniques pour examiner systématiquement comment des crises épileptiques peuvent accélérer des processus de neurdégénérescences et en cours de vieillissement. Dans ce projet, nous allons tester les hypothèses suivantes : i) les crises épileptiques suffisent à déclencher les voies amyloïdes et l’hyper phosphorylation de tau dans le cerveau ; ii) ces effets sont plus sévères au cours du vieillissement. Cette exploration est importante, au vu de l’incidence croissante des épilepsies et des comorbidités neurologiques chez la personne âgée.

Bénéfices attendus

Pouvoir mettre en évidence une corrélation pathophysiologique entre une crise épileptique qui arriverait pendant le vieillissement et le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

- Entre 2 et 5 injections intra-péritonéales sur une durée de 2 heures - Une procédure chirurgicale d'une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction d'un status epilepticus sur la souris engendre des décharges neuronales fortes. Celles-ci peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou entrainer l'animal à se blesser dans la cage (morsure de la langues). Ces effets sont observés dans 10 % des cas. L'injection, si nécessaire, de diazépam entraine une somnolence de l'individu avec absence d'hydratation (comblée par une IP de solution saline stérile) et d'alimentation pendant plusieurs heures. La pose d'un implant crânien pour suivi électroencéphalographique peut entrainer un inconfort temporaire, signe de grattage plus intense au niveau de celui-ci.

Devenir

A la suite de la procédure 1, les animaux seront mise à mort par CO2 car leur utilisation est terminée. Les animaux de la procédure 2 seront mise a mort comme décrit dans la procédure pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle alternatif pour observer les crises épileptiques et le déclin cognitif (maladie d'alzheimer) dans leur globalité.

Réduction

Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales sur les animaux d'un an puisque le comportement sera effectué sur les méme animaux que le prélèvement d'organes. De plus, Nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux.

Raffinement

Le raffinement passe par le maintien de l'enrichissement dans les cages notamment en cas d'isolement des souris pour les besoins de l'expérience. La socialisation sera de nouveau rendue possible quand les contraintes expérimentales le permettront. Tous les animaux seront surveillés lors de la procédure 1 et un SE supérieur à 2 H entrainera l'injection IP de diazépam à 0.5mg/kg pour stopper les crises et éviter ainsi une surmortalité. Pour la procédure 2 avec chirurgie, une grille de score (ci-joint) sera établie et permettra par exemple de : -procéder à une désinfection en cas de palie ou de suture problématique sous isoflurane, -surveiller le poids de l'animal avec une mise à mort si perte > 15% et apport de nourriture appétente si perte entre 10 et 15%. Pour les enregistrement EEG, une habituation à la contention sera effectuée chaque jour pour minimiser les stress lors des enregistrements.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisi en fonction des modèles nécessaires à l'étude. Un modèle isomorphe est nécessaires. La mise en place d'un modèle épileptique artificiellement induit . La souris répond aux besoins scientifiques et aux règles des 3R. Le fond génétique C57Bl/6 est utilisé dans le modèle car il a pu montrer la meilleure réponse physiopathologique. Le modèle d'épilepsie utilisé ici, induit par injection de kainate est un modèle connu et robuste. Il permet l'étude de la physiopathologie de l'épilepsie. Les animaux utilisés sont des adultes mâles agés de 2 mois, 6 mois et 9 mois. Les souris seront gardées au long court pour les points de prélèvement à 6 mois, 9 mois et 1 an. Nous allons induire une crise épileptique a des stades différents de la vie pour évaluer les conséquences de celle-ci en fonction de l'âge.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène pendant quatre jours puis six séances d'électrostimulation du mollet sous anesthésie générale, pour étudier le rôle d'une protéine du métabolisme énergétique dans les cellules souches musculaires. Le porteur décrit un projet de recherche fondamentale et affirme que l'analyse détaillée du tissu musculaire ne peut se faire sur "animal entier vivant", ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il indique que l'électrostimulation ne peut être reproduite in vitro et conclut au caractère "indispensable" du modèle animal.

