Multisystémique

528 souris subissent l'implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie générale, 456 reçoivent trois séances d'irradiation de 4 Gy sur trois jours consécutifs, et 120 une injection intracardiaque pour provoquer des métastases cérébrales. 648 souris en tout sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur attend chez les souris porteuses de glioblastome une perte de poids, de motricité et de sensibilité, qu'il annonce limitée à 24 heures par le respect des points limites. L'injection intracardiaque, elle, apparaît dans la liste des procédures sans durée ni mention d'anesthésie, et les séances d'IRM sans nombre ni durée.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de vésicules extracellulaires (EV) sur les tumeurs cérébrales hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels et notamment à la radiothérapie. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, l’efficacité des thérapies actuelles. L’objectif dans la première procédure est de déterminer, dans un modèle de glioblastome murin, le mode d’administration le plus pertinent et la dose d’EV les plus efficaces. Puis dans les procédures suivantes, d’analyser l’efficacité des EV dans 3 autres modèles animaux de glioblastome murin ou humain ou métastatique, présentant des spécificités différentes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme est une amélioration des stratégies thérapeutiques conventionnelles du glioblastome en utilisant des EV qui ont montré, par des études précédentes dans d’autres pathologies, leur capacité à améliorer les thérapies actuelles. A long terme, le bénéfice attendu est l’administration de ces EV lors des stratégies thérapeutiques conventionnelles chez l’Homme.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : -Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 528 animaux sont concernés. -Injection intracardiaque pour les 120 animaux des procédures concernées par les métastases cérébrales. -Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 456 animaux sont concernés. -Injection d’analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la chirurgie et 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale

Impact sur les animaux

Les séances fractionnées de radiothérapie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Le degré de sévérité de ces interventions est donc léger. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeurs cérébrales et la procédure d’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Ces nuisances sont atténuées par l’utilisation d’un agent anesthésique et l’administration d’analgésiques et leur durée est de quelques minutes. Ces interventions sont donc de sévérités modérées. Nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h . A ce titre la procédure dans son ensemble de suivi d'efficacité thérapeutique a été classée modérée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer des organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et aux réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures EV (taille, aspect de toxicité,) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. De plus, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence qu’il faudrait un maximum de 12 animaux par groupe afin d’obtenir une différence significative . Ce nombre d’animaux pourra être revu à la baisse durant l’étude après une analyse statistique séquentielle.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissements des cages. Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 2 à 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids due aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Afin d’étudier l’effet des traitements sur les cellules tumorales au sein même de leur microenvironnement, il est nécessaire d’utiliser des modèles murins, les modèles in vitro ne répliquant pas toutes les composantes étudiées (hypoxie, inflammatoire et vasculaire). Les modèles animaux de tumeurs sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la croissance tumorale tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes car ces souris présentent la composante inflammatoire. Les modèles de tumeur cérébrale murin utilisés repose sur l’implantation de cellules de gliome issues de ces souris immunocompétentes. De plus, l’efficacité du traitement sera évaluée sur des modèles de tumeurs cérébrales humaines et métastases qui seront alors implantés chez des souris immunodéficientes permettant ainsi le développement de la tumeur d’origine humaine. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire.

3 800 rongeurs, 3 200 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à huit prises de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à quatre-vingt-seize heures d'hébergement individuel en cage de collecte des urines et des fèces. Les molécules sont administrées par voie orale sans anesthésie, ou par injection sous anesthésie gazeuse. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour prélever leurs organes. Le porteur présente ce travail comme une activité de plateforme, dont les résultats servent à décider de la poursuite ou de l'arrêt du développement d'une molécule.

Objectifs

Le développement d’un nouveau médicament est un processus long, qui nécessite de nombreuses étapes avant de pouvoir envisager son administration chez l’être humain. Il est notamment indispensable d’étudier son comportement dans un organisme vivant. Des équipements spécialisés permettent ainsi d’analyser comment une molécule est absorbée, distribuée dans les différents organes, transformée puis éliminée par l’organisme. Ces études permettent de déterminer si elle atteint bien les tissus ciblés, en quelle quantité, pendant combien de temps et par quelles voies elle est évacuée. Ces informations sont essentielles pour évaluer le potentiel d’une molécule innovante et accompagner son développement dans le cadre de projets de recherche scientifique et préclinique.

