Éthologie / comportement / biologie animale
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Etude de la vulnérabilité aux maladies psychiatriques chez un modèle murin hypocholinergique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Quinze minutes d'observation par jour pendant trois semaines sous pulvérisations de spray sucré, dix injections intrapéritonéales en dix jours, une restriction alimentaire faisant perdre jusqu'à 25 % du poids : 1 000 souris vont être utilisées, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 664 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter un virus et implanter des fibres. Le porteur cherche à provoquer des comportements compulsifs, toilettage excessif, anorexie d'activité sur roue, effets de substances psychoactives, chez une lignée porteuse d'un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques. Il affirme que l'absence de méthodes alternatives l'"oblige" à recourir à ces modèles murins, et ne dit rien de ce qu'un comportement de souris permet de conclure sur un trouble psychiatrique humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux mécanismes communs sous jacents aux maladies psychiatriques. Les comportements habituels persistants et la compulsion sont considérés comme des caractéristiques communes à plusieurs pathologies telles que les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles liés à la consommation de substances et les troubles du comportement alimentaire. L’identification d’un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques constitue un atout pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux pouvant être à l’origine de ces désordres psychiatriques à composante compulsive sur un modèle murin. Les objectifs de ce projet sont 1) identifier la vulnérabilité aux compulsions de ce modèle murin, 2) comprendre comment ce variant module l’activité de certaines régions cérébrales au cours de la mise en place de ces comportements compulsifs et 3) identifier des stratégies thérapeutiques pharmacologiques pour rétablir un comportement normal chez ce modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de maladies psychiatriques à composante compulsive. A l’heure actuelle très peu de données permettent d’y voir clair et d’envisager une thérapie visant à empêcher voir réduire la sévérité de ces pathologies pour certaines mortelles. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet ainsi que d’approfondir nos connaissances sur ces pathologies psychiatriques. Nos travaux identifieront des facteurs et des processus qui permettront par la suite d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre ces maladies dévastatrices.
Procédures
Six procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des désordres compulsifs. En utilisant des modèles murins nous évaluerons l’efficacité d’un traitement pharmacologique sur le rétablissement d’un comportement normal. Un premier aspect consistera à s’intéresser à la mise en place comportementale de la compulsion en étudiant le toilettage compulsif chez les animaux (procédures 1 et 4) à travers l’exposition et l’analyse comportementale des animaux exposés à des pulvérisation de spray sucrée sur le pelage (15 min d’observation quotidienne durant 3 semaines max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (10 injections max à raison 1 fois par jour pendant 10 jours–quelques secondes). Nous nous intéresserons ensuite à la compulsion observée lors de la mise en place de troubles du comportement alimentaire (procédures 2 et 5). Les animaux seront individualisés, exposés à une roue d’activité (libre accès dans la cage durant 3 semaines environ) et l’apport en aliment sera contrôlé (sur une période de 10 jours max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (7 injections max à raison 1 fois par jour pendant 7 jours max–quelques secondes). Enfin, nous nous intéresserons aux effets après administration ou non de substances psychoactives (procédure 3) délivrées quotidiennement en intrapéritonéale (1 injection par jour durant 6 jours – quelques secondes) et leur comportement sera enregistré avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale en amont (6 injections maxi à raison 1 fois par jour pendant 6 jours–quelques secondes). Les procédures 4 et 5 incluront une unique chirurgie au niveau cérébral qui se déroulera avant la mise en place des comportements de compulsion. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie permettra de pouvoir suivre les modifications neurobiologiques. Enfin, la procédure 6, inclura une chirurgie au niveau cérébral permettant d’administrer des vecteurs viraux permettant de modéliser différents modèles. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite exposés aux 2 types de compulsions (toilettage et alimentaire) de manière successive avec un temps de repos entre les deux. Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.
Impact sur les animaux
1/ La mise en place de la compulsion de toilettage peut entrainer un stress ou une anxiété chez les animaux (perte de poids 5-1 pourcents) 2/ L’isolement peut entraîner un stress et une souffrance chez les les animaux 3/ L’ABA nécessitant une restriction alimentaire progressive entraine une perte de poids conséquente chez l’animal après plusieurs jours (5-25 poucents) 4/ L’injection ip peut entraîner une douleur légère au point de piqure 5/ Les chirurgies stéréotaxiques (injections de virus et implantation de fibres) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures 6/ Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardio-respiratoire
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des désordres psychiatriques que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces pathologies. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des comportements compulsifs (de toilettage, du comportement alimentaire et de l’addiction) nous oblige à utiliser les modèles murins proposés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1000 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard sur le plateau de phénotypage. Sauf procédure expérimentale le nécessitant, les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis durant l'ensemble de la procédure. A minima, une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent se battre et se blesser ; elles sont, dans ces cas, prises en charge immédiatement avec l’avis du comité de bien être animal et/ou du vétérinaire-référent de notre établissement utilisateur. Nous avons défini des points limites pour toutes les procédures. Si ces points limites sont atteints, nous consultons notre vétérinaire référent pour décider du devenir des souris.
Choix des espèces
Notre projet est basé sur l’étude d’un variant identifié chez des patients humains. L’expression de celui-ci chez la souris est indispensable pour mieux comprendre la vulnérabilité qu’il confère aux humains envers diverses maladies psychiatriques. Ainsi, le modèle souris constitue un atout pour développer efficacement notre projet. L’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et leurs conséquences sur le comportement. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les dysfonctionnement cérébraux opérants dans la mise en place des comportements compulsifs. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Nos études sur la mise en place des compulsions dans les maladies psychiatriques seront importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de celles-ci mais permettront également d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de comportements compulsifs se focalisent pour le moment chez l’adulte.
Campagnes Sturat. Suivi de la fraction estuarienne de la population soutenue d’esturgeons européens et des espèces piscicoles du milieu (Avenant)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 9000
Remis à l'eau sur leur lieu de capture, 9 070 des 9 200 poissons annoncés dans ce projet sont déclarés rendus vivants au milieu, l'écart de 130 individus restant sans explication dans le résumé. Les procédures impliquent un niveau de souffrance légère pour 9 150 poissons et modéré pour 50 d'entre eux, capturés par 126 traits de chalut de fond de trente minutes par an. Les esturgeons européens, espèce en danger critique d'extinction, sont anesthésiés puis marqués par pit-tag intramusculaire et marque transmusculaire, biopsiés à la nageoire, échographiés, photographiés et, pour 70 à 75 % d'entre eux, soumis à un lavage gastrique provoquant des spasmes pour faire régurgiter leur contenu stomacal. Le porteur estime à une cinquantaine par an les esturgeons capturés et juge cet effectif "raisonnable pour une espèce en danger critique".
