Oncologie

632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 256 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit des cancers du poumon ou de la vessie par un carcinogène chimique présenté comme identique à celui du tabac, administré par injections ou dans l'eau de boisson pendant plusieurs semaines, pour étudier des fibroblastes qui entourent les tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs de vessie peuvent provoquer une occlusion, une rétention d'urine et des douleurs, contenues par une palpation régulière et des points limites. Il reconnaît que des cultures d'organoïdes sont à l'essai mais les juge insuffisantes, et renvoie à une perspective les retombées pour l'immunothérapie.

Objectifs

Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à une biopsie auriculaire, en vue de déterminer leur génotype, avant d’intégrer les différentes procédures. Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines.

Impact sur les animaux

Une légère douleur de courte durée est attendue lors des biopsies auriculaires nécessaire au génotypage des animaux. Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre). Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle.

Devenir

Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem

Remplacement

Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas pour l’instant de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. Seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’initier cette recherche fondamentale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici . Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure.

Raffinement

Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite

Choix des espèces

Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris seront génotypées à 3 ou 4 semaines (prélèvement auriculaire) Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.

13 366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 108 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations liées à la dystonie et à la maladie de Parkinson, elles reçoivent jusqu'à trente injections dans le péritoine, des chirurgies du cerveau, neuf prélèvements sanguins et des tests de récompense qui imposent isolement et restriction alimentaire pendant plusieurs semaines. Le porteur indique qu'un tiers des souris d'une lignée cessent de grandir et sont alors tuées. Il affirme que ce réseau neuronal ne peut pas être reproduit in vitro et renvoie au long terme les retombées pour des maladies rares.

Objectifs

L’objectif général de ce projet est de déterminer les conséquences de mutations de gènes impliqués dans des dystonies et dans la maladie de Parkinson sur les circuits moteurs, les circuits de la récompense, l’addiction et de la dépression, ainsi que les anomalies moléculaires dans une zone spécifique du cerveau chez des souris mutantes, modèles de troubles du tonus musculaires (contractions musculaires involontaires par exemple). Puisque les protéines perturbées peuvent être exprimées dans d’autres organes que le cerveau, les altérations métaboliques due à ces mutations seront aussi étudiées. Nous étudierons également les anomalies moléculaires des souris mutées.

Bénéfices attendus

Bénéfices tant scientifiques que thérapeutiques. Mise en évidence des anomalies potentiellement similaires à celles observées chez les patients et essai d'un traitement potentiel de ces anomalies. Ces découvertes bénéficieront à la caractérisation et compréhension des anomalies moléculaires expliquant les symptômes observés chez les patients et permettront de découvrir de nouveaux traitements et d'améliorer la prise en charge des patients qui souffrent d'une maladie rare et orpheline donc nécessitant un effort de recherche pour les soutenir.

Procédures

Prélèvement d'extrémité de queue pour génotypage (durée de quelques secondes). Les animaux ayant un phénotype dommageable (1/3 des animaux au sein d'une seule des lignées participantes) arrêtant leur croissance seront euthanasiés avec appui du personnel en charge du Bien Etre Animal pour la décision. Les injections intrapéritonéales (max30 au total par animal réparties sur une plusieurs semaines - quelques seconde/injection) ainsi que le nouvel environnement dans les appareils expérimentaux pourraient potentiellement introduire un stress chez certains animaux et une fatigue liée aux tâches d'apprentissage sans jamais atteindre l’épuisement mais qui entraînerait un arrêt de la participation à la tâche par l'animal. Les souris qui participeront à un test de récompense seront isolées pour la restriction alimentaire pendant une semaine avant de commencer le protocole de réponse aux récompenses pendant 3 semaines, effectué dans une cage équipée de distributeurs de récompense. Les souris participant au test de préférence à l’eau sucrée seront isolées pendant 4 à 6 semaines, placées dans des cages de plus grande taille avec 2 biberons. Les souris chez qui les paramètres métaboliques seront mesurés auront 9 prélèvements sanguins, sous anesthésies locale, répartis sur 3 jours différents espacés d’une semaine, sur des periodes de 2h lors des jours de prélèvement. Une unique procédure chirurgicale est prévue pour certains des animaux : l’opération chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, durera 30 min environ pour une micro-injection dans une structure cérébrale. En fin de période de maintien, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable observé chez certaines souris (1/3 des animaux au sein d'une seule des lignées participantes) provoquera une perte de poids et un arrêt de croissance. Les animaux seront euthanasiés dès l’observation d’absence de croissance. L'identification génétique (génotypage) des animaux réalisée par prélèvement de quelques millimètres d'extrémité de la queue est susceptible de générer une douleur et un stress de courte durée. Les injections intrapéritonéales, les prélèvements sanguins répétés et l'injection du traitement et le test comportemental répété à plusieurs reprises peuvent également générer du stress et une douleur légère et de courte durée. L’isolement et la restriction alimentaire nécessaires pour certaines tâches comportementales pourrait introduire un stress et une perte de poids limitée. Les injections neurochirurgicales pourraient potentiellement introduire un stress ainsi que de la douleur chez certains animaux dans les heures ou les jours suivants après la chirurgie.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre les analyses scientifiques biologiques par prélèvements de tissus

