Multisystémique

1 596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des greffes de cœur, de peau ou d'îlots pancréatiques sous anesthésie, l'implantation d'une pompe diffusant des traitements et jusqu'à neuf prélèvements sanguins, certaines recevant une induction chimique de diabète. Le porteur indique que les chirurgies entraînent gêne et douleur au réveil malgré les analgésiques et des difficultés de mouvement à la cicatrisation. Il étudie le rôle des cellules Natural Killer dans le rejet de greffe et affirme que ce phénomène ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Actuellement, on considère que les lésions de rejet sont principalement le fait des lymphocytes T et des anticorps dirigés contre le greffon (réponse du système adaptatif). Récemment des preuves expérimentales ont montré que le rejet pouvait aussi être induit par l’activation d’une autre population cellulaire : les cellules Natural Killer (NK). Ce type de rejet étant nouveau, les mécanismes exacts ainsi que l’impact des différents immunosuppresseurs utilisés habituellement en transplantation pour prévenir le rejet est inconnu sur ce type de rejet.Les cibles cellulaires et moléculaires du greffon reconnues par le système immunitaire varient selon le type de rejet : cellules des vaisseaux sanguins du greffon ou cellules plus en profondeur du tissu transplanté par exemple. Les objectifs de ce projet qui sera mené chez la souris sont : i) d’acquérir des données nouvelles pour mieux comprendre le rôle des différents effecteurs immunitaires et l’interaction avec leurs cibles cellulaires et ou moléculaires, ii) tester des molécules pour pouvoir retarder le développement des lésions de rejet et prolonger la durée de vie des greffons. Il s’agit d’un objectif prioritaire en transplantation compte tenu de la pénurie d’organe. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer l’accès à la greffe pour les patients qui le nécessitent. Différents types de greffe (dites vascularisés ou non vascularisés) seront nécessaires pour mettre en évidence les mécanismes impliqués (en termes de cibles cellulaires), ainsi des souches de souris transgéniques différentes afin de mimer les différences moléculaires entre donneurs et receveurs. Ce projet sera découpé en 6 procédures : en effet, chaque type de modèle de greffe (cardiaque, cutané ou pancréatique) sera étudié en vu des objectifs 1 et 2 suivants : 1) La caractérisation des mécanismes moléculaire et cellulaires impliqués dans les rejets de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots et 2) la validation de molécules pour évaluer leurs capacités à réduire le risque de rejet de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots sur une durée de 8 Semaines maximum. 1596 souris maximum

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes impliquant le système plaquettaire dans ce type de rejet ainsi que la validation de certaines molécules candidates nous permettraient de proposer de nouveaux traitements pour améliorer la survie du greffon aux patients transplantés

Procédures

Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 1h Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – opération au niveau du cou (total opération 2h) Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon de pancreas : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 30 secondes) Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (total opération 2h). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe – Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon cutané : Greffe d’un morceau de peau sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) au niveau du flanc (total opération 30-40 min). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe Expérience de maximum 49 jours

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang (sinus, submandibulaire ou queue) sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cœur, d’ilots ou de peau sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 3 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Le rejet d’organe ne peut pas être reproduit in vitro

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs à 10 animaux par groupe. Nous tenons compte du taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques soit 12 initial, et la mise en place du diabète, taux de réussite 70% soit 14 initial pour obtenir 10 souris par groupe au final. Les groupes comporteront donc entre 10 et 14 individus au maximum afin d’avoir au moins 10 animaux analysables par groupe compte tenu des taux de réussite de chaque chirurgie. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1596 souris (mus musculus).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Différents traitements seront administrés pour réduire la douleur (analgésie) et les souris seront sous anésthésie générale pour les chirurgies Analgésie local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. Suivi post op à 4-6h post opération, J1 et J2 Aucune chirurgie le jeudi et vendredi pour un suivi à J1 et J2. Mesure de la glycémie pour mesurer la prise de greffe Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (ils ne seront isolés que s’ils présentent une lésion au niveau de la suture de la peau post chirurgie) -anésthésie locale avant l’incision sur la zone à opérer (pompe et greffon) et sur la zone avant suture -antiobiotique durant les 24h post chirurgie La perte du greffon, ilots, peau ou cœur, ne peut entrainer la mort de l’animal en soi. L’utilisation de la pompe permettra de traiter les souris quotidiennement sans avoir recours à des injections IP quotidienne. Les souris sont placées en armoire chauffante après la chirurgie durant 4-6hpuis remise dans leur cage sur portoir Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées sous hote avec des loupes binoculaires avec du materiel steril En cas d'infection, un traitement antibiotique sera administré. Des points limites précis et prédictifs ont été définis de manière à éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature.

