Oncologie

Greffées d'une tumeur par injection de cellules cancéreuses, puis traitées par de nouvelles injections, 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse tous les trois jours, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. L'objectif est de tester si des inhibiteurs de tyrosine kinase, déjà autorisés chez des patients, ralentissent la croissance tumorale une fois combinés à une chimiothérapie ou à une immunothérapie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de passer par un modèle vivant, aucune méthode ne permettant selon lui de reconstituer un système immunitaire in vitro.

Objectifs

Les inhibiteurs d'enzymes oncogènes ont été approuvés pour le traitement de routine des patients atteints de cancer. Ils agissent sur la croissance de cellules cancéreuses. Cependant, cette fonction a récemment été remise en question par des découvertes montrant les effets immunostimulateurs directs de ces inhibiteurs a été démontré que certains de ces médicaments sont dotés de la capacité d'induire la mort cellulaire immunogène dans les cellules cancéreuses, stimulant ainsi les cellules cancéreuses à émettre des signaux qui les rendent détectables par le système immunitaire. De plus, nous avons fourni des preuves précliniques solides selon lesquelles les inhibiteurs induisant la mort cellulaire immunogène peuvent être avantageusement combinés avec une chimiothérapie et une immunothérapie standard, pour traiter le cancer du poumon non à petites cellules. En outre, il a été identifié un certain nombre d'inhibiteurs comme de puissants amplificateurs de la présentation croisée par certaines cellules. Plus globalement, nous disposons donc de preuves solides selon lesquelles certains inhibiteurs ont la capacité d'agir comme inducteurs de la mort cellulaire immunogène sur les cancers et que d'autres inhibiteurs peuvent stimuler la présentation croisée par certaines cellules agissant ainsi, aussi, comme des activateurs de la mort cellulaire immunogène. Il est indispensable de tester davantage ces médicaments seuls ou en combinaison avec une chimiothérapie et/ou une immunothérapie standard dans des modèles précliniques variés pour permettre la traduction des présents résultats en traitements concrets pour les patients.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à une diminution de la croissance tumorale après traitement avec les inhibiteurs testés en association aux traitements conventionnels anti-tumoraux comparée aux traitements conventionnels seuls. Cela permettra de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux aux patients par la suite.

Procédures

Les souris recevront une à deux injections de cellules tumorales (durée 2min) puis des traitements par injection (maximum 3 injections, durée moins d’une minute) pour certaines. Ces interventions seront faites sur anuimaux vigiles avec anesthésie locale. Elles seront manipulés brièvement (

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse 2 à 3 fois par semaine (tous les trois jours). Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal. Les croisances tumorales peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Les traitements peuvent entraîner une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids chez la souris

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Les inhibiteurs de la tyrosine kinase agissent in vitro en inducteur de la mort cellulaire immunogène sur des cellules cancéreuses (in vitro). Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est indispensable d’utiliser un modèle reproduisant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Des analyses statistiques seront faites sur les résultats obtenus sur les animaux et leurs organes.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de différents éléments. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes). Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - La souris est un animal très utilisé en oncologie préclinique, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois administrations de molécules fluorescentes dans la veine de la queue ou sous la nuque, subit jusqu'à quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie sous anesthésie générale, avant une dernière injection au moment de sa mise à mort. Une souris qui perd plus de 20 % de son poids est sortie du protocole et tuée sans délai. Le projet sert à mettre au point les vecteurs d'une société privée qui répond à ce qu'elle décrit comme une "demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique".