Remplacement

Notre projet propose de disséquer les mécanismes et les conséquences du rôle de mutations dans des gènes impliqués dans des maladies comme la dystonie et le Parkinson, dans l'apparition de troubles de l’apprentissage par récompense et de troubles du métabolisme, mettant en jeu différents réseaux neuronaux et métaboliques, ainsi que les voies de signalisation moléculaires chez les souris porteuses de ces mutations. Le fonctionnement de ce réseau ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu'à l'aide d'études comportementales au niveau de l'animal. Une fois les acteurs moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures lorsque cela est possible pour limiter le nombre d'animaux utilisés. D'une façon générale, nous nous efforçons continuellement d'évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués est de maximum 13366 pour l'ensemble des procédures. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats

Raffinement

Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d'hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d'inconfort possible. Pendant les procédures, les animaux seront observés et manipulés quotidiennement et une pesée sera effectuée régulièreement. Lorsque cela est possible, les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h. L'eau, la nourriture seront fournies ad libitum sauf en cas de procédure avec restriction alimentaire, un carré de coton pour nidifier ainsi qu’un bâtonnet à ronger sont placés dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Si besoin, lors d’un petit effectif ou de tension dans le groupe un complet d’enrichissement peut être apporté par des maisonnettes ou des lanières de kraft. Ils feront l'objet d'un contrôle quotidien. L'évaluation de la douleur et de la détresse est réalisée en observant l'aspect des souris et leur comportement. Des points limites sont définis spécifiquement aux procédures et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Le cas échéant, des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux (injection d'antalgiques) si trouble mineur ou passager, ou bien euthanasie règlementaire. Les mutations dans les lignées transgéniques envisagées ne sont pas dommageables pour l’état de santé de l'animal. Lors des chirurgies : mise en place de diverses mesures préventives des complications.

Choix des espèces

Dans nos études, les souris sont utilisées afin de tirer profit des techniques de transgénèse (souris transgéniques). La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies du mouvement proche de celle de l'homme. Il existe de nombreux tests comportementaux nécessaires pour cette étude qui sont développés chez la souris. La souris est un modèle reconnu d'étude du mouvement, notamment car elles ont des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et sont déjà utilisées dans des modèles de mouvements anormaux hyperkinétiques, particulièrement pertinents dans l'étude de la pathologie étudiée ici. La souris est aussi très utilisée dans les études de récompense, l’addiction, et l’anxiété. Les protocoles concernant ces aspects sont bien définis et les mécanismes sont également clarifiés. Concernant l’étude de métabolisme, la souris partage beaucoup de similarités physiologiques avec l’humain qui fait que la souris est un très bon modèle pour effectuer des études in vivo et ex vivo concernant la mesure d’insuline, concentration de glucose etc. la zone du cerveau de la souris qui nous intéresse (le striatum) murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et des humains, en faisant ainsi un modèle particulièrement utile à l'étude d'une maladie de cette zone , telle que les mouvements anormaux étudiés ici. Expériences chez des animaux adultes. Cette partie du projet s'intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des mouvements anormaux liés aux dystonie et à la maladie de parkinson, exprimés dans un organisme mature, à l'âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes.

78 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, parfois par chirurgie de la veine jugulaire, six séances d'imagerie sous anesthésie et une ponction cardiaque terminale, pour suivre la distribution de liposomes destinés à traiter des femmes enceintes. Le porteur indique que les procédures peuvent provoquer des avortements spontanés, et que les fœtus sont tués par décapitation pour analyse. Le recours à un "organisme entier" est présenté comme nécessaire pour étudier la mère et les fœtus.

Objectifs

Le développement de médicaments lors de la grossesse est complexe, car il faut à la fois éviter le passage des médicaments du côté du bébé et les concentrer au niveau du placenta pour limiter les effets secondaires chez la mère. Ainsi ce projet s’articule autour du développement de médicaments de tailles nanométriques, qui sont fabriqués pour aller spécifiquement dans le placenta.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques disponibles pour la femme enceinte.