Objectifs
Le projet consiste à réaliser un suivi des populations de poissons en milieu estuarien et plus particulièrement, celui d’une espèce de poisson en danger critique d’extinction, qui a bénéficié d’un plan de sauvegarde national et de soutiens via des programmes européens, l’esturgeon européen. Ces mesures ont permis de maîtriser la reproduction en captivité de ce dernier et de lâcher dans le milieu naturel des juvéniles issus de ces reproductions pour soutenir la population sauvage. Afin de connaître l’évolution de cette nouvelle population dans son milieu naturel et d’évaluer le succès de ces pratiques de repeuplement, un suivi régulier doit être mis en place. Celui-ci sera réalisé dans le milieu estuarien puisque c’est là que ces poissons vont séjourner plusieurs années avant de partir grossir en mer et de revenir en estuaire pour entamer leur migration de reproduction jusqu’aux frayères fluviales. Les possibilités de trouver des individus seront donc beaucoup plus importantes dans ces endroits qu’en pleine mer. L’espèce ayant décliné avant l’acquisition de connaissances la concernant, il est nécessaire de mieux documenter son écologie en milieu naturel (régime alimentaire, croissance, structure en âge, préférences environnementales, migrations). Lors de précédentes campagnes d’échantillonnage, une procédure-pilote de marquage et de monitoring de quelques spécimens par marque satellite a permis de documenter pour la première fois leur comportement en mer ainsi que leurs migrations entre l’estuaire et la mer. Depuis ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves (déclarations de pêcheurs professionnels), mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle à ce jour. Mis à part la description de sites de frayères historiques potentiels, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Pour l’étudier, nous nous proposons de remplacer la procédure de marquage satellite par des marquages acoustiques chez quelques grands spécimens, ce qui permettra de suivre par télémétrie leurs trajectoires pour la reproduction jusque dans les fleuves.
Bénéfices attendus
L’esturgeon européen (A. sturio) ayant décliné avant l’acquisition de connaissances, il est important de mieux documenter son écologie en milieu naturel. Ce projet permettra la collecte de données sur les régimes alimentaires, structures en âge des populations, croissance, préférences environnementales, migrations. Outre leur intérêt fondamental, les résultats informeront sur l’évolution, dans son milieu, de cette population soutenue et permettront d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement. Suite au repeuplement dans le bassin versant de plus de 1.7 M de juvéniles d’esturgeon européen entre 2007 et 2015, les individus sont actuellement en âge de se reproduire. Durant les campagnes d’échantillonnages précédentes, le marquage de grands spécimens avec des marques satellites a documenté pour la 1ère fois leur comportement en mer et leurs migrations trophiques entre l’estuaire et la mer. Cette procédure-pilote s’est avérée très informative. La modélisation des données est en cours pour reconstituer les trajectoires maritimes a posteriori ; les 1ers résultats sont encourageants mais nécessitent une analyse approfondie avant d’envisager la pose de nouvelles marques satellites. Ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves par des pêcheurs professionnels, mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle. Nous supposons qu’il s’agissait d’individus mâles en exploration et qu’il n’y a pas encore eu de remontée d’individus femelles. Excepté la description de frayères historiques potentielles suite aux concentrations d’individus observées par le passé, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Le marquage par télémétrie acoustique d’une dizaine d’autres grands spécimens entre septembre 2024 et juin 2025 permettra de suivre en continu sur les prochaines années leurs trajectoires jusqu’aux fleuves. Grâce au monitoring dans les fleuves et à l’embouchure de l’estuaire, nous disposerons d’informations sur la migration de reproduction et le retour en mer des individus (trajets, périodes, vitesses). L’intérêt est l’obtention de données individuelles 1/ complémentaires, indépendantes des captures accidentelles déclarées sur la base du volontariat car l’espèce est protégée, 2/ sans avoir besoin de recapturer le poisson et 3/ sur le long terme (jusqu’à 6 ans), certains individus pouvant se reproduire chaque année ou tous les deux ans.
Procédures
Tous les 2 mois (6 campagnes/an), un échantillonnage piscicole par chalutage de fond est réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’A. sturio ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître les autres populations de poissons présentes pour identifier les interactions possibles. Par campagne sont réalisés 21 traits de chalut, d’une durée de 30 min. A chaque trait, toutes les espèces présentes sont identifiées le plus rapidement possible, en les maintenant humides ou immergées (viviers), puis relâchés sur le lieu de capture. S’il s’agit d’A. sturio, on renseigne leur nombre, longueur, poids, état et numéro des marques d’identification s’ils en sont déjà dotés au moment de la capture. Si ce n’est pas le cas, les individus sont marqués pour identification (Pit-tag interne et marque numérotée externe) et de petits morceaux de nageoire sont prélevés pour réaliser des analyses génétiques (origine repeuplement ou sauvage) et isotopiques (utilisation des habitats) et estimer leur âge (durée de ces marquages et prélèvements : 2 à 3 min). En fonction de leur état, on réalise une échographie (maturité, sexage), une photographie (morphologie générale) et un lavage gastrique (exploration du régime alimentaire) (durée totale de ces 3 manipulations moins de 10 min). S’ils ont un poids suffisant, une marque à mémoire externe enregistrant température, oxygène et salinité du milieu est fixée à la base des écussons dorsaux pour documenter leurs préférences environnementales (moins de 5 min pour la pose de cette marque). Les plus gros spécimens sont aussi dotés d’une marque acoustique pour suivre leurs trajectoires, posée en interne (cavité abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) selon la date de capture et l’avancée présupposée de la maturation (environ 5 min pour cette manipulation). Pour toutes les manipulations, les esturgeons européens sont anesthésiés.
Impact sur les animaux
Ces effets sont liés au stress de capture, voire de stabulation et biométrie (confinement, émersion). La durée de chalutage est de 30 min pour limiter les blessures des poissons prélevés. Les esturgeons européens peuvent aussi subir du stress et/ou blessures occasionnés par les actes expérimentaux successifs suivants : 1) marquage individuel (Pit-tag en intramusculaire et marque numérotée en transmusculaire) et 2) prélèvements de tissus de nageoires, qui peuvent entrainer des blessures tissulaires de type plaie cutanée, mais qui ne sont pratiqués que si nécessaire (i.e. individu échantillonné pour la 1ère fois) ; 3) échographie (état de maturité, sexage) et photographie (morphologie générale), qui bien que non invasives, ne sont opérées qu’en fonction de l’état du poisson ; 4) lavage gastrique provoquant des spasmes transitoires facilitant la régurgitation du bol alimentaire, fait seulement si l’individu est en bon état ; 5) selon sa taille, pose d’une marque DST externe (fixée à la base des écussons dorsaux pour éviter d’endommager la musculature) et 6) pour les plus gros poissons, pose d’une marque acoustique interne (intra-abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) si l’individu est en période de reproduction et auquel cas, il n’est pas doté d’une DST.
Devenir
Etant donné que le projet porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire et notamment sur le suivi, dans son milieu, de la population soutenue d’esturgeon européen, l’objectif de l’étude ne peut pas être atteint en dehors du milieu naturel. A l’issue des procédures, les poissons sont remis en liberté dans leur secteur de capture, ce qui est couvert par une autorisation préfectorale. Les esturgeons européens sont traités à part en priorité (biométrie, échographie, marquage d’identification, prélèvements tissulaires et lavage gastrique). Ils sont ensuite conservés en vie. Ceux dont l’état ou la taille ne permet pas un marquage supplémentaire (avec marque à mémoire et/ou marque acoustique), seront remis à l’eau rapidement sur leur lieu de capture. Il en sera de même pour les plus gros individus qui auront été marqués. De par l’objectif de l’étude, il est nécessaire de relâcher les esturgeons européens marqués au niveau de leur secteur de capture afin d’étudier la population en milieu naturel. La décision du moment du lâcher est prise par les intervenants qui sont formés à l’expérimentation animale et à la pratique de la chirurgie expérimentale. Ce moment sera fonction de l’état du poisson au réveil (reprise d’un comportement de nage normal). Nous bénéficions de toutes les autorisations réglementaires pour impliquer dans ce projet cette espèce d’esturgeon qui est protégée.