Bénéfices attendus

Les études menées par notre plateforme permettent de fournir des informations indispensables sur la répartition et la concentration de la molécule dans l’organisme, ainsi que sur sa persistance et ses voies d’élimination. Ces informations sont nécessaires pour évaluer la pertinence des molécules candidates et orienter la décision quant à la poursuite ou non de leur développement. D’un point de vue médical, une connaissance des paramètres de ces molécules dans des organismes vivants permettent une translation clinique de ces paramètres chez l’Homme.

Procédures

Un opérateur spécialisé réalisera une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil ou une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse. Des prises de sang(1 minute) seront réalisées : au maximum 8 sur une période de 24h par animal vigile. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant maximum 96 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et les fèces.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale, un stress lors de la prise de sang et un stress avec parfois une légère perte de poids lié à l’hébergement individuel dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et fèces.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour prélever leurs organes.

Remplacement

Bien que des études in vitro ou des études preuve de concept soient réalisées en amont pour l’ensemble des molécules, il n’est pas possible de recréer in vitro ou in silico la complexité d’un organisme entier avec tous les composants biologiques qui entrent en jeu. Dans le cadre d’une application future en santé humaine, il est donc indispensable de mener une étude in vivo.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, une sélection préalable des molécules d’intérêts sera réalisée in vitro. Pour chaque molécule retenue, une seule dose sera évaluée in vivo. Cette dose sera définie à partir des paramètres pharmacologiques obtenues in vitro et des données in vivo préliminaires déjà disponibles dans la littérature. Enfin, les analyses statistiques reposeront sur un nombre minimum d’animaux. Les molécules seront évaluées chez les deux sexes avec le nombre minimum d’animaux à manipuler, soit 3 à 5 animaux par sexe.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi comprenant des maisons, des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid et des bâtonnets en bois à ronger, pendant une période d’acclimatation d’au moins sept jours. Ils feront l’objet d’une surveillance quotidienne assurée par du personnel formé et habilité. Pour réduire ou supprimer le stress relatif aux administrations et aux prélèvements, ceux-ci seront réalisés dans une pièce au calme sans passage. La douleur engendrée est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H à 96H de la manipulation. Afin de détecter au plus vite tout signe de souffrance , une surveillance de leur état général et de leur comportement sera réalisée grâce à une grille de score et à l’utilisation de points limites définissant les circonstances potentielles pour lesquelles des prises en charge appropriées doivent être mises en place rapidement. Enfin, pour réduire ou supprimer le stress lié à l’hébergement individuel dans les cages spéciales permettant de recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées sur le même portoir dans la même pièce. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des organismes-modèles reconnus pour l’étude de la physiologie et de la physiopathologie de l’être humain. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, correspondant à une période où les principales fonctions physiologiques, métaboliques, rénales, cardiovasculaires et hépatiques sont matures et stabilisées. Ce stade permet d’obtenir des paramètres biologiques interprétables, tout en limitant les biais liés à la croissance, au développement postnatal ou au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes est ainsi adaptée aux objectifs du projet et cohérente avec les standards des études précliniques réalisées chez le rongeur.