Procédures

Tous les animaux vont être soumis à des interventions suivantes : une seule injection dans la veine de la queue (30 secondes), la souris étant maintenue dans une cage de contention sur une durée totale de 3 minutes, ou injection dans la veine jugulaire qui nécessite une chirurgie (durée 30min), 6 séances d’imageries sous anesthésie générale d'une durée totale de 10 minutes au maximum par séance, une anesthésie profonde avant de procéder au prélèvement sanguin sur les animaux endormis par ponction cardiaque (geste d’une durée d’une minute environ). Les animaux seront ensuite mis à mort dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal. Les embryons seront mis à mort par décaptitation pour l'analyse de ceux-ci.

Impact sur les animaux

La pose de cathéter au niveau de la veine jugulaire nécessite une chirurgie sous anesthésie. Ce projet utilise des femelles gestantes, les procédures pourraient induire des avortements spontanés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution et la toxicité éventuelle des molécules utilisées sur ceux-ci. Les foetus sont euthanasiés pour évaluer la toxicité des molécules utilisées et s’il y a présence de ces molécules dans les tissus fœtaux ou non pour évaluer un potentiel passage des molécules à travers du placenta.

Remplacement

Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations par des expériences réalisées en laboratoire pour ne tester chez l’animal, que les formulations optimales. Il nous est nécessaire de disposer d’un organisme entier, car nous souhaitons étudier les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse sur la mère et les bébés. Nous ne disposons pas de méthode alternative permettant de répondre à ces questions.

Réduction

Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Nous utiliserons des tests statistiques afin de définir le nombre minimum d'animaux à étudier pour mettre en évidence les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse. Ainsi, pour l’étude pilote 3 femelles non gestantes par condition seront utilisées. Nous utilisons une technique d’imagerie optique, non invasive, pour évaluer le profil de distribution en fonction du temps. Cela permet de faire plusieurs mesures sur un même animal et donc in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. En effet, il ne sera plus nécessaire d'euthanasier l’animal pour localiser les molécules fluorescentes puisque leur localisation peut être évaluée en fonction du temps, grâce à l’utilisation de l’imagerie. Pour la deuxième partie des groupes de 15 souris gestantes par conditions seront suffisants.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d’hébergement et auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. La souris est placée sur un tapis thermostaté pendant l’imagerie. De plus, elle sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d’imagerie. Des points limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis, surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînerait l'euthanasie anticipée de l'animal.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer, la distribution des molécules de tailles nanométriques, dans les différents tissus de l'organisme, après injection. La souris est le modèle le plus approprié de par sa physiologie proche de l’homme ainsi que la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Nous analyserons des souris femelles adultes âgés de 10 semaines au moment de l’injection. Les souris femelles gestantes seront en deuxième semaine de gestation. Cette chronologie de gestation est choisie, car c’est le moment où le placenta est le mieux développé et c’est un moment encore assez éloigné pour ne pas risquer un accouchement prématuré.

1360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de fragments de tumeurs d'enfants ou une injection de cellules tumorales, puis des injections répétées et des prélèvements sanguins, pour étudier le sarcome d'Ewing et tester des traitements. Le porteur décrit des greffes et injections jugées peu gênantes et des prélèvements sanguins brièvement douloureux. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles reproduisant l'écosystème tumoral sont les seuls proches des tumeurs de patients et restent nécessaires avant les essais chez l'humain.

Objectifs

Les tumeurs pédiatriques sont rares, puisqu’en France, un enfant sur 440 va développer un cancer avant l’âge de 15 ans, mais elles représentent 28 % de la mortalité enfantine ce qui en fait la 2e cause de décès chez les 1-14 ans après les accidents. Le sarcome d’Ewing est la seconde tumeur osseuse maligne pédiatrique la plus fréquente après l’ostéosarcome et touche environ 80 à 100 nouveaux patients par an en France. Malheureusement, 20 % des patients présentent des métastases au diagnostic ce qui diminue drastiquement leur chance de survie. Génétiquement, le sarcome d’Ewing a bien été caractérisé et est lié à une fusion entre deux gènes, aboutissant à l’expression d’une protéine anormale. Cependant, les mécanismes d’action de cette protéine dans la transformation tumorale doivent encore être élucidés. Afin de comprendre cette transformation tumorale et identifier les meilleures pistes thérapeutiques pour ces patients, l’utilisation des modèles animaux est primordiale pour nos projets. Nous utilisons des modèles de PDX (patient derived xenograft) qui sont générés après une greffe chez la souris d’un fragment de tumeur issu de patients. A l’heure actuelle, ces modèles animaux n’ont pas d’équivalence qui leur permettrait d’être remplacés par des approches alternatives de type in vivo puisqu’ils sont les seuls qui se rapprochent le plus de la tumeur de patients. . L’objectif du projet est d’identifier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - la génération de nouveaux modèles d’étude de cancers pédiatriques (PDXs ainsi que de nouvelles lignées cellulaires dérivées de PDX) qui sont limitants aujourd’hui. En effet, les modèles de PDX nous permettent d’obtenir du matériel tumoral suffisant pour réaliser nos études puisque nous ne pouvons pas les effectuer sur les tumeurs de patient, vu la quantité de matériel obtenue et la rareté des échantillons. De plus, les modèles PDX sont les seuls modèles qui se rapprochent le plus aux tumeurs de patient. - Etudier la structure 3D de la chromatine sur ces échantillons de PDX pourra générer un maximum de données qui seront primordiales à la compréhension de la biologie des tumeurs d’Ewing et des Ewing-Like. Ces résultats et analyses vont nous permettre de répondre à nos questions biologiques et par la suite, ces données pourront être utilisées par toute la communauté scientifique afin de répondre à leur propre hypothèse. - La validation des nouvelles molécules identifiées sur des modèles de PDX. En effet, les découvertes qui seront réalisées grâce à ces nouvelles technologies et grâce au criblage in vitro, vont nous permettre l'identification de nouvelles molécules. Il sera donc important de valider ces dernières in vitro sur des cellules dérivées de PDX et in vivo sur des modèles de xénogreffe/PDX avant de passer aux tests cliniques chez l’homme.

