Multisystémique
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Génération d’une lignée de souris transgénique surexprimant la protéase HTRA3 comme modèle d’étude du vieillissement prématuré observé dans le syndrome de Cockayne
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur génère une lignée transgénique surexprimant une protéine pour provoquer un vieillissement prématuré, et décrit les atteintes attendues, perte de poids et de masse musculaire, baisse de la mobilité et des fonctions cognitives, douleurs chroniques, jusqu'à la mise à mort pour prélèvement d'organes. Les injections pharmacologiques sont administrées en une fois ou chaque jour sur dix jours. Il justifie le recours à l'animal par la rareté et la fragilité des patients atteints du syndrome de Cockayne et affirme qu'aucun système in vitro ne peut reproduire le vieillissement d'un tissu.
Objectifs
L’analyse de cellules dérivées de patients avec le syndrome de Cockayne (CS) a montré que la réparation défectueuse de l'ADN, due à l'altération de l’une ou l’autre des protéines n'était vraisemblablement pas la cause principale de la maladie, mais plutôt d’autres fonctions de ces mêmes protéines. Le vieillissement précoce et la neurodégénérescence dans le CS ont été réfractaires à l'expérimentation car les modèles murins ne récapitulent pas complètement la maladie, et car le matériel biologique provenant de patient est difficile à obtenir (les patients CS sont extrêmement fragiles). La faible représentativité des modèles animaux pour le CS représente un handicap majeur pour l'investigation et le développement éventuel de stratégies précliniques pour le CS. Au vu des données indiquées au-dessus, il est fort possible que la surexpression d’une protéine candidate soit une cause majeure de la maladie. Nous prévoyons donc de générer une nouvelle lignée de souris inductible cette protéine pour vérifier cette hypothèse.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à ce que cette lignée de souris exprime de manière ubiquitaire (dans tous les organes/tissus) des niveaux élevés de la protéine , de manière constante ou pendant des périodes données lorsqu'elle est supplémentée ad hoc avec un inducteur. Les souris surexprimant la protéine en permanence et/ou pendant des périodes données devraient présenter des signes de vieillissement prématuré et/ou de neurodégénérescence. Nous nous attendons à une durée de vie plus courte que les souris non supplémentées en inducteurs ou les souris contrôle (non transgéniques) ainsi qu’à une apparition plus précoce de la dégénérescence de plusieurs organes et du cerveau, ce qui se traduit par une mobilité, une flexibilité et une cognition affectées. Enfin, ce modèle de souris sera d'une grande importance pour les études mécanistes et précliniques du syndrome de Cockayne, y compris pour les thérapies, puisque nous avons identifié plusieurs molécules antioxydantes effectives in vitro.
Procédures
Les animaux recevront un traitement pharmacologique en injection unique (durée 15 sec/animal) ou en injections répétées de façon quotidienne (durée 15 sec/animal) sur une durée de 10 jours
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont ceux caractéristiques du processus de vieillissement ; incluant une perte de poids (musculaire), une réduction de la mobilité et des fonctions cognitives, et des douleurs chroniques (posturale, fibrotique), et ceux jusqu’à la mise à mort des animaux à la fin du protocole expérimental.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole expérimental ou en cas d’atteinte d’un point limite pour prélèvement d’organes pour analyse des défauts au niveaux moléculaire et/ou cellulaire et/ou histologique (les animaux ne pourront donc pas, ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés)
Remplacement
Aucun système in vitro ne peut récapituler la complexité des interactions et reproduire fidèlement les conditions naturelles au sein d’un tissu normal ou en vieillissement. Ceci est particulièrement justifié pour le vieillissement qui se définit par la dégénération d’un tissu ou organe avec le temps. Il est par conséquent difficile d’étudier l’ensemble des composantes du vieillissement à l’échelle cellulaire. En plus de ces limitations, le matériel biologique issu des patients (sang, biopsies) est très difficile à obtenir du fait de leur faible nombre (incidence : 1/200000) et de leur fragilité extrême. Le processus de vieillissement implique une multitude de réponses et d’interactions cellulaires avec leur environnement au sein d’une ultrastructure tridimensionnelle complexe (matrice extracellulaire tridimensionnelle, types cellulaires variés, facteurs de croissance, etc), qui ne peuvent être appréhendé dans leur globalité qu’in vivo.
Réduction
Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats statistiquement interprétables. Un nombre de 6 animaux, pour les groupes contrôles et les groupes expérimentaux, sont utilisés pour réaliser les expériences. Les résultats obtenus entre les groupes expérimentaux et les groupes contrôles sont analysés par des tests d’hypothèse paramétrique ou non paramétriques.
Raffinement
Un suivi régulier des animaux selon leur état général de santé et le développement des signes caractéristique du vieillissement (aspect pelage, motricité/activité, appétit) est prévu. Le poids des souris sera également enregistré. Les cages seront également garnies avec des éléments d’enrichissement pour réduire l’impact d’un environnent stressant pour les animaux. En cas d’identification d’une douleur ou souffrance quelconque de l’animal, liée ou non au vieillissement induit, des traitements sont prévus avec administration d’analgésique pour assurer un confort total des animaux. Si les signes cliniques de souffrance ne s’améliorent pas dans les jours suivants, ou en présence d’une perte de poids trop importantes, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sont des petits mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’Homme. Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche. Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées). Cette richesse de ressources permet des croisements facilités afin d’étudier des composantes multifactorielles, particulièrement appropriées pour l’étude du vieillissement et surtout des maladies liées à l’âge, qui ne sont pas causées par l’altération d’un seul gène. Ceci entre dans le cadre du raffinement avec la possible valorisation d’animaux non utilisés pour d’autres projets. L’évaluation du phénotype de la nouvelle lignée nécessite l’utilisation des animaux à la naissance, au sevrage et à l’âge adulte. Dans l’autre procédure les animaux seront utilisés à partir de l’âge adulte (6 à 8 semaines) pour que le sevrage permette l’accès aux produits administrés dans l’eau de boisson ou la nourriture et ainsi réduire les injections. Notre objectif étant de générer un phénotype de vieillissement précoce par induction d’un transgène, les animaux seront utilisés jusqu’à l’apparition de signes phénotypiques d’un vieillissement sévère (souris gériatrique), et donc potentiellement pour les animaux contrôles jusqu’à 24-36 mois sous réserve d’un état général satisfaisant.
Rôle de la coagulation et de l’inflammation dans l’ischémie intestinale chez la souris et évaluation de l’efficacité de différents traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
720 souris femelles vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Leur abdomen est ouvert et l'artère irriguant l'intestin est clampée pendant une heure pour provoquer une ischémie, suivie d'une reperfusion et de prélèvements sanguins, certains animaux recevant un anticoagulant ou un anti-inflammatoire. Le porteur indique que la pathologie provoque des lésions de l'intestin et une contamination du sang par des bactéries, ce qui justifie selon lui l'euthanasie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne simule la circulation complexe en jeu et juge la simulation informatique "peu prédictive".
