Oncologie

1 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des tumeurs humaines leur sont greffées (glioblastome, prostate, rein, poumon) puis traitées par des anticorps monoclonaux, la charge tumorale pouvant atteindre 1 500 mm³ et provoquer nécroses et métastases entraînant la mise à mort. Le porteur revendique un dispositif "ON/OFF" arrêtant les étapes suivantes en cas d'échec, censé réduire les effectifs. Il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" pour prendre en compte le microenvironnement tumoral que le in vitro ne reproduit pas.

Objectifs

La croissance des tumeurs malignes nécessite un débit sanguin adapté, fourni par des vaisseaux néoformés, permettant l’apport d’éléments nutritifs et d’oxygène nécessaires à cette croissance pathologique. Ce phénomène est le résultat d’actions coordonnées entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement de la tumeur. Parmi les facteurs potentiels, une protéine fortement impliquée notamment dans le phénomène de vascularisation intra-tumorale a été mise en évidence : l’Adrénomédulline (AM). L’implication de l’AM dans le processus tumoral a fait l’objet de nombreux articles de recherche scientifique publiés dans des journaux internationaux. Son rôle a également été valorisé par plusieurs publications sur différents modèles tumoraux in vitro mais également in vivo. L’utilisation d’anticorps polyclonaux anti-système de l'AM, provoque une diminution de la croissance tumorale in vivo sur des modèles de xénogreffes tumorales. Cependant les anticorps polyclonaux ne peuvent être utilisés en thérapie humaine. Ainsi dans cette optique, des anticorps monoclonaux ont été développés. Cette étude permettra d’évaluer l’efficacité des différents anticorps monoclonaux produits sur différents modèles tumoraux et de les valider comme potentiel outil thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est de démontrer que les anticorps monoclonaux bloquants anti-récepteurs de l’AM dirigés contre la région extracellulaire peuvent déstabiliser la vascularisation tumorale par apoptose des cellules vasculaires endothéliales et promouvoir une régression tumorale faisant de ces anticorps un outil thérapeutique visant à améliorer le traitement des cancers et permettant de répondre à l’échappement de certains patients aux thérapeutiques actuellement utilisées.

Procédures

3 procédures expérimentales vont être menées: 1/Test d’angiogenèse sur souris C57BL6. Nous aurons différents groupes d’expérimentation : 1 groupe contrôle placebo recevant une solution saline ; 1 groupe positif traité avec un anticorps polyclonal ayant montré dans une étude in vivo antérieure une efficacité ; 5 groupes correspondant aux 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP2 validés comme efficaces in vitro ; de même 5 groupes pour les 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP3 validés in vitro. Pour chaque groupe, 10 souris seront nécessaires. Nous aurons donc besoin pour une expérimentation de 12 groupesx10 souris soit 120 souris. Cette expérience sera réalisée en duplicate pour valider les résultats obtenus et montrer leur reproductibilité, nous aurons donc besoin de 240 souris C57BL6. Les souris seront mises à mort au 21ème jours. 2/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes hétérotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Suite à l’angiogenèse in vivo, seuls les 3 meilleurs anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et les 3 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés. Il y aura toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif traité avec l'anticorps polyclonal. Pour les modèles du cancer de la prostate, du rein et du poumon, on a 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 80 souris par modèle soit pour 3 modèles = 240 souris. Pour le modèle du glioblastome (prise tumorale 100%), on a 8 groupes x 7 souris = 56 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un maximum de 592 souris athymiques. Le temps de traitement sera dépendant de la vitesse de croissance tumorale et du suivi clinique des animaux. 3/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Pour les anticorps monoclonaux, suite aux expériences hétérotopiques, seuls les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP2 et les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés, nous aurons toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif. Pour chaque modèle, on a donc 6 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 60 souris, soit pour l’ensemble des modèles 4x60 = 240 souris. Cette expérience sera dupliquée pour montrer sa reproductibilité ce qui montera le besoin en souris à 480. Le temps de traitement sera dépendant de la perte de poids de l'animal et du suivi clinique, sans modification le temps maximum de traitement sera de 5-6 semaines.

Impact sur les animaux

Pour détecter toute souffrance, nous observons quotidiennement le comportement des souris : mobilité, alimentation, agressivité, prostation, déshydratation, abcès, hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20 % de son poids et la charge tumorale ne devra pas excéder 10% du poids de l'animal ou un volume de 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux (2 fois/semaine mais tous les jours si la perte de poids est supérieure ou égale à 10%) et par mesure de la masse tumorale avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique (3 fois/semaine). Si un des critères pré-établis selon la grille d'évaluation de la souffrance ou de détresse mise en place, il sera mis à mort immédiatement. Des phénomène de nécrose peuvent également être observés sur les xénogreffes hétérotopiques. Ils sont associés au développement tumoral des glioblastomes sans traitement au préalable ceci étant due probablement à la vitesse de croissance tumorale très importante. Les autres modèles tumoraux peuvent également présenter des phénomènes de nécrose de la tumeur suite à un traitement anti-angiogénique. Enfin des métastases peuvent apparaître, les animaux seront alors immédiatement mis à mort.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Prélèvement de tissus après mise à mort : sous hotte stérile prélèvements du Matrigel, des tumeurs et des organes afin de réaliser des études permettant l'analyse de la croissance tumorale et du microenvironnement en fonction des traitements appliqués.