Objectifs

A l'heure actuelle, beaucoup de besoins médicaux restent malheureusement insatisfaits, sans aucun traitement curatif ou palliatif, et peuvent devenir de véritables enjeux de santé publique dans le futur. Il existe ainsi une demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique pour l'identification de récepteurs exprimés à la surface des cellules, permettant des approches ciblées. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à identifier des récepteurs exprimé sur les cellules que l'on veut cibler et de développer des molécules capables de les reconnaitre et s'y fixer. Nous pourrons ensuite conjuguer des médicaments sur nos molécules afin de les faire passer les barrières physiologiques naturelles et atteindre plus efficacement les tissus cibles. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces car ils n'atteignent pas de manière spécifiques les tissus voulus. Cette demande de projet a pour objectif le développement et l’amélioration de nos molécules pour faciliter le passage des médicaments à travers les membranes cellulaires. Le fait d'accrocher nos molécules à des proteines fluorescentes permet de suivre leur localisation.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nos molécules permet d'obtenir une localisation plus spécifique et d'éviter des effets sur les tissus non voulu et cela constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont les suivantes : -L’administration de nos molécules se fera sur animaux éveillés en une dose ou plusierus doses répétées (maximum x3). Ces dernières se feront : - Au niveau de la veine de la queue pour l'animal vigil en contention, geste rapide (≤ 2min). - Ou au niveau de la nuque pour les sous-cutanées, animal vigile, libre sans contention ; geste rapide (≤ 2min). L'injection intrapéritonéale (1 fois lors de la mise à mort des individus) -Les prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux vigiles : au maximum 4 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7 jours et ≤20% sur 14 jours. Pour chaque imagerie la souris est anesthésiée. Il y aura à minima 1 imagerie et cela peut aller jusqu'à 7 imageries. L'imagerie prend quelques minutes (entre 2 et 5min).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : - La contention des animaux dans le cas des administrations intraveineuses et sous-cutanées. - Les différentes administrations réalisées : intraveineuses ou sous-cutanées et intrapéritonéales (lors de la mise à mort des individus). - Les prélèvements sanguins intermédiaires

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de caractériser ex vivo la biodistribution mais aussi l'efficacité selon le type de molécule couplée.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités, mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 10 études par an, nous aurons besoin de 40 animaux par an (n mixte=4 *10), soit un total de 200 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les imageries se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal tout en ayant un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale par injection de morphinique. Le bien être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, ou morceau de bois afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dit « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 17-28g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Après des essais menés sur des souris privées de système immunitaire, 50 souris immunocompétentes reçoivent sous la peau des cellules de carcinome pulmonaire à petites cellules. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, maintenues chaque semaine dans un cône de contention en inox pour recevoir en intraveineuse un placebo, un anticorps médicamenteux, une immunothérapie ou les deux traitements associés. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'être humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé chez la souris lors des études précédentes, la gravité déclarée restant pourtant modérée. Toutes seront tuées pour peser les tumeurs, mesurer l'infiltration immunitaire et chercher la toxicité sur les organes, en vue d'un essai clinique de phase 1.