Objectifs
L’ischémie mésentérique aigue est une affection grave provoquée par une obstruction des vaisseaux irriguant l’intestin, diminuant le flux sanguin et l'apport d'oxygène dans ce dernier et entraînant une détresse intestinale. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes de la formation de caillots et de l’inflammation dans les vaisseaux sanguins irriguant l’intestin dans cette pathologie. En effet, l’intervention chirurgicale permettant la désobstruction des vaisseaux sanguins, induit une réoxygénation trop rapide du tube digestif, et conduit paradoxalement à des lésions des vaisseaux et de l’intestin importantes. Certaines études expérimentales animales ont montré́ que les lésions intestinales étaient initiées par le retour du sang oxygéné vers les tissus de l’intestin qui n’étaient plus irrigués. Cela est appuyé par certaines études, utilisant des modèles expérimentaux animaux, qui suggèrent l’idée qu’une réoxygénation progressive du tissu réduiraient les lésions intestinales. Notre hypothèse de recherche est que les mécanismes associés à la formation des caillots obstruant les vaisseaux et l'inflammation sont impliqués dans les lésions vasculaires et intestinales observées dans la pathologie. Nous avons également émis l'hypothèse que l'inflammation dû à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin pouvait être un facteur aggravant, qui pourrait participer à l'amplification des phénomènes observés. Deux objectifs sont décrits pour ce projet : 1) Caractériser les mécanismes conduisant à la formation d’un caillot et à l’inflammation contribuant à l’obstruction des vaisseaux sanguins irriguant l’intestin. 2) Explorer l’intérêt de différents traitements (Anti-coagulants, anti-inflammatoires) dans la limitation des lésions intestinales en thérapeutique expérimentale chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre pourquoi il est difficile de restaurer une circulation sanguine efficace dans les vaisseaux irriguant l’intestin après l’élimination de caillots obstruant ces derniers et empêchant l’apport d’oxygène au niveau de l’intestin. Nous étudierons également, l'intérêt d’utiliser des traitements anti-coagulants et anti-inflammatoires dans cette pathologie. En effet, l’évaluation de nouveaux traitements susceptibles de contrôler les phénomènes responsables des lesions des vaisseaux et de l’intestin est primordiale afin d’améliorer le pronostic des patients atteints d’ischémie intestinale. La perfusion d’anti-thrombotiques tels que l'héparine, d’anti-inflammatoire comme l’aspirine ou des agents limitant les phénomènes d’inflammations dus à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin, pourraient diminuer la mortalité des patients atteints d’ischémie intestinale dans toutes ces applications cliniques encore insuffisamment comprises et efficacement traitées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure sans réveil. Ils seront opérés sur une table chauffante à 37°C, après une anesthésie générale et un traitement antalgique. Après ouverture abdominale, un clamp sera posé sur l'artère principale permettant l’irrigation de l’intestin (artère mésentérique supérieur) induisant l’interruption temporaire de la circulation sanguine au niveau intestinal. Le clamp sera maintenu en place pendant 1 heure avant d’être retiré afin de rétablir la circulation sanguine intestinale. Nos observations commenceront dès la pose du clamp (ischémie) et jusqu’à 1 heure après le retrait du clamp (reperfusion). Un prélèvement sanguin sera effectué en début et en fin de procédure. Afin d'évaluer l'efficacité de différentes molécules thérapeutiques, certains animaux se verront administrer par injection intra-veineuse un traitement anti-coagulant ou anti-inflammatoire au cours de la procédure. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de la pathologie attendus sont des dommages de l’intestin et une contamination du sang par les bactéries provenant de l’intestin, justifiant l'euthanasie sous anesthésie générale en fin de procédure. Les effets indésirables liés à la procédure sont : une douleur liée à l’injection de l’analgésique et une douleur liée à la procédure chirurgicale en cas de réveil de l’animal (évité avec une surveillance continue et un maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure).
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées après la reperfusion intestinale afin de prélever l’intestin grêle pour des analyses des tissus biologiques et d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil.
Remplacement
L’ischémie intestinale et les lésions associées à la reperfusion intestinale sont une maladie grave, d'une mortalité extrême (80% chez l'Homme), avec des formes très hétérogènes et encore très mal connue. L'utilisation d'un modèle non animal n'est pas réalisable et pas pertinent pour cette pathologie. En effet, aucun modèle non animal ne permet de simuler le circuit complexe de circulation et les nombreuses interactions impliquées dans le développement de la pathologie. Ces multiples paramètres et l’hétérogénéité de la pathologie en font un modèle difficilement reproductible en milieu artificiel et peu prédictif via l’utilisation de logiciel informatique.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux a été déterminé d’après une analyse statistique. Nous avons estimé qu’il faut inclure 10 animaux par groupe au minimum pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Une revue bibliographique nous a permis de sélectionner les doses pour les traitements ciblés les plus pertinentes afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Avant les procédures expérimentales, les animaux sont dans une cage spacieuse qui permet aux souris de se déplacer librement et d'adopter des comportements naturels, en groupe pour permettre une interaction sociale entre les souris et avec litières (copeaux de bois) et boites pour encourager les comportements de nidification. Les souris seront opérées sur une table chauffante à 37°C sous anesthésie générale. Après une analgésie pour réduire les douleurs durant la procédure, les animaux seront anesthésiés à l'aide d'un gaz (induction dans une chambre dédiée et maintien à l’aide d’un masque). Les effets de l’anesthésie et l’analgésie seront suivis tout au long de la procédure. En cas de signe de réveil, la quantité d’agent anesthésiant sera augmentée. Si les signes persistent ou d’autres signes indiquant une souffrance de l’animal apparaissent, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de l’ischémie mésentérique aigue chez la souris est déjà décrit dans la littérature et notre équipe est déjà formée à la procédure qui a montré des résultats applicables à ce qui peut être observé chez l’homme. Des souris femelles adultes (7 à 9 semaines) seront utilisées pour que les vaisseaux irriguants l'intestin puissent être facilement visualisés sous loupe. Des souris plus âgées ou un autre modèle animal risqueraient de présenter des zones grasses autour des vaisseaux, compromettant leur observation. De plus, notre laboratoire est habitué à travailler avec les souris, et cela à chaque étape de l’expérimentation : soins préalables, maniement et gestion du stress, matériel anesthésique, opératoire et de monitorage, analgésie et euthanasie.
Etude de la biodistribution de peptides, peptides modifiés et pseudo peptides par imagerie TEP/TDMX
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit jusqu'à quatre injections et subit jusqu'à quatre séances d'imagerie TEP sous anesthésie générale sur quatre semaines, avant un prélèvement d'organes post mortem. Le projet cherche à mesurer la biodistribution de quinze peptides candidats, dont huit seulement sont disponibles, pour orienter de futures applications médicales. Le porteur affirme que l'étude in vivo de l'élimination et de l'accumulation dans les organes ne peut se faire que sur des animaux.