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un impact crânien est infligé à des souriceaux de 17 jours, suivi de l'implantation d'un mini-microscope par une fenêtre crânienne, puis de tests comportementaux (exploration, coordination motrice, sensibilité tactile, état anxieux) et d'imagerie du cerveau. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme qu'aucun signe de douleur n'apparaît au réveil. Toutes les souris sont tuées pour des analyses en immunohistochimie et par IRM.

Objectifs

Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place à la suite d'un traumatisme crânien (TC) au sein du cerveau et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Nous allons nous focaliser dans ce projet sur les atteintes des vaisseaux sanguins ainsi que sur les processus inflammatoires qui se mettent en place après un TC. Le caractère unique de ce projet est assuré par l’utilisation d’une technique innovante permettant d’imager les cerveaux de souris se comportant grâce à un mini-microscope qui sera implanté sur leur tête.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu).

Procédures

1. trauma crânien léger juvénile (TC): 17 jours après leur naissance, les animaux seront anesthésiés pendant 5 min et subiront un impact léger calibré de 200 µs. Animaux contrôles soumis au même geste, sauf impact. Réalisé une seule fois. 2. Implantation des lentilles de miniscope. Réalisé un mois après TC sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Réalisation d’une fenêtre crânienne. Le cas échéant injection stéréotaxique de virus. Insertion et fixation du prisme, scellement de la base d’ancrage. Durée de 1h à 1h30, plus 30 min en cas d’injection virale. Réalisé une seule fois. 3. Tests comportementaux et imagerie calcique sur animal vigile. Tous les 3 mois (2 fois pour la moitié des animaux, 4 fois pour l’autre moitié). A. mise en place du miniscope. Contention à la main et positionnement du miniscope à l’aide d’une plateforme aimantée sur la lentille. B. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration, 3 tests de coordination motrice, 2 tests de sensibilité tactile, et 1 test d’évaluation de l’état anxieux. Tests de 5 minutes réalisés à raison d’1 test/jour. C. Injection intrapéritonéale unique (environ 3 secondes) lors de la dernière session comportementale (6 mois post TC pour la moitié des animaux, 12 mois pour l’autre moitié), une demi-heure avant le test d’évaluation de l’état anxieux.

Impact sur les animaux

Ce projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile anesthésié. Une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur et reprend immédiatement un comportement normal. Les conséquences incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Il n’y a pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des modèles de souris permettant une exploration longitudinale par imagerie calcique parfaitement décrits qui sont très utilisés dans le domaine et très bien décrits dans la littérature. Aucun phénotype dommageable n’a été décrit. La chirurgie envisagée peut entraîner à faible niveau hypothermie, déshydratation, douleur postopératoire et stress. La pose d’un implant tel que la lentille de miniscope s’accompagne de la possibilité de perte de l’implant. Lors de l’imagerie calcique sur animal vigile couplée au comportement, la pose du miniscope sur la lentille entrainera une contention très courte d’environ 20s. Le poids (< 2g) et le câble reliant le miniscope peuvent occasioner une gêne. Chaque série comportementale peut représenter une source de stress pour les animaux. L’injection IP du composé peut entraîner une douleur ou une gêne locales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 224 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Les procédures expérimentales ont été spécialement conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés par l’obtention d’un suivi longitudinal non invasif. En effet, l’utilisation de l’imagerie in vivo permet d’enregistrer sur un même animal l’évolution de l’unité neurovasculaire au cours du temps, limitant significativement le nombre d’individus nécessaires à cette étude (par exemple, pour 4 temps d’intérêt un seul groupe d’animaux ne sera nécessaire contre 4 groupes avec des techniques classiques). De même cette technique permet de diviser par 2 le nombre d’individus nécessaires pour une approche pharmacologique, les animaux représentant leurs propres contrôles, et augmentant de fait la significativité des résultats. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra d’augmenter l’efficacité des techniques d’imagerie et donc réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en conservant une puissance statitistique satisfaisante, nous avons réalisé une étude de la robustesse de notre nombre d’animaux pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser.