Remplacement
Aucun remplacement des poissons étudiés ne peut être effectué puisque les données recherchées ne peuvent être fournies que par les espèces elles-mêmes vivant dans le milieu naturel. Comme indiqué précédemment, afin de connaître l’évolution, dans son milieu, de la population soutenue d’A. sturio et d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement mises en place dans le cadre du PNA, un suivi régulier doit être réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’esturgeons européens ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître également les autres populations de poissons présentes dans l’estuaire pour identifier les interactions possibles. Par conséquent, pour réaliser le suivi des populations piscicoles estuariennes et en particulier, de l’état de la population soutenue d’esturgeons européens, il est nécessaire de capturer les poissons pour pouvoir les dénombrer (estimer les abondances), les mesurer, les marquer (suivi individuel de croissance), les équiper de marques spécifiques (étude des déplacements et des préférences environnementales).
Réduction
D’après les échantillonnages historiques, on peut s’attendre à capturer en moyenne une cinquantaine d’esturgeons européens par an au grand maximum. Tous seront marqués individuellement pour identification afin d’avoir un suivi le plus exhaustif possible de la population. En effet, étant donné la faible abondance de l’espèce (soutien de population) et de l’effort de capture ciblant l’espèce relativement faible (campagnes bimestrielles en estuaire, captures accidentelles par des pêcheurs), le taux de recapture attendu est faible (150 cm pour les marquages acoustiques de géniteurs). Cela représente sur l’année environ 10-15 individus marqués avec une DST dont une dizaine par acoustique. Les effectifs capturés dans l’estuaire peuvent varier d’une année à l’autre en fonction notamment des actions de repeuplement. D’après nos estimations, l’effectif envisagé correspond en moyenne, à l’échelle de l’année, au nombre d’animaux qui ont un poids supérieur au poids minimal requis pour le marquage sur le maximum d’individus possible, et il peut être considéré comme raisonnable pour une espèce en danger critique telle que l’esturgeon européen.
Raffinement
- 21 traits de chalut de fond par campagne (soit 126 traits/an) sont effectués dans des secteurs médian et aval chalutables de l’estuaire en suivant 2 grilles d’échantillonnages légèrement décalées alternativement d’une campagne à l’autre. Cela représente environ 1 % de la surface totale de l’estuaire subtidal (i.e. les secteurs non soumis au marnage), soit un impact sur le fond de l’estuaire qui nous parait négligeable sachant que ce dernier est par ailleurs soumis à des dragages réguliers et importants pour les besoins de la navigation. - La durée de chalutage de 30 min est fixée sur la base d’échantillonnages historiques qui mettaient en évidence qu’elle limitait les blessures des poissons prélevés. A la remontée du chalut, les poissons sont réceptionnés sur un matelas, et transférés dans un ou des viviers alimentés en circuit ouvert. - Quelle que soit l’intervention, l’A. sturio est anesthésié au préalable pour limiter stress et douleur (les dosages du produit anesthésiant sont adaptés à sa taille et au type d’intervention). Durant les manipulations, il est immergé, ou alimenté, via un tuyau, d’anesthésique à dose sédative ou arrosé d’eau claire de l’estuaire (maintien humidité cutanée). L’ensemble est réalisé avec le plus grand soin par des intervenants ayant une bonne expérience de ces pratiques et parfaitement conscients de la fragilité de l’espèce. Après son réveil dans un vivier alimenté en eau courante de l’estuaire bien oxygénée et sa reprise d’un comportement de nage normal, l’A. sturio est relâché sur le lieu de capture à l’aide d’un toboggan. Les procédures seront adaptées à la situation : réduction si l’individu est blessé ou maigre et/ou s’il y a beaucoup d’individus, pas de lavage gastrique chez ceux marqués par acoustique.
Choix des espèces
- Etant donné que l’étude porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire, l’ensemble des espèces capturées sont identifiées et traitées. En plus des esturgeons européens (Acipenser sturio), on s’attend à capturer en majorité les espèces suivantes : mulet-porc (Chelon ramada), maigre (Argyrosomus regius), anguille européenne (Anguilla anguilla), bar franc (Dicentrarchus labrax) et bar moucheté (Dicentrarchus punctatus), flet (Platichthys flesus), merlan (Merlangius melangus), sole (Solea solea), sprat (Sprattus sprattus), anchois (Engraulis encrasicolus), gobies (Pomatoschistus spp.), raie bouclée (Raja clavata), alose feinte (Alosa fallax) et grande alose (Alosa alosa), congre (Conger conger), lamproie marine (Petromyzon marinus), ainsi que 2 espèces d’esturgeons exotiques suite à des échappements de piscicultures : l’esturgeon sibérien (Acipenser baeri) et l’osciètre (Acipenser gueldenstaedti). - En fonction des espèces capturées et de la saison, il s’agira de poissons de stades juvéniles ou adultes. Pour l’esturgeon européen, il s’agira de juvéniles de plus d’un an. Il est également possible que des adultes en migration de reproduction (âge> 12 ans) soient capturés.
Suivi longitudinal à long terme d’une espèce de mammifère sociale : la marmotte Alpine
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Piégées au sol, transportées dans un sac, puis anesthésiées de dix à trente minutes, 650 marmottes alpines subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À la première capture de leur vie, elles reçoivent un transpondeur et des marques auriculaires et subissent un prélèvement de peau, puis chaque année des prélèvements de poils, de sang et, pour les mâles matures, de sperme obtenu par électrostimulation en dix à vingt minutes. Le porteur signale un risque d'hyperthermie potentiellement fatale quand un animal reste piégé trop longtemps par forte chaleur, sur un site où aucun arbre ne fait de l'ombre, et le compense par des ombrelles posées sur les cages et de l'eau versée sur l'animal. Toutes sont relâchées près de leur terrier après environ deux heures, avec le risque, pour une marmotte dominante trop longtemps absente, qu'un rival ait pris son territoire et tué les marmottons.
Objectifs
Les suivis à long-termes de populations d’animaux sauvages constituent aujourd’hui une ressource scientifique précieuse pour répondre à de nombreuses questions concernant l’écologie et la biologie évolutive. L’objectif du présent programme de recherche est la perpétuation d’un suivi démographique, phénotypique, génétique, physiologique d’une population de marmotte Alpine (Marmota marmota). La marmotte Alpine est une espèce sociale, à reproduction despotique (seul le couple dominant se reproduit) et hibernante. Ces caractéristiques biologiques en font une espèce modèle originale pour les mammifères et, de manière plus générale, pour les espèces qui vivent en groupes structurés et stables. Nous souhaitons mieux comprendre le rôle de la vie en groupe et de la socialité sur l’écologie des populations et de mettre en évidence la manière dont la variabilité environnementale (par exemple les changements globaux) affecte le rapport coût – bénéfice de la vie en groupe. Nous étudierons également les variations de la sex-ratio des jeunes en réponses aux changements globaux. Cela passe notamment par une quantification de la variabilité inter- et intra-individuelle de la proportion relative de spermatozoïdes avec un chromosome Y versus X.