Objectifs
Au cours des dernières années, les peptides ont connu une augmentation de leur utilisation en médecine que ce soit pour des applications en tant agents diagnostiques ou comme composés thérapeutiques. Ils bénéficient d’une meilleure bio-distribution et bio-disponibilité que les anticorps tout en possédant une plus forte affinité et sélectivité que les “petites molécules”. Cependant, les peptides naturels sont souvent difficilement utilisables sans modification préalable de leurs structures en raison de leurs temps de demi-vie faibles in vivo. Les modifications chimiques permettent de générer des peptides ou des pseudo peptides (endo thio-peptide, uréido-peptides par exemple) ainsi que des peptides portant des chaines carbonées ou fluorées qui améliorent considérablement leurs demi-vies mais qui modifient aussi leurs bio-distribution in vivo. L’objectif de ce projet est de déterminer par imagerie non invasive la biodistribution et la biodisponibilité de ces peptides après une administration par voie intra-veineuse, intra-péritonéale ou en sous cutanée et également de définir précisément les voies d’élimination et les zones potentielles d’accumulation afin d’anticiper une toxicité potentielle de ces peptides et de sélectionner les meilleurs candidats pour de futures applications en médecine. L’imagerie in vivo nous permettra également d’étudier la capacité de peptides modifiés à traverser les membranes (paroi intestinale, barrière hémato- encéphalique, peau). Les résultats seront comparés à ceux obtenus avec les peptides natifs mais aussi comparés entre eux selon les méthodes d’administration. Retombées attendues : ce projet doit ouvrir la voie à l’utilisation des peptides comme outil thérapeutique pour le traitement de maladies ou comme agents d’imagerie pour le diagnostique. Le 2eme objectif de ce projet est de permettre de sélectionner les meilleurs candidats médicaments ou à orienter les travaux de recherche visant à améliorer les propriétés pharmaco-cinétiques et dynamiques des peptides. 15 molécules sont envisagées (8 sont d’ores et déjà disponibles) pendant la durée du projet. Nous travaillerons sur souris blanches Balb/c mâles ou femelles indifféremment. Cette phase de sélection permettra de choisir les molécules les plus prometteuses qui feront l’objet de demande d’expérimentation spécifique ultérieurement si les résultats préliminaires sont suffisants.
Bénéfices attendus
est doit permettre de sélectionner les meilleurs candidats médicaments ou à orienter les travaux de recherche visant à améliorer les propriétés pharmaco-cinétiques et dynamiques des peptides. 15 molécules sont envisagées (8 sont d’ores et déjà disponibles) pendant la durée du projet. Nous travaillerons sur souris blanches Balb/c males ou femelles indifféremment. Cette phase de sélection permettra de choisir les molécules les plus prometteuses qui feront l’objet de demande d’expérimentation spécifique ultérieurement si les résultats préliminaires sont suffisants.
Procédures
Les animaux recevront au maximum 4 injections de produit selon 3 voies maximum d'une durée de 1 minute chaucune sur une période de 4 semaines sous anesthésie générale isoflurane. Chaque animal aura 4 examens d'imagerie maximum d'une durée de totale de 120 minutes et minimale de 10 minutes sur une période de 4 semaines sous anesthésie générale. Pas de chirurgie ni de prélèvement sur animal vigile ou anesthésié dans ce projet.
Impact sur les animaux
Les doses de radio-activité injectées et les doses de rayons X reçues n'induisent pas d'effets indésirables sur la durée de l'étude .Un léger hématome peut apparaitre au site d'injection intraveineux mais qui se résorbe en 48 h selon notre expérience.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure car différents organes d'intérêt seront prélevés post mortem pour des analyses ex vivo ultérieures.
Remplacement
L'objectif de ce travail étant d’évaluer in vivo la biodistribution, l’élimination et/ou l’accumulation dans des organes de différents petpides elle ne peut se faire que sur des animaux.
Réduction
L’imagerie TEP/TDMX est non invasive, les quantités de produits injectées sont de l’ordre de 0,01 mg/Kg ce qui est extrêmement faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. En effet, chaque animal recevra le peptide selon les 3 modalités d'injection après une période wash out de 24 heures minimum. En fin de protocole, les organes seront prélevés pour des études ex vivo complémentaire sans augmenter le nombre d'animaux. Nous utiliserons 10 à 15 souris par groupe pour pouvoir faire des statistiques sur les résultats obtenus. Ce nombre d'animaux par groupe est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité.
Raffinement
Avant le début du protocole, les animaux sont habitués à la présence du personnel pendant une période minimale de 7 jours et maximale de 14 jours. En dehors des périodes d’examen les animaux sont manipulés le moins possible tout en faisant attention à minimiser le stress induit par la manipulation et la présence du personnel du laboratoire. Les animaux sont placés à plusieurs par cage et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les intercations sociales et une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Un gel ophtalmique est appliqué sur la rétine pour éviter le déssechement occulaire et une injection sous cutané de NaCl 0.9% à température corporelle (10 ml/kg) pour éviter la déshydratation lors des anesthésies (examens TEP/TDMX et injection). La température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorés en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax respectivement pendant les examens d'imagerie afin de déceler tout signe précoce de mal être. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés .
Choix des espèces
Le projet vise à déterminer les voies d’élimination, le stockage dans des organes cibles ainsi que des paramètres pharmacologiques. Etant donné que notre objectif n’est pas de déterminer l’efficacité de chaque produit, sur un modèle spécifique, des souris blanches peuvent être utilisées pour cette étude. Les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines (adulte) lors de l’injection des radiotraceurs.
Étude de la machinerie de synthèse des protéines chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
128 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un antalgique puis une anesthésie profonde, avant l'ouverture de la cage thoracique et une perfusion cardiaque qui fixe les tissus, pour étudier la composition des ribosomes dans différents organes. Le porteur indique n'attendre qu'un léger stress et une légère douleur liés aux injections. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de travailler sur "organisme entier", les protéines identifiées devant ensuite être étudiées in vitro.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale. Il vise à élucider les mécanismes complexes qui régissent l’expression des gènes, un processus essentiel dans le fonctionnement cellulaire. Les ribosomes, les machines moléculaires qui synthétisent les protéines, jouent un rôle central dans ce processus. Historiquement, les ribosomes ont été décrits comme étant identiques dans toutes les cellules. Cependant, des études récentes ont mis en évidence une grande hétérogénéité dans la composition des ribosomes et ont émis l’hypothèse de l’existence d’une multitude de ribosomes différents, décrits comme ribosomes “spécialisés”, chacun avec une activité spécifique. Afin d’étudier ces ribosomes “spécialisés” dans différents organes (le foie, le cerveau ou la rate par exemple) et comprendre leur fonctionnement, nous avons mis en place une approche innovante permettant de déterminer la nature des différentes protéines qui les composent. Nos premiers résultats obtenus dans des cellules en culture, nous ont permis de mettre en évidence près de 600 protéines qui se lient directement aux ribosomes. Cela ouvre de nouveaux champs de recherche pour la compréhension des mécanismes fondamentaux du fonctionnement cellulaire qui sont contrôlés par les ribosomes. Actuellement, nous souhaitons étendre notre étude en caractérisant la composition de ribosomes spécialisés dans différents organes chez la souris. Pour cela, nous avons généré une souris qui nous permet de marquer tous les ribosomes de chaque cellule et de les purifier. Cette lignée de souris est viable et n’a pas de phénotype dommageable. Elle n’a pas non plus d’immunodéficience connu ou de phénotype immunologique. Pour effectuer nos analyses, nous devons fixer les tissus (aussi appelés organes) avec un produit chimique chimique afin de stabiliser les interactions entre les ribosomes et les protéines qui interagissent avec eux. . Nos résultats indiquent que si la fixation des organes récupérés a lieu après la mise à mort des souris alors la fixation n’est pas homogène et cela introduit des biais expérimentaux dans l’analyse de la composition des ribosomes. Pour réaliser des analyses fiables, les organes seront donc fixés sur les animaux sous anesthésie profonde sans réveil. Les tissus seront ainsi figés avant la mise à mort des animaux. Cette procédure garantit que les interactions entre les ribosomes et d'autres protéines restent inchangées, reflétant ainsi la situation réelle dans les cellules vivantes.