Procédures

Une partie des souris de ce projet sera opérée sous anesthésie (1 fois) pour recevoir un fragment tumoral en sous-cutanée au niveau du dos (durée de l’anesthésie : 15 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine. (durée du geste inférieure à 30 sec) Une autre partie des souris sera injectée avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée aux animaux anesthésiés (1 fois – durée de l’anesthésie inférieure à 1 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine (durée du geste inférieure à 30 sec)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues au cours de la greffe de fragments tumoraux seront celles liées à l’incision de la peau sur des animaux anesthésiés (gène d’intensité faible et de courte durée). Suite à ces greffes, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du dos qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles à l’injection de produits non toxiques et non douloureux (gène d’intensité faible, de courte durée). Suite à ces injections, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du flanc qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les prélèvements de sang au niveau de la joue entraineront une douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques dans l’abdomen des souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles pré-cliniques pertinents de la maladie est nécessaire, pour étudier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. En particulier, l'utilisation de la souris qui est un organisme vivant, mammifère intégré et autonome, présente de nombreuses similitudes avec l’homme. L’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques ne peut se limiter à des expériences in vitro. En effet, nous réalisons d’ores et déjà pour nos différentes études des expériences in vitro pour tester par exemple des molécules sur des lignées cellulaires. Aussi, nous réalisons en collaboration, des expériences ex-vivo en microfluidique en utilisant des cellules dérivées de PDX. La microfluidique permet de miniaturiser l’expérience afin de tester un grand nombre de molécules avec peu de cellules ce qui permet de réduire le nombre de souris à utiliser pour ces tests. Nous effectuons également des expériences sur des tumeurs de patients pour caractériser l’expression des gènes. Cependant, la rareté des échantillons humains et la faible quantité obtenue ne nous permettent pas de réaliser des expériences complémentaires sur ces échantillons. D’où l’importance d’utiliser ces - modèles murins, reproduisant au mieux la complexité de l’écosystème tumoral, incluant cellules tumorales et cellules du microenvironnement, avant d’envisager des tests chez l’Homme dans le cadre d’essais cliniques.

Réduction

Toutes les précautions seront prises pour réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant une valeur significative des résultats obtenus. Les tests préliminaires in vitro permettent de limiter le nombre de molécules à tester sur les souris. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Les souris recevront anesthésique et analgésique au moment de la greffe. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, lors des greffes ainsi que des traitements, les animaux auront une surveillance accrue afin d'assurer leur bien-être. Une observation et une notation de leur état général seront évaluées de façon objective en utilisant une grille de score. Les expérimentations sont arrêtées dès l'atteinte d'un point-limite.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour les expériences menées en oncologie. En effet, les souches murines sont parfaitement définies (modèles génétiquement modifiés, souches immunodéprimées permettant le développement de tumeur d'origine humaine) et présentent une parenté biologique avec l’Homme (génome murin/humain, physiologie). Ceci est vrai pour la tumeur que nous étudions, à savoir le sarcome d’Ewing. Nous utilisons des modèles PDXs reproduisant la diversité des tumeurs de patients. Dans le contexte préclinique du cancer, les PDXs reconstituent l’écosystème tumoral avec ses différentes composantes, incluant cellules tumorales et autres cellules présentes de la tumeur tel qu’il existe chez les patients. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance, l'adolescence et les jeunes adultes. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des animaux âgés de 5 semaines (réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation) à 8 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement de ces tumeurs pédiatriques.