Bénéfices attendus
Nous testerons l’hypothèse que les changements climatiques ont des répercussions majeures sur la socialité des individus, qui deviennent en quelque sorte plus égoïstes, en préférant quitter le groupe de naissance que de rester et aider à l’élevage des marmottons frères et sœurs. Les résultats attendus auront des implications pour les autres espèces sociales, y compris l’homme face aux changements globaux. Enfin, déjà fragilisée par le changement climatique, la marmotte Alpine est chassée à l’automne dans certains départements du sud-est de la France. La chasse à la marmotte semble assez marginale, mais les effets négatifs du changement climatique pourraient pousser nos décideurs politiques à en interdire la pratique. Notre projet apportera une meilleure compréhension du rôle des pères dans l’allocation selon les sexes en comparant la proportion de spermatozoïdes avec un chromosome X versus Y. La recherche sur l’allocation selon les sexes s'est concentrée jusqu’ici presque exclusivement sur le rôle de la mère alors que les parents peuvent avoir des intérêts divergents. Quelques études récentes ont montré une proportion déséquilibrée des chromosomes sexuels X et Y dans les échantillons de sperme de bovins domestiques et dans les populations humaines affectées par des polluants, ce qui rend difficile l’extrapolation des résultats à des populations sauvages comme la marmotte alpine. L’importance du rôle des pères reste à démontrer, mais ses multiples implications potentielles pour l’évolution de l’allocation selon les sexes et les conflits parentaux invitent à un surcroît d’attention.
Procédures
L’ensemble de ces prélèvements est réalisé après induction d’une anesthésie générale (~ de10 à 30 minutes): - Prélèvements de tissu cutané, injection d’un transpondeur et pose de marques auriculaires lors de la première capture dans la vie de l’animal (10 minutes) ; - Prélèvements de poils à chaque première capture de l’année (1 minute) ; - Prélèvements sanguins à chaque première capture de l’année (de 1 à 5 minutes) ; - Prélèvement de sperme chez les mâles sexuellement matures à chaque première capture de l’année (de 10 à 20 minutes) ;
Impact sur les animaux
Les principales sources de nuisance identifiées pour les marmottes sont (i) les risques de blessures superficielles, de traumatologie et le stress thermique causé par la capture (phase d’attente dans le piège puis transfert dans le sac de transport) ; La marmotte étant une espèce thermosensible avec une thermorégulation comportementale marquée (refuge dans le terrier), il existe un risque d’hyperthermie potentiellement fatal lorsqu’un animal reste piégé pendant trop longtemps lors des épisodes de forte chaleur (note : il n’y a aucun arbre sur le site d’étude). (ii) douleur et stress lors des mesures biométriques et lors des prélèvements biologiques ; (iii) le risque de déstructuration sociale par la prise de pouvoir sur un territoire par des rivaux lors de la capture d’un individu dominant. Un changement de dominance par un animal transient ou d’un territoire voisin, change la composition du groupe et induit souvent un infanticide des marmottons.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie et relâchés dans leur milieu de vie après la procédure à proximité immédiate du terrier où ils ont été capturés.
Remplacement
Notre programme de recherche sur la marmotte Alpine repose en grande partie sur l’étude des réponses individuelles et populationnelles aux variations des conditions environnementales d’origine diverse (ex : climat, phénologie de la végétation, socialité). Ces réponses sont étudiées aux niveaux comportemental, physiologique et démographique. Notre étude s’inscrit dans la lignée des suivis à long termes en écologie évolutive qui repose sur le suivi le plus long et plus exhaustif des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Les populations de marmottes en captivité (par exemple en zoo) ne constituent pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur la démographie et les processus évolutifs. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Notre protocole a été réfléchi de sorte que toutes les quantités de tissus prélevées soient utilisées pour répondre à nos problématiques de recherche. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas anticiper de manière précise la quantité que nous allons collecter), les échantillons supplémentaires seront mis à disposition de notre réseau de collaboration et participent ainsi à du “remplacement” pour des projets futurs.
Réduction
Chaque année, 30 familles de marmottes Alpines sont suivies, correspondant ainsi à environ à 250 individus capturés. Ce nombre de 30 est le nombre minimal permettant d’approximer la distribution réelle de traits quantifiés dans la population par la loi normale et ainsi utiliser les outils statistiques appropriés. D’autre part, étant donnée les forts effets structurant de l’âge dans les paramètres démographiques des espèces à longue durée de vie, la description de la dynamique des populations nécessite des tailles d’échantillon substantielles d’animaux d’âge connu (donc suivis de la naissance à la mort) afin d’estimer les paramètres démographiques (survie, reproduction, dispersion). Le suivi longitudinal des animaux nous permet d’avoir des mesures répétées pour les individus et contribue ainsi à limiter le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats interprétables et fiables.
Raffinement
Nous réduisons les risques d’hyperthermie en plaçant des « ombrelles » sur le dessus des cages à pièges qui recouvrent environ la moitié de leur longueur, offrant une zone ombragée pour l’animal le temps qu’un membre de l’équipe arrive sur place. Des bouteilles d’eau sont prévues pour arroser légèrement l’animal pendant le transport quand la température de l’air est 27°C, et une vérification des pièges est faite systématiquement toutes les 30 minutes de 07:00 à 21:30, une plage horaire qui couvre l’activité journalière des marmottes. Le stress lié à la manipulation et à la contention est atténué car les animaux sont anesthésiés avant que les prises de mesures, d’échantillonnage des tissus et le marquage débutent. Les manipulations sous anesthésie sont effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié et le plus silencieusement possible. La durée totale entre la capture et le relâcher est en moyenne de 2 heures incluant 20 minutes de contention et de manipulation en dehors du sac de capture, mais il existe une forte variabilité individuelle dans le temps de réveil. Un temps de réveil long est risqué pour un dominant car pendant son absence un animal transient ou voisin peut tenter de prendre le contrôle de son territoire en tuant notamment les marmottons. Bien que nous limitions ce risque en plaçant un effaroucheur ou une personne sur le territoire le temps de la manipulation, cela n’est pas optimal en termes de dérangement. Ainsi en 2024, nous prévoyons d’expérimenter un nouveau protocole d’anesthésie dans le but de réduire le temps de réveil des individus et d’induire une analgésie plus puissante. Une analgésie plus puissante est mise en place pour les mâles sexuellement matures afin de limiter les possibles douleurs associées à l’électrostimulation dont la mise en place est prévue en 2024. Les protocoles d’anesthésie et d’électrostimulation seront optimisés en fonction des réponses des marmottes aux protocoles initialement définis. Nous envisageons aussi des protocoles alternatifs, comme la collecte de sperme par pharmo-induction si l’électrostimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux.
Choix des espèces
La marmotte Alpine (Marmota marmota) est une espèce particulièrement pertinente pour l’étude de la socialité (élevage coopératif, groupes sociaux hiérarchiques et stables), et représente un modèle biologique pour nombre d’espèces de mammifères sociaux. Sa structure sociale est bien décrite, et son comportement de territorialité et sa longévité (jusqu’à 16 ans) facilitent grandement le suivi des compositions de groupe et de leur dynamique temporelle. Ces caractéristiques biologiques permettent donc d’appréhender en détails la façon dont la vie en groupes sociaux affecte les traits d’histoire de vie et comment la socialité contraint les stratégies biodémographiques des espèces. Grâce à ce projet, nous disposons d’un jeu de données biodémographiques conséquent à l’échelle individuelle (30 ans de suivis) ainsi qu’une connaissance de nombreux facteurs environnementaux (météorologie, pathogènes…). Le recours à des populations captives ne permettrait pas de répondre aux objectifs de nos projets. Tous les stades de développement sont concernés par l’étude. La marmotte Alpine étant particulièrement longévive (longévité maximale observée sur le site de 16 ans), il est impératif de prendre en compte la structure d’âge de la population, et donc de connaître l’âge exact des animaux. A notre connaissance, la seule méthode fiable à disposition est de marquer les individus au stade juvénile (marmottons c’est-à-dire les jeunes de l’année), seule classe d’âge pouvant être déterminée à l’année près avec certitude. Ensuite, le statut social des marmottes est une variable capitale structurante les traits d’histoire de vie (conditionnant l’accès à la reproduction, la dispersion, et le taux de mortalité des individus) mais qui changent rapidement au cours d’une saison et d’une année à l’autre – ce n’est pas une variable fixe propre à chacun. Nous devons alors capturer les animaux tout au cours de leur vie pour être en mesure de décrire leur histoire de vie correctement.