Bénéfices attendus
La réalisation de notre projet aura des apports importants pour la connaissance fondamentale sur les rôles spécifiques des ribosomes spécialisés présents dans chaque organe et permettra d’ouvrir une nouvelle voie de recherche afin de caractériser le rôle fonctionnel de l’interaction entre certains détecteurs de virus et les ribosomes, dans le cadre de la réponse immunitaire innée. En outre, les protéines identifiées comme associées aux ribosomes spécialisés dans les différents organes seront une ressource d’intérêt pour des chercheurs dans différents domaines de la biologie.
Procédures
Tous les animaux de notre protocole seront soumis aux interventions suivantes : changement d'animalerie 7 jours avant le début des expériences, injection sous-cutanée pour la livraison d’antalgiques : 1 fois par animal 30 minutes avant l'injection d'anesthésiques, durée de l’injection : 10 secondes puis 1 injection dans l'abdomen pour anesthésie profonde : 1 fois par animal, durée de l'injection : 10 secondes ; puis la cage thoracique sera ouverte par chirugie (temps de l'intervention 5 minutes) et une perfusion cardiaque sous anesthésie profonde (durée de la mise en place de la perfusion : 5 secondes, temps de perfusion : 12 minutes.
Impact sur les animaux
Cela entrainera donc un léger stress dû au changement d'animalerie, un léger stress dû à la contention puis une légère douleur due aux injections de l'antalgique et de l'anesthésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort puis les organes d'intérêt seront prélevés afin d’analyser les ribosomes spécialisés et de les comparer entre les différents organes.
Remplacement
L’objectif de ce projet étant de connaitre les partenaires des ribosome in vivo et de comparer la liste de ces partenaires entre plusieurs organes il est nécessaire de travailler sur organisme entier. Les protéines identifiées dans notre étude pourront ensuite être validées et leur fonction cellulaire étudiée dans des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base de données préliminaires. Le nombre d'animaux dans chaque lot a été réduit au maximum et sera composé de 8 souris contrôles non transgéniques et de 8 souris transgéniques.
Raffinement
Les souris utilisées dans notre projet n’ont pas de phénotype dommageable. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, la perfusion des souris sera réalisée sous anesthésie profonde. Aussi, des antalgiques seront administrés aux souris avant l’anesthésie afin d’éviter d’éventuelles douleurs liées à la procédure de perfusion. Pendant toute la durée de l’anesthésie profonde, les animaux seront placés sur un tapis chauffant, afin de limiter les risques d'hypothermie, et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d'éviter les risques de sècheresse oculaire. En cas de problème non anticipé lors de la perfusion intracardiaque, la souris sera immédiatement mise à mort par dislocatoion cervicale.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier la composition des ribosomes notamment dans les cellules du système immunitaire présentes dans les organes du système immunitaire car il permet d’avoir accès à suffisamment de matériel biologique pour pouvoir réaliser des analyses biologiques. Par ailleurs, le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir réaliser, à terme des expériences d’infection par divers virus dans des animaux génétiquement modifiés afin de valider nos premiers résultats obtenus sur des lignées cellulaires. Nous utiliserons dans notre projet des animaux adultes afin d’étudier les fonctions des ribosomes dans des conditions physiologiques chez l’adulte.
Étude de la modulation de l’inflammation aiguë par induction de la senescence.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour une partie et sévère pour la majorité, 192 sur 228. Elles reçoivent des injections du vaccin anticovid de Pfizer pour induire des cellules sénescentes, puis des lipopolysaccharides ou une irradiation gamma pour déclencher une inflammation aiguë. Le porteur indique que ces agents peuvent provoquer un choc septique, de la fièvre, des tremblements et une prostration entre 15 et 48 heures après le traitement. Il affirme que la sénescence et l'immunité impliquent trop d'organes pour être reproduites en culture, ce qui rend selon lui le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
En vieillissant, l’organisme accumule des cellules potentiellement toxiques appelées « cellules sénescentes » ou CS. Leur impact sur le corps réduirait l’espérance de vie en favorisant l’apparition de différentes pathologies liées à l’âge. Il est généralement considéré que leur délétion diminuerait les comorbidités associées au vieillissement. Néanmoins, il a également été montré que la délétion de certains types de CS est néfaste pour certains organes, en particulier si les CS concernées font partie du système vasculaire. Leurs rôles et fonctions restent donc largement incompris et controverse. Ces CS s’accumulent soit lentement tout au long de la vie, soit au contraire apparaissent massivement à la suite d’un stress induit par une pathologie. Dans les 2 cas, il semble que ces cellules sénescentes puissent impacter le système immunitaire et notamment avoir des propriétés anti-inflammatoires. Des résultats récents laissent entendre que les cellules immunitaires sénescentes pourraient ainsi inhiber l’inflammation aiguë. L’objectif de ce projet est de déterminer si l’induction de la senescence a des effets protecteurs contre l’inflammation aiguë, permettant ainsi de diminuer les dommages tissulaires qui lui sont généralement associés. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des modèles murins ou nous induirons, dans un premier temps l'apparition des CS en exposant nos souris au vaccin anticovid BNT162b2 de Pfizer. Puis, dans un second temps, nous exposerons les souris à des agents biologiques (lipopolysaccharides ou LPS) et physiques (rayonnement gamma) induisant une l’inflammation et des dommages cellulaires. Nous rechercherons ensuite dans les tissus de ces souris des signes de dommages cellulaires issus de l’inflammation aiguë.
Bénéfices attendus
L'inflammation et la détérioration des tissus qui lui est associée est une pathologie grave. Elle peut être causée par plusieurs facteurs, notamment une infection bactérienne ou virale, des maladies auto-immunes, plusieurs maladies associées au vieillissement comme le diabète ou des interventions cliniques comme la radiothérapie. L'inflammation est causée par une réponse incontrôlée ou prolongée du système immunitaire qui finit par produire des lésions tissulaires. Si nous pouvons trouver une nouvelle façon de contrôler ce processus, comme l’induction de cellules immunitaires sénescentes, nous pouvons établir de nouveaux protocoles pour combattre certains des symptômes les plus agressifs de certaines maladies comme l’infection par le SRAS-CoV-2 (covid) ou la septicémie. De plus, cela peut offrir une protection aux personnes qui subissent une radiothérapie pendant un traitement contre le cancer, en évitant les effets secondaires qui en découlent induits par les dommages tissulaires produits par l'irradiation. En outre, les patients atteints d'une maladie auto-immune comme le lupus peuvent être traités pour réduire ou retarder les symptômes de la maladie. En résumé, les bénéfices que la société recevra de ce projet pourraient avoir un impact sur la vie de nombreuses personnes.