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme. Il s’appuie sur la mise en place des méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra de réduire le temps de chirugie d’environ 30 min et donc favoriser la récupération post-opératoire des animaux. Le projet sera mis en oeuvre par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Une fiche de suivi post-opératoire sera mise en place.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un traumatisme crânien en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 12 mois après le traumatisme crânien afin d’évaluer les conséquences à long-terme.

369 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 290 tuées à l'issue et 79 gardées vivantes pour être réutilisées. Elles subissent un décalage horaire imposé pendant trois semaines, des frottis vaginaux répétés jusqu'à treize semaines et jusqu'à neuf microprélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours, pour étudier l'effet d'un rythme de travail posté sur la fertilité. Le porteur décrit une irritation vaginale et une douleur modérée liée à l'incision de la queue. Il affirme que l'étude de ces mécanismes exige des "organismes entiers vivants" et ne peut se faire sur des cellules isolées.

Objectifs

La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.

Bénéfices attendus

A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 290 animaux. 79 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.

45 xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à six laparotomies sous anesthésie pour prélever des fragments d'ovaires, à deux mois d'intervalle, pour étudier des protéines membranaires du lysosome dans les ovocytes. Le porteur reconnaît que chaque laparotomie "provoque un traumatisme à l'animal" même sans signe comportemental visible, et indique que les xénopes seront tués faute de pouvoir être relâchés, l'espèce étant classée envahissante. Il affirme que l'ovocyte de xénope est "nécessaire" quand les lignées cellulaires ne suffisent pas à détecter l'activité étudiée.

Objectifs

Ce projet de biologie cellulaire fondamentale concerne le lysosome, un compartiment interne de la cellule dont le rôle principal est de dégrader les constituants cellulaires obsolètes. Cette dégradation permet, d'une part, d'éviter que les macromolécules et les compartiments cellulaires vieillissants deviennent toxiques pour la cellule et, d'autre part, de recycler les composants simples pour fabriquer de nouvelles macromolécules ou alimenter le métabolisme. Par ailleurs, il a été récemment montré que le lysosome joue un rôle essentiel comme senseur de l'état nutritionnel de la cellule et la régulation de la croissance cellulaire. L'importance du lysosome est montrée par l'existence d'une cinquantaine de maladies génétiques, les maladies lysosomales, qui sont la conséquence de mutations de gènes impliqués dans la biologie du lysosome. Cette problématique est importante car on sait que les dysfonctions du lysosome au niveau du système nerveux central peuvent être associées à des pathologies graves, en particulier, neurodégénératives. Les protéines intralysosomales, qui réalisent la dégradation des composés obsolètes, sont relativement bien caractérisées. En revanche, les protéines de la membrane du lysosome restent peu étudiées bien que certaines d'entre elles soient mutées dans des pathologies humaines. Notre projet consistera à étudier l'activité de protéines membranaires du lysosome, en particulier des transporteurs qui évacuent les produits de dégradation à travers cette membrane et qui permettent leur recyclage dans la cellule.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra d’identifier et d'étudier l’activité de transporteurs pour mieux comprendre la biologie du lysosome, la physiopathologie des maladies associées, et éventuellement de proposer de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux subiront une procédure chirurgicale consistant à ouvrir l'abdomen pour prélever des fragments d'ovaires. La procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes. Chaque animal subira un maximun de 6 opérations.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs fois (six fois maximum) une chirurgie consistant à ouvrir l'abdomen pour prélever des sacs ovariens ce qui est susceptible de générer de la douleur. Ces chirurgies de courte durée (15-20 min) sont réalisées sous anesthésie et un intervalle de deux mois minimun est respecté entre deux opérations sur un même animal. Les animaux seront isolés pendant les 4 jours suivants la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au plus tard lors du sixième prélèvement que nous avons défini comme étant le nombre maximal de laparotomies que peut subir un même animal. Plusieurs opérations sur le même animal peuvent être envisagées car la procédure est rapide, l'organe prélevé est très proche de la peau ce qui a peu d'impact sur les autres organes abdominaux et les animaux récupèrent rapidement (reprise de la prise alimentaire et d'une activité normale). Cependant, il faut considérer que, bien qu'aucun signe comportemental visible de souffrance chez le xénope ne soit observé et que les ovaires se régénèrent, chaque laparotomie provoque un traumatisme à l'animal. Le nombre de prélèvements varie selon les établissements entre 3 et 6 . Nous prélevons un faible pourcentage d'ovaire à chaque opération, nous alternons les côtés de l'abdomen en maximisant le temps entre deux opérations ce qui permet dans la majorité des cas de réaliser 6 prélèvements. Les animaux seront mis à mort car ils ne pourront ni être relachés dans la nature, ni replacés. Il est interdit de les relacher dans la nature car le xénope est une espèce envahissante vecteur de maladies comme la chytridiomycose et il sera inscrit en 2024 sur la liste des espèces exotiques envahissantes préoccupantes de l'Union Européenne. Son replacement est difficilement envisageable car la détention d'individus étant soumise à autorisation préfectorale et possession d'un certificat de capacité, il existe peu de possibilités en dehors des laboratoires de recherche.