Etude de la représentation neuronale de l’état du système cardio-respiratoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Deux chirurgies, d'une heure puis d'une heure quarante-cinq, pour implanter des électrodes dans le cerveau, une électrode sous la peau du thorax et une canule dans le nez. 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent ensuite jusqu'à trois heures par jour la tête fixée sur une roue pendant une semaine, certaines étant entraînées une à deux heures par jour pendant plusieurs mois à une tâche auditive, avec des jets d'air et des goûts amers comme stimuli aversifs. Une partie reçoit des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, que le porteur ne nomme pas, en indiquant seulement que la hausse du stress dure "au maximum quelques heures".
Objectifs
La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.
Bénéfices attendus
Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.
Devenir
A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.
Remplacement
Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.
Réduction
Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.
Raffinement
Hébergement : Les animaux ont accès à un enrichissement (dôme, coton) et sont hébergés ensemble sauf s’il y a de l’agressivité entre individus dans quel cas ils peuvent être isolés. Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.
Choix des espèces
Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.
Evaluation cognitive de souris modèles de myopathie de Duchenne dans un contexte social en cage d’élevage
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Une biopsie de l'extrémité de la queue puis l'implantation sous la peau d'une puce RFID sous anesthésie précèdent trois à huit semaines passées en colonie de douze à seize individus, où l'accès à la boisson change de place et d'horaire selon des règles que chaque souris doit apprendre. 1 596 souris porteuses de mutations modélisant la myopathie de Duchenne vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur présente ce dispositif comme évitant tout stress lié à l'isolement, à la restriction alimentaire ou à la manipulation, tout en indiquant que certaines souris peuvent se retrouver privées d'eau par la pression sociale du groupe ou parce que la règle à apprendre dépasse leurs capacités, et qu'une souris qui ne s'abreuve toujours pas au bout de douze heures est retirée et tuée. Les cerveaux sont prélevés après les tests, 80 femelles et mâles surnuméraires étant gardés en vie pour former de nouveaux couples.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations qui conduisent à une dégénérescence musculaire, mais également à des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques. Les patients atteints de DMD présentent en particulier des déficits d’apprentissage, de mémoire et de la flexibilité comportementale. La présence et la sévérité de ces troubles dépend de la position des mutations dans le gène responsable de la maladie et les études chez la souris impliquent donc la comparaison de plusieurs modèles porteurs de différentes mutations. Ces souris lorsqu’elles sont testées de manière isolée montrent fréquemment des réponses de stress et de longues périodes d’immobilité, alors que leur activité dans un environnement familier est comparable à des souris témoins. Ce projet a pour but d’évaluer le comportement et les capacités cognitives des souris modèles de DMD avec une approche plus éthologique, en plaçant des groupes sociaux dans une grande cage d’élevage dans laquelle les animaux peuvent apprendre différentes tâches pendant plusieurs semaines, à différents moments du cycle jour/nuit, et sans intervention d’un expérimentateur car les tâches sont programmées et la quantification des comportements est automatisée. Le projet permettra d’identifier des déficits comportementaux pouvant servir à évaluer l’efficacité de traitements, qui pourront être analysés rapidement sur des groupes importants d’animaux. Ce projet est donc important pour le diagnostic et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le cerveau dans la DMD.
Bénéfices attendus
Les troubles comportementaux et cognitifs associée à la myopathie de Duchenne sont encore peu étudiés mais ne peuvent plus être aujourd’hui considérés comme secondaires, car vu l’évolution des thérapies et prises en charge dans cette maladie, la durée de vie des patients s’accroit considérablement et les troubles affectant le système nerveux prennent progressivement une place de plus en plus importante dans la vie des patients. De plus, certaines mutations ont un impact très handicapant (déficience intellectuelle, troubles neuropsychiatriques) chez environ un tiers des patients. Il est donc important d’apporter des réponses à ces questions au cours d’études sur des modèles animaux de la maladie, porteurs de différentes mutations. Les résultats de ce projet permettront de préciser les relations entre mutations et sévérité des déficits, et d’identifier des déficits comportementaux utiles pour de futures études précliniques évaluant l’effet de traitements pour compenser ces troubles. L’évaluation automatique des comportements et des capacités cognitives dans notre dispositif a aussi un intérêt majeur au niveau éthique, car il permet de tester les souris dans leur lieu d’hébergement familier, enrichi par le contexte social et par une activité naturelle de recherche de boisson dans des zones différentes de la cage, en évitant tout stress lié à l’isolement, à la restriction en aliment, à l’anxiété induite par un environnement nouveau, ou à la manipulation par l’expérimentateur. Ce dispositif permet aussi l’obtention rapide de résultats sur des cohortes conséquentes de souris dans des conditions expérimentales stables, à la fois pendant les périodes diurnes et nocturnes. Les protocoles développés dans ce projet permettent d’étudier des fonctions cognitives de haut niveau affectées dans de nombreuses autres pathologies neurodéveloppementales et neurodégénératives, et pourront donc s’appliquer à de nombreuses études et modèles dans notre institut.
Procédures
Une biopsie de l'extrêmité de la queue (1mm) est faite le à l’âge de 7-10 semaine pour identifier le génotype des souris. Une anesthésie gazeuse de courte durée (
Impact sur les animaux
Une légère douleur pourrait être ressentie au moment de la biopsie de la queue pour génotypage. Certaines souris pourraient avoir des difficultés d’accès à la boisson du fait de la pression sociale susceptible de s’instaurer dans un grand groupe, ou dans certains protocoles impliquant une compétition sociale ou quand la règle à apprendre pour accéder à la boisson s’avère trop compliquée pour certaines souris modèles présentant un sévère déficit cognitif.
Devenir
Suite à leur production la majorité des souris (1516) passent expérimentation, 80 souris sont gardées pour former de nouveaux couples. À la suite des tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de leur cerveau. Une partie des femelles et mâles surnuméraires sera gardée en vie et utilisée pour former de nouveaux accouplements (n=80), les autres seront utilisées pour des prélèvements d’organes hors champ, ou euthanasiés.