Procédures
Injection intraperitoneale (maximum de 2 par souris, necessite quelques secondes), Irradiation (1 seule, necessite quelues minutes).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans la premiere des cinq procédures, sauf l’injection intrapéritonéal nécessaire pour traiter les souris avec le vaccin BNT162b2. En effet, celui-ci a déjà été testé sur différentes espèces animales aux doses indiquées sans compromettre le bien-être animal, et est couramment utilisé sur des patients humains lors d’essais cliniques dans différents pays. Trois procédures nécessiterons des injections IP de lipopolysaccharides. Les LPS sont de puissants agents inflammatoires pouvant notamment induire un choc septique, de la fièvre et une baisse de la pression artérielle. Nous attendons donc à une possible détérioration de l’état sanitaire de la souris entre 15 et 20 heures après l’injection de LPS. Cela pourrait se traduire par une prostration, des tremblements et une apathie de la souris. Afin de pouvoir intervenir rapidement et limiter au maximum leur souffrance si les souris atteignent un point limites, elles seront suivies au moins une fois par heures de 15H à 24H apres le traitement. Deux procédures nécessitant une exposition ont des rayons gamma induiront des symptômes similaires, mais décalé de 24 à 48H dans le temps.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La senescence et le système immunitaire sont des processus impliquant une communication entre de nombreux tissu et organes différents, il est ainsi impossible de mimer leur interaction en culture cellulaire ou a l'aide d'un ordinateur. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux proposés à utiliser au cours de ce projet a été déterminé pour garantir une population représentative permettant d'effectuer une analyse statistique valide.
Raffinement
Ce projet nécessite d’exposer nos modèles animaux à des traitements qui impacteront leur bien-être. Pour limiter au maximum leur souffrance, les souris seront suivies par les expérimentateurs à l’aide de fiches de scores adaptées aux procédures expérimentales qu’elles subiront, et permettant d’identifier précocement les animaux en souffrances. En effet, tant les signes de mal-être que leurs cinétiques d’apparition varieront suivant qu’on injecte des LPS ou qu’on expose les souris a des rayons gamma. Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres (comportement, état général, neuromusculaire, poids) et seront remplies tout au long de l'expérimentation. On notera en particulier un suivi chaque heure dans le cas des injections de LPS entre 15 et 24 heures post-traitement. Un soin particulier sera aussi apporté au suivi de leurs poids : une baisse de poids ≥15% par rapport au poids de la précédente pesée ou de ≥25% par rapport à la pesé avant traitement entraîneront une mise à mort. D'autre part, nous avons prévu un suivi sanitaire journalier par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnelles techniques). Nous nous assurerons que les souris ont un accès ad libitum a l’eau et la nourriture, qu’elles puissent satisfaire les besoins propres à leur espèce (abris pour souris, papier utilisable pour se faire un nid, petit bout de bois à ronger), litière en copeaux de bois. De plus, par souci de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage et conservés intacts.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude exploratoire et innovante avec l’utilisation de modèles murins récents qui n'existent pas chez d'autres espèces. La souris, qui est l'animal le plus largement utilisé en recherche fondamentale, est particulièrement bien connue à tous les niveaux, a un cycle de reproduction court permettant une optimisation dans la sélection des génotypes d’intérêts. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. La sénescence est un phénomène complexe impliquant plusieurs types cellulaires, voire plusieurs organes différents, comme le prouve sa composante immunitaire. Elle correspond à un processus impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, qui nécessite une étude au niveau de l’organisme entier. Les souris seront des adultes de 2 mois.
Antibiorésistance et infections invasives à méningocoques – Étude dans un modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris reçoit une greffe de peau humaine sur le dos sous anesthésie, puis une injection de méningocoques qui déclenche une septicémie, évoluant selon le porteur d'une baisse d'activité vers la prostration puis la mort. Elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées car greffées et infectées, et sont tuées à la fin de chaque procédure. Le porteur décrit son modèle humanisé comme "le seul et unique" reproduisant ces infections chez la souris, pour étudier la résistance de la bactérie aux antibiotiques.
Objectifs
Les infections invasives à méningocoques sont causées par le méningocoque, une bactérie pathogène à Gram-négatif responsable de méningites et de chocs septiques. Ces infections restent malheureusement encore trop souvent létales malgré l’existence d’un traitement antibiotique. En effet, in vitro dans une boite de pétri, la bactérie est très sensible aux antibiotiques. Cependant, in vivo dans le corps humain, cette bactérie résiste aux traitements antibiotiques efficaces in vitro pour des raisons encore inconnues. L’objectif de ce projet est d’étudier les causes de cette antibiorésistance et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la contrer.
Bénéfices attendus
Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoques observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants impliqués dans la mise en place du phénomène de résistance aux antibiotiques • De tester et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrer la résistance aux antibiotiques A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 2 types d’expériences : 1. Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux seront infectés pendant 3, 6 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2. Des expériences d’imagerie intravitale pour l’étude de l’infection via des observations en microscopie réalisée in vivo, chez l’animal anesthésié. À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, les observations seront réalisées pendant une période maximale de 6h00.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilisent des cultures in vitro de cellules humaines infectées, notamment des cultures de cellules endothéliales ou épithéliales, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoques.
Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal… 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille… 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections
Raffinement
Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut SPF (specific pathogen free). Une inspection quotidienne permettra de vérifier qu’il n’y a aucune détérioration de leur état due à une potentielle infection. 30 minutes avant le début de la chirurgie, les animaux sont prémédiqués avec l’injection sous cutanée d’un antalgique et d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés,. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Les animaux sont placés après infection dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Lors des expériences d’exploration par microscopie optique confocale, les animaux reçoivent un traitement préopératoire analgésique 30 min avant le début de l’anesthésie et la chirurgie permettant d’exposer le greffon pour l’observation des vaisseaux humains. Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 3 par cage dans des cages contenant du coton et un igloo. Des points limites sont établis pour chacune des procédures expérimentales et associés à des interventions pour réduire leur impact sur le bien-être animal.
Choix des espèces
Cette étude utilise des souris car le système vasculaire et immunitaire de la souris est proche du système vasculaire et immunitaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.
Impact in vivo d’une ptéridine sur le système immunitaire et musculaire murin
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Jeunes ou âgées, elles reçoivent des injections répétées d'une molécule (une ptéridine), des prélèvements de sang et passent des tests de force et de motricité (grip test, rotarod), pour comprendre le rôle de cette molécule dans le vieillissement du muscle et du système immunitaire. Le porteur signale un stress et une possible inflammation aux points d'injection, ainsi qu'une fatigue transitoire lors des tests. Il décrit l'analyse des muscles comme "indispensable", ce qui rend selon lui la mise à mort de toutes les souris "requise".