Les souris utilisées portent la mutation du syndrome de Wolfram et développent, dès 21 jours de vie, une surdité et un syndrome vestibulaire, auxquels s'ajoute un diabète. 1 440 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever plusieurs structures cérébrales. Elles subissent des injections quotidiennes pendant deux mois et demi, six contrôles alimentaires de quinze heures, six piqûres caudales sur neuf mois, et le porteur signale une irritation possible aux sites d'injection sur l'abdomen. Des tests comportementaux servent à évaluer les capacités motrices du premier mois à l'âge adulte, sans que le document précise lesquels.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique rare mais qui ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la protéine responsable de la pathologie et la compréhension récente de son rôle dans la cellule et son implication dans les processus neurodégénératifs, fondamentaux dans des pathologies comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington, permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Il est important de caractériser les effets thérapeutiques de composés neuroprotecteurs chez les souris pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés par la suite chez l'Homme. Le modèle d'étude est la souris qui possède la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits d'équilibre et d'audition. Les objectifs de ce projet sont de déterminer l'ampleur des déficits observables et d'évaluer les effets bénéfiques des composés médicaments testés.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter une preuve d'efficacité des composés testés. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour des pathologies rares/orphelines (Sclérose latérale amyotrophique, Hungtington...) pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : Les animaux seront soumis à 1 contrôle alimentaire (durée 15h), des injections journalières pendant 2 mois et demi et des prélèvements de quelques gouttes de sang mensuellement pour suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murin. Au total, en plus des injections journalières, les animaux seront soumis à 6 contrôles alimentaires, 6 injections et 6 piqures caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". Le contrôle alimentaire sur un durée de 15h peut également engendrer un stress. Une irritation peut survenir aux sites d'injections sur l'abdomen de l'animal. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels ( surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. Aucune alternative à ce jour ne peut se substituer totalement à ce modèle. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant. Toutes les molécules testées ont été préalablement testées sur des modèles in vitro de culture cellulaire et sur des tests comportementaux sur la larve de poisson zèbre dont l'âge est inférieur à 5 jours.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe. Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de collecter un maximum d’échantillons.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton pour éviter que les animaux ne se blessent et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Si les animaux présentent un augmentation de leur production d'urine (dû à l'installation d'un diabète) les fonds de cages seront changés plus régulièrement. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Une crème analgésique sera appliquée sur la queue avant les prélèvements de sang. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu .

Choix des espèces

Ces expérimentations seront réalisées sur un modèle murin de type syndrome de Wolfram qui mime tous les symptômes que l'on retrouve chez l'Homme atteint par cette pathologie, à savoir un diabète, et une dégénérescence des cellules ciliées de l'oreille menant à des troubles vestibulaires. Les capacités motrices des animaux seront testées dès le 1er mois jusqu'à l'âge adulte.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le foie, les muscles ou le pancréas. Elles subissent une à quatre prises de sang sur animal vigile, jusqu'à huit injections, pour certaines une chirurgie de moins de trente minutes, et une privation de nourriture ou d'eau de douze à quarante-huit heures. Le projet vise à valider chez la souris un biomarqueur sanguin déjà observé chez des patients atteints de lésions aiguës du foie, du muscle ou du pancréas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces interactions dans un "organisme entier" et conclut que l'expérimentation animale reste "indispensable".

Objectifs

Certaines lésions aiguës affectant des organes vitaux tels que le foie, les muscles ou le pancréas peuvent déclencher des réponses inflammatoires et métaboliques systémiques sévères. Ces atteintes sont observées dans différents contextes pathologiques humains, notamment lors d’intoxications aiguës, de sepsis ou de maladies auto-immunes et peuvent évoluer vers une défaillance multiviscérale. Ces processus sont fréquemment associés à l’activation de mécanismes de mort cellulaire régulée, tels que l’apoptose, la nécroptose et la ferroptose, qui, lorsqu’ils sont activés de manière excessive ou non contrôlée, peuvent contribuer à l’aggravation des lésions tissulaires. L’objectif général du projet est d’identifier et de caractériser un mécanisme commun de signalisation systémique des lésions tissulaires aiguës reposant sur la libération, dans la circulation sanguine, d’un biomarqueur intracellulaire lors de la mort cellulaire. Le projet vise à valider et à approfondir des observations réalisées chez l’homme, notamment dans des cohortes de patients présentant des pathologies inflammatoires aiguës ou métaboliques, afin d’évaluer la valeur prédictive de ce biomarqueur vis-à-vis de la morbidité et de la mortalité, en complément des marqueurs actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués lors de lésions aiguës touchant des organes vitaux. En s’appuyant sur plusieurs modèles expérimentaux complémentaires, il permet d’analyser comment des dommages cellulaires sévères peuvent être associés à la libération de signaux circulants reflétant l’intensité des atteintes tissulaires et la réponse globale de l’organisme. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les liens entre les lésions locales d’un organe, les réponses systémiques observées dans l’organisme et l’évolution vers des formes graves de la maladie. Cette approche intégrée, combinant des observations issues de différents niveaux d’analyse, vise à identifier des indicateurs biologiques globaux permettant de mieux apprécier la sévérité des atteintes et leur évolution dans le temps. À plus long terme, ces travaux pourront apporter des connaissances utiles pour la recherche biomédicale, en particulier pour l’étude de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques pouvant conduire à une altération de plusieurs organes. Les bénéfices attendus concernent principalement l’amélioration des connaissances fondamentales sur les mécanismes en jeu, susceptibles de contribuer indirectement au développement de stratégies de prise en charge ou de prévention de ces pathologies chez l’homme ou l’animal.