Remplacement
Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont initialement menées sur des souris. Notre projet a pour but d’effectuer des tests comportementaux qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants. Les souris sont utilisées à un âge où la maladie est à un stade précoce, sans symptômes moteurs et ne donnant pas lieu à des souffrances.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base des publications utilisant des méthodes similaires d’analyse du comportement, la réussite des expériences nécessite 12-15 souris par groupe. Nous utilisons des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. De plus, notre approche avec enregistrement de données 24/24h permettra d’obtenir de nombreuses données comportementales, tout en limitant la variabilité, et donc le nombre d’animaux, par la répétition des mesures qui sont ensuite moyennées au sein de chaque expérience. Les études seront initialement conduites sur les lignées dont les mutations conduisent chez l’Homme aux déficits cognitifs plus sévère, tandis qu’une autre lignée, dont la mutation a peu d’impact chez l’Homme sur la cognition, ne sera étudiée qu’à titre comparatif seulement avec les protocoles qui auront révélé des déficits dans les autres lignées. L’ensemble de ces mesures permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Une semaine avant l’étude, une courte anesthésie (
Choix des espèces
Les explorations précliniques dans le cadre de cette maladie sont menées sur des souris. D’autres modèles animaux de cette maladie existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différentes lignées porteuses de mutations représentatives des mutations retrouvées chez les patients et induisant des variations dans la sévérité des symptômes. Les souris jeunes adultes seront étudiées (minimum 8 semaines). Ceci est nécessaire pour comparer aux résultats obtenus dans des projets précédents au même âge. De plus, c'est à cet âge que des traitements sont habituellement testés chez ces souris. Les troubles comportementaux et cognitifs sont présents à cet âge ; tester des souris plus vieilles (>6 mois) pourrait biaiser nos conclusions car leurs performances seraient influencées par un handicap moteur avancé.
Comportement olfactif du poisson cavernicole aveugle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1 920 poissons cavernicoles aveugles, encore au stade larvaire, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Mis à jeun 72 heures puis isolés, ils sont exposés à une odeur alimentaire pendant trente minutes, quatre jours de suite, 1 440 élevés en lumière normale et 480 dans le noir. Le porteur attend de ces observations une meilleure compréhension des mécanismes évolutifs qui permettent à des animaux non-humains de survivre à un changement brutal d'environnement, sans autre retombée annoncée. Sur le remplacement, il écrit en une phrase que les comportements étudiés sont non prévisibles et que le recours à l'animal est "requis par définition".
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment certaines composantes biologiques participent à la modification du système nerveux central et des comportements qu’il gouverne dans le cadre de l’adaptation à des changements d’environnement.
Bénéfices attendus
Grâce aux résultats que nous espérons obtenir nous pourrons mieux comprendre les mécanismes évolutifs et biologiques qui seuls ou combinés permettent à des animaux de survivre à un changement brutal d'environnement (lumière, température, nourriture) puis comment au cours de l’évolution ces mêmes animaux deviennent adaptés à ce nouvel environnement.
Procédures
Test de comportement olfactif : animaux vigiles mis en présence d’une odeur alimentaire pendant 30 minutes, 4 jours de suite sur 1440 animaux élevés en condition normale et sur 480 animaux élevés dans le noir.
Impact sur les animaux
Nuisance 1 : Mise à jeun. Les alevins sont à jeun 72 heures. Pas d'effets indésirables attendus car les poissons supportent naturellement la mise à jeun. Nuisance 2 : Isolement. Une étude précédente montre que le niveau de cortisol des poissons après changement d'environnement et isolement revient à la normale après 24 heures. Nous effectuons une acclimatation de 3 jours pour que le jour du test, le niveau de stress de l'alevin soit au niveau basal. L'effet indésirable attendu est l'augmentation du stress pendant 24 heures suivi d'un retour à la normale.
Devenir
Dans les deux procédures les alevins sont euthanasiés pour études neuranatomique post-mortem.
Remplacement
Remplacement : Les comportements étudiés dans ce projet sur des poissons adaptés à des milieux différents sont non prévisibles, notre projet nécessite donc une approche in vivo.
Réduction
Réduction : afin de réduire les nombres nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques qui permettent d’obtenir des résultats fiables avec moins d’animaux. Les tests d’observation du comportement étant non invasifs nous utiliserons les mêmes animaux dans différents tests de comportement ce qui contribuera aussi à réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous ne nous attendons pas à observer des signes de souffrance autre que parfois un stress lié au changement d’aquarium. Cependant, nous suivrons les signes de stress éventuels des animaux et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience
Raffinement
Raffinement : nous avons mis en place des conditions d’observation du comportement qui visent à minimiser au maximum le stress des animaux : ni contention humaine, ni immobilisation, ni contrainte dans un espace réduit.
Choix des espèces
Nous souhaitons décrire et quantifier des comportements animaux. Le recours à l'animal est requis par définition. De part l'existance des deux éco-morphotypes de cette espèce de poisson est un modèle idéale pour étudier l'évolution du système nerveux. Le système olfactif est complètement développé à partir de 4 semaines. Avant ce stade, les seuils de détection olfactifs sont très variables d'un individu à l'autre ce qui complique l'interprétation du comportement de réponse aux odeurs. Cependant la transparence des larves de 4 semaines rend difficile la détection des larves par un logiciel de tracking or à 6 semaines, les larves sont détectées. Nous étudions donc le comportement des larves de 6 semaines car les seuils de détection sont moins variables et les larves sont bien détectées par un logiciel de suivi de la locomotion.
CRABIER_EST – Les phoques crabiers et le krill en Antarctique de l’Est
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Sédatés à distance au moyen d'une perche, anesthésiés vingt à quarante-cinq minutes, équipés d'une balise collée sur la fourrure, 20 phoques crabiers subissent une prise de sang de 18 millilitres et le prélèvement d'une vibrisse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit que l'anesthésie à distance comporte plus de risques de surdosage ou de sous-dosage que la contention, mais qu'elle stresse moins l'animal, le phoque crabier étant décrit comme agressif et difficile à maintenir. Les balises resteront en place huit à onze mois, jusqu'à tomber avec la mue, sans recapture. Les animaux sont relâchés dans leur habitat une fois équipés, pour documenter la distribution du krill dans une zone que des navires norvégiens et chinois commencent à convoiter.
Objectifs
Les zones englacées sont particulièrement sensibles au réchauffement global. Pour prédire la capacité d’adaptation de prédateurs dépendant de la banquise dans ce contexte de changement climatique dans les différentes régions antarctiques, il est important de déterminer au préalable comment ils utilisent leur environnement physique et biologique. Ces prédateurs consomment de grandes quantités de ressources marines, parmi lesquelles le krill (Euphausia superba) occupe une place prépondérante. Cette espèce — dépendante de la banquise pour son développement larvaire — consomme du phytoplancton et est consommée par des prédateurs, elle assure ainsi une large part du transfert de carbone des producteurs primaires (vivant sous la banquise) vers les maillons trophiques supérieurs. Les futurs changements de l’étendue de la banquise antarctique dans un climat plus chaud pourraient affecter de manière négative les populations de krill, et par conséquence celles de leurs prédateurs. Toutefois, l’évolution future de l’ensemble du réseau trophique reste difficile à prévoir tant la compréhension des différentes composantes de l’écosystème antarctique et de leurs interactions est incomplète, voire approximative. A titre d’exemple, la connaissance de la distribution et de l’abondance du krill en hiver ainsi que des zones d’alimentation des prédateurs du krill sont à ce jour très limitées, notamment dans les régions encore peu touchées par les variations de la banquise, telles que l’Antarctique de l’Est. En effet, les études dans ces zones englacées sont difficiles car peu accessibles. Le présent projet a pour but de combler ce déficit de connaissances, en étudiant l’écologie des phoques crabiers et des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. Les phoques crabiers sont les plus grands consommateurs de krill (60 à 70 millions de tonnes de krill par an) et les plus abondants au monde (7 à 30 millions), ainsi les changements dans son écologie, sa distribution et son comportement reflètent les changements dans la population de krill de l’Antarctique. Grâce à des techniques de bio-télémétrie, on enregistre les plongées des phoques, les phases d'accélération et leur position, on pourra déterminer les zones d’alimentation clés et la distribution du krill très importante pour l’écosystème.
