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Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 1/2)
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Génétiquement modifiées pour porter des mutations trouvées chez des enfants atteints à la fois de maladies du cerveau et de faiblesse musculaire, 768 souris vont être utilisées, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un morceau d'oreille leur est prélevé vers 7 à 10 jours de vie pour le génotypage, puis cinq tests de motricité leur sont appliqués entre une et trois semaines d'âge. Un sous-groupe reçoit une injection destinée à déclencher des crises d'épilepsie, avec vingt minutes d'observation ensuite. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et muscles, la comparaison de ces deux organes étant l'objet même du projet.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Sur le plan anatomique, même si la surface du cerveau de la souris adulte présente moins de circonvolutions que celle de l’homme, la quasi-totalité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. Sur le plan génétique, environ 90% des gènes sont conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend les études génétiques particulièrement pertinentes dans ce modèle. Sur le plan comportemental, la souris présente un excellent compromis entre complexité comportementale et proximité phylogénétique, permettant la modélisation de pathologies associées à des comportements complexes tels que la reconnaissance sociale ou la reconnaissance d’objets. Et enfin, contrairement à certains autres modèles expérimentaux, la souris permet également d’étudier les différences liées au sexe, un paramètre particulièrement important dans les troubles du neurodéveloppement, qui présentent une prévalence plus élevée chez les garçons. Les souris seront utilisées à différents stades de développement.
Generation de lignées transgéniques pour étudier la formation de l’organe olfactif chez le poisson zébre
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1 312 poissons zèbres sur 2 920 vont être tués parce qu'ils ne portent pas le bon génotype, les 1 608 autres étant gardés pour la reproduction, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certains individus issus de douze des trente lignées créées subissent une biopsie de moins de deux minutes, seul geste invasif prévu, suivie d'un isolement de moins de trois jours. Les adultes ne servent qu'à produire des embryons, dont le développement externe permet l'imagerie à haute résolution sur le vivant. Le porteur présente ce modèle comme permettant la transgenèse "sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur", dans un projet qui prévoit la mise à mort de 1 312 poissons au tri génotypique.
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 30 nouvelles lignées pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir de nouvelles lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons à mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. De plus ces lignées seront accessibles à toute la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, d'enzymes ou pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques impliqués dans de nombreux processus et pathologies.
Procédures
Certains individus issus de 12 lignées générées, pourront subir une biopsie. Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Les animaux générés par transgénèse seront observés et sélectionnés dès le 1er jour, ainsi toutes malformations du développement seront écartées rapidement. Ils seront suivis journalièrement, afin de détecter le plus précocement possible tous signes de souffrances, et ce sur 2 générations. Les individus issus de certaines lignées mutantes homozygotes, pourront présenter précocement des signes cliniques liés à l'âge. Le prélèvement de tissu invasif peut provoquer un stress lié à la manipulation (quelques secondes) et à l'isolement (
Devenir
Les animaux n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort. Les autres animaux seront conservés à des fin de reproduction.
Remplacement
Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon modèle pour comprendre le développement de l’organe olfactif et la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement embryonnaire et l’imagerie sur le vivant. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendre la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif dont la perturbation peut conduire chez l’Humain à des pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques et complexes. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » à haute résolution grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet également aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse ainsi qu’à la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe, ce qui permet d'avoir accès à ses embryons facilement, et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulent entre le stade 1 cellule (oeuf) et 4 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. En effet, la mise en place du système olfactif s'effectue entre 12 heures post fécondation (hpf) et 36hpf. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives.
Utilisation du microbiote intestinal sur modèle murin femelle comme intervention thérapeutique dans la Maladie de Charcot.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Gavées quotidiennement pendant sept jours, soumises à des tests moteurs, des prélèvements sanguins sous anesthésie et des examens d'imagerie avec traceur radioactif, 240 souris femelles vont être utilisées dans des procédures dont la moitié classées sévères. Elles développent une forme de la maladie de Charcot, avec perte de poids et parfois mort prématurée. Le porteur affirme, en s'appuyant sur la littérature, que ces modèles ne ressentent aucune douleur, alors qu'il classe 120 des 240 souris en souffrance sévère. Toutes sont tuées en fin d'étude pour prélever cerveau, moelle épinière, intestin et muscle.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénerative grave qui touche progressivement les neurones responsables des mouvements. Avec le temps, elle entraîne une perte de la force musculaire et de la mobilité. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de stopper l’évolution de la maladie. Cette maladie ne concerne pas uniquement le cerveau et la moelle épinière : elle s’accompagne aussi de dérèglements du système immunitaire, du métabolisme et de la gestion de l’énergie par l’organisme. De plus en plus d’études montrent que les bactéries présentes naturellement dans l’intestin, appelées microbiote intestinal, jouent un rôle important dans la santé globale. Elles participent notamment à la digestion, au bon fonctionnement du système immunitaire et à la communication entre l’intestin et le cerveau. Des modifications de ce microbiote ont été observées chez les patients atteints de maladie de Charcot, suggérant qu’il pourrait influencer l’évolution de la maladie. Ce projet a pour objectif d’étudier si le transfert de microbiote intestinal provenant de souris jeunes et en bonne santé peut avoir un effet bénéfique dans des modèles de souris atteintes d’une forme de la maladie de Charcot. L’idée est de rééquilibrer le microbiote intestinal afin d’agir indirectement sur les mécanismes impliqués dans la maladie, comme l’inflammation et les troubles du métabolisme. Nous faisons l’hypothèse qu’en restaurant un microbiote plus équilibré, il serait possible de réduire l’inflammation, d’améliorer certaines fonctions de l’organisme et de ralentir la progression de la maladie. Pour cela, les souris seront suivies dans le temps afin d’évaluer leur comportement, leur motricité et différents paramètres biologiques. L’utilisation de plusieurs modèles de souris (3 au total) permettra également de mieux comprendre pourquoi la maladie de Charcot se manifeste différemment d’un individu à l’autre, et d’identifier des mécanismes communs reliant le microbiote intestinal, le métabolisme et la dégénérescence du système nerveux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de suivre dans le temps les effets d’un transfert de microbiote intestinal chez des souris modèles de la maladie de Charcot. Cela permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes impliques dans cette maladie. L’étude s’intéressera à plusieurs aspects de la maladie, notamment l’évolution du microbiote intestinal, le fonctionnement du métabolisme, les réactions inflammatoires, les capacités motrices et le comportement des animaux, ainsi que les altérations observées dans le système nerveux. En combinant ces différentes observations, les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment l’intestin et le cerveau communiquent entre eux dans le contexte de la maladie de Charcot, et comment un rééquilibrage du microbiote intestinal pourrait influencer l’évolution de la maladie. L’utilisation de plusieurs modèles de souris représentant différentes formes de la maladie de Charcot permettra également de prendre en compte la diversité de la maladie. Cette approche aidera à comprendre pourquoi les symptômes et la progression de la maladie de Charcot peuvent varier d’un individu à l’autre, et à identifier des mécanismes communs pouvant être ciblés par de futures stratégies thérapeutiques. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation du microbiote intestinal, en complément des traitements existants. Il contribuera ainsi au développement de pistes de recherche innovantes susceptibles d’améliorer la prise en charge future des patients atteints de maladie de Charcot.
Procédures
Les souris utilisées développent spontanément une maladie neurodégénérative. D'après les connaissances scientifiques actuelles, cette affection n'est pas associée à une douleur chez l'animal. Au cours du projet (environ 12 semaines par groupe), les animaux feront l'objet de différentes interventions : génotypage, administration de traitements, suivi régulier, prélèvements et examens d'imagerie. Administration du traitement : toutes les souris recevront soit un transfert de microbiote intestinal, soit un traitement contrôle, donné par la bouche à l'aide d'une sonde souple adaptée. Cette intervention sera réalisée une fois par jour pendant 7 jours consécutifs et durera environ 1 à 2 minutes par animal. Elle sera effectuée sur des animaux éveillés (240 souris). Suivi et observations : les animaux seront pesés une fois par semaine. Des tests permettant d'évaluer leurs capacités motrices et leur comportement seront réalisés toutes les deux semaines. Chaque session durera environ 30 à 45 minutes par souris, avec des périodes de repos. Ces observations concernent 216 souris suivies dans le temps. Prélèvements sanguins : de petits volumes de sang seront prélevés une fois par mois, avec un maximum de trois prélèvements par animal. Une courte anesthésie gazeuse sera réalisée avant chaque prélèvement, d'une durée d'environ 4 minutes. Le prélèvement lui-même durera 2 à 3 minutes. Ces procédures concernent 216 souris. Examens d'imagerie : chaque souris bénéficiera de deux examens, au début et à la fin de l'étude. Ces examens nécessitent l'administration de substances permettant de visualiser certaines fonctions du cerveau. Une injection sera réalisée sur animal éveillé, et une autre sous anesthésie. Chaque session durera environ 40 minutes, incluant l'anesthésie et le réveil. Ces examens concernent 216 souris. Fin de l'étude : les animaux seront euthanasiés de manière encadrée par une administration de produit anesthésiant à forte dose, puis des prélèvements d'organes seront réalisés.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris utilisés développent spontanément un phénotype neurodégénératif mais il est établi et largement reportée dans la littérature qu’aucune douleur n’est ressentie par les animaux. Une perte de poids et un dysfonctionnement intestinal pouvant entraîner un décès prématuré pourront être observé dans l’un des modèles. Les nuisances liées aux procédures expérimentales sont les suivantes : • Gavage oral : légère gêne ou stress pendant la manipulation et risque d’une légère inflammation de l’œsophage transitoire (quelques minutes) • Imagerie : stress lié à la manipulation et à l’induction de l’anesthésie. De plus, légère douleur ou inconfort au site d’injection du traceur radioactif et possible formation d’un hématome suite à l’injection du traceur radioactif ciblant la neuroinflammation. • Prélèvements sanguins : douleur ou risque d’hématome selon le site (veine sublinguale) et un possible stress temporaire peut être engendré lors des contentions. • Tests comportementaux et moteurs : stress lié à la manipulation et aux contraintes physiques. Les animaux seront habitués aux manipulations pour réduire le stress.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement d’organes (cerveau, moelle épinière, intestin, muscle) nécessaires aux analyses finales.