Objectifs

Le maintien de la quantité et de la qualité du tissu musculaire strié squelettique est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à s’adapter soit à une augmentation de l’activité musculaire (exercice physique) soit à une diminution de l’activité musculaire (immobilisation, alitement prolongé). Les cellules souches musculaires (les cellules satellites) ont une contribution importante à cette capacité d’adaptation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires, processus conduisant à une accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Cette accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires dépend des propriétés énérgétiques des cellules souches et de la fibre musculaire. Ainsi, des données obtenues sur des cultures cellulaires montrent qu’une protéine X régulant les processus énergétiques des cellules favorise l’accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Il a également été démontré qu’un protocole d’exercice consistant à électrostimuler les muscles du mollet de souris saines se traduit par une augmentation du nombre de noyaux au sein des fibres musculaires. Nous avons donc pour objectif d’utiliser ce protocole d’exercice par électrostimulation afin d’étudier le rôle de la protéine X dans l’accumulation de noyaux générée par l’exercice. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules souches musculaires dans le maintien du bon fonctionnement du muscle strié squelettique et l’influence d’une protéine dont la fonction est de réguler les processus énergétiques cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant les processus énergétiques des cellules souches dans le fonctionnement du tissu musculaire.

Procédures

Chaque animal recevra une injection par jour de tamoxifène ou d’huile en intra péritonéale pendant 4 jours. Chaque animal sera ensuite soumis à 6 séances d’exercice d’électrostimulation du mollet réparties sur une période de 7 jours (i.e., 3 séances consécutives, 1 jour de repos, 3 séances consécutives). Chaque séance d’exercice d’électrostimulation sera réalisée sous anesthésie générale et durera un maximum de 20 minutes. Afin d’évaluer la progression du cycle cellulaire des cellules souches musculaires, les animaux seront supplémentés à l’aide d’un analogue de la thymidine (0,5 mg/ml repris dans une solution glucosée à 1%) administré dans l’eau de biberon 24h avant la première séance et jusqu’à la fin de la procédure expérimentale (soit pendant 8 jours consécutifs).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). L’injection de tamoxifène dans les animaux adultes n’induit pas en soi de phénotype dommageable comme montré dans des études précédentes. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables de l’administration d’EdU dans l’eau de biberon. Il a été démontré que le protocole d’exercice par électrostimulation n’induit aucune altération de la fonction et de la structure musculaire ainsi qu’aucun changement de mobilité, d’activité et de comportement des animaux. Aussi, il a été démontré que les anesthésies répétées à l’isoflurane liées au protocole d’électrostimulation n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux. Les animaux ne présentent aucun signe de prostration ou d’amaigrissement et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater normalement dès leur réveil. Enfin, aucun animal n’a dû être mis à mort du fait de la procédure d’exercice par électrostimulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’électrostimulation et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Les analyses statistiques précédentes de l'équipe permettent d'ajuster le nombre d'animaux requis. La taille de l’échantillon (12 animaux par condition) a été déterminée en prévoyant, à l’aide de tests statistiques adaptés, une augmentation de 15% du nombre de noyaux par fibre à l’issue du protocole d’électrostimulation chez les animaux contrôles

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale profonde lors de l’exercice d’électrostimulation. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet d’invalider la protéine X soit dans la fibre musculaire, soit dans la cellule souche afin d’évaluer les impacts fonctionnels, tissulaires et cellulaires sous-jacents. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bactériémie à staphylocoque doré résistant à la méticilline leur est provoquée par injection dans la veine de la queue, avec prélèvements sanguins quotidiens pendant dix jours, pour étudier le rôle protecteur de la protéine cavéoline-1. Le porteur indique que l'aggravation de l'infection conduit à prostration, cyanose et perte de poids, la mise à mort étant alors anticipée. Il reconnaît qu'une étude sur cellules a déjà établi le rôle de la cavéoline-1, mais affirme que la confirmation "doit" passer par un modèle in vivo.