Bénéfices attendus
Ces résultats appuieront la consolidation de la base scientifique d'une gestion écosystémique de la pêche au krill par la Commission pour la conservation de la faune et la flore marines de l'Antarctique. En effet, il n'y a pour le moment pas de pêche significative de krill dans l'Antarctique de l’Est, mais des notifications récentes de navires norvégiens et chinois suggèrent un intérêt croissant de l'industrie pour cette région et pour cette ressource. Cette étude permettra la mise en place d'une surveillance sur la distribution du krill et des zones d'alimentation des prédateurs du krill en l'absence de pression de pêche afin d'anticiper les éventuelles menaces pour l'écosystème centré sur le krill. Ce projet remplira de fait 1) un des objectifs du programme de contrôle de l'écosystème de la Commission pour la conservation de la faune et la flore marines de l'Antarctique, c'est-à-dire distinguer les changements dus à l'exploitation des ressources marines des changements dus à la variabilité environnementale. Ce projet contribuera également à 2) "l'évaluation des risques" dans la zone afin d'essayer de comprendre l'impact possible de la pêche sur l'écosystème. Enfin les modèles d'habitat du krill utilisés pour élaborer les projections des populations de krill et les stocks comportent des limitations spatiales et temporelles importantes et connues en raison du manque de données disponibles, en particulier pendant la saison hivernale. Cette recherche fournira 3) des informations sur la distribution et l'abondance de cette espèce sous la glace de mer et pendant l'hiver, mais aussi sur son importance cruciale pour ses prédateurs, les phoques crabiers (dans le cadre de ce projet) et les relations fonctionnelles qu'ils entretiennent, en surveillant les changements dans les interactions trophiques.
Procédures
Les interventions sur les phoques crabiers se feront après la période de mue entre février et avril 2025, 20 individus maximum seront équipés et garderont leur balise entre 8 à 11 mois jusqu'à la mue suivante ou jusqu’à ce que la balise se décolle. On procèdera à une sédation sans contention à l’aide d’une perche (10 à 20 min), puis une anesthésie (20 à 45 min) durant laquelle aura lieu l’équipement de l'appareil (contenant l'accéléromètre, le capteur de profondeur, de température et le système de localisation via Argos) par collage sur la fourrure, ainsi qu’une prise de sang (18 ml une fois) et le prélèvement d'une vibrisse pour étudier le régime alimentaire des phoques crabiers (utilisation des isotopes stables du carbone et de l'azote par analyse chimique). Le matériel tombera à la mue sans recapture de l’animal.
Impact sur les animaux
L’induction de l’anesthésie sera faite à l’aide d’une perche à proche distance de l’animal mais sans contention donc les phoques subiront un stress de courte durée durant la procédure (~3 min). L’anesthésie à distance présente plus de risques chez certaines espèces de phoques que la contention et l’injection par voie intra- veineuse or, le phoque crabier est un animal agressif et sa contention est particulièrement difficile ; elle rallongerait le temps de stress auquel l’animal est exposé. Il existe des risques plus fréquents de surdosage ou sous dosage mais la procédure est en revanche moins stressante pour l’animal. La prise de sang et le prélèvement de vibrisse auront lieu durant l'anesthésie de l'animal et n'auront pas d'effet significatif sur l'animal (prélèvement de 0,036% du volume sanguin d’un individu de 300 kg et repousse de la vibrisse prélevée). Les instruments sont collés sur la tête à l’aide de colle epoxy bi-composants selon un protocole éprouvé. Nous nous attendons à ne pas observer d’effet mesurable des instruments sur le comportement alimentaire des phoques car il a été montré qu’une caméra de section deux fois plus grande que celle utilisée ici n’avait pas d’impact significatif sur la durée moyenne des plongée, la dépense énergétique, et la fréquence des mouvements de nage des phoques de Weddell. De plus, lors d’une autre étude qui a comparé le gain de masse et le taux de survie d’éléphants de mer équipés et non équipés, aucun effet de la pose, même répétée, d’équipement n’a été détecté. Enfin une étude récente de l’effet de la pose d’instruments sur des phoques de Weddell et des éléphants de mer par la méthode de la colle epoxy a montré que cette dernière n’avait pas d’impact biologique détectable sur les animaux.
Devenir
Les individus étudiés seront libérés dans leur habitat naturel une fois équipés, le matériel sera récupéré à distance sans recapture. Application de la règle des «trois R».
Remplacement
L’objectif étant d’étudier le phoque crabier et son écologie en mer dans leur milieu naturel, il ne peut pas être remplacé par une autre espèce, par des animaux d’élevage, ou encore par des expérimentations en captivité. Le phoque crabier a seulement fait l'objet d'une étude dans cette zone de l'Antarctique et on ne peut donc pas le remplacer par une autre espèce.
Réduction
La réduction est appliquée, puisque le nombre d’animaux capturés est limité à un nombre maximum de 20 individus (objectif autour de 15 individus) pour une campagne dû aux contraintes des déploiements à bord d'un brise-glace (déploiement du personnel sur la banquise pendant une durée limitée pour laquelle les conditions météorologiques doivent être optimales). Ce nombre correspond à 20 individus sur un effectif total de la population de phoques crabiers en Antarctique estimée à ~7 à 30 millions. L'estimation statistique de nombre d'individus nécessaires pour comprendre les variations de leur comportement en fonction des variations de la distribution du krill n'est pas envisageable, car l'effet mesuré est variable et se caractérise par des changements d'habitats ou de stratégies d'alimentation pas toujours facilement quantifiables, et nous ne savons pas en avance les comportements que nous allons observer. Dans un schéma idéal, nous souhaiterions avoir le plus de déploiements possibles (avec des stades d'âge et sexes différents) pour avoir le plus de diversité dans les relations entre l'écologie en mer de ces animaux, leur proie (le krill) et les conditions environnementales. En revanche nous essayons d'équiper le plus d'animaux possibles en prenant en compte les contraintes climatiques extrêmes du terrain, la disponibilité des animaux, les contraintes liés à leur cycle de vie (phase sur la banquise, lactation, mue) et les coûts très importants des instruments. Nos analyses multivariées à effets mixtes ne visent pas à comparer les sexes ou les stades d'âge, et le nombre d'individus défini est suffisant pour diversifier les traits individuels car chaque individu « bio- échantillonnent » leur environnement dans plusieurs zones différentes.
Raffinement
Les points limites de la procédure et leur raffinement sont les suivant: 1) L’état général de l’animal est évalué avant sa capture (embonpoint, absence de malformation et de plaie) ; 2) Stress lié à la capture : l'animal est anesthésié à distance à l'aide d'une perche, le stress est minimisé et la contention est absente ; 3) Surveillance de l'anesthésie: les paramètres cardiaques et respiratoires de l’individu sont surveillés ainsi que le degré d’anesthésie: protocole de gestion de complications éventuelles lors de l’anesthésie joint à cette demande. 4) Récupération du matériel : pas de récupération possible dans la zone de banquise dite dérivante avec le brise-glace (les animaux sont constamment en mouvement), les balises tomberont avec le poil des phocidés au cours de la période de mue l'année d''après qui se déroule entre janvier et février. 5) Taille de l'instrument : Nous nous attendons à ne pas observer d’effet mesurable des instruments sur le comportement alimentaire des phoques car il a été montré qu’une caméra de section deux fois plus grande que celle utilisée ici n’avait pas d’impact significatif sur la durée moyenne des plongée, la dépense énergétique, et la fréquence des mouvements de nage des phoques de Weddell. De plus, lors d’une autre étude qui a comparé le gain de masse et le taux de survie d’éléphants de mer équipés et non équipés, aucun effet de la pose, même répétée, d’équipement n’a été détecté. Enfin une étude récente de l’effet de la pose d’instruments sur des phoques de Weddell et des éléphants de mer par la méthode de la colle epoxy a montré que cette dernière n’avait pas d’impact biologique détectable sur les animaux.