Remplacement
Les méthodes alternatives réalisées en laboratoire, sans utilisation d’animaux, ne permettent pas d’étudier le fonctionnement de l’organisme dans son ensemble. Or, la maladie de Charcot ne concerne pas uniquement le système nerveux : elle s’accompagne aussi de modifications au niveau de l’intestin, du métabolisme et du système immunitaire. Des travaux scientifiques antérieurs, menés par notre équipe et par d’autres, ont montré que cette maladie est associée à un déséquilibre des bactéries présentes dans l’intestin, ainsi qu’à des perturbations du fonctionnement global de l’organisme et à une inflammation. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre plusieurs organes, avec des échanges permanents entre l’intestin, le cerveau et le reste du corps. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites dans des modèles simplifiés en laboratoire, comme des cultures de cellules. De plus, l’approche utilisée dans ce projet consiste à transférer l’ensemble des bactéries intestinales d’un individu à un autre. Cette méthode entraîne des modifications globales et naturelles de l’équilibre des bactéries intestinales. Un tel processus ne peut pas être reproduit en laboratoire, ni en utilisant uniquement des bactéries isolées. L’utilisation de souris est donc nécessaire pour étudier l’impact de ces modifications à l’échelle de l’organisme entier. Ce modèle permet d’observer simultanément les effets sur le cerveau, l’intestin et les autres fonctions de l’organisme, ce qui est indispensable pour comprendre comment ces différents éléments interagissent et influencent l’évolution de la maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été soigneusement déterminé afin d’en utiliser le moins possible tout en garantissant des résultats fiables. Sur la base d’études scientifiques antérieures portant sur la maladie de Charcot, un effectif de 12 souris par groupe est considéré comme suffisant pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes étudiés. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour analyser les résultats et vérifier leur fiabilité. À cet effectif s’ajoutent 3 souris par groupe, qui seront utilisées uniquement au début de l’étude afin de vérifier que le transfert des bactéries intestinales a bien fonctionné. Ces animaux ne seront pas suivis sur la durée. En raison des différences possibles entre les animaux et du risque de décès prématuré lié à la maladie, le nombre de souris par groupe est porté à 20. Cela permet de conserver un nombre suffisant d’animaux jusqu’à la fin de l’étude, sans avoir à utiliser de nouveaux groupes. Pour chacune des trois lignées de souris étudiées, quatre groupes seront constitués : des souris malades recevant le transfert de bactéries intestinales, des souris malades recevant un traitement contrôle, des souris saines recevant le transfert, et des souris saines recevant le traitement contrôle. Chaque groupe comprendra 20 souris, soit un total de 240 animaux pour l’ensemble du projet. Le nombre total d’animaux est également réduit grâce au suivi des mêmes souris tout au long de l’étude. Plusieurs types de mesures (comportement, analyses biologiques et examens d’imagerie) seront réalisés sur un même animal. Cette approche permet d’obtenir un grand nombre d’informations sans multiplier les groupes d’animaux, et contribue ainsi à limiter leur utilisation.
Raffinement
Tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins 10 jours avant le début de l’étude. Durant cette période, ils seront habitués à la manipulation afin de réduire leur stress : ils seront pris doucement dans les mains, caressés et autorisés à se déplacer librement. Plusieurs mesures seront mises en place pour limiter la souffrance et améliorer leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement dans leur environnement. Une alimentation adaptée sera fournie. Certaines souris pouvant présenter des troubles digestifs recevront une nourriture sous forme gélifiée dès les premiers stades de la maladie afin de prévenir les complications. Pour tous les animaux, cette alimentation sera également proposée dès les premiers signes de maladie afin de limiter la perte de poids. Ils y seront habitués progressivement en la recevant comme une récompense. En cas de difficultés à se déplacer, la nourriture sera placée directement dans la cage pour en faciliter l’accès. Les animaux seront également habitués aux différentes manipulations nécessaires aux procédures, notamment à être pris en main et placés dans les dispositifs utilisés pour l’anesthésie. Leur état de santé sera surveillé régulièrement (trois fois par semaine) à l’aide d’une grille d’évaluation et par la mesure de leur poids. En cas de douleur ou de blessure, un traitement antidouleur sera administré et les soins nécessaires seront réalisés. Les prélèvements sanguins seront effectués sous une courte anesthésie afin de limiter l’inconfort. Des critères précis permettront d’identifier rapidement toute dégradation de l’état de santé. En cas de signes de mal-être, une surveillance renforcée sera mise en place. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas rapidement ou devient sévère, il sera euthanasié de manière encadrée afin d’éviter toute souffrance. Certains critères incluent notamment une perte de poids importante ou des difficultés à se redresser. Lors des examens d’imagerie, les animaux seront anesthésiés. Leur respiration et leur température seront surveillées en continu et une protection des yeux sera assurée.
Choix des espèces
Il existe peu de modèles animaux permettant d’étudier la maladie de Charcot dans des conditions adaptées à ce projet. Trois lignées de souris ont été sélectionnées car elles développent la maladie de manière progressive, ce qui permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Ces modèles présentent également des différences importantes, notamment dans la vitesse d’évolution de la maladie, les mécanismes biologiques impliqués et les symptômes observés, y compris au niveau digestif. Ces différences sont essentielles pour mieux représenter la diversité de la maladie observée chez les patients. Elles permettent d’étudier comment une modification des bactéries intestinales peut influencer l’évolution de la maladie dans différents contextes. Les méthodes alternatives réalisées en laboratoire, sans animaux, ne permettent pas de reproduire les interactions complexes entre l’intestin, le système nerveux, le métabolisme et l’inflammation à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation de ces modèles animaux est donc nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Les souris utilisées seront des femelles adultes. Pour les trois lignées étudiées, le début de l’étude correspond à une phase où les animaux ne présentent pas encore de signes visibles de la maladie. Cela permet d’observer l’apparition et la progression des symptômes au cours du temps. Les mêmes animaux seront suivis tout au long de l’étude afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et d’obtenir des données complètes sur l’évolution de la maladie.
Gestion du phénotype dommageable d’arthrite lors de l’élevage de lignées murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Élevées pour développer spontanément une arthrite inflammatoire, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est génotypée par poinçonnage de l'oreille sur animal vigile, sans anesthésie mentionnée. Le porteur décrit une inflammation articulaire apparaissant vers huit à dix semaines, avec un gonflement des pattes pouvant affecter la mobilité. Sur les 1 200 animaux, 900 sont expédiés vers un autre établissement pour y être utilisés, 300 servent à l'élevage et sont tués avant vingt semaines pour limiter l'aggravation de la maladie avec l'âge.
Objectifs
Ce projet décrit une procédure de l'élevage avec la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une arthrite inflammatoire. Ces souris sont un modèle d’inflammation articulaire qui est causée par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule inhibant l’interleukine 1 qui va limiter l’inflammation. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une inflammation excessive qui va notamment toucher les articulations. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques ou les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal peuvent aggraver cette inflammation. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie observée chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans des projets de recherche afin d'étudier l’arthrite inflammatoire et, à terme, aider à la recherche sur cette maladie chez l’homme qui représente 1 million de patients en France.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à l'équipe de recherche et à leurs partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener leurs études sur l’arthrite inflammatoire. A long terme, ces souris aideront les chercheurs à : mieux comprendre l’arthrite, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles façons de traiter cette maladie, tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints d’arthrite.