Remplacement

Quand c'est techniquement possible, nous utiliserons des lignées cellulaires pour les études fonctionnelles des protéines membranaires d'intérêt. Les ovocytes de xénopes seront nécessaires 1- si une activité endogène présente dans les lignées cellulaires masque l'activité de la protéine recombinante étudiée 2- si un très fort taux d'expression de la protéine recombinante est nécessaire pour détecter son activité 3- pour étudier l'activité par électrophysiologie .

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, nous organiserons les expériences pour qu'un même prélèvement d'ovocytes fournisse du matériel pour plusieurs manipulations (caractérisation de deux transporteurs différents ou d'un même transporteur par deux approches expérimentales différentes). Le nombre d'animaux a été calculé pour réaliser un prélèvement par semaine, en effectuant un maximum de six prélèvements par animal et en respectant un délai d'au moins deux mois entre deux prélèvements.

Raffinement

Les xénopes sont hébergés en groupe de douze animaux maximum dans des aquariums en verre. La température et la quailté de l'eau sont rigoureusement controlées. Afin de réduire le stress des xénopes, les parois des aquariums exposés vers l'intérieur de la pièce sont couverts de plastique foncé opaque et des feuilles de nénuphars en plastique flottent à la surface. Cela permet aux xénopes de se cacher comme ils le font dans la nature pour se protéger des prédateurs. Le prélèvement des sacs ovariens est réalisé sous anesthésie générale et la récupération des animaux après la chirurgie est surveillée étroitement pendant les quatre jours qui suivent le prélèvement. Des points limites spécifiques ont été définis. Un maximum de six prélèvements sera effectué par animal avec un délai d'au moins deux mois entre chaque prélèvement.

Choix des espèces

Le xénope commun est le seul animal à produire en grande quantité des cellules géantes, avec peu de protéines endogènes à la membrane plasmique et dans lequelles on peut exprimer des protéines recombinantes en abondance par injection d'ARN synthétique. Les animaux seront agés de 18 mois minimum car ils doivent avoir atteint la maturité sexuelle

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisses et en sucre pendant 23 semaines, six séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un radiotraceur et des tests comportementaux d'activité motrice, de dépression et d'anxiété, pour étudier par imagerie l'atteinte cérébrale liée à une maladie du foie. Le porteur décrit comme effets attendus une prise de poids et un possible stress au réveil des anesthésies. Il affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour cette approche globale et présente le rongeur comme le "modèle de choix".