Procédures

Toutes les souris feront l'objet de manipulations de routine nécessitant d'être brièvement maintenues. Afin de clarifier le parcours des animaux, les interventions se répartissent ainsi, selon les groupes étudiés : Prélèvements sanguins : chaque animal subira entre 1 et 4 prises de sang, réalisées sur animal vigile. Chaque geste dure quelques secondes. Injections : certains animaux recevront entre 1 et 8 injections, réalisées sur animal vigile ou sous anesthésie selon la nature de l’intervention. Chaque injection dure quelques secondes. Lorsque l’intervention est susceptible d’induire une douleur, un traitement analgésique préventif est administré en amont. Ces traitements analgésiques sont intégrés au nombre total d’injections prévues. Injection sous anesthésie générale : pour un groupe spécifique, une injection nécessaire à l’induction du modèle expérimental sera réalisée sous anesthésie générale de très courte durée. Le geste dure quelques minutes. Un traitement analgésique sera ensuite maintenu pendant la phase d’observation. Chirurgie : certaines souris subiront une unique intervention chirurgicale de moins de 30 minutes. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale profonde, associée à des traitements analgésiques préventifs locaux et généraux. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie liée à l’anesthésie. Contrôle de l’alimentation ou de l’accès à l’eau : avant le début de certaines expériences, certains animaux vigiles seront soumis à une période unique et temporaire de retrait de la nourriture ou de l’eau, d’une durée comprise entre 12 et 48 heures selon la procédure concernée. Cette étape est nécessaire pour standardiser leur état métabolique ou reproduire les conditions physiopathologiques du modèle.