Objectifs

La famille des exotoxines EDIN (A, B et C) de S. aureus compromet la perméabilité vasculaire par induction de tunnels transcellulaires. Des résultats non publiés montrent que cavéoline-1, une protéine fortement exprimée dans les cellules endothéliales, limite la formation et l’élargissement de ces tunnels transencellulaires. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine i) un doublement du nombre des tunnels transcellulaires provoqués par l’EDIN et ii) l’élargissement de ces tunnels. Des études antérieures sur modèle souris ont montré que l’EDIN est responsable d’une plus grande capacité des bactéries à induire une augmentation de la perméabilité vasculaire, associée à une plus forte dissémination de S. aureus dans les tissus par voie hématogène. Basé sur des résultats obtenus in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à la bactériémie induite par la souche LUG1799 du clone ST80-SARM-IV PVL+ et que ceci est directement lié à l’activité de la toxine EDIN-B. La souche LUG1799 est représentative des souches de S. aureus résistantes à la méticilline, problème majeur en Europe et en France. Nous nous baserons sur des études précédentes pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude et par une approche d’analyse statistique pour définir le nombre d’animaux par groupe.

Bénéfices attendus

Des travaux antérieurs ont permis de montrer un lien causal entre la formation des tunnels transendothéliaux induits par l’exotoxine EDIN de S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires : œdème et hémorragie. De plus un exemple de formation transitoire de tunnels transcellulaires en physiologie est décrit lors de la transmigration des leucocytes à travers l’endothélium. Bien qu'elle ait été longtemps controversée, la première preuve de transcytose de leucocytes au travers des cellules endothéliales a été démontrée in vivo et/ou in vitro pour les monocytes, les neutrophiles, les lymphocytes, grâce à l’imagerie confocale à haute résolution. L'intégrité de la barrière endothéliale est maintenue lors de la diapédèse des leucocytes au travers des cellules endothéliales grâce à la formation d'un anneau d’actine-myosine qui est étroitement ajusté à la taille des leucocytes. Cet anneau stabilise le pore pendant le passage des leucocytes empêchant la fuite de plasma et la formation associée d'œdème. La formation de tunnels transcellulaires de taille régulée est aussi essentielle pour permettre l'écoulement de l'humeur aqueuse. Le dysfonctionnement de ces tunnels transcellulaires affecte la résistance à l'écoulement avec augmentation de la pression intraoculaire, provoquant le glaucome. Les protéines responsables de la régulation de ces tunnels transcellulaires sont largement inconnues. Nous avons identifié le rôle inhibiteur de la cavéoline-1 sur la formation et l’élargissement des tunnels transcellulaires induits par l’EDIN. Cette étude permettra de démontrer le rôle protecteur de la cavéoline-1 lors de la bactériémie induite par une souche clinique de S. aureus ST80-SARM-IV edinB+ et ouvrira à une meilleure compréhension de la régulation des tunnels transcelluaires dans les processus physiologiques et pathophysiologiques.

Procédures

Cette procédure consiste en l’administration de S. aureus par injection intravasculaire dans la veine de la queue avec suivi de la bactériémie par prélèvement sanguin quotidien de 20 microlitres (3 minutes par intervention) durant 10 jours. Cette procédure est néanmoins modérée car conduit à une mise à mort anticipée des animaux lors de l’apparition d’un phénotype caractéristique d’aggravation de la bactériémie.