Objectifs

Le carcinome à petites cellules du poumon (SCLC), est la forme de cancer du poumon la plus aggressive, avec une survie à 5 ans de seulement 7% avec très peu d'options thérapeutiques actuellement disponibles. L'approbation de nouvelles immunothérapies en association avec un traitement de chimiothérapie conventionnel en première ligne a représenté une nouvelle étape thérapeutique en 2018 avec une diminution du risque de décès d'environ 30% grâce aux réponses prolongées. Cependant, la survie globale à 3 ans reste inférieure à 20 %, dus aux résistances innées et acquises, les options de traitement actuelles restent limitées. Dans ce contexte, notre projet a pour objectif d’utiliser un anticorps médicamenteux qui a montré in vitro son efficacité thérapeutique sur les cellules de cancers cutanés et pulmonaires agressifs mais également in vivo sur un modèle murin immunodéficient (sans système immunitaire fonctionnel). L’objectif du présent projet est d’évaluer l'efficacité du produit étudié seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle murin immunocompétent avant de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’humain.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est l’évaluation du nouveau anticorps médicamenteux Adcitmer utilisé seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle de souris immunocompétentes utilisant une lignée murine de carcinome à petites cellules du poumon. La validation de ce modèle nous permettra d’évaluer le bénéfice d’une bithérapie biomédicament/immunothérapie. L’objectif plus global etant donc d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de contribuer à la mise en place d’un essai clinique de phase 1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de SCLC (cancer à petites cellules du poumon) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés une fois par semaine en intraveineuse avec le placebo, le biomédicament Adcitmer, l'immunothérapie Avelumab ou la combinaison des deux traitements. Pour cela les souris seront placées dans un cône de contention le temps de l'application de la pommade anesthésiante et de l'injection en intraveineuse (5-10 minutes par intervention).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutanée et une contention hebdomadaire en cône de contention pour l'injection en intraveineuse. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intraveineux. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs, de l'infiltration immunitaire des tumeurs et l'évalution de la toxicité sur les organes impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité d'Adcitmer a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de SCLC humaines et sur la lignée murine KP11. L'obtention de données préliminaires in vitro sur ces différentes lignées a permis de limiter le nombre de doses testées dans la recherche d'optimisation des schémas thérapeutiques dans le modèle de xénogreffes de la lignée humaine de SCLC, en modèle souris immundéficient. Grâce à ces expériences préliminaires, nous proposons dans ce projet, d'évaluer la plus-value apportée par une combinaison biomédicament/immunothérapie en testant une dose optimale du biomédicament et non plusieurs.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et la dose testée sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Pour les injections en intraveineuse, les souris seront maintenues dans un cône de contention en inox, pour leur générer moins de stress lors de cette manipulation, les souris seront habituées à cette contention 2 fois par semaine avant leur inclusion dans l’étude. De plus, une pommade anesthésiante sera appliquée avant chaque injection en intraveineuse, et une friandise sera donnée aux souris après. Pour limiter toute souffrance des animaux, une grille décisionnelle a été élaborée afin de monitorer l'état de santé des animaux, si l'un des critères de souffrance est atteint, la décision de sacrifier l'animal sera prise. De plus, afin de limiter les souffrances lors de l'euthanasie, un sédatif sera injectée en intrapéritonéal avant le sacrifice.

Choix des espèces

La génération d'une lignée carcinomateuse murine présentant l'ensemble des marqueurs caractérisant les lignées de SCLC humaines, nous permet d'utiliser un modèle de souris immunocompétente pour évaluer notre traitement. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et l'effet des traitements caractérisé, 836 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à neuf injections de vaccin, de traitement associé et d'immunothérapie étalées sur trois semaines. Les tumeurs implantées dans le poumon peuvent provoquer des difficultés respiratoires, des douleurs modérées et une perte d'appétit. Le porteur écrit ne pas pouvoir envisager le remplacement des animaux, tout en indiquant que l'intelligence artificielle permettrait d'étudier l'interaction entre cellules immunitaires et cellules tumorales et qu'elle n'est "pas actuellement utilisée".

Objectifs

Le pronostic global des patients atteints de cancer du poumon est mauvais, et dans ce contexte l’immunothérapie suscite un grand intérêt, néanmoins, bien que ces traitements aient permis d’améliorer la survie de certains patients, les taux de réponse restent limités. Nous avons identifié des lymphocytes infiltrant les tumeurs et appelées lymphocytes T résidents capables d’éliminer les cellules tumorales et associés à une meilleure survie des patients dans plusieurs pathologies cancéreuses. Ce projet permettra : 1) d’élucider le rôle des lymphocytes T résidant dans les tumeurs dans la réponse aux immunothérapies in vivo dans un modèle de souris, 2) de mieux comprendre le fonctionnement des immunothérapies pour les améliorer et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous utiliserons deux modèles de souris portant une pathologie cancéreuse, et des traitements anti-cancéreux in vivo. Jusqu’à ce jour, aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité du système immunitaire dans un environnement tumoral.