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 14 jours. Cette méthode consiste à prélever sur animaux vigiles un petit échantillon de tissu (environ 2 mm de diamètre) sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.
Impact sur les animaux
Les souris qui n’expriment pas le récepteur inhibant la molécule de l’inflammation interleukine 1 peuvent, pour certaines, développer spontanément une inflammation articulaire à partir de l'âge de 5 semaines. Cependant, les observations récentes de l’équipe de recherche démontrent un âge plus tardif pour l’apparition de l’arthrite, vers 8-10 semaines. Il s’agit de symptômes comme une rougeur ou un gonflement des articulations. Lorsque l’atteinte est sévère, elle peut se manifester par un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Selon les observations antérieures, ces souris ne développent que très peu de signes généraux et leur mobilité est peu affectée. Les souris reproductrices pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage (douleur légère de courte durée).
Devenir
Une partie des animaux sera expédiée en début ou avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée dans des projets de l’équipe de recherche dans un autre établissement utilisateur (900 animaux pour l’expérimentation en 5 ans). Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement (300 animaux pour l’élevage en 5 ans). Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 20 semaines, pour limiter l’évolution du phénotype dommageable avec l’âge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie l’arthrite, qui est une maladie complexe multifactorielle faisant intervenir différents facteurs (le système immunitaire, les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal, le patrimoine génétique et l’environnement), différents organes et la présence d’une inflammation à la fois chronique locale (articulation) et systémique. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle mammifère vertébré est nécessaire, car les organes impliqués dans la physiopathologie de l’arthrite (notamment le système immunitaire, l’intestin, les articulations et les tissus lymphoïdes associés) présentent des différences anatomiques, physiologiques et immunologiques importantes chez les espèces non mammifères, limitant leur pertinence translationnelle pour l’étude de cette pathologie humaine. Afin d'étudier l'interaction entre l’environnement, le microbiote intestinal et le génome de l'hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (par exemple, modèles cellulaires).
Réduction
Un nombre total de 1200 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour l’élevage et les animaux nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, le modèle pourra être cryoarchivé dans notre établissement.
Raffinement
Tous les animaux mutés de manière homozygote pour la modification génétique et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 5 semaines seront suivis à partir de 4 semaines et ce jusqu'à leur envoi avant 8 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation (ou leur mise à mort) : une évaluation du bien-être animal sera réalisée en prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'aspect général, le comportement et la mobilité de l’animal. En fonction de l’état de l’animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la vétérinaire et/ou la SBEA (disponibilité de la nourriture directement dans la cage, mise à disposition d’une solution de réhydratation gélifiée, augmentation de la fréquence du suivi, application d'un antiseptique). Les points limites précoces et spécifiques pour les signes cliniques de l’arthrite ont été définis. Si, malgré le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 20 semaines (pour limiter les nuisances liées à la progression de l’arthrite avec l’âge).
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées pour étudier l’arthrite, car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’articulation elle-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entraînant ainsi une inflammation articulaire ressemblant à une arthrite chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris seront utilisées pour les croisements dès l’âge de 7-8 semaines (maturité sexuelle) et ce jusqu’à 20 semaines, pour limiter l’expression du phénotype dommageable qui progresse avec l’âge. Le phénotype dommageable d’arthrite est susceptible d'apparaître à partir de l'âge de 5 semaines, mais dans l’élevage de l’EU du chercheur ne se manifeste pas avant 8-10 semaines. Les animaux envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 5-8 semaines pour limiter et potentiellement éviter l’expression du phénotype dommageable avant l’envoi.
Analyse du métabolisme des cellules souches musculaires en cachexie et du développement fœtal lors d’une pathologie cancéreuse MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour comprendre la fonte musculaire liée au cancer et l'effet d'une tumeur sur le fœtus, 2 088 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales puis des injections quotidiennes pendant cinq jours, la tumeur pouvant s'ulcérer et provoquer une perte de poids et une faiblesse. Une partie des femelles est gravide, afin d'observer l'impact du cancer maternel sur l'embryon. L'effectif de 2 088 animaux se répartit en groupes de six, répétés sur de nombreuses lignées génétiquement modifiées.
Objectifs
La perte de masse musculaire, appelée cachexie, peut avoir différentes origines telles que le cancer, une maladie, une infection chronique, le vieillissement ou également une sous-alimentation. L’ensemble du projet vise à apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la mise en place des muscles squelettiques au cours du développement, de la régénération musculaire et des pathologies. Nous proposons ici de définir les caractéristiques métaboliques des cellules souches musculaires (MuSCs) à différents stades et de comprendre comment le métabolisme peut influencer le programme de développement des muscles dans différents contextes, ici après une cachexie causée par une tumeur ou par la restriction d’apports nutritifs. Dans notre modèle d’induction d’une tumeur nous n’attendons pas de développement de métastases du fait de la localisation de la tumeur dans une localisation différente de son environnement d’origine ainsi que de la relative courte durée de nos expériences. Pour cette étude, il est essentiel de recourir à des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettent de marquer et suivre spécifiquement les lignages embryonnaires, dont le lignage musculaire afin de suivre leur modification et leur fonction. Le deuxième aspect que nous étudions est le développement du muscle pré- et post-natal et sa capacité à régénérer au cours d’un cancer. Nous visons à analyser, au sein de l’axe mère–fœtus, l’impact de certaines molécules tumorales sur le développement de l’embryon et du foetus, afin de mieux comprendre les potentielles répercussions cliniques d’une grossesse menée par une patiente atteinte d’un cancer. Si certaines expériences d’analyse peuvent être établies in vitro, d’autres doivent impérativement être réalisées in vivo car aucun système in vitro ne permet à ce jour de reproduire fidèlement les conditions naturelles et complexes d’un tissu. Nous apporterons une attention toute particulière à assurer le bien-être animal durant le développement des tumeurs. Notre expérience acquise au cours des 5 dernières années n’a pas révélé de métastases dans ce modèle tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à offrir une vision globale de l’hétérogénéité musculaire observée entre différents groupes musculaires, en identifiant les régulateurs intrinsèques et extrinsèques qui confèrent à chaque muscle ses caractéristiques propres. Ces résultats apporteront des connaissances inédites sur les bases moléculaires contrôlant les prédispositions variées des muscles aux pathologies, fournissant ainsi des informations cruciales pour le développement de nouvelles thérapies. Alors que la majorité des recherches se focalisent sur la réponse des fibres musculaires à la cachexie, notre approche novatrice se concentre sur les cellules souches musculaires, acteurs essentiels de la régénération musculaire. En outre, ce projet scientifique aborde un domaine encore largement inexploré : les conséquences d’un cancer chez une femelle gestante sur le développement embryonnaire. Alors que les progrès en oncologie permettent à de plus en plus de femmes d’envisager une grossesse malgré un diagnostic de cancer, les connaissances restent très limitées sur les conséquences biologiques des tumeurs — et en particulier des molécules tumorales et de l’état inflammatoire de l’animal — sur le fœtus en développement. L’étude de l’axe mère–fœtus dans ce contexte permettrait d’identifier d’éventuels impacts précoces sur le développement de l’embryon, susceptibles d’altérer la croissance, la différenciation cellulaire ou le développement de certains organes, en particulier des muscles. Ces travaux pourraient donc conduire à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’environnement tumoral maternel influence le fœtus, ouvrant la voie à des stratégies de surveillance, de prévention ou d’intervention ciblées pendant la grossesse.
Procédures
Des injections sous la peau (quelques secondes), une injection dans l’abdomen(quelques secondes) ou une administration orale (de l’ordre d’une minute) chaque jour, pendant 5 jours, pour des analyses spécifiques.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites peuvent entraîner différents types de nuisances pour les animaux. L’administration des cellules tumorales par injection peut engendrer un stress physiologique léger et une douleur de courte durée au moment de la piqûre. La répétition des manipulations et des injections peut représenter une source de stress cumulatif. Au moment du point d’analyse choisi, le cancer induit une perte de poids pouvant entraîner une faiblesse générale ainsi qu’une réduction de la locomotion. La tumeur peut s’ulcérer, entraînant l’apparition de lésions cutanées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des expériences pour collecter les tissus nécessaires à nos travaux de recherche.
Remplacement
La formation et la régénération des muscles squelettiques impliquent une multitude de réponses et d’interactions cellulaires et leur environnement au sein d’une structure tridimensionnelle complexe. L’environnement ou la niche, est composé de multiples facteurs comme une matrice tridimensionnelle et des types cellulaires interstitiels variés. Les cultures in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité de ces interactions. Néanmoins, l’approche in vitro pour les stratégies d’analyses moléculaires sera mise en place toutes les fois où cela sera possible afin de limiter le recours à l’animal en utilisant des lignées cellulaires ou des cellules primaires amplifiées in vitro.