Impact sur les animaux

Des périodes de contrôle alimentaire sont prévues et peuvent induire une sensation de faim, une baisse transitoire d’activité et une gêne liée au jeûne. Un contrôle alimentaire plus prolongé peut majorer la sensation de faim, entraîner une perte de poids transitoire et une altération temporaire de l’état général. Un contrôle hydrique est également prévu et peut induire une sensation de soif et une gêne transitoire. La contention, les manipulations répétées, les administrations et les prélèvements réalisés sur animaux vigiles peuvent induire un stress aigu transitoire, une réaction d’évitement et une détresse ponctuelle. Le placement en dispositif de contention pour certaines administrations, ainsi que la répétition de gestes techniques au cours de certaines procédures, peuvent majorer ce stress transitoire. Certaines étapes impliquent une anesthésie et une intervention chirurgicale, susceptibles d’induire un stress physiologique, une baisse transitoire de la thermorégulation et, plus rarement, une détresse cardio-respiratoire pendant l’anesthésie ou au réveil. Certaines administrations nécessitent un réchauffement transitoire, pouvant constituer un stress thermique. Les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur légère et transitoire, ainsi qu’un risque d’hématome ou de saignement local. Les administrations par injection peuvent induire une douleur brève au point d’injection et une irritation locale ; lorsqu’elles sont répétées, elles peuvent augmenter le risque de réaction inflammatoire locale et de complication interne. Les administrations intramusculaires peuvent induire une douleur locale et une gêne locomotrice transitoire. L’intervention chirurgicale peut induire une douleur post-opératoire, un risque d’inflammation locale, un risque d’infection et une altération transitoire de la mobilité. L’induction expérimentale de lésions aiguës peut entraîner une maladie avec inconfort, douleur modérée, baisse d’activité, troubles transitoires de l’alimentation et de l’hydratation.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre laboratoire met en œuvre, en amont des expérimentations animales, des approches de remplacement visant à limiter le recours aux animaux lorsque cela sera possible. Les phases exploratoires et de mise au point reposent notamment sur des modèles in vitro (essais sur des cultures de cellules) et sur des approches in silico, utilisés pour tester des hypothèses, optimiser des conditions expérimentales et sélectionner les paramètres à mesurer. Toutefois, les objectifs de ce projet nécessitent des investigations in vivo. Les modèles retenus reposent sur l’induction de lésions d’organes ainsi que sur l’évaluation de leurs conséquences métaboliques. Ces phénomènes impliquent des interactions intégrées entre plusieurs organes et systèmes (notamment immunitaire, métabolique et nerveux). À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de façon suffisamment fidèle l’ensemble de ces interactions et leur dynamique dans un organisme entier, ni d’évaluer de manière intégrée les effets des procédures sur l’état général, la réponse inflammatoire et les paramètres biologiques mesurés aux temps précoces définis. En conséquence, l’expérimentation animale reste indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un nombre total maximal de 240 souris. La stratégie de réduction repose sur l’optimisation du plan expérimental afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maintenant la validité scientifique des résultats. Afin de réduire le recours à des animaux témoins distincts, chaque animal sera utilisé, lorsque le protocole le permet, comme son propre contrôle, grâce à la réalisation de prélèvements ou de mesures avant et après l’administration expérimentale. Cette approche permet des comparaisons pour un même individu et contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet. Par ailleurs, les expérimentations seront regroupées et planifiées de manière à mutualiser les lots lorsque cela est possible. Plusieurs tissus seront prélevés chez un même animal et utilisés pour différentes analyses afin de maximiser les informations obtenues. De plus, les échantillons seront partagés avec des collaborateurs dans un cadre défini afin d’éviter la réalisation d'expériences redondantes et de limiter la production de nouveaux lots d’animaux. La taille des effectifs a été établie de manière stricte grâce à un calcul de puissance : cette méthode permet de déterminer l’effectif minimal nécessaire pour observer un effet. En conséquence, chaque groupe expérimental comprendra 15 souris, ce qui permet de prendre en compte la variabilité naturelle entre les individus tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, sur ces effectifs réduits, il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques rigoureux pour garantir une interprétation fiable et solide des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de prise en charge des animaux respecteront strictement la réglementation en vigueur ainsi que les pratiques validées au sein de l’établissement utilisateur. Les animaux seront hébergés en cages collectives, avec un accès permanent à une alimentation standard et à l’eau ad libitum, sauf lorsque des périodes de privation ou de restriction seront explicitement prévues par certaines procédures expérimentales. L’environnement sera enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, afin de favoriser l’expression de comportements naturels et de limiter le stress. Une surveillance clinique régulière, adaptée à chaque procédure, sera assurée tout au long du projet. Elle permettra l’identification précoce de tout signe de mal-être ou d’altération de l’état général, tels qu’une diminution de l’activité, une posture anormale, une piloérection ou des modifications du comportement. Des points limites spécifiques à chaque modèle expérimental sont définis afin de limiter la douleur, la souffrance ou la détresse des animaux. L’apparition d’une altération marquée de l’état général ou de signes cliniques sévères conduira à une évaluation immédiate et, le cas échéant, à l’arrêt anticipé de la procédure pour l’animal concerné. Les sites d’injection et, lorsque cela est applicable, les zones chirurgicales feront l’objet d’une observation régulière afin de détecter précocement toute réaction locale ou complication. Un suivi attentif sera également assuré après les administrations ou les interventions chirurgicales, en particulier durant les phases critiques définies pour chaque procédure. Des mesures adaptées de prise en charge seront mises en œuvre afin de limiter l’inconfort lié aux actes expérimentaux, incluant le recours à des protocoles d’anesthésie et d’analgésie appropriés ainsi que des mesures de maintien de la température corporelle lorsque cela est nécessaire. En cas de diminution de la prise alimentaire, un apport nutritionnel complémentaire sous forme de gel alimentaire pourra être mis à disposition afin de garantir un apport énergétique suffisant. L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé par du personnel formé et habilité à l’expérimentation animale, conformément aux exigences réglementaires, afin d’assurer des manipulations maîtrisées, reproductibles et respectueuses du bien-être animal.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris, incluant des souris commerciales non transgéniques et des souris génétiquement modifiées pour cibler des gènes spécifiques liés aux maladies étudiées. Ces souris sont fertiles, possèdent un système immunitaire normal et ne présentent aucun problème de santé lié à leur génétique dans des conditions d’élevage classiques. Le choix de la souris se justifie par la pertinence de cette espèce pour étudier les inflammations aiguës, les lésions des organes et les mécanismes de mort des cellules. La souris permet d’explorer globalement les interactions entre les systèmes immunitaire, métabolique et sanguin, qui sont au cœur de ce projet. Ces réactions complexes à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent pas être reproduites de façon adéquate par des méthodes alternatives (comme des cultures de cellules). De plus, la souris constitue un modèle de référence pour lequel il existe une grande expertise en élevage, en soins vétérinaires, et de nombreux outils d’analyse fiables. La disponibilité de souris génétiquement modifiées et la grande similitude des mécanismes biologiques étudiés avec ceux observés chez l’humain rendent cette espèce particulièrement adaptée à nos objectifs. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 8 semaines. À ce stade, les souris ont terminé leur développement et présentent un système immunitaire et un métabolisme adultes, ce qui est indispensable pour garantir la fiabilité scientifique des résultats de cette étude.