Bénéfices attendus

Afin de comprendre pourquoi les taux de réponse à l’immunothérapie restent limités chez la majorité des patients atteints de cancer, notre objectif est de mieux comprendre le rôle d’une nouvelle classe de globules blancs, les lymphocytes T résidents, présents dans la tumeur. Grâce à des modèles in vivo, nous chercherons à comprendre quels sont les mécanismes permettant l’obtention de ces lymphocytes dans la tumeur. Notre but est de faire avancer les connaissances sur les causes de l’efficacité limitée du système immunitaire dans les tumeurs et ainsi contribuer à l’amélioration de la réponse aux immunothérapies et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris seront greffées avec une lignée cellulaire tumorale avec une seule injection (durée 1 minute, anesthésie locale). L'injection du vaccin sera répétée 2 fois tous les 7 jours pendant 20 jours (durée 1 minute, sous anesthésie locale). Le vaccin sera combiné à un autre traitement appliqué par injection répétée 3 fois tous les 4 jours pendant 20 jours (durée 1 minte, anesthésie locale). L’immunothérapie est une solution injectée 4 fois tous les 4 ou 5 jours pendant 16 à 22 jours (durée 1 minute, anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Les injections causent un stress et douleur légère de courte durée. Les tumeurs greffées en sous-cutanée peuvent entraîner une gêne mécanique légère, une douleur modérée. Les tumeurs induisant un ou plusieurs foyers tumoraux dans le poumon, peuvent causer des problèmes respiratoires et des douleurs modérées. Parmi les nuisances possibles de ces tumeurs il y a aussi la perte d'appétit et de poids.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever certains organes pour caractériser l’effet des traitements, les effets anti-tumoraux et les cellules immunitaires.

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique ou des anticorps thérapeutiques dans un contexte cancéreux relève d’une grande complexité où les modèles in vitro seuls n’apporteraient pas tous les éléments et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs. Nous ne pouvons pas envisager le remplacement des animaux pour nos études. Cependant nos hypothèses de travail se basent sur nos expériences in vitro avec des cellules humaines et sur la littérature. Certaines approches expérimentales in vitro pourront aussi être réalisés afin de confirmer une partie des résultats obtenus grâce aux expérimentations in vivo. Le nombre de souris pour cette étude a été calculé mathématiquement afin d'utiliser le plus petit nombre de souris tout en restant statistiquement significatif. L'intelligence artificielle pourrait permettre d'étudier l'interaction potentielle entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales mais n'est pas actuellement utilisée.

Réduction

Les expérimentations seront réalisées toutes les 6 semaines pour nous permettre d’analyser les résultats et de modifier le protocole suivant les résultats précédents obtenus in vivo. Un maximum de conditions sera réalisé au sein d’une même expérience pour réduire le nombre d’expériences et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés en tant que lot contrôle. Nous utiliserons le plus petit nombre de souris tout en respectant la validité statistique de l'étude. Afin de calculer à priori le nombre d’animaux pour répondre à nos hypothèses, un logiciel de statistique a été utilisé. Pour chaque procédure, le test statistique sera adapté et tiendra compte des résultats de nos expérimentations antérieures et de nos connaissances sur les modèles murins en cancérologie, ce qui nous permettra de réaliser des conditions de traitement cohérentes et ainsi réduire le nombre de groupes/animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les deux jours puis tous les jours à partir de J8 pour les souris avec tumeurs pulmonaires et une grille de score sera réalisée. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le toilettage = grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. En cas de changement de comportement, de l’enrichissement sera ajouté dans la cage ou les souris seront séparées. Un examen clinique sera réalisé avec l'utilisation d'une grille de score et en cas de gênes ou douleur dues à la progression des tumeurs, en particulier les tumeurs pulmonaires, un anti-inflammatoire sera administré pour minimiser les douleurs et un aliment adapté sera donné. Un anti-inflammatoire sera administré pour les douleurs légères. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle in-vivo le plus adéquat pour l’étude des interactions entre le système immunitaire et le microenvironnement tumoral complexe. De plus, le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, et les modèles tumoraux sont les plus appropriés pour notre étude et comparables aux cancers humains. L’invalidation génétique de la molécule d'intérêt spécifiquement dans les lymphocytes T a été généré seulement dans cette espèce. Cependant, une étude sera réalisée en parallèle sur des échantillons tumoraux humains afin de renforcer les résultats obtenus dans le modèle murin. Les animaux, âgées de 5 à 8 semaines seront réceptionnées par l’animalerie et utilisés après une période d’acclimatation de 7 jours minimum. Les greffes de tumeurs seront réalisées sur des animaux âgés de 6 à 9 semaines afin d’obtenir une meilleure prise de greffe et avoir une grande quantité d’infiltrat lymphocytaires.