Réduction
Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique. - de façon à pouvoir utiliser les animaux dans des tests non invasifs en amont de la mise à mort pour le prélèvement d’organes. Un nombre de 6 animaux, pour les groupes contrôles et les groupes expérimentaux, sont utilisés pour réaliser les expériences. Les résultats obtenus entre les groupes expérimentaux et les groupes contrôles sont analysés par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Un suivi régulier des animaux selon leur état général de santé et le développement des tumeurs est prévu. Le poids des souris et la taille des tumeurs sera enregistré. En cas d’ulcération légère de la tumeur, des traitements locaux sont prévu avec administration d’analgésique si nécessaire afin de prévenir toute douleur ou détresse et de maintenir le bien-être des animaux. Si les ulcérations ne s’améliorent pas dans les jours suivants ou que l’état de santé général de l’animal montre une quelconque souffrance, une mise à mort est prévue. Du gel hydrique sera fourni aux animaux, l’hydratation sera assurée par une injection de sérum physiologique en sous-cutané.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est basée sur plusieurs critères : - Les souris sont des petits mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme. - Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche. - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les acteurs de la régénération qui permet d’isoler une population pure de cellules souches musculaires. - Modèles de pathologies humaines : l’accès à des souris « modèles de pathologies humaines » que nous étudions est un avantage considérable pour développer des thérapies. Le stade de développement utilisé est l’adulte de 6 à 12 semaines pour un epartie des expériences. Au-delà de 12 semaines, la composante fibreuse du muscle est plus importante et nos rendements d’extraction de cellules sont moindres. Les autres stades des animaux utilisés concernent : Les embryons
Ciblage par vectorisation d’agents thérapeutiques et diagnostiques dans le domaine de l’oncologie
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Menée par une société qui a mis au point sa propre technologie de vectorisation, l'étude soumet 600 souris à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la peau, puis deux à quatre administrations des molécules à tester et jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort en urgence, les autres à la fin du protocole. L'objectif est d'évaluer l'efficacité et la distribution de molécules conjuguées destinées à cibler les cellules cancéreuses.
Objectifs
Les cancers demeurent la première cause de mortalité en France et nécessitent le développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et plus efficaces. L’identification de récepteurs ou transporteurs surexprimés à la surface des cellules tumorales constitue une approche prometteuse pour améliorer la spécificité des agents thérapeutiques et diagnostiques. Notre société a mis au point une technologie qui associe des vecteurs biologiques à différentes molécules d’intérêt. Cette approche exploite les mécanismes naturels de passage des cellules pour permettre aux molécules de franchir certaines barrières biologiques et d’atteindre les tissus ciblés. Le projet vise à évaluer l’efficacité et la distribution dans l’organisme de ces molécules conjuguées (molécules-C) en oncologie, en ciblant des récepteurs ou transporteurs surexprimés par les cellules cancéreuses. Les résultats attendus permettront d’apprécier le potentiel de cette approche de vectorisation pour le développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d’évaluer l’efficacité de molécules vectorisées pour délivrer de manière ciblée des agents thérapeutiques et diagnostiques vers des tumeurs. Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension de la distribution et des effets biologiques de ces molécules, ainsi que la validation de modèles précliniques pertinents pour l’oncologie. Ces connaissances pourront contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques et potentiellement moins toxiques, et orienter la conception de futures approches ciblées en oncologie.
Procédures
Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La mise en contention (avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 2 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires peuvent être réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances ou effets indésirables sont liés au stress physique et à l’inconfort des animaux : - Lors des manipulations expérimentales : stress lié à la mise en contention, aux différentes administrations (induction tumorale par injection sous-cutanée (100µl), administration des molécules-C par voie intraveineuse ou sous-cutanée (une à trois maximum par individu), administration intrapéritonéale lors de la mise à mort (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris) et aux prélèvements sanguins intermédiaires (maximum 4 prélèvements ≤50 µl par individu, ne dépassant pas 10 % de la volémie sur 14 jours). - Lors de l’implantation et croissance tumorale : inconfort ou gêne locale liée à l’implantation des cellules tumorales et au développement des tumeurs. Les souris athymiques, en raison de leur phénotype immunodéprimé, peuvent présenter une sensibilité aux infections et une altération de l’état général ; ces nuisances potentielles sont toutefois limitées par les conditions d’hébergement (cages individuellement ventilées) et la surveillance régulière appliquées à l’ensemble des souris.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Si, au cours de l’expérimentation, un animal atteint un point limite, il sera euthanasié en urgence après validation par le vétérinaire et le porteur de projet.
Remplacement
Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont une première série de tests in vitro afin de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires (SPR, mesure d’affinité cellulaire). Cependant, ces tests ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble des paramètres physiologiques (mécaniques, immunitaires, métaboliques et d’élimination) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour évaluer ces paramètres complexes, il est nécessaire de recourir à un modèle vivant, ici la souris, premier modèle animal disponible proche de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Aucun modèle informatique ou in vitro n’est actuellement capable d’intégrer toutes les interactions physiologiques requises pour étudier la pharmacocinétique et l’efficacité pharmacologique de nos vecteurs. La souris reste donc, à ce jour, le système le plus pertinent pour étudier de manière complète la pharmacologie des molécules conjuguées chez les mammifères.
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs permet d’utiliser des doses réduites, limitant ainsi les effets secondaires indésirables (Raffinement) et le nombre d’animaux nécessaires (Réduction). Le nombre d’animaux par groupe (15) a été défini pour garantir une puissance statistique suffisante, en tenant compte de l’effet biologique attendu, de la variabilité individuelle. Chaque étude comporte 2 groupes expérimentaux (1 contrôle et 1 traité), permettant de tester chaque molécule avec un minimum d’animaux. La planification annuelle et quinquennale a été optimisée pour que le nombre total sur 5 ans ne dépasse pas 600, tout en assurant des données fiables. Enfin, une sélection ciblée des tissus à prélever permet d’éviter des prélèvements inutiles et d’optimiser l’utilisation des animaux pour plusieurs analyses.
Raffinement
Les animaux sont répartis à raison de 5 individus maximum par cage et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. De plus, une observation quotidienne des animaux porteurs de tumeurs, avec mesure régulière des volumes tumoraux, permettra d’établir quotidiennement un score prenant en considération la perte de poids, la présence de signes de douleur ou de souffrance notable (cardiaque, respiratoire). Toutes les administrations (iv, ip et sc) sont réalisées par un personnel formé, expérimenté pratiquant en routine ce type d’études chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Lorsqu’ils ont lieu, les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : un volume tumoral supérieur à 1000 mm³, une perte de poids supérieure ou égale à 20 % par rapport au poids corporel maximal, ou un score de souffrance supérieur à 10 avec analgésie inefficace après 2 h. A la fin du projet tous les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Des essais in vitro sont réalisés en amont pour vérifier l’interaction des vecteurs avec leurs récepteurs cellulaires. Ces approches ne permettent cependant pas d’évaluer l’ensemble des paramètres physiologiques complexes impliqués in vivo, tels que la distribution dans l’organisme, la pharmacocinétique ou l’efficacité tumorale. À ce jour, aucun modèle alternatif (in vitro ou in silico) ne permet de prédire de manière fiable ces paramètres. Le recours à des modèles murins est donc indispensable pour l’évaluation de vecteurs à visée thérapeutique ou diagnostique dans un contexte tumoral. La souris constitue un modèle mammifère pertinent, intégrant l’ensemble des mécanismes physiologiques nécessaires à l’étude de l’efficacité pharmacologique. Pour cette procédure, des animaux dits « jeunes adultes » seront utilisés, âgés d’environ 6 semaines et pesant en moyenne 24g à 28g, ce qui permet d’optimiser les posologies et la standardisation des expérimentations. Deux souches seront employées selon les besoins expérimentaux : - Une souche déficiente en système immunitaire, permettant l’implantation et la croissance reproductible de tumeurs solides humaines sous-cutanées, facilitant la prise tumorale et le suivi de la croissance tumorale. - Une souche sauvage présentant un système immunitaire fonctionnel, permettant l’évaluation des vecteurs dans un environnement tumoral incluant la réponse immunitaire.
Prélèvement de tissu pour le génotypage d’animaux génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
180 000 souris subissent un poinçon à l'oreille pour le génotypage, geste qui provoque une douleur aiguë immédiate, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Cette biopsie sert à identifier les animaux porteurs de mutations, dans un établissement qui maintient environ 450 lignées de souris génétiquement modifiées. Contrairement à la plupart des projets, ces souris ne sont pas tuées à l'issue de la procédure. Elles restent en vie et le chercheur en charge de chaque lignée décide ensuite de leur sort selon les projets qu'il mène.