Impact sur les animaux

Des expériences antérieures ont montré que des souris transgéniques invalidées pour le gène de la cavéoline-1 du même fond génétique que celle que nous élevons (C57BL/6, 12-14 semaines) une fois infectées par voie intravasculaire (veine de la queue) par 103 CFU de Salmonella typhimurium souche SB300 meurent en 7 jours (temps ½) alors que les souris sauvages meurent en 13 jours. Cet effet de susceptibilité à l’infection est à mettre en parallèle avec une translocation accrue des bactéries vers le foie avec formation de larges granulomes et translocation dans la rate, une forte augmentation de marqueurs de la réponse immunitaire (IFN-gamma, IL-6, TNF-alpha) dans le sang et la production de taux élevés de NO dans le sérum. Cette réponse péjorative de marqueurs immunitaires est récapitulée par l’injection de LPS de S. typhimurium. Les souris lors de l’infection meurent plus rapidement du fait d’une réaction immunitaire élevée et translocation de Salmonella plus forte dans les organes essentiels. Aucune étude à ce jour n’a permis de définir si des souris invalidées dans le gène de la cavéoline-1 sont plus susceptibles à des bactériémies induites par des bactéries à Gram-positif, S. aureus étant la plus fréquemment isolée dans la bactériémie à Gram-positif chez l’homme que l’infection soit d’origine nosocomiale ou communautaire. Un ensemble de résultats obtenus in vitro sur cellules primaires endothéliales humaines concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des tunnels transendothéliaux provoqués par les exotoxines EDIN (A, B et C). Nous chercherons à prouver chez l’animal invalidé pour la cavéoline-1 que lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B les animaux montrent des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection du fait d’induction de fuites vasculaires. Nous suivrons l’évolution de la bactériémie provoquant un phénotype caractéristique de bactériémie aggravée conduisant à la prostration, immobilité, apathie, des animaux avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et perte de poids significative de plus de 20%. Ce suivi des animaux permettra une mise à mort anticipée des souris présentant un phénotype de bactériémie aggravée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Une étude de biologie cellulaire conduite sur cellules endothéliale en remplacement d’expériences sur l’animal nous permet d’affirmer que la cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de tunnels transendothéliaux qu’induit l’EDIN. La formation de ces tunnels transendothéliaux corrèle avec l’apparition de fuites vasculaires. Cette approche de remplacement de type biologie cellulaire nous a permis de limiter le nombre de gènes de susceptibilité à l’EDIN à étudier pour ne sélectionner que la cavéoline-1. Le rôle protecteur de la cavéoline-1 dans l’infection bactériémique par une souche de S. aureus produisant l’exotoxine EDIN-B doit être confirmée par une approche in vivo.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives avec une seule procédure de « suivi d’aggravation de la bactériémie » et nous définirons le nombre d’animaux par groupe grâce à un calcul statistique de puissance. Pour l'étape 1 (établissement de la CFU50) les effectifs ont été calculés sur la base d'expériences précédentes sur d'autres modèles animaux. Pour les étapes 2, 3 et 4 les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Pour approximation, une analyse de puissance d'un test de comparaison de proportions a été réalisée, pour un risque 5%, une puissance de 80%, donnant des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux selon la grille d’évaluation de la douleur du stress et inconfort du SBEA, nous permettra de détecter au plus tôt les points limites de souffrance de l’animal. Les points limites seront : des changements de comportement, tels que l'isolement dans le groupe, ainsi que prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative (plus de 20%) seront mis à mort. Dans ces conditions, la mise à mort sera anticipée par dilacération cervicale pour abréger les souffrances de l’animal (technique validée 1A). Des cotons imbibés d’eau et de la nourriture « Dietgel » seront placés dans la cage dans le cas ou certaines souris auraient du mal à se déplacer.

Choix des espèces

Etude comparative de souris transgéniques invalidées dans le gène codant la cavéoline-1 de fond génétique C57BL/6 (B6.Cg-Cav1tm1Mls/J, Jackson via Charles River) versus souris sauvage « littermate ». Les souris C57BL/6 sont sensibles à l’infection intraveineuse par S. aureus (geste technique validé 18A). Nous savons d’expériences précédentes (n° dap160118) que l’injection de doses comprises entre 5x 106 et 5x 108 CFU suivant les souches de S. aureus conduit à un état de prostration, immobilité, apathie avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative de plus de 20% conduisant à une mise à mort anticipée de 50 % des animaux sur 10 jours. La valeur de CFU50 des souris C57BL/6 à l bactériémie LUG1799 sera déterminée dans l’étape n°1. La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par S. aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus, littérature abondante. Notre étude portant sur l’infection de type bactériémie sera conduite sur des animaux de 8-16 semaines selon un protocole publié portant sur un modèle de souris invalidées dans le gène codant la cavéoline-1.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.

Objectifs

Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.

Bénéfices attendus

Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).

Procédures

Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.

Remplacement

Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.

Réduction

Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.

Raffinement

Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.

Choix des espèces

L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mutation de l'oncogène Kras déclenche chez elles des lésions précancéreuses du pancréas, puis elles reçoivent des injections et des gavages répétés de molécules candidates avant un prélèvement terminal de sang et d'organes. Le porteur affirme que ces lésions "ne devraient pas" entraîner de douleur, en s'appuyant sur le diagnostic tardif du cancer chez l'humain. Il sollicite 1 200 souris sur cinq ans tout en indiquant que le projet ne devrait en nécessiter qu'environ 300, et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'"organisme intégré".