60 souris subissent chacune deux implantations de cellules tumorales, l'une sous la peau, l'autre directement dans la prostate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les effets attendus courent sur les trente jours de la procédure, perte de poids, perte d'appétit, douleurs prolongées au site de greffe, et pour l'implantation intra-prostatique des saignements, des difficultés urinaires et une gêne des mouvements. Les tumeurs sous-cutanées sont mesurées deux fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, pour prélever les tumeurs, les organes lymphoïdes et le foie.

Objectifs

Le taux de cholestérol peut modifier la prolifération et l’activation des cellules immunitaires. La concentration du cholestérol dans les cellules est contrôlée par des récepteurs spécifiques, les récepteurs nucléaires LXRs (Liver X Receptors). Le rôle de ces LXRs dans la composante immunitaire de la prostate tumorale n’est pas clairement établi. Il existe deux récepteurs LXRs, alpha et beta codés par des gènes différents. Au niveau des cellules immunitaires, les deux types de récepteurs semblent avoir des rôles distincts et spécifiques de certains sous-types cellulaires. Ce projet consiste à définir si les deux types de récepteurs ont des conséquences différentes sur la nature et la fonction de l’infiltrat immunitaire des tumeurs prostatiques. Les études seront conduites sur des tumeurs greffées sur des souris avec des cellules immunitaires dont le gène codant pour chacun des récepteurs LXRs est non fonctionnel. Le but de ces travaux sera de définir l’impact de l’absence des récepteurs LXRs dans l’infiltrat immunitaire tumoral prostatique.

Bénéfices attendus

Plusieurs études montrent que les LXRs peuvent moduler le paysage immunitaire de différentes tumeurs avec des rôles différentiels pour les deux isoformes de LXRs . L’objectif de ce travail est de définir les différences d’implication des deux LXRs sur la croissance tumorale et sur la réponse immune antitumorale dans un modèle pré-clinique de cancer de la prostate. L’utilisation d’un modèle syngénique (cellules greffées et hôte de la même espèce) est pertinent pour s’approcher au mieux d’une réponse immunitaire réelle et complète, à l’inverse de l’utilisation de modèles xénogreffés sur souris immunodéprimées. A court terme ce projet donnera des arguments pour poursuivre l’investigation entre les LXRs et la réponse immune chez la souris, notamment pour établir des modèles transgéniques dans lesquels on manipulera de façon génétique l’expression des LXRs dans certaines cellules immunitaires. L’élucidation des rôles précis des LXRs dans ces sous-types immunitaires et la possibilité d’utiliser des modulateurs de leur activité permettrait le développement de thérapies adjuvantes pour accroître l’efficacité de l’immunothérapie du cancer de la prostate.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions :1) implantation sous-cutanée de cellules tumorales de souris réalisé 1 seule fois durée de la procédure maximum 10 secondes 2) une implantation intra-prostatiques des cellules tumorales de souris réalisé une seule fois, durée de la procédure maximum 10 minutes. Toutes les souris seront observées deux fois par semaine selon une grille de score permettant d'évaluer leur comportement et les tumeurs sous-cutanées mesurées deux fois par semaine sous anesthèsie gazeuse (environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Le projet proposé est susceptible d’induire des nuisances, telles qu’une perte de poids, un stress, une perte d’appétit et des douleurs successives au geste chirurgical et à la prise tumorale. En particulier , l’implantation de tumeur en sous-cutanée peut induire des grosseurs susceptibles de gêner les mouvements normaux de l’animal. Il peut induire des douleurs de longue durée ou gonflements au niveau du site de greffe. Une infection/inflammation locale au site d’injection, ainsi que l’apparition d’hématomes font également partie des effets indésirables possibles (sévérité modérée). Des effets systémiques peuvent être attendus : perte de poids, faiblesse musculaire, altération du comportement (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. L’implantation de tumeur en orthotopique (intra-prostatique) est une procédure pouvant également induire des effets néfastes, tels qu’une inflammation locale et des douleurs moyennes, de moyenne durée. L’insertion de cellules tumorales dans la prostate (organe richement vascularisé) peut entraîner des saignements locaux de courte durée. Malgré un geste maitrisé, la lésion des structure et tissus environnants est possible, entrainant des difficultés urinaires. La prise tumorale et le développement d’une masse pelvienne peuvent également entrainer des douleurs, et des difficultés urinaires et de motilité de l’animal (sévérité modérée). Ces effets peuvent apparaître pendant toute la durée de la procédure c'est a dire 30 jours. Des effets indésirables consécutifs à l’anesthésie sont possibles : détresse respiratoire, hypotension, bradycardie, hypothermie. Ces effets indésirables sont immédiats et seront pris en charge dans les minutes post-observation. Les données de la bibliographie n’indiquent pas de potentiel métastatique de cette lignée cellulaire, les effets indésirables liés aux métastases ne sont donc pas attendus.