Objectifs
Nous assistons à une expansion démographique de la population âgée dont la prise en charge constitue un défi majeur. Le vieillissement s’accompagne d’un syndrome de fragilité, affectant aussi bien le système immunitaire que musculaire qui peut entraîner des fractures de la hanche chez les personnes âgées de plus de 75 ans avec pour conséquences une perte de l’autonomie liée à la non-reprise de la marche, mais surtout une mortalité avoisinant les 30 pour cent dans l’année qui suit l’opération. La fracture de hanche représente un bon modèle de stress aigu, intéressant pour décrire les réponses inflammatoires sur les systèmes immunitaires et musculaires des personnes âgées. Dans ce contexte de stress aigu, le système immunitaire est activé et conduit à la production d’une ptéridine, un marqueur de l’activation immunitaire. Le rôle propre de cette ptéridine n'est pas encore bien décrit dans la littérature. De précédentes études ont montré que cette ptéridine est un biomarqueur prédictif de la mortalité à un an post-fracture et est associée à l'échec de la reprise de la marche. Dans ce projet, le but est de comprendre comment l'inflammation peut avoir un impact sur la capacité de résilience des patients âgés et comprendre les mécanismes d’action de cette ptéridine dont le rôle semble délétère au niveau immunitaire et musculaire. L’impact de cette molécule est regardé in vivo sur des souris jeunes et âgées exposées chroniquement à cette ptéridine. Les niveaux d’inflammation ainsi que les changements phénotypiques et fonctionnels sur les cellules immunitaires et musculaires sont évalués. Le projet vise également à valider que les conséquences délétères potentielles de cette molécule sont réversibles suite au traitement par des anti-inflammatoires, anti-prolifératives et anti-oxydantes.
Bénéfices attendus
Des précédentes études ont montré que cette ptéridine est un biomarqueur prédictif de la mortalité à un an post-fracture et est associée à l'échec de la reprise de la marche. Ce biomarqueur identifie ainsi les patients vulnérables, à plus haut risque de mauvais décours clinique. La compréhension des mécanismes d’action de cette ptéridine dont le rôle semble délétère au niveau immunitaire et musculaire, permettra d’identifier des stratégies thérapeutiques susceptibles d'entrainer une récupération rapide, une meilleure résilience, une qualité de vie optimale et la survie à long terme des personnes âgées confrontées à un événement clinique aigu.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre interventions: 1) L'injection intrapéritonéale de molécules (3 fois par semaine) est une intervention de très courte durée (environ 1 minute) sur des animaux vigiles; 2) Des prélèvements sanguins sont réalisés sur des animaux vigiles (1 fois tous les 15 jours) 3) Des tests fonctionnels pour évaluer la fonction motrice sur des animaux vigiles dont la durée globale est d'environ 15 minutes (1 fois); 4) la mesure de force d’un muscle de la jambe de la souris d’une durée d'environ 15 minutes (1 fois).
Impact sur les animaux
*Dans notre projet, les injections par voie intrapéritonéale réalisées chez la souris peuvent être source de stress physique et de douleur au point d’injection (avec potentiellement un risque d’inflammation). Le prélèvement sanguin peut également être source de stress physique et entraîner une inflammation de courte durée au point de piqûre. Les anesthésies sont susceptibles d’induire un stress thermique. Les grip test et le rotarod peuvent également générer un stress et une fatigue transitoires.*
Devenir
Tous les animaux (n=880) de la procédure sont euthanasiés à la fin de la procédure. L’analyse des muscles est indispensable pour ce projet. L’euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise.
Remplacement
Notre but est d’étudier l’effet d'une ptéridine in vivo sur le système immunitaire et sur la fonction musculaire de la souris au cours du vieillissement. Pour cela, nous utiliserons des souris contrôle C57bl7, jeunes ou âgées. La plupart des analyses concernant l’impact de cette ptéridine sur le système immunitaire ou son effet sur la fonction musculaire ne peuvent pas être reproduites in vitro ni ex vivo, ce qui nécessite l’utilisation des modèles murins. L’analyse du système immunitaire et des muscles de ces souris au cours du vieillissement nous permettra de comprendre l’effet de cette ptéridine. En parallèle, des cultures de cellules musculaires ou prélèvements sanguins seront utilisées pour disséquer les mécanismes sous-jacents. Pour cela d’autres muscles (Gastrocnemius, soleus, etc) ou organes seront prélevés à l’euthanasie pour pouvoir obtenir des cultures primaires murines. Également des prélèvements sanguins seront effectués avant le traitement, deux semaines après et au moment de l'euthanasie.
Réduction
Chaque groupe sera constitué de 15 à 25 animaux pour obtenir des résultats statistiques dans le respect de la règle des 3R. Un maximum de 880 animaux seront utilisés. Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.
Raffinement
Les animaux auront une période d’au moins 7 jours d’acclimatation avant de commencer l’expérimentation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite au réveil des différentes procédures, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour les prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées. A la fin de l'acte, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur ou inconfort. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
Le modèle murin C57BL6 sera utilisé de par la grande homologie avec l’Homme permettant une bonne étude des processus biologiques comme le vieillissement. De plus, la durée de vie relativement courte des souris (environ 2 ans) permet également d’étudier rapidement le vieillissement sur une période de temps raisonnable pour la recherche. Le modèle C57BL6 est utilisé car c’est un modèle accessible et couramment employé pour différentes recherches. Les souris C57BL6 âgées de 3 mois (équivalent à 20-26 ans chez l’Homme) sont considérées « jeunes ». Les souris C57BL6 âgées de 16 à 22 mois (équivalent à 60-80 ans chez l’Homme) sont considérées « âgées ».
Exploration du métabolisme du fer en physiologie et dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires_1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Modèle d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, la maladie de Sanfilippo, 160 d'entre elles reçoivent une injection de fer et l'ensemble subit des prélèvements sanguins avant une euthanasie terminale pour nécropsie. Le porteur indique remplacer quand c'est possible l'animal par des cultures cellulaires, qui restent issues des souris, et affirme que la complexité physiologique du projet ne peut être reproduite in vitro. Il justifie l'espèce par la disponibilité d'une souche mutée et d'outils développés de longue date.
Objectifs
Les héparanes sulfate (HS) sont des sucres complexes. Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des HS provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de sucres partiellement dégradés dans un compartiment cellulaire spécifique; le lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée mucopolysaccharidose de type III. Cette maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux essentiellement dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. La poursuite de l’amélioration de cette approche prometteuse continue et des essais précliniques avec le vecteur sont en cours dans notre équipe. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris. Les dépôts de fer s’accumulent progressivement avec l’âge aussi bien chez les patients que dans le modèle de souris. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose dans la maladie, en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose dans cette maladie et identifier les populations cellulaires touchées dans le contexte de la maladie de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Sanfilippo . A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes de la ferropotose associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précision aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. l'étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
80 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 80 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. Toutes les 368 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanalise réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture). 160 souris vont avoir une injection non douloureuse de fer en solution ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. c'est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
160 souris de ce projet recoivent une injection unique en intrapéritonéale d'une solution tamponnée contenant du fer. L'observation de l'animal en continu dans l'heure qui suit permet de déceller toute anomalie synonyme de douleurs (prostration, changement dans l'aspect de l'animal). Le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement peut détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Il n'est pas attendu d'effets particulier car nous avons une euthanasie de l'animal qui se déroule 7 jours après l'injection de fer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure expérimentale
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui reste issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant. des tests statistiques adaptés seront utilisés. Les résultats avec p
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Pour les injections IP, elles seront réalisées par un personnel compétent et habitué. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animale. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées, etc…), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra l’euthanasie de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborée sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche mutée pour l’enzyme alpha-N acetylglucosaminidase (Naglu) est adaptée pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo B et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux (Ac, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des ages assez précoce qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie + ou- en présence de fer exogène. A 2 mois ces animaux ont les 1er influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Exploration du métabolisme du fer en physiologie et dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires_1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères ou menées sous anesthésie terminale sans réveil. Le porteur indique que 160 d'entre elles reçoivent une injection intrapéritonéale de fer et 80 un prélèvement sanguin à la queue, l'ensemble étant euthanasié pour des nécropsies et des cultures cellulaires. Il décrit peu d'effets attendus de l'injection de fer, l'euthanasie survenant sept jours après. Sur le remplacement, il affirme recourir à des cultures issues des animaux mais conclut que la complexité du cerveau impose pour l'instant le modèle in vivo, en disant surveiller les avancées des organoïdes.