Objectifs

L’adénocarcinome du pancréas est un cancer en constante augmentation qui devrait d’ici fin 2022 se classer comme le second cancer le plus mortel. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunité de traitement thérapeutique, conduisant les patients à moins de 5% de chance de survie 5 ans après leur diagnostic. Grâce aux analyses génétiques à grande échelle, plusieurs mutations impliquées dans cette pathologie ont déjà été identifiées chez l’Homme. L’initiation des cancers du pancréas est majoritairement associée à l’acquisition de mutations de l’oncogène Kras. Face à ces mutations, les cellules affectées deviennent précancéreuses, elles développent une réponse de protection visant à limiter leur expansion. Ce processus appelé « Sénescence oncogénique induite » ou OIS conduit les cellules précancéreuses à induire des mécanismes visant à limiter leur prolifération, mais également à sécréter de nombreux composés complexes (regroupés sous le terme: SASP) dont le rôle bénéfique ou délétère sur la progression tumorale restent encore mal compris. De nombreuses fonctions sont décrites au large spectre de molécules sécrétées qui compose le « SASP ». Ces molécules sont produites en aval de grandes voies canonique de signalisation (mTOR, JAK (Janus Kinase), Notch, Toll Like Receptor (TLR), …). Leurs actions peuvent être inflammatoiree, favoriser la fibrose ou plus bénéfique pour certaines d’entre elles. Parmi les nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, le développement de molécules appelées « sénomorphiques » vise à bloquer spécifiquement les molécules du SASP aux effets délétères tout en conservant l’action des molécules bénéfiques. L’objectif de notre projet vise à évaluer les effets thérapeutiques de 5 candidats molécules capables de bloquer les voies de signalisation qui conduisent à la production de différentes molécules du « SASP » par les cellules précancéreuses pancréatiques. Il consistera à traiter à court terme (2 semaines) ou à long terme (2 mois) de jeunes souris porteuses dans leur pancréas de la mutation KRAS qui est à l’origine des cancers pancréatiques chez l’Homme. Les résultats bénéfiques ou délétères seront ensuite observés sur les lésions développées afin de mieux comprendre le rôle complexe du SASP dans l’initiation des tumeurs pancréatiques.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à mieux comprendre l'intérêt du ciblage thérapeutique des cellules sénescentes et des molécules qu’elles secrètent dans le cadre du développement des cancers pancréatiques. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité d'action du SASP dans les pré-lésions pancréatiques et fournir des pistes importantes pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les cancers du pancréas

Procédures

Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés, sur 2 semaines à 2 mois, pour administrer les molécules candidates thérapeutiques. La fréquence d’administration dépendra des molécules concernées (3 injections intrapéritonéales et de 3 à 5 gavages par une canule adapté par semaine). Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin des procédures de traitements sur des animaux, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.

Impact sur les animaux

L'activation ciblée de la mutation de Kras dans le pancréas des souris entrainera l'apparition de pré-lésions cancéreuses pancréatiques. Ces lésions bégnines ne devraient toutefois pas entrainer de douleurs (chez l'homme le cancer pancréatiques n'est diagnostiqué que très tardivement par des douleurs). Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés qui pourraient entrainer un inconfort ou des irritations locales sur lesquels nous seront particulièrement vigilant. Les produits testés pourraient entrainer une réponse inflammatoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements réalisés. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages de molécules secrétées par les pré-lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les pancréas collectés post-mortem. Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Remplacement

Aucun autre modèle ne permet de reproduire de manière aussi satisfaisante la progression tumorale du cancer du pancréas puisque les tumeurs se développent au niveau du pancréas lui-même. En raison de la nature complexe de la recherche proposée qui vise à évaluer les effets de molécules thérapeutiques au sein de lésions pancréatiques précancéreuses (où des interactions cellulaires complexes prennent place), nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. L’effet des molécules que nous proposons de tester ont toutefois été étudié et validé in vitro sur des lignées cellulaires pour confirmer l’intérêt thérapeutique des travaux que nous proposons.