Devenir

Les animaux seront mis a mort par dislocation cervicale apres une anesthesie à l'isoflurane pour les prélèvements de tumeurs, organes lymphoïdes et foie pour analyses.

Remplacement

Ces études sont précédées par des études in vitro de cocultures de milieu tumoral obtenu à partir de lignées cellulaires (cellules tumorales de souris ou autres cellules de cancer de la prostate) et de cellules immunitaires. Nous évaluons notamment l’effet de l’activité ou de l’inactivation des LXRs sur les mécanismes cellulaires impliquant les cellules immunitaires (activation, capacités phagocytaires et migration), permettant de limiter le recours à l’expérimentation animale. Cependant l’utilisation de modèles tumoraux syngéniques (mêmes espèces entre tumeur greffée et animal receveur) permettra d’avoir une cartographie de l’ensemble des cellules immunitaires en fonction de l’état d’activation des LXRs au sein d’un système complet. .

Réduction

Une étude pilote, permettant d’ajuster la dose/le modèle de souris à utiliser dans l’étude principale, effectuée sur un petit lot d’animaux, permettra de limiter le nombre d’animaux inclus dans l’étude. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé et minimisé tout en maintenant la puissance statistique de l’étude. Le prélèvement de plusieurs organes par animal à la fin des expérimenations permet également d’optimiser ce nombre utilisé. Des données préliminaires obtenues par l’équipe in vitro/sur d’autres études ont également été utilisées dans la mise en place du design expérimental, afin d’affiner les hypothèses de recherche et d’éviter l’utilisation trop importante d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 4 souris avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’ensemble des enrichissements est adapté aux éventuels changements de corpulence du rongeur induits par la prise tumorale (grosseurs/gènes locomotrices). Les animaux bénéficieront d’un suivi pré, per et post-opératoire renforcé, qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal être (feuille de score pour chaque animal). Une observation quotidienne est réalisée par les zootechniciens et un suivi bihebdomadaire par les participantes au projet. Une intervention par des traitements analgésiques et anti-inflammatoires est prévue le cas échéant.