Objectifs
Les héparanes sulfate (HS) sont des sucres complexes. Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des HS provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de sucres partiellement dégradés dans un compartiment cellulaire spécifique; le lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée mucopolysaccharidose de type III. Cette maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux essentiellement dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. La poursuite de l’amélioration de cette approche prometteuse continue et des essais précliniques avec le vecteur sont en cours dans notre équipe. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris. Les dépôts de fer s’accumulent progressivement avec l’âge aussi bien chez les patients que dans le modèle de souris. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose dans la maladie, en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose dans cette maladie et identifier les populations cellulaires touchées dans le contexte de la maladie de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Sanfilippo . A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes de la ferropotose associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précision aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. l'étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
80 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 80 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. Toutes les 368 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanalise réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture). 160 souris vont avoir une injection non douloureuse de fer en solution ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. c'est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
160 souris de ce projet recoivent une injection unique en intrapéritonéale d'une solution tamponnée contenant du fer. L'observation de l'animal en continu dans l'heure qui suit permet de déceller toute anomalie synonyme de douleurs (prostration, changement dans l'aspect de l'animal). Le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement peut détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Il n'est pas attendu d'effets particulier car nous avons une euthanasie de l'animal qui se déroule 7 jours après l'injection de fer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure expérimentale
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui reste issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant. des tests statistiques adaptés seront utilisés. Les résultats avec p
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Pour les injections IP, elles seront réalisées par un personnel compétent et habitué. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animale. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées, etc…), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra l’euthanasie de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborée sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche mutée est adaptée pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo B et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux (Ac, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des ages assez précoce qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie + ou- en présence de fer exogène. A 2 mois ces animaux ont les 1er influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Etude de l’effet de l’augmentation de la quantité de bactéries sur la sensibilité des antibiotiques (effet inoculum), sur Escherichia coli résistantes aux antibiotiques dans un modèle d’infection intraabdominale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
1 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de bactéries provoquant une septicémie, puis des antibiotiques toutes les deux heures, pour tester l'efficacité de nouveaux traitements contre des Escherichia coli ultrarésistantes selon la quantité de bactéries. Le porteur décrit une septicémie apparaissant deux heures après l'inoculation et une surveillance par grille de score déclenchant la mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il affirme que la complexité d'une infection in vivo rend le remplacement par des tubes à essai "non réalisable" et le passage par l'animal "indispensable".
Objectifs
Il est urgent de développer de nouvelles molécules antibiotiques pour lutter contre les bactéries ultrarésistantes. Parmi elles, Escherichia coli (E. coli) est la bactérie la plus fréquemment responsable d’infections urinaires et digestives et d’infections généralisées (septicémies) chez l’homme. Elle est aussi parmi les plus touchées actuellement par la résistance aux antibiotiques, avec parfois plus aucun antibiotique efficace (bactéries ultrarésistantes). De nouveaux antibiotiques ont été très récemment développés et ont montré leur efficacité pour tuer certaines bactéries ultrarésistantes. Ces antibiotiques ont montré leur efficacité au laboratoire dans des tubes à essai contre des souches de E. coli ultrarésistantes, mais chez l’homme, faute de données d’efficacité suffisamment nombreuses et du fait d’échecs de traitement rapportés chez certains malades, ces antibiotiques ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours et lorsque le recours aux autres options disponibles n’est pas envisageable. On dispose actuellement de très peu de travaux de recherche sur l’utilisation de ces nouveaux antibiotiques, notamment peu de choses sur leur efficacité quand il y a une quantité importante de bactéries (appelé « inoculum important »). L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi avant de les tester chez l’homme il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal, en l’occurrence la souris. L’objectif de notre travail est l’analyse de l’efficacité de ces nouveaux antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes (ou inoculum différent) pour s’assurer qu’ils restent efficaces même pour tuer de grandes quantités de bactéries. Nous utilisions pour ces expériences un modèle d’infection intra abdominale de la souris qui provoque une septicémie et avec lequel on peut faire varier la quantité de bactéries. L’efficacité des antibiotiques sera évaluée en termes de survie des animaux infectés et nombre de bactéries présentes apres traitement au niveau de la rate des animaux (qui correspond à ce qui se trouve dans le sang).
Bénéfices attendus
Les résultats de ce travail pourront permettre de mieux définir les conditions de l’utilisation de ses molécules chez l’Homme et comprendre pourquoi parfois elles ne marchent pas.
Procédures
Les souris seront infectées par une injection dans le ventre (intra péritonéale) à l'aide d'une aiguille fine de 250μL contenant un mélange de bactéries sur animal vivant non anesthésié (durée du geste environ 5 secondes) et traitées par antibiotiques par une injection sous la peau du cou de 0,2mL toutes les deux heures (durée du geste 5 secondes). Elles seront surveillées de façon très rapproché puis euthanasiées si elles montrent le moindre signe de souffrance avant la fin de l'expérimentation. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur souris vivante. Un prélèvement stérile de liquide péritonéal (2mL) et de la rate seront réalisés après euthanasie de la souris. Un prélèvement sanguin (2mL) par ponction intra-cardiaque sera également réalisé après l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Ce modèle représente un modèle de sévérité modérée d’infection péritonéale bactérienne avec septicémie qui apparait à partir de 2h après l’inoculation bactérienne. Aucune douleur n’est à attendre, en revanche les souris peuvent être stressées, avec des signes tels que les poils hérissés et une fatigue.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de l'experimentation ou avant en cas d'atteinte d'un point limite pour limiter au maximum des souffrances inutiles. La durée totale est de 30h au maximum (2h infection + 24h traitement + 4h post traitement). Tous les animaux seront mis à mort, car nous aurons à faire des prélèvements des organes et du sang, qui ne peut se faire sur animal vivant.
Remplacement
L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi, avant de les tester chez l’homme, il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal. En effet, la complexité d'une infection in vivo rend pour l’instant le remplacement de ce modèle expérimental par des modèles in vitro (tube à essai) non réalisable.