Objectifs
Notre institut a pour mission de créer et d’élever des souris génétiquement modifiées. Ces animaux servent de modèles pour l’étude de maladies génétiques humaines, aussi bien pour comprendre le mécanisme de la maladie que pour tenter de trouver des traitements. Les souris qui naissent ne sont pas toutes porteuses de la mutation d’intérêt et/ou pas de la même manière, on dit qu'elles n'ont pas le même génotype. Pour déterminer ce génotype, nous devons faire une analyse de leur ADN en prélevant sur chaque souris un petit peu de tissu au niveau de l’oreille.
Bénéfices attendus
La connaissance du génotype des souris génétiquement modifiées est essentielle pour mener à bien les projets de recherche scientifique. En effet, cela permet de connaître les animaux porteurs de la mutation à étudier. Ainsi, les groupes de souris peuvent être constitués, la maladie étudiée et les traitements potentiels testés. Il est donc possible finalement de réaliser des recherches rigoureuses sur les maladies génétiques et de pouvoir tirer des conclusions éclairées sur les projets menés. Nous possédons environ 450 lignées de souris transgéniques nécessitant des prélèvements pour caractérisation génétique.
Procédures
Chaque souris impliquée dans ce projet sera prise en contention à la main et un poinçon sera réalisé au niveau de son oreille en vue de prélever un peu de tissu (punch de 2 millimètres de diamètre). Ce geste est réalisé en moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de tissu par poinçon à l'oreille engendre une douleur aiguë immédiate et un stress dû à la sortie de la cage, la séparation momentanée des congénères et la contention. Des risques d’infection ou d’inflammation au niveau du punch ne peuvent pas être totalement exclus mais restent extrêmement rarissimes.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à la suite de cette procédure peu invasive. La prélèvement permettra de déterminer le génotype de l'animal. Le chercheur en charge de la lignée déterminera son devenir en fonction des projets qu'il mène.
Remplacement
La création et l'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire, tout comme il n'y a pas d'autre possibiltié que le recours à l’animal vivant pour ce projet de prélèvement de tissu. Le recours à l’animal permet l'étude des maladies génétiques humaines. La création de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées, le maintien de ces lignées et leur utilisation permettent la réalsiation de nombreux projets de recherche.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. Dans le cas de la création de souris génétiquement altérées, nos techniques ont évoluées et gagnée en efficacité ces dernières années. Cela nous permet d'utiliser moins d'animaux. Dans le cas de la production d’animaux destinés à des projets scientifiques, les schémas d’accouplement sont programmés et optimisés pour produire un minimum d’animaux et favoriser la proportion d’animaux du génotype souhaité. La quantité d'animaux à produire est adaptée au cas par cas, en fonction des besoins des chercheurs.
Raffinement
Pour réduire au maximum les nuisances, le prélèvement sera réalisé au plus tôt à partir de 8 jours d’âge, âge à partir duquel le développement et le décollement des oreilles permettent la réalisation d'un poinçon. Ce prélèvement à l'oreille est calibrée (2mm de diamètre) et réalisée avec un instrument prévu et commercialisé à cet effet. Pour limiter les risques d’infection, cet instrument est nettoyé et décontaminé entre chaque utilisation. Le puncher est également remplacé régulièrement afin de garantir qu’il soit toujours bien opérationnel. Le geste sera réalisé par du personnel formé, et rapidement pour minimiser la durée de séparation de l'animal d’avec ses congénères et pour permettre un retour rapide dans sa cage. Des points limites spécifiques au prélèvement effectué ont été établis, et les souris feront l’objet d’une surveillance attentive après la procédure pour détecter et prendre en charge l’animal rapidement si nécessaire. Ainsi, les souris sont surveillées quotidiennement ce qui permet de faire un suivi de la cicatrisation. Des soins avec l’utilisation d’antiseptique seront mis en place en cas de signes d’infection ou de mauvaise évolution de la plaie de biopsie.
Choix des espèces
La majorité des projets menés dans notre institut utilise la souris comme modèle pour trois raisons principales : ses capacités de reproduction, ses caractéristiques génétiques proches de l'homme, et les techniques d'ingénierie génétique bien maitrisées. Il existe à ce jour, plusieurs dizaines de milliers de lignées murines génétiquement altérées dans cette espèce pour étudier la biologie et les maladies humaines. La pertinence du choix du modèle souris est justifiée de plus le cas échéant dans les projets des chercheurs qui utiliseront les souris de ce projet. Les prélèvements de tissu à l'oreille peuvent être réalisées à partir de l'âge de 8 jours, une fois l'oreille formée et décollée. Les poinçons réalisés se feront sur des souris âgées de plus de 8 jours (cela comprend la possiblité de prélever à tous les âges supérieurs à 8 jours).
Étude des troubles sensoriels et recherche de traitements dans un modèle animal de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un traitement pendant un mois, par voie orale ou par injections quotidiennes, avant des tests de vision et d'audition sous anesthésie. Ces souris reproduisent une maladie génétique rare, la maladie de Charcot-Marie-Tooth, dont les troubles moteurs apparaissent vers six mois. Le porteur affirme que le recours à un modèle animal mammifère est "indispensable", aucun autre modèle ne présentant selon lui ces symptômes.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie génétique rare qui provoque une faiblesse des muscles, surtout dans les jambes et les pieds, rendant la marche difficile. Les patients peuvent aussi avoir des pieds déformés et une perte sensorielle. Une des formes les plus communes de cette maladie entraine une perte de la vue ou de l’audition. Cette maladie est causée par une mutation qui impacte le bon fonctionnement des mitochondries. A ce jour, les troubles de la vision et de l’audition n’ont pas encore été étudiés dans le modèle de souris qui reproduit cette maladie. De plus, il n’existe toujours pas de traitement efficace. C’est pourquoi nous proposons une nouvelle approche thérapeutique, en testant des molécules ciblant un récepteur clé dans le fonctionnement de la mitochondrie. Ce projet sera donc composé de deux objectifs : caractériser les troubles sensoriels du modèle souris et tester des molécules thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de caractériser la perte de vision et d'audition d'un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Il permettra également d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés par nos collaborateurs chimistes sur ces déficits neurosensoriels. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour une pathologie n’ayant aucun traitement disponible à ce jour.
Procédures
Les animaux seront identifiés par marquage à l'oreille. LES MOLECULES THERAPEUTIQUES A TESTER SERONT EN PREMIERE INTENTION, DONNEES PAR VOIE ORALE, SOUS FORME DE PETITES GOUTTES DEPOSEES DELICATEMENT DANS LA BOUCHE, PENDANT 1 MOIS 6 JOURS/7, AVANT LES TESTS. SI LE GESTE N'EST PAS EFFICACE elles seront injectées quotidiennement dans le ventre en alternant la gauche et la droite, pendant 15 jours avant les tests fonctionnels. Deux tests d'évaluation de la vision seront réalisés sur animal vigile (durée 30 minutes) et sur animal anesthésié avec application d’un collyre dans l’œil pour dilater la pupille (durée 40 minutes). Le test auditif sera réalisé sous anesthésie (40 minutes).
Impact sur les animaux
La contention pour l’identification et les injections peut engendrer un léger stress et une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des injections. Les troubles locomoteurs caractérisés qui se développent à partir de 6 mois vont entrainer une gêne pour l’animal. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi sera mise en place afin de garantir le bien-être animal. Tous nos tests d'exploration fonctionnelle sont peu douloureux et sans conséquence physiologique à part un léger stress
Devenir
A l'issue des 2 procédures, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal de la pathologie est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptômes locomoteurs rapidement. Cela permet l'élaboration plus rapide d'un traitement curatif. Les troubles sensoriels quant à eux doivent être caractériser avant de pouvoir tester un potentiel traitement. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal mammifère pour étudier les fonctions auditives pertinentes chez l’humain.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous nous sommes basés sur notre expérience sur un modèle avec des troubles sensoriels similaires associé à une analyse de puissance pour calculer le nombre d’animaux.
Raffinement
Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec des maisonnettes et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Pour éviter que ces souris ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur. Pour limiter l’agitation des souris présentant des troubles locomoteurs, l’enrichissement sera renforcé dans les cages (petites briques de bois, des frisures de papier kraft et des tubes en carton par exemple). Si nécessaire, la nourriture pourra être remplacée par du gel alimentaire. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. Tout au long du projet, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux afin de minimiser au maximum la douleur, la détresse ou toute souffrance inutile. Les protocoles incluront l'utilisation systématique d'anesthésiques et d’analgésiques adaptés. Les points limites définis à l’avance feront l’objet d’une surveillance rigoureuse et quotidienne des animaux. Ces critères permettront de mettre un terme à l’expérimentation de manière anticipée si l’animal présente des signes de souffrance non contrôlable ou de détérioration de son état général (perte de poids significative, troubles moteurs graves, automutilation, perte d’autonomie, etc.). Le projet intègre également des techniques non invasives ou faiblement invasives ( examens auditifs/visuels) pour limiter l’impact des procédures sur les animaux.LA METHODE DE TRAITEMENT SERA RAFFINEE EN UTILISANT LA VOIE ORALE. L’euthanasie, lorsqu’elle est requise, sera réalisée selon les méthodes recommandées par les autorités compétentes (Directive 2010/63/UE), de manière rapide et sans douleur.