Choix des espèces

La réponse immunitaire anti-tumorale est un processus complexe impliquant le dialogue entre de nombreux types cellulaires notamment les cellules de la tumeur et les cellules immunes. L’utilisation d‘animaux immunocompétents permet d’étudier les mécanismes mis en jeu dans un organisme complet, ce qui est majeur pour le developpement de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. L’utilisation du modèle souris permet aussi d’utiliser des organismes modifiés génétiquement et d’étudier des régulateurs spécifiques. Nous utiliserons des individus post-puberts de 2 à 4 mois, correspondant à a période optimale pour les procédures d’implantation au niveau de la prostate.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dès la gestation avec un régime carencé en oméga 3 ou équilibré, elles subissent une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau, une injection de N-oxyde de clozapine, puis un test de mémoire de travail spatiale et un test de mémoire associative. Ce second test consiste à associer un environnement à des "stimulations" appliquées aux pattes, susceptibles selon le porteur de provoquer une douleur passagère, sans qu'il précise lesquelles. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale" et qu'aucune méthode de remplacement n'apparaît dans les bases de données consultées, l'apport annoncé étant une meilleure compréhension des liens entre alimentation et mémoire.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de notre équipe et fait suite à plusieurs années de recherche sur l'impact des acides gras polyinsaturés oméga 3 sur la physiologie du cerveau. Les données obtenues sur ce projet ont donné lieu à plusieurs publications et nous ont permis d'obtenir des soutiens financiers importants (ANR JCJC, JPND Solid européen). La carence en lipides oméga 3 est associée à des déficits du développement cérébral et des altérations de comportement à l'âge adulte. Nos résultats récents indiquent une augmentation de l'activité des neurones de l'hippocampe dans le cerveau lorsque les souris sont soumises à un régime déficient en lipides oméga 3 depuis la gestation chez les mâles et les femelles à l'âge adulte. Cette hausse d'activation de l'hippocampe est associée à une altération des mémoires de travail et associatives dépendantes de l'hippocampe en condition de carence en oméga 3. Notre objectif est de démontrer que cette hyper-activation est responsable des déficits comportementaux par des approches de pharmacogénétiques permettant de diminuer l'activité des neurones de l'hippocampe pendant la tâche comportementale.

Bénéfices attendus

Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche de pharmacogénétique et comportementale. Elle apportera des connaissances nouvelles visant à mieux comprendre les mécanismes cérébraux des troubles de la mémoire en lien avec l'alimentation.

Procédures

Les animaux seront soumis à des régimes carrencés ou équilibrés en oméga-3 depuis la gestation. Ils sont soumis à 1 test comportemental à 3 mois visant à mesurer la mémoire de travail spatiale et la mémoire associative, toutes deux dépendentes de l'hippocampe. Une injection intrapéritonéale de N-oxyde de clozapine juste avant le comportement sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux de la procédure 1 réaliseront un test de mémoire de travail spatiale qui dure 15 min au total sur deux jours (acquisition, test) et ne cause aucune détérioration de l'état général des animaux. Les animaux de la procédure 2 subiront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations pouvant entrainer une douleur passagère au niveau des pates mais n'entrainant pas de perte de poids, ni d'altération de l'état général des animaux. Pour les deux procédures, les régimes équilibré, carencé en Oméga 3 n’impactent pas le bien-être général de l’animal en termes de comportements alimentaire ou social mais pourraient modifier les capacités cognitives que nous voulons étudier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection stéréotaxique chirurgicale d'un virus dans le cerveau, qui induira une douleur passagère chez les animaux, traitée par une approche d'antalgiques pré et post-opératoire. Une baisse de l'appetit et une diminution du poids des animaux est possible en post-opératoire et nécessitera un suivi post-opératoire journalier. Pour les deux procédures, les animaux subiront une injection de N-oxyde de clozapine en périphérie, qui n'a pas d'effet indésirables à la dose et fréquence d'administration sur l'état de bien être des animaux, mais induira une légère douleur passagère liée au geste.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en oméga n-3 sur les mémoires à l'âge adulte chez la souris. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique afin de permettre un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu tel que des igloo en carton ou en plastique, ainsi que de l'eau et de la nourriture à volonté. Les souris auront plusieurs phases d'habituation : une semaine d'habituation à l'arrivée des géniteurs, une habituation à l'experimentateur avant les tests et/ou les chirurgies, une habituation aux pièces de comportement avant les tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Le projet porte sur le stade adulte des animaux pour lequel des données préliminaires ont été générées chez la souris et la genèse de données nouvelles sur le modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et déclin cognitif, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement notamment à l'âge adulte.