Réduction
De nombreuses analyses seront réalisées en amont pour réduire les conditions testées et les animaux utilisés. Les analyses déjà réalisées au sein de l’équipe seront une base pour cibler les doses des traitements antibiotiques nécessaires, permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutes les molécules testées sont des antibiotiques. Pour le cefiderocol, une étude de dose (pharmacocinétique) sera nécessaire car cette molécule n’a jamais été utilisée dans le modèle ; en revanche pour l’avibactam et aztreonam l’étude a déjà été réalisée dans notre laboratoire et ne sera donc pas refaite, pour limiter le nombre de souris utilisées. Des souris dites "contrôles", c'est a dire traitées avec des antibiotiques dont on sait qu'ils sont efficaces, seront utilisées, mais ces contrôles ne seront pas répétés à chaque experimentation pour limiter le nombre de souris utilisées. Les organes (rate, liquide péritonéal) seront congelés et conservés à -80°C pour permettre une analyse ultérieure en cas de besoin sans devoir recourir à nouveau à l'expérimentation chez la souris.
Raffinement
En ce qui concerne le raffinement, il sera obtenu grâce au respect d’un délai d’au moins 72h entre l’arrivée des souris au laboratoire et le début de l’expérimentation animale, le respect des conditions optimales d’hébergement des souris en animalerie en portoirs ventilés, c'est à dire en cages adaptées bien ventilées (5 souris par cage) et la surveillance des animaux toutes les 2 heures pendant toute l’expérimentation, avec accès facile à l’eau et à la nourriture. L’apparition de signes chez l’animal de souffrance avec un score de points limites sera surveillée de près. Les délais entre l’infection par les bactéries et le traitement antibiotique sont réduits à deux heures pour limiter le risque de souffrance. L’euthanasie sera programmée 4h après la fin du traitement antibiotique qui dure 24 h, sans attendre de décès spontané, ou avant si des signes de souffrance apparaissent (torpeur, poil hérissé ...). Un score de points a été établi, prenant en compte 3 paramètres, avec à chaque fois une gradation de 0 à 4: la posture normale voutée, voutée+ et voutée ++, la mobilité: normale, altérée, altérée + et prostrée et le poils: sans atteinte, hérissés, hérissés + et hérissés ++. Le point limite est atteint si la somme des points est > ou = à 6 ou si le score de 3 est atteint pour la mobilité ou la posture. En cas d’atteinte du point limite, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection intrapéritonéale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection intra-péritonéale. Les souris utilisées ont 8 semaines (environ 25 grammes). Ce sont des animaux adultes pour utiliser des souris de poids suffisant.
Rôle de la clusterine dans une modèle murin de syndrome hémolytique urémique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une toxine bactérienne reproduisant le syndrome hémolytique urémique, ainsi que des prises de sang répétées, pour tester une molécule censée améliorer la survie. Le porteur décrit une asthénie, une diarrhée et des tremblements marquant le point limite, et s'appuie sur l'article 14 de la directive pour réaliser certaines injections sans anesthésie. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable", cette pathologie systémique ne pouvant s'étudier sur un modèle uniquement cellulaire.
Objectifs
Le syndrome hémolytique urémique (SHU) est une maladie infectieuse grave le plus souvent d’origine alimentaire. Elle est une forme de microangiopathies thrombotiques (MAT), un ensemble de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. Chez l’enfant, ce syndrome est le plus souvent causé par une infection due à une bactérie appartenant à la famille des Escherichia coli (E. coli) producteurs de toxines, appelées les Shiga-toxines (STx1 et 2). Ces toxines entraînent l’inflammation et la mort cellulaire massive. Le traitement de première intention repose sur les échanges plasmatiques. Actuellement, il n’existe pas d’options thérapeutiques ayant fait leurs preuves pour le traitement d’un SHU autres que des soins supports. La mise au point d’une véritable thérapie afin de traiter le SHU est nécessaire et primordiale afin de diminuer la mortalité et la morbidité. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires : le déficit en CLU était associé à une mortalité accrue et la supplémentation en CLU a amélioré la survie des souris. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de la CLU dans la physiopathologie du SHU et son rôle protecteur potentiel afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.
Bénéfices attendus
Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance renale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.
Procédures
1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner 182 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 3/ L’Injection intra veineuse est utilisée dans 2 procédures du projet. Elle concerne 116 animaux, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.
Impact sur les animaux
L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. A une dose plus importante de Stx-2, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie, selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.
Réduction
Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (244) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront agées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.
Caractérisation du rôle neuroprotecteur des cavéolines dans les atteintes consécutives à un traumatisme crânien léger chez la souris juvénile.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance, elles reçoivent une injection dans le cerveau, puis subissent à 21 jours un traumatisme crânien provoqué par un impact sous anesthésie, suivi de séries de tests comportementaux et d'IRM, avant d'être tuées par perfusion d'un fixateur. Le porteur présente ce modèle comme reproduisant un traumatisme crânien pédiatrique et renvoie les retombées thérapeutiques à un potentiel futur. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ou informatique" ne permet cette étude et que le projet "ne peut pas se passer de l'expérimentation animale".
Objectifs
Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place au sein du cerveau à la suite d'un traumatisme crânien léger et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Ce projet unique va explorer le potentiel thérapeutique d’une protéine d’intérêt, la cavéoline, en étudiant son rôle protecteur dans le cerveau. Notre équipe utilisera un modèle léger de traumatisme crânien chez la souris, nous permettant d'étudier sur le long cours, à l'aide de tests comportementaux et d'outils d'imagerie innovants, les processus induits sur le système nerveux central avec une définition encore inaccessible chez l'homme. Ces processus chroniques seront étudiés par l’utilisation de souris ayant reçu une injection permettant l’augmentation de notre protéine d’intérêt. Suite à l’induction du traumatisme crânien, ces animaux seront soumis à une évaluation comportementale permettant d’évaluer leurs capacités locomotrices, leur niveau d’anxiété et leur mémoire et nous réaliserons également un suivi au cours du développement par imagerie IRM. Notre étude sur le rôle de cette protéine d’intérêt pourrait nous permettre d’établir la pertinence de cette protéine dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 (CAVéoline-1) représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.
Procédures
1. injection unique dans le cerveau le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. Réalisé une seule fois. 2. trauma crânien léger juvénile (TC): 21 jours après leur naissance, les animaux subiront une anesthésie générale courte (5 minutes) pendant laquelle il recevront un impact léger au niveau du crâne. Animaux contrôles soumis uniquement à l’anesthésie générale. Réalisé une seule fois. 3. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes, 2 tests de coordination motrice d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux de 5 minutes et 2 tests d’apprentissage spatial qui nécessitent des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale s’étalera sur 2 semaines, avec 11 jours où l’animal sera testé sur une durée de 5 min par jour. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers, un jour après le dernier test comportemental. 5. Fixation du tissu cérébral. Anesthésie générale profonde et adaptée. Perfusion d’un fixateur pendant 5 minutes jusqu’à l’arrêt du cœur. Prélèvement des tissus.
Impact sur les animaux
Notre modèle repose sur une injection dans le cerveau à la naissance sous anesthésie très courte. Ce geste peut entraîner une réduction de la température du corps ou un retard de croissance. De plus, nous utiliserons un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Les conséquences possibles incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Chaque série comportementale peut entraîner du stress et de la fatigue. L’anesthésie réalisée lors de l’imagerie par IRM peut aussi entraîner une dépression respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 348 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.
Remplacement
Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.
Réduction
Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes lors des tests comportementaux / IRM.
Raffinement
Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie et d'analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés.
Choix des espèces
Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.