Objectifs

La NAFLD (acronyme anglais, non-alcoholic fatty liver disease) regroupe un large spectre de maladies hépatiques chroniques caractérisées par une accumulation excessive de graisses dans le foie (stéatose) sans lien avec l’alcool, et qui touchent environ 25% de la population générale et 80% des personnes en obésité morbide. Dans certains cas, la maladie évolue vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH, acronyme anglais non-alcoholic steatohepatitis), une forme sévère et irréversible avec inflammation. Cette forme agressive de la maladie favorise l’accumulation de fibrose et peut évoluer vers la cirrhose et ses complications, principalement cardiovasculaires. Cette maladie hépatique est désormais reconnue comme un dysfonctionnement multisystémique, c’est-à-dire que le mauvais fonctionnement du foie entraine le mauvais fonctionnement d’autres organes, comme le cerveau. L’encéphalopathie hépatique est la complication la plus fréquemment décrite et des études ont mis en évidence l’impact de l’obésité et d’une mauvaise alimentation sur le fonctionnement cérébral et cognitif. Cependant, les mécanismes cérébraux sous-jacents restent inconnus à ce jour. L’imagerie fonctionnelle offre la possibilité d’explorer in vivo certains des mécanismes élémentaires qui affectent le fonctionnement cérébral tels que le métabolisme cérébral, la densité synaptique ou l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’objectif de ce travail est de mettre en œuvre ces méthodes d’imagerie déjà développées et appliquées dans notre laboratoire, à un modèle rongeur NAFLD/NASH bien caractérisé afin d’identifier les mécanismes physiopathologiques à l’origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie hépatique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans la NAFLD/NASH, et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Cela permettra également d’identifier quelle(s) méthode(s) d’imagerie sera la plus pertinente pour continuer le développement de cette approche chez l’homme. A plus long terme, cela permettra d’envisager l’étude de cette pathologie in vivo chez des patients atteints par ces pathologies avec pour objectif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : -Administration d’un régime alimentaire enrichi en graisses et sucre, pendant 23 semaines. -Réalisation de sessions d’imagerie (6 par animale) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum,) -Injection d’un radiotraceur (1 minute) -Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux ( 5/animale) afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 6 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. -

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - Accumulation de gras dans le foie (asymptomatique) et prise de poids - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’atteinte multisystémique d’une maladie hépatique. Un modèle animal est indispensable afin d’envisager cette approche globale de la pathologie. Le modèle rongeur NAFLD/NASH est le modèle de choix pour cette approche car déjà largement utilisé pour l’étude de cette maladie avec une atteinte cérébrale mise en évidence par certaines études. Le choix du rongeur est également adapté aux différentes expérimentations envisagées (imagerie et comportement) qui pourront être conduites aisément avec ces animaux.

Réduction

L’utilisation des différentes modalités d’imagerie permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.

Raffinement

Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergés par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue au début de leur séjour et avant de débuter le régime alimentaire HFHSD. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux traités par le régime HFHSD feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids au cours du traitement. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. .

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections hépatiques. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP et IRM ainsi qu’à l’étude comportementale. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).

6620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des flavivirus neurotropes par injection, voie orale ou injection intracrânienne, subissent des biopsies de queue, des prises de sang et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier l'influence du fond génétique sur la sensibilité à l'infection. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, apathie et paralysie, et que les animaux sont tués parce qu'infectés par des pathogènes dangereux pour l'humain. Il affirme que ces phénomènes se développent à l'échelle de l'"organisme entier" et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par les flavivirus neurotropes. En particulier, la survenue de formes sévères de la maladie et l’apparition de troubles neurologiques et comportementaux secondaires à l’infection restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par un flavivirus neurotrope ? 2. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par un flavivirus neurotrope ? 3. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de flavivirus ? 4. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 5. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier de nouveaux modèles de souris qui pourront être utiles pour étudier la physiopathologie des infections virales neuroinvasives ou pour le développement de mesures préventives et thérapeutiques. De plus, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection. La caractérisation poussée de l’infection par les flavivirus neurotropes dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser les connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement des infections virales neuroinvasives. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard de l’émergence ou la réémergence actuelle des flavivirus en Europe et dans le monde et des conséquences neurologiques dramatiques causées par ces infections.

Procédures

Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par injection une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par administration orale dans la bouche à l’aide d’une seringue une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec flavivirus neurotrope par une injection intracraniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Des tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance).

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 4 procédures de sévérité modérée. Dans certains cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids faible et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par des pathogènes dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur le virus Zika montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne devrait pas nécessiter plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience avec le virus Zika. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.

Raffinement

Les inoculations et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. Certaines inoculations seront réalisées sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire.

Choix des espèces

1. Nous disposons de bons modèles d'infection par les flavivirus neurotropes chez la souris. 2. La souris fait partie des espèces « réservoir » des virus de l’encéphalite à tiques. 3. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 4. La dangerosité des flavivirus neurotropes impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par les flavivirus neurotropes sur le développement post-natal du cerveau.