Réduction

Afin de nous conformer à la règle de Réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation des traitements thérapeutiques testés. 6 à 9 souris par sexe et par groupe devraient nous permettre d’obtenir des conclusions statistiques interprétables entre groupe de traitements. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale sauf en cas de problèmes techniques qui compromettraient l’interprétation de nos travaux. Signalons enfin que les traitements à court et long terme seront réalisés séquentiellement et que les traitements à long terme ne seront mis en place qu’en d’absence d’effets des traitements à court terme. Bien que nous sollicitions 1200 souris sur 5 ans, ce projet ne devrait donc nécessiter qu’un quart de ces animaux (300) pour atteindre nos objectifs.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, perte de poids, irritations liées aux modes d’administrations des traitements réalisés). L’identification de ces signes entraineraient alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir la variabilité des bénéfices thérapeutiques des traitements que nous testerons, ils seront accompagnés de nombreuses analyses des tissues pré-tumoraux post-mortem par des approches histologiques et moléculaires complémentaires qui permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Choix des espèces

Le modèle murin que nous avons choisi pour réaliser cette étude reproduit parfaitement la pathologie humaine. Il est basé sur l’expression conditionnelle dans le pancréas d’une mutation de l’oncogène Kras qui est retrouvée dans plus de 90% des patients atteints de cancer du pancréas. Il reproduit les lésions pré-cancéreuse (PANINs) qui sont décrites chez l’Homme. Ces animaux permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas qui prend place chez l’homme en aval des mutations qui affectent ce gène. L’utilisation d’animaux est de plus essentielle pour la réalisation de notre projet car elle requiert l’analyse des effets de molécules thérapeutiques sur un organisme intégré. Les protocoles de traitements mis en place seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. A cet âge les souris porteuses de mutation Kras ne présentent que de très rares lésions de type PANINs dans lesquelles l'existence de mécanismes de sénescence est déjà bien démontrée.

12 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées en vie pour le renouvellement du troupeau. Chaque animal subit jusqu'à 55 prises de sang, une synchronisation des chaleurs, une production et un transfert d'embryons sous anesthésie épidurale, pour mesurer l'effet de ces techniques de reproduction sur le bien-être des génisses. Le porteur reconnaît que l'étude préliminaire avait mis en évidence le stress lié à l'isolement et à la contention imposés par ces actes. Il affirme qu'aucun système ex vivo ne permet d'évaluer ces effets et invoque une demande sociétale accrue pour le "bien-être animal".

Objectifs

Dans un contexte de demandes sociétales accrues vis-à-vis du bien-être animal (97% des Européens estiment qu’il est important de protéger le bien-être des animaux d’élevage selon l'eurobaromètre 2015 de la comission européenne), donner des éléments de réponse et des pistes d’amélioration est primordial. De ce fait, les entreprises et organismes agricoles cherchent à prendre en compte cette notion au sein de leurs activités. Les entreprises impliquées dans la reproduction et la génétique des ruminants souhaitent pouvoir étudier l’impact des technologies de la reproduction sur le bien-être des animaux en vue éventuellement de les améliorer. Très peu de publications scientifiques sont disponibles sur ce sujet. Ainsi, il a été mis en évidence que la palpation rectale et l’insémination animale entrainaient une augmentation significative de cortisol dans le sang à la suite de ces manipulations. De plus, il a été montré que la ponction folliculaire ovarienne, utilisée dans la cadre des productions d’embryon in vitro, ne semblait pas impacter le bien-être des animaux. Aucune étude n’a étudié l’impact des protocoles de collecte et de transfert d’embryons sur le bien-être des génisses. Or, ces techniques requièrent un ensemble d’actes successifs représentatif des pratiques de reproduction actuelles chez cette espèce, dont l’IA. De plus, l’évaluation du bien-être animal dans les travaux précédemment cités ne prenaient en compte que des données physiologiques ou de production alors qu’il est communément admis aujourd’hui que l’évaluation du bien-être animal doit être multicritères, prenant également en compte des données comportementales. Une expérimentation préliminaire, ayant déjà fait l'objet d'une saisine au comité d'éthique, a été menée l'année dernière sur 6 animaux permettant à la fois de préciser les effets attendus (variabilité indivdiuelle forte) mais soulignant également plusieurs points de vigilance dans les procédures et méthodes utilisées pour éviter les biais expérimentaux (nécessité d'un protocole en carré latin, standardisation de l'approche de l'animal, monitoring de la fréquence cardiaque...). Fort de cette expérience, le projet présenté ici a donc pour objectif de mesurer l’impact des protocoles de production et de transfert d’embryons sur le bien-être de 12 génisses.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de conforter les résultats préliminaires déjà acquis dans l'étude préliminaire et ainsi d’objectiver l’impact de ces technologies de la reproduction sur le BEA des génisses. Sur la base de ces résultats, il conviendra de proposer d'éventuelles voies d'amélioration.