Choix des espèces
La pathologie étudiée est une pathologie multi-organes où les altérations locomotrices s'accompagnent de signes neurosensoriels. Un modèle de souris, permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests neurosensoriels seront réalisés sur les souris à 3 âges différents DANS LES DIFFERENTS GROUPES afin de pouvoir déterminer à quel moment les troubles apparaissent. Une fois que le stade d’apparition des symptômes sera identifié, les tests neurosensoriels seront reproduits après administration des molécules thérapeutiques.
Photosensibilité et dérégulation immunitaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées porte une modification génétique qui leur fait développer un lupus, les autres reçoivent une huile minérale qui déclenche la même maladie huit semaines plus tard. 2140 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont tondues puis exposées à des UVB sous anesthésie, ce qui provoque des rougeurs, une inflammation et, à force de répétition, des lésions de la peau. Le projet cherche à relier la sensibilité au soleil des patients lupiques à une molécule produite par certaines cellules immunitaires.
Objectifs
Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune (où le système immunitaire attaque le corps lui-même) qui touche principalement les femmes jeunes. Les traitements actuels ont de lourds effets secondaires et ne sont pas forcément efficaces pour tous les patients. Chez 30 à 50% des patients lupiques, les reins peuvent être touchés, ce qui peut mener à la nécessité d’une dialyse ou d’une greffe de rein. La moitié des patients sont aussi très sensibles au soleil (photosensibilité): les rayons UVB peuvent aggraver la maladie notamment au niveau des reins. Le lupus est une maladie complexe et implique des cellules qui font partie des défenses naturelles du corps. Par exemple, les basophiles, généralement connus pour leur rôle dans les allergies, participent à l’aggravation du lupus. Une substance appelée prostaglandine D2 (PGD2) joue un rôle important en activant ces cellules lors des poussées de la maladie. Un autre type de cellule, les mastocytes de la peau, sont aussi connus pour être impliqués dans les réactions allergiques et pour produire beaucoup de PGD2 après une exposition au soleil, mais leur rôle dans le lupus n’est pas connu. Le but de notre projet est de comprendre si la sensibilité au soleil chez les patients lupiques est liée à la PGD2 produite par les mastocytes de la peau lorsqu’ils sont exposés aux UVB. Cette PGD2 des mastocytes pourrait ensuite activer les basophiles et déclencher une poussée de la maladie. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris lupiques avec ou sans mastocytes, ou dont les mastocytes ne peuvent pas produire de PGD2, puis nous les exposerons aux UVB. L’objectif final est de mieux comprendre la photosensibilité dans le lupus, afin de mieux diagnostiquer la maladie et de développer de nouvelles façons de la traiter.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre exposition au soleil et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des marqueurs quantifiables associés à cette photosensibilité dans le lupus permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir ou limiter les atteintes rénales graves du lupus..
Procédures
Un génotype (gène absent dans une des lignées de souris) dit dommageable est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie autoimmune (lupus) légère (pas de maladie grave) mais cependant quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Différentes lignées de souris modifiées génétiquement seront utilisées. Toutes les souris seront euthanasiées et analysées avant de développer une forme grave de la maladie. Des animaux seront injectés en intrapéritonéal avec une huile minérale pro-inflammatoire, ce qui entraînera 8 semaines plus tard une pathologie lupique également légère (pas de maladie grave) mais quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 4 types d’interventions : des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) (souris vigiles), des injections dans la peau (« intradermiques ») et/ou dans le ventre (« intrapéritonéales ») (moins de 30 secondes par injection) (souris vigiles), des prélèvements d’un petit volume de sang (moins de 30 secondes) sous anesthésie générale (2 à 3 minutes), et des expositions à des doses contrôlées d’UVB avec un appareil de photothérapie (moins d’une minute), également sous anesthésie générale. Des animaux pourront recevoir jusqu’à 8 piqûres intradermiques et 8 piqûres intrapéritonéales. Pour certains animaux, l’exposition aux UVB sera répétée jusqu’à 3 fois tous les 3 jours pendant une semaine. Certains animaux seront prélevés deux fois d’un petit volume de sang avec une semaine entre les deux prélèvements.
Impact sur les animaux
Une des lignées de souris utilisées développe une pathologie autoimmune (lupus) légère (pas de maladie grave) mais cependant quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). D’autres animaux seront injectés en intrapéritonéal avec une huile minérale pro-inflammatoire, ce qui entraînera 8 semaines plus tard une pathologie lupique également légère (pas de maladie grave) mais quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Dans certains cas peu fréquents, l’huile minérale pro-inflammatoire peut induire une détresse respiratoire. Des animaux seront tondus sur le dos 48 heures avant la première exposition aux UVB avec une tondeuse adaptée, ce qui pourra entraîner un stress sur 2-3 minutes. L’exposition aux UVB n’entraînera pas de brûlure mais une rougeur et une inflammation légère de la peau des souris tondues. La répétition des expositions peut induire des lésions cutanées non sévères. Les injections intrapéritonéales induiront un stress et une douleur brève de piqûre. Les contentions des animaux induiront un stress bref.
Devenir
Les expérimentations du projet sur les lots de souris dureront au minimum 72 heures et au maximum 16 semaines. Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des expérimentations et en cas d’atteinte de points limites, et leurs organes prélevés et analysés.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études en milieu artificiel ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence UVB/autoimmunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
Expérimentalement, le modèle d‘exposition aux UVB dans le contexte lupique a déjà été réalisé précédemment au sein de notre laboratoire et permet donc de réduire ici au strict minimum le nombre de souris nécessaires. Les nombres de souris par groupe ont été calculés pour tenir compte de la variabilité entre les souris dans la réponse aux UVB et au développement des paramètres lupiques. Cela nous donnera une puissance statistique suffisante pour pouvoir conclure scientifiquement sur les paramètres analysés. Des prélèvements post-mortem seront conservés pour répondre à d’éventuelles questions ultérieures afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet. Enfin, dans le but de démontrer la reproductibilité de nos résultats, chaque procédure ne sera répétée qu’une fois uniquement si lors de la première série d’expérience une tendance nette mais avec des statistiques ne permettant pas de conclure scientifiquement sont obtenues. Cette éventuelle répétition nous permettra de confirmer ou d’invalider scientifiquement les premiers résultats.
Raffinement
Avant et pendant les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, jamais isolés, toujours avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher) et sont observés quotidiennement. Les procédures sont réalisées dans le but de limiter au maximum les nuisances induites aux animaux. La surveillance des animaux injectés avec une huile pro-inflammatoire sera renforcée entre la deuxième et la troisième semaine après injection, ce qui correspond au moment où les souris sont fragilisées et sensibles au stress. Une grille de score a été établie afin de suivre l’état général de ces animaux et d’identifier ceux nécessitant une intervention rapide d’interruption des procédures. Les animaux n’ayant pas un score nul (mais inférieur au point limite) se verront apportés une attention particulière. Passée la période où les animaux injectés avec une huile pro-inflammatoire sont plus fragiles (fin semaine 1 à fin semaine 2), ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Si le point limite était malgré tout atteint, les souris seraient euthanasiées sans attendre la fin de la procédure. L’évaluation des points limites au cours d’une des procédures sera réalisée à l’aide d’une grille d’évaluation déjà validée et prenant en compte : l’évolution du poids de la souris, son comportement, son apparence et ses difficultés éventuelles à respirer. L’expérience acquise avec les expositions aux UVB nous a montré que dans les conditions utilisées dans le présent projet, aucune brûlure ou lésion cutanée n’est induite. Cependant, une grille de score de dermatite a été établie pour pouvoir vérifier cela pour tous les animaux avant chaque exposition aux UVB. En plus de la surveillance quotidienne des animaux, les évaluations « cliniques » seront réalisées une à trois fois par semaine.
Choix des espèces
Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes pathologiques d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce utilisée (souris domestique) est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.