Remplacement

Le processus de développement d'une substance originale comme médicament exige, après l'étude in vitro sur des cellules en culture, de valider son utilisation in vivo. En effet préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leur efficacité sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo ainsi parmi les 24 anticorps, seuls les 5 anticorps anti-RAMP2 et les 5 anticorps anti-RAMP3 les plus efficaces ont été retenus pour passer à l'étape in vivo. Cette étude in vivo sur modèles tumoraux ne peut être remplacée car elle est indispensable pour prendre en compte le microenvironnement tumoral sachant de nombreuses études publiées au niveau internationnal montre que ce compartiment est un partenaire très actif avec la cellule maligne influançant le processus tumoral, celui-ci n'étant pas pris en compte in vitro. Il est également nécessaire de déterminer s'il existe des effets physiologiques de ces anticorps. Les retours d'expériences in vivo sont donc indispensables au développement de potentiel médicament et sont des pré-requis à l'étude clinique.

Réduction

Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de souris de 1312 cependant ces études seront menées avec un système de ON/OFF et en affinant le nombre d'anticorps à tester. Préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leurs efficacités sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo à 5 anticorps et par conséquent le nombre de lots d'animaux à utiliser. Ainsi une première étude d'angiogénèse sera réalisée avec 5 anticorps anti-RAMP2 et 5 anticorps anti-RAMP3. Si l'expérience est infructueuse, elle sera arrêtée. Si des résultats positifs sont obtenus, l'étude sur xénogreffes hétérotopique (étape 2) sera lancée mais avec un maximum de 3 anticorps anti-RAMP2 et 3 anti-RAMP3 à tester. Pour l'étape 3 s'agissant de l'étude sur xénogreffes orthotopiques, seuls les modèles tumoraux positifs à l'étape 2 et un maximum de 2 anticorps ant-RAMP2 et 2 anti-RAMP3 seront lancés. Cependant si les résultats sont négatifs à l'étape 2, l'étude sera arrêtée après les modèles hétérotopiques. Ce nombre de 1312 souris correspond aussi à un nombre de souris n=10 par groupe d'expérimentation sauf pour le modèle hétérotopique du glioblastome où n=7. Ce nombre de 10 souris (ou 7) par groupe d'expérimentation nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable au niveau de la réponse au traitement et de faire face aux problèmes de prises tumorales. Pour analyser les résultats obtenus nous utilisons le test de variance ou de Fischer PLSD, Statview 512. Pour valider les résultats, les expériences devront être dupliquées pour prouver leur reproductibilité et leur non-dépendance par exemple au lot de production des souris.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 15 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les souris seront hébergées dans des cages de tailles adéquates. Un enrichissement du milieu par igloo teintés en polycarbonate qui réduit le stress induit par les facteurs environnementaux et les interactions sociales sera utilisé. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement) d'air sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Les souris seront surveillées quotidiennement par un personnel expérimenté. Pour diminuer la souffrance au moment de l'acte chirurgical, une analgésie pré et post-opératoire sera appliquées. Le temps d’analgésie post-opératoire sera adapté en fonction du suivi clinique des souris. Au moment de l'injection du Matrigel ou des cellules tumorales, une anesthésie gazeuse sera réalisée. Dans le cas du modèle orthotopique, une anesthésie fixe sera utilisée. Si des nécroses de la tumeur apparaissent, nous soulagerons la douleur des souris par application d'une analgésie adaptée. Pour détecter toute souffrance, leur comportement est observé régulièrement : mobilité, alimentation, agressivité, prostration, déshydratation, abcès et hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20% de son poids et la charge tumorale ne devra pas représenter plus de 10% du poids de l'animal sans excéder 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux et la mesure du développement des tumeurs avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique. Si un des critères pré-établis survient chez l'animal, il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Pour les tests d’angiogénèse in vivo, nous utiliserons des souris C57BL6, modèle général polyvalent. L’immunocompétence de ces souris est importante car l’objectif est d’étudier l’ensemble des cellules recrutées par l’AM au sein du Matrigel, cellules pro-angiogéniques et cellules du système immunitaire. Certes il y a un risque d’immunisation active des souris contre l’anticorps injecté cependant le temps de traitement de maximum 15-20 jours va permettre de limiter au maximum ce biais potentiel. Ce modèle a été validé et publiés dans de nombreux articles internationaux. Pour les études sur la croissance tumorale, la souris athymique nude, laquelle a un système immunitaire déficient, a été choisi afin de pouvoir implanter des cellules cancéreuses (lignées cellulaires humaines établies) permettant la formation de tumeur. Les souris seront âgées de 7-8 semaines afin d'avoir un poids adulte stable. Pour les souris C57BL6, cet âge est également adapté à l’immunocompétence attendue dans le modèle d'étude de l'angiogénèse in vivo.