Injection de cellules tumorales en moins d'une minute, mesure du volume de la tumeur tous les deux jours sur animal vigile, trois vaccinations sous anesthésie espacées d'une semaine, deux prises de sang, puis radiothérapie. 2 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du sein pour les femelles et de mélanome pour les mâles. Le porteur affirme que le développement de la tumeur ne créera pas de contrainte mécanique et que la radiothérapie, administrée au quart ou à la moitié de la dose maximale tolérée, n'induit aucune nuisance. Toutes sont tuées, soit après avoir atteint les points limites, soit pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité antitumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par le matériel génétique tumoral hors des cellules. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération du matériel génétique tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et potentialise l’immunité antitumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité du matériel génétique dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité antitumorale. Nous avons caractérisé récemment une composante dont la fonction principale est de couper/digérer le matériel génétique libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience de cette enzyme limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de protéine, ciblant le matériel génétique tumoral, dans la régulation de l’immunité antitumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de cette composante dans la régulation de l’immunité antitumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'une composante ciblant le matériel génétique libéré dans les tumeurs dans la régulation de l’immunité antitumorale induite par différentes radiothérapies en oncologie. C’est une question fondamentale car le matériel génétique libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Des résultats préliminaires de nos collaborateurs semblent indiquer que cette composante soit requise pour l’induction de l’immunité antitumorale induite par certaines chimiothérapies, notre but est d’étudier les rôles de cette composante dans les mêmes modèles tumoraux mais traités par radiothérapies. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancers du sein et du mélanome.

Procédures

1. L’injection des cellules tumorales ou des anticorps est réalisée en moins d’une minute. 2. Certains animaux de l’étude auront deux prélèvements de sang. 3. La mesure du volume tumoral est effectuée tous les deux jours sur des animaux vigiles. et dure moins d’une minute par souris. 4. La vaccination par des cellules s’effectue sur souris endormies à 3 reprises espacées d’une semaine ; l’injection dure au maximum une minute par souris.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée à l'injection de cellules par voie sous-cutanée ou dans le coussinet de la glande mammaire est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs sera suivi par des mesures régulières et leur développement ne créera pas de contraintes mécaniques chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements par les vésicules, des études préliminaires ont montré qu’elles ne seraient pas supérieures à celles induites par une piqûre d’aiguille ; aucune autre douleur n’est prévisible. Dans ce projet, la thérapie radioactive n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la dose maximale tolérée.

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront euthanasiés à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction d’une enzyme coupant/digérant le matériel génétique relargué par les cellules cancéreuses impliquée dans la mise en place de la réponse antitumorale suite aux traitements anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés avec une déficience de cette enzyme. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudierons l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Concernant la gestion de la colonie de souris, nous utilisons les souris femelles pour le modèle de cancer du sein, tandis que les souris mâles seront utilisées pour le modèle de mélanome. Ainsi, les mâles et les femelles issues de notre colonie seront utilisés pour l’un de nos modèles, afin d’optimiser au maximum la gestion de notre colonie.

Raffinement

Nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures (décrits dans la section procédure) mises en œuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. L’approche des points limites entrainera une surveillance accrue des animaux (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car nous avons une souche de souris génétiquement déficiente pour la composante que nous étudions afin répondre au mieux à nos objectifs. Nous utiliserons les souris adultes à partir de 8 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle d’une composante l’induction de l’immunité antitumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein et du mélanome, des pathologies qui affectent exclusivement l’adulte.