Etude de biodistribution de molécules marquées par des approches non invasives d’imagerie optique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 180
450 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, tous tués pour prélèvements de tissus. Chaque animal subit plusieurs anesthésies gazeuses, l'administration d'une molécule, jusqu'à trois séances d'imagerie par jour et deux prélèvements sanguins. Le porteur indique tester des molécules de ses clients dont il ne connaît pas la nature, ce qui l'empêche d'anticiper leur tolérance. Une nouvelle voie a été ajoutée, l'injection dans le liquide entourant la moelle épinière, avec un point limite déclenchant la mise à mort en cas de paralysie des membres.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont multiples. En effet, il s'agit d'évaluer le comportement de molécules ou biomolécules (anticorps, fragments d'anticorps...) après administration chez l'animal vivant, par des approches d'imagerie non invasive. Cela permettra d'analyser la distribution au sein de l'organisme (tissulaire, organes d'élimination,...), l'évolution dans le temps, la durée avant disparition du signal (élimination). L’AJOUT DE LA VOIE D’ADMINISTRATION DANS LE LIQUIDE ENTOURANT LA MOELLE EPINIERE PERMET D’EVALUER LA BIODISTRIBUTION DE MOLECULES FLUORESCENTES AU NIVEAU DU SYSTEME NERVEUX CENTRAL (MOELLE EPINIERE, ENCEPHALE, CERVELET) ET D’ETUDIER LEUR DIFFUSION AU SEIN DE CE COMPARTIMENT. L’INTEGRATION DE CETTE VOIE D’ADMINISTRATION PERMET AINSI D’ADAPTER LES MODALITES D’ADMINISTRATION AUX PROPRIETES DES MOLECULES ETUDIEES, SANS MODIFIER LES OBJECTIFS SCIENTIFIQUES NI LE CADRE EXPERIMENTAL DU PROJET.
Bénéfices attendus
En évaluant la biodistribution de nouvelles molécules potentiellement thérapeutiques, ce projet permettra d'apporter des informations précieuses et cruciales sur leur devenir suite à leur administratrion chez l'animal vivant, et aidera à la sélection des meilleurs candidats médicaments avant essais chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des anesthésies gazeuses : lors de la dépilation (1 fois), lors de l'administration de la molécule à tester (1 fois), puis une par session d'imagerie (maximum 3 par jour). Chaque anesthésie LORS DES ACQUISITIONS n'excèdera pas 10 minutes. SEULE L'ANESTHESIE LORS DE L'ADMINISTRATION INTRATHECALE SERA COMPRISE ENTRE 5 ET 15 MINUTES. Des prélèvements sanguins inférieurs à 1 minute (1 au cours de l'étude et 1 terminal) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
La manipulation, les administrations, les anesthésies et prélèvements peuvent provoquer du stress chez les animaux. Des effets indésirables liés à l'administration des molécules thérapeutiques (mauvaise tolérance...) peuvent être observés mais sont difficiles à anticiper car nous ne connaissons pas la nature des molécules de nos clients.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés. Des prélèvements de sang total pourront également être réalisés.
Remplacement
La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la distribution des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est réduit à son minimum pour chaque groupe. L'approche en imagerie non invasive permet de réduire et de raffiner le modèle d'étude : la stratégie d'expérimentation permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle (étude longitudinale). Des analyses post mortem (imagerie ex vivo et analyse des tissus) seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possible relatives aux molécules administrées.
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal,...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Les procédures d'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, dans une enceinte avec lit chauffé. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : -Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au niveau du site d’injection de la molécule; - FAIBLESSE OU PARALYSIE DES MEMBRES, SE TRADUISANT PAR DES DEFAUTS DE LOCOMOTION . Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris/rat) sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. En effet, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entre ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus ils présentent certains intérêtes pratiques décisifs: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de préciser que les molécules actuellement utilisées en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont aussi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Différences de sensibilité rénale entre les différentes souches de souris de laboratoire
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
L'ischémie rénale provoquée tue jusqu'à 30 % des animaux dans les trois jours suivant l'opération. 810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une interruption de la circulation dans les deux reins, une irradiation corporelle totale, une greffe de moelle et des gavages répétés. L'étude compare la sensibilité rénale de deux sous-souches de souris de laboratoire, en n'utilisant que des mâles, les femelles étant écartées car naturellement protégées.
Objectifs
La souche B6 de souris noires a été développée dans les années 1950 au Jackson Laboratory, puis transférée au National Institutes of Health (NIH). Au fil du temps, une dérive génétique a conduit à la formation de deux sous-souches distinctes, les souris B6J et B6N. Une analyse génomique effectuée en 2013 a identifié plus de 34 mutations génétiques entre ces deux sous-souches. Certaines mutations spécifiques, notamment dans le gène Nlrp12, présentes uniquement chez les B6J, ont été associées à des différences phénotypiques significatives entre les deux sous-souches. Dans ce contexte, nos travaux récents ont mis en évidence une variation de sensibilité entre les B6J et les B6N au développement d’une dysfonction rénale aiguë suite à une atteinte rénale ischémique. Ainsi, les B6J développent des lésions rénales aiguës sévères avec un taux de mortalité accru après une ischémie-reperfusion rénale bilatérale, alors que les B6N semblent protégées. Ces observations suggèrent que des différences phénotypiques majeures existent dans la réponse au stress ischémique rénal entre les sous-souches de souris noires. D'après la littérature, une hypothèse génétique majeure peut être avancée pour expliquer les différences observées entre les souris B6J et B6N. Il a été démontré qu'une mutation du gène Nlrp12 chez les souris B6J altère le recrutement des neutrophiles dans les tissus inflammatoires. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail sera d’identifier si un défaut de recrutement des neutrophiles en lien avec la mutation de Nlrp12 peut être responsable de l'hypersensibilité rénale post-ischémique des souris B6J comparativement aux B6N.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des différences phénotypiques de lésions rénales entre les deux sous lignées les plus utilisées dans la littérature de souris noires. Ces deux sous lignées ont accumulé des variations génétiques influençant leur sensibilité aux atteintes rénales. Ces différences peuvent modifier de manière significative les résultats obtenus par la communauté scientifique dans les modèles d’atteinte rénale aiguë et chronique. Leur caractérisation contribuera à améliorer la reproductibilité expérimentale, à éviter les biais d’interprétation des modèles transgéniques et à renforcer la fiabilité ainsi que la pertinence translationnelle de la recherche préclinique en néphrologie.
Procédures
Chaque animal subira les interventions suivantes : A. Procédures chirurgicales ou prélèvement invasif sur animal anesthésié au nombre de quatre : 1. Modèle d'insuffisance rénale par ischémie rénale bilatérale (1 fois, durée : 30 min) 2. Mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) (3 fois max, durée : 2h) 3. Prélèvement de sang par la veine cave (1 fois, durée : 2 min). B. Procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Échographie rénale sur animal anesthésié (3 fois max, durée : 20 minutes) 2. Irradiation corporelle totale sur animal vigile (1 fois, durée : 15 min) 3. Greffe de cellules mononuclées de la moelle osseuse en rétro-orbitaire sur animal anesthésié (1 fois, 5 min) 4. Prélevement de sang à la queue sur animal vigile (1 fois, durée 5 min) 5. Gavage avec l'inhibiteur de MPO ou au solvant sur animal vigile (18 fois max à raison deux fois par jour; durée : 20 secondes) 6. Injection intrapéritonéale d'un anticorps neutralisant des neutrophiles ou d'un isotype contrôle (1 injection; durée : 20 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés à la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux liés à la récupération post-irradiation ou post-chirurgie (modèle d’insuffisance rénale post-ischémique) ; pouvant conduire à une perte de poids dans les 24 premières heures (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite). De notre expérience, l'irradiation corporelle totale des souris est très bien tolérée une fois que la greffe des cellules médullaires d'une souris donneuse a été effectuée. L'ischémie rénale bilatérale peut conduire dans les trois premiers jours suivant l’opération à une atteinte rénale aiguë avec une mortalité accrue pour les animaux les plus atteints (30%). Dans notre expérience, passées les premières 72h, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une ischémie rénale bilatérale, suggérant que la période critique douloureuse est limitée à ce temps court après la chirurgie.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l'hétérogénéité du recrutement des neutrophiles entre les deux sous souches de souris noires, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Néanmoins, pour répondre à notre question biologique, le remplacement total des animaux par de la culture cellulaire n'est pas réaliste car les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre le système immunitaire et le rein in vivo. L'utilisation de modèles animaux pour étudier les variations de sensibilité rénale en lien avec le recrutement des neutrophiles reste nécessaire pour atteindre les objectifs de notre projet de recherche. Dans ce contexte, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies rénales humaines.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échographie rénale, mesure du débit de filtration glomérulaire) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses fonctionnelles, histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité interindividuelle et de la mortalité post-opératoire dans notre modèle chirurgical (ischémie rénale bilatérale).
Raffinement
Pour raffiner, les animaux importés de deux éleveurs différents pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. La souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les échographies et les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées, placée sur plaque chauffante à 37°C pour éviter toute hypothermie et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Dans la semaine suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera renforcée avec un examen bi-quotidien par du personnel compétent afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
Dans cette étude, notre objectif est de comparer la sensibilité au stress rénal ischémique dans les deux sous souches de souris noires les plus couramment utilisées au laboratoire. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et nous maitrisons les outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles rénales in vivo ainsi que ex vivo dans ce modèle de stress rénal aigü chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes de 7 à 10 semaines pour notre étude. A ce stade, le rein est parfaitement formé et nous possédons déjà tous les paramètres fonctionnels et structurels de ces deux organes pour l'ensemble des génotypes à tester. Nous n'utiliserons que les mâles dans cette étude car les femelles sont naturellement protégées de lésion rénale post-ischémique ne nous permettrant pas d'étudier les différences de sensibilité entre les deux sous-souches de souris noires.