Procédures

Afin d'évaluer l'impact des protocoles de production et de transfert d'embryons sur les génisses, 12 femelles naïves de toutes biotechnologies de la reproduction suivront: - une phase d'acclimatation à leur nouvel environnement, aux moyens de contentions utilisés et aux prises de sang (6 prises de sang) sera effectuée (2 semaines); - une synchronisation des chaleurs pour initier une phase témoin (sans technologies de la reproduction; ~4 semaines) puis une phase expérimentale (avec technologies de la reproduction; ~9 semaines) ou inversement (dispositif en carré latin). Au cours de ces phases, 49 prises de sang seront réalisées sur les animaux pour suivre les paramètres plasmatiques en lien avec l'évaluation du BEA soit au total 55 prises de sang par génisse en incluant la phase d'acclimatation. Lors de la phase expérimentale uniquement, les génisses suivront également un protocole de production d'embryon et un protocole de transfert d'embryons. En dehors du suivi des paramètres plasmatiques, le bien-être de ces génisses sera évalué de façon multicritère par le recueil non invasif de phénotypes physiologiques (monitoring de l’activité et de la rumination par des colliers activimètres, de la température ruminale par des thermobolus, de la fréquence cardiaque par des ceintures Polar) et comportementaux (vidéos individuelles et de groupe) qui ne font pas l'objet d'une procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les technologies de la reproduction étudiées dans cette étude sont aujourd'hui largement utilisées à travers le monde et ne sont pas connues pour induire des douleurs ou un stress intenses et prolongés aux animaux. De plus, selon les pratiques actuelles, une anesthésie épidurale sera systématiquement pratiquée lors des procédures de collecte et de transfert d'embryons. Enfin, la finalité de cette étude est d'étudier les impacts plus fins sur les animaux dans le but de raffiner les technologies de la reproduction. L'étude préliminaire a mis en évidence le stress causé par l'isolement et/ou la contention des animaux nécessaire à la réalisation des actes mais également quelques tendances qu'il sera nécessaire de de confirmer sur des effectifs plus importants. De plus cette étude a permis de vérifier que les prélèvements répétés de sang ne conduisaient pas à une douleur intense et prolongée des animaux et que ceux-ci n'entrainaient pas de complications particulières. Les animaux seront suivis de façon journalière et placés sous monitoring permanent de la rumination, de l'activité ou de la température ruminale. Cette surveillance continue des animaux nous permettra de réagir rapidement en cas de dégradation de leur état de santé.

Devenir

Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

Le bien-être animal est une notion complexe dont l'évaluation ne peut être que multicritères. A ce jour, aucun système ex vivo permet de mesurer l’impact de ces technologies sur le bien-être des animaux.

Réduction

Chaque animal étant son propre témoin dans cette étude, ceci permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation. Sur la base des travaux préliminaires menés et de la grande variabilité individuelle constatée, un nombre de 12 animaux semble suffisant pour mettre en évidence une différence significative (avec un risque alpha de 5% et une puissance de test de 80% minimum) à partir des tendances observées. Compte-tenu des effectifs prévus (12 animaux) et de l’appariement des données (mesures répétées sur les mêmes individus), seuls des tests non paramétriques peuvent être utilisés.

Raffinement

La finalité de cette étude est de raffiner les technologies de la reproduction. Toutefois, selon les pratiques actuelles, une anesthésie épidurale est systématiquement pratiquée lors des procédures de collecte et de transfert d'embryons. De plus, les génisses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (10m² par animal avec un accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...).

Choix des espèces

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, les techniques utilisées dans ce projet sont des pratiques couramment réalisées en élevages. Afin de produire le matériel biologique nécessaire au déroulement du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères (< 2 ans). Ce stade de développement correspond au stade de développement des animaux sur lesquels les biotechnologies de l’embryon sont pratiquées. De plus, le fait qu’elles n’aient subie aucune biotechnologie de la reproduction avant d’intégrer l’étude permet d’éviter les éventuels biais liés à la répétition des protocoles.