Deux à trois semaines à 4-6 °C, vingt-quatre heures sur vingt-quatre, en cage individuelle, avec une prise de température rectale quotidienne : 610 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Pour 94 d'entre eux, le froid arrive après huit semaines passées à 28 °C, transition que le porteur décrit comme "un stress plus important", avec sortie du protocole si la température corporelle reste durablement sous 33,5 °C. L'objectif déclaré est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur, piste explorée contre l'obésité. Le rat a été préféré à la souris parce que sa taille fournit davantage de tissu adipeux brun par animal, ce qui permet d'en utiliser moins pour une même expérience.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire). Début de modification [Le protocole pour le lot supplémentaire (exposition des animaux à la neutralité thermique (28°C) pendant 8 semaines avant leur exposition au froid (4-6°C) constituera un stress plus important que le passage de 22°C au froid (94 animaux sont concernés), mais au vu des premiers résultats obtenus avec le protocole initial d'exposition au froid, cela semble nécessaire pour favoriser le brunissement du tissu adipeux blanc inguinal (en plus de l'induction du TAB interscapulaire). Les études utilisant ce type de protocole ne décrivent aucune nuisance majeure sur l’animal. On a pu également observer durant notre protocole initial d’exposition au froid, qu'aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et qu'aucune mesure corrective n'a été nécessaire.] Fin de modification.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Début de modification [Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) ont été mis en place et seront également appliqués y compris dans ce nouveau protocole. Les animaux mis en cage individuelle, pourront se voir et se sentir dans les armoires ventilées. Afin de réduire le stress, l'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée et en cage individuelle se fera en 2 temps. Durant notre protocole initial d’exposition au froid, aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et aucune mesure corrective n'a été nécessaire. Dans ce nouveau protocole, où la transition au froid sera plus marquée, la surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux sera maintenue. Les points limites déjà définis permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C.] Fin de modification. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Début de modification [afin de limiter le développement du TAB avant l'exposition au froid, les animaux seront placés à la neutralité thermique dès l'âge de 4 semainesleur réception Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.