Prélèvements de tissus et fluides biologiques pour constituer une biobanque, développer l’analyse de biomarqueurs, ou fournir la recherche biomédicale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 300
Lapins : 20
Chiens : 150
Ouistitis et tamarins : 50
Macaques à longue queue : 90
Pour constituer une biobanque et fournir des tissus à la recherche, 910 animaux, souris, rats, lapins, chiens, ouistitis et macaques, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les prélèvements vont de prises de sang sur animal vigile à des ponctions de liquide céphalorachidien ou synovial sous anesthésie, ces dernières pouvant provoquer douleur, gonflement ou infection articulaire. Le recours au primate non humain est présenté comme obligatoire pour les études précliniques de sécurité. Une partie des animaux est réutilisée dans d'autres projets ou adoptée, le reste étant tué pour alimenter la biobanque en organes.
Objectifs
Afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs, le développement et la validation de méthodes d’analyses des échantillons biologiques sont nécessaires pour la bonne réalisation des études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de médicaments régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires). A terme, dans le cadre de ces exigences 3Rs, des appareils et des méthodes d’analyses plus performantes permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour un objectif scientifique donné et de raffiner les procédures expérimentales (par exemple, en réduisant les volumes sanguins prélevés, ou en déterminant des points limites plus précoces). De plus, en recherche fondamentale ou avancée, les produits biologiques (organes, tissus ou fluides) issus d’animaux sont essentielles pour des études in vitro, la recherche translationnelle et in fine le développement de méthodes alternatives à l’expérimentation animale. Ces études permettent de limiter l’utilisation directe d’animaux en expérimentation à des procédures peu invasives ou de réduire le nombre d’animaux utilisés pour obtenir la même quantité de données scientifiques. Ce projet a donc pour objectif le prélèvement de fluides (sang, liquide céphalorachidien, liquide synoviale, sperme) et d’organes afin de constituer une biobanque, de développer ou optimiser les méthodes d’analyses des biomarqueurs d’intérêt et fournir à la communauté scientifique des produits biologiques
Bénéfices attendus
Ce projet assure le développement et la validation de méthodes d’analyses ou d’identifications de marqueurs physiologiques dans les études pré-cliniques et indispensables à l’élaboration de tout nouveau médicaments, ainsi que la constitution d’une biobanque et l’approvisionnement en tissus biologiques des laboratoires de recherche. Il permet la mise en application dans le cadre d’études réglementaires régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires) d’appareils ou de méthodes d’analyses biochimiques, hématologiques, histologiques ou encore immunologiques plus fiables et plus précises. Il permet d’assurer un suivi plus spécifique des effets d’un produits en cours d’essai chez l’animal, ce qui apporte au moins deux bénéfices majeurs : 1) détecter plus rapidement les effets délétères pour la santé des animaux modèles (et donc anticiper des lésions sévères avant que l’impact sur le bien être devienne significatif) et 2) augmenter notre capacité à détecter de potentiels effets toxiques en amont des phases de test cliniques chez l’humain. De plus, il permet de développer des méthodes réduisant les volumes prélevés nécessaires lors des analyses de biomarqueurs, ainsi que les fréquences de prélèvement chez l’animal. Enfin, en particulier dans le cadre des prélèvements d’organes, en plus de constituer une biobanque indispensable à la recherche fondamentale, appliquée ou translationnelle, il permet d’assurer une formation sous tutorat de collaborateurs ayant acquis les bases théoriques des gestes techniques mais nécessitant de pratiquer ces gestes et ce sans utiliser d’animaux à dans ce seul but. Ainsi, ce projet permet l’optimisation continue de la qualité des données expérimentales des études précliniques et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de réduction et de raffinement (réduction de la fréquences et des volumes d’échantillons biologiques nécessaires).
Procédures
Les prélèvements sanguins seront la plupart du type effectués vigiles, dans un système de contention appropriés, en quelques minutes. Le prélèvement de liquide céphalorachidien ou de liquide synoviale est effectué sous anesthésie, de 10 à 20 minutes environ. Le prélèvement d'organes est effectués post mortem.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins (majoritaires au cours de ce projet) ne constituent pas de risque significatif pour la santé des animaux, d’autant plus car ils sont effectués dans le cadre des lignes directrices internationalement reconnues. Le prélèvement de liquide céphalo rachidien, lorsqu’il est effectué par un personnel qualifié sur un animal en bonne santé ne présente que peu de risques de complications sévères. Les complications les plus susceptibles d’avoir lieu sont celles lié à l’anesthésie (prévenu en utilisant un protocole d’anesthésie mis en place par un vétérinaire), et le risque d’une hernie en cas d’hypertension intracrânienne (risque négligeable lorsque le geste est pratiqué sur des animaux en bonne santé).. Le prélèvement de liquide synoviale peut entrainer un gonflement, une douleur au niveau de l’articulation, ou encore une infection (arthrite). Tous les effets secondaires seront pris en charge par un vétérinaire, disponible 24h/24
Devenir
Les animaux seront soit utilisés dans d'autres projets autorisés par le MERS, soit adoptés lorsque cela est possible (sur avis vétérinaire), soit euthanasiés pour fournir la recherche biomédicales en échantillons biologiques et entretenir une biobanque pour chaque espèce ou lorsque les 2 premières solutions ne peuvent être effectés après avis vétérinaire.
Remplacement
Lorsque cela est possible, le développement et la validation d’appareils ou de méthodes analytiques sont faits en utilisant des substitues au sang. Ces substitues peuvent être des solutions de contrôles chimiques reconstitués (surtout dans le cadre de dosages biochimiques), ou encore des contrôles humains délivrés par le fournisseurs des appareils. Ces échantillons reconstitués permettent de remplacement les échantillons de sang frais prélevés chez l’animal.
Réduction
Dans le cadre des études pré-cliniques, des prélèvements sanguins sont nécessaires avant que ne commencent l’étude, c’est-à-dire avant l’administration du produit testé. Lorsque les volumes de sang prélevés le permettent, le sang (et ses dérivés : plasma, sérum) non utilisé dans le cadre de l’étude est récupéré pour ce projet, réduisant ainsi le nombre d’animaux naïfs nécessaire. De plus, l’utilisation d’échantillons chimiques reconstitués lieu et place de sang frais permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Lors de la procédure terminale pour prélever les organes, les animaux utilisés seront le plus souvent des animaux ré-utiliser d’autres procédures (après validation par un vétérinaire), afin de ne pas sacrifier un animal uniquement pour récupérer ces organes. La procédure peut permettre de former les personnels à des actes techniques simples (ex : prise de sang) lorsque l’animal est anesthésie.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficient d’une période d’adaptation afin de s’habituer à leur nouvel environnement et de limiter le stress. Ils sont ensuite entraînés de manière progressive, à l’aide de méthodes positives, pour faciliter les soins et réduire les contraintes lors des manipulations nécessaires. Les animaux vivent en groupe dans des conditions adaptées à leurs besoins, avec des activités et des aménagements quotidiens destinés à favoriser leur bien‑être. L’isolement n’est utilisé qu’en cas de nécessité (par exemple pour des soins), sous contrôle vétérinaire. Les changements de groupes sont réalisés progressivement afin de réduire le stress et le risque de blessures. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement, avec un suivi vétérinaire régulier et un accès à une assistance vétérinaire 24h/24. Chaque animal fait l’objet d’un examen vétérinaire avant d’être inclus dans le projet. Toutes les interventions sont tracées afin d’assurer un suivi rigoureux. Des équipements adaptés sont utilisés pour limiter les manipulations directes et le stress, notamment chez les primates. Les quantités de substances administrées ou prélevées respectent strictement les recommandations internationales en vigueur, dans le but de garantir la sécurité et le bien‑être des animaux.
Choix des espèces
Les études précliniques de sécurité et d’efficacité sont obligatoires avant tout essai chez l’être humain et répondent à des règles réglementaires strictes. Elles nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces animales différentes afin d’assurer la fiabilité des résultats. Pour certaines études portant sur le système immunitaire, le recours au primate non humain est nécessaire en raison de sa proximité biologique avec l’homme. Ce projet a pour objectif de développer et d’améliorer les outils et méthodes d’analyse utilisés dans ces études précliniques. Les espèces animales choisies correspondent à celles reconnues comme les plus pertinentes pour évaluer la sécurité des candidats médicaments. Les animaux inclus dans ce projet sont les mêmes que ceux utilisés ensuite dans les études, et sont sélectionnés à partir d’un âge garantissant leur maturité et leur bon état de santé.