Quarante heures en cage individuelle sans enrichissement, répétées trois fois, et jusqu'à 52 semaines de régime hypercalorique : 1 400 souris et 1 500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Les souris femelles reçoivent chaque jour un dérivé de la testostérone qui supprime leur cycle, les hamsters femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, et l'ensemble subit frottis vaginaux quotidiens pendant quatorze jours, prises de sang après jeûne, tests de tolérance au glucose, épilation sous anesthésie et échocardiographie. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est attendu de ces mesures. L'objectif est de construire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques associé à l'obésité pour y tester des composés, aucun modèle in vitro ou ex vivo de présélection n'existant selon lui.

Objectifs

Le syndrome d’ovaires polykystiques (SOPK) touche 6 à 13% des femmes en âge de procréer. Elle se traduit par un désordre hormonal menant à l’anovulation et à l’infertilité. Outre le fait que le syndrome impacte la vie sexuelle des femmes atteintes, il peut induire un désordre métabolique et un risque cardiovasculaire important : ces femmes sont plus susceptibles de développer un surpoids/une obésité, de l’hypertension artérielle, de l’hyperlipidémie, un diabète de type 2. Aujourd’hui les traitements anti-obésité et anti-diabète ne sont pas compatibles avec le souhait de procréation et d’enfanter et il est donc nécessaire de trouver une stratégie thérapeutique efficace pour traiter les atteintes métaboliques de ses femmes sans pour autant les empêcher de procréer. Pour ce faire, il faut donc développer des modèles précliniques atteints de syndrome d’ovaires polykystiques et d’obésité permettant de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées à cette population de patientes.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles SOPK associé à l’obésité mimant ce qui est observé chez les femmes atteintes. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques associée à la SOPK et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en sucre seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 52 semaines pour les hamsters). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeûn 6h maximum avant le prélèvement. Des frottis vaginaux seront réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (quotidiennement pendant 14 jours et jusqu’à 4 fois durant le projet, sur animal vigile, quelques secondes). Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à un taux normal de sucre dans le sang. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille (2 minutes en fin de période de traitement). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

-Le traitement quotidien avec un dérivé de la testostérone induit l’absence de cycle menstruel chez la souris femelle. -L’ovariectomie (retrait des ovaires) induit l’absence de cycle œstral chez le hamster femelle. -Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. -Les mesures réalisées et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal supporte mal l’anesthésie ou soit stressé par certains gestes techniques. -Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Nous devons collecter les organes cibles (foie, système génital, tissus adipeux, muscles, cœur, tibia a minima) donc tous les animaux seront mis à mort en fin de projet.

Remplacement

Le dérèglement associé à la SOPK et l’obésité est un dérèglement multi organique, qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo de préscreening. La SOPK est une maladie combinant dérégulation du cycle hormonal et dérégulation métabolique. Ces dérégulations ciblent de multiples organes de l’appareil reproducteur et du système métaboliques (foie, tissu adipeux, muscle, pancréas, …). Aujourd’hui il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo mimant l’ensemble de ces dérégulations.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.

Raffinement

Lors de la mise sous régime et lors du traitement pharmacologique, l’état physique des animaux est monitoré et scoré 1 fois par jour tous les jours de l’étude. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé par la structure du bien-être animal (SBEA). Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être sera placé en armoire chauffante. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage individuelle (dépense énergétique) se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés par la SBEA avec du cicalfate crème et du cicalfate lotion 2/jour jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques type acide fusidique sera validé avec le vétérinaire désigné.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Le hamster est un modèle bien connu pour avoir un métabolisme des lipides (cholestérol et triglycérides) et des lipoprotéines, comparable à l’homme. En outre, nous avons caractérisé et publié plusieurs modèles nutritionnels de hamster, y compris celui utilisé dans le présent projet, en utilisant des mâles. En conséquence la connaissance acquise sur ces espèces permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines d’âge et les hamsters sont utilisés à partir de 13 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine où la SOPK se met en place au moment de la puberté.