Choix des espèces
Ce projet vise à améliorer notre compréhension de l’écologie des phoques crabiers et des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. Les phoques crabiers sont les plus grands consommateurs de krill (60 à 70 millions de tonnes de krill par an) et les plus abondants au monde (7 à 30 millions), ainsi les changements dans son écologie, sa distribution et son comportement reflètent les changements dans la population de krill de l’Antarctique. Grâce à des techniques de bio-télémétrie, on enregistre les plongées des phoques, les phases d'accélération et leur position, on pourra déterminer les zones d’alimentation clés et la distribution du krill très importante pour l’écosystème. Cette procédure concerne des animaux adultes car ce sont les individus présents sur la banquise, les juvéniles sont plus fréquemment en mer jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade reproducteur.
Effet de l’eau riche en oxygène sur la méthanogènese entérique chez le ruminant
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Enfermées sept jours d'affilée en chambre respiratoire pour mesurer le méthane qu'elles émettent, 4 brebis de réforme vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Le projet teste une eau de boisson enrichie en nanobulles d'oxygène, censée gêner les microbes producteurs de méthane du rumen. Le porteur écrit que cette mesure n'entraîne "aucune souffrance ni douleur", ce que la gravité modérée déclarée dans le même document contredit. Le devenir des brebis dépend d'une évaluation administrative en cours : si l'innocuité des nanobulles n'est pas établie, elles seront tuées par précaution, sinon leur replacement sera soumis à l'avis de la structure de bien-être animal.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’effet d’une eau de boisson enrichie en nanobulles d’oxygène sur la production de méthane entérique chez l’ovin. Cet essai servira de preuve de concept. Les microbes producteurs de méthane (méthanogènes) sont très sensibles à l’oxygène et notre hypothèse de travail est que les nanobulles d’oxygène inhiberont l’activité des méthanogènes.
Bénéfices attendus
La diminution de l’empreinte carbone des ruminants par une solution innovante d’utilisation facile sur le terrain, y compris au pâturage, peu coûteuse et facilement acceptable par les utilisateurs et la société.
Procédures
Au cours des 7 jours d'expérimentation, les animaux seront dans des chambres respiratoires semi-ouvertes.
Impact sur les animaux
Les animaux entreront en chambre respiratoire pendant 7 jours consécutifs pour la mesure des émissions de méthane. Cette mesure n’entraîne aucune souffrance ni douleur chez l’animal qui est libre de mouvement dans une surface de 3,3 m2 qui est supérieure aux normes de bien être (2 m2). Les chambres respiratoires semi-ouvertes sont disposées côte à côte avec de larges parois translucides qui permettent aux animaux de se voir, de s’entendre et de percevoir les odeurs, ce qui diminue le stress lié à l’isolement.
Devenir
L’innocuité de l’utilisation de nanobulles dans l’eau de boisson est en cours d’évaluation par les autorités compétentes. Si elle ne peut être établie, en application du principe de précaution, les animaux seront mis à mort. Sinon, leur replacement sera soumis à l’avis de la SBEA.
Remplacement
Ce type d’étude a déjà été réalisé in vitro et nécessite une validation chez l’animal.
Réduction
D'après notre expérience reconnue dans le domaine de la mesure des émissions des gaz à effet de serre par les ruminants, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables en termes d'émissions de méthane en chambre respiratoire avec un écart entre groupes de ~30% est de 4 par lot. Chaque animal sera son propre témoin. Nous utilisons le nombre minimal d’individus pour cette étude de preuve de concept très peu contraignant pour les animaux.
Raffinement
Cette mesure n’entraîne aucune souffrance ni douleur chez l’animal qui est libre de mouvement dans une surface de 3,3 m2 qui est aménagée avec caillebotis pour assurer un confort de couchage et la bonne évacuation des effluents. Les chambres respiratoires semi-ouvertes sont disposées côte à côte avec de larges parois translucides qui permettent aux animaux de se voir, de s’entendre et de percevoir les odeurs, ce qui diminue le stress lié à l’isolement.
Choix des espèces
Pour cette étude nous avons besoin des animaux avec un rumen fonctionnel (des agneaux après sevrage ou des ovins adultes). Nous utiliserons des brebis de réforme car en fin de vie productive. Il n'y a pas de préférence de sexe pour l’objectif de l’étude, par contre tous les animaux seront du même sexe. Comme indiqué au-dessus, nous utiliserons des femelles de réforme. On s’attend à une diminution minimale de méthane d’environ 30%. Cette amplitude de diminution est facilement détectable en chambre respiratoire. Le nombre de 4 animaux est suffisant au vue de la précision des mesures pour cette preuve de concept.
Profil et circuits socio-émotionnels de deux lignées de souris exprimant des mutations du récepteur nicotinique α5 impliquées dans l’alcoolisme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
472 souris vont être utilisées et toutes tuées pour conserver leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 230 chirurgies stéréotaxiques d'injection virale ou de pose de fibre optique. Chaque animal opéré passe ensuite sept jours seul en cage, puis subit un enregistrement électrophysiologique de l'hippocampe pouvant durer une heure. Le protocole prévoit aussi 84 souris exposées à un biberon d'éthanol toutes les vingt-quatre heures pendant six semaines, 80 immobilisées quinze minutes en contention et 360 soumises cinq jours durant à des tests de reconnaissance des émotions avec enregistrement de leurs vocalisations ultrasonores. Le porteur qualifie la contention de "stress psychogène modéré" et prête à l'exposition à l'alcool des effets "positifs de type anxiolytiques, relaxant et euphorisants".
Objectifs
L’OMS raporte que 5% de décès dans le monde peuvent être attribués à l’abus d’alcool. Le fléau sociétal et de santé publique que repésente l’alcoolisme motive la recherche de facteurs de risques génétiques et environnementaux, dans le but de développer des interventions thérapeutiques plus efficaces. Des études génétiques chez l’Homme ont permis de montrer un lien entre une modification du gène des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool. Malheureusement, le lien causal entre cette altération génétique et l’alcoolisme est difficile à étudier chez l’homme. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de cette altération dans la consommation d’alcool, la gestion des émotions et comportements sociaux, à l’aide de lignées de souris exprimant la même altération génétique que l’Homme. Afin de connaitre les conséquences de cette altération génétique sur l’activité neuronale, nous enregistrerons la réponse à la stimulation des neurones situés dans les régions du cerveau impliquées dans la reconnaissance des émotions. Enfin, dans le cas ou des déficits sont observés chez les animaux porteurs de la modication génétique, nous tenterons d’améliorer le déficit socio-émotionel en corrigeant, par thérapie génique, l’altération génétique du récepteur α5 dans le cerveau de souris. Ce même traitement pourrait aussi régulariser leur consommation d’alcool.
Bénéfices attendus
Bien que des études génétiques chez l’Homme aient montré un lien entre une modification du gène responsable de l’expression des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool, les mécanismes à l’origine de cette vulnérabilité demeurent inconnus. Or, il existe différentes formes (ou types) d’alcoolisme associées à des comportements émotionnels et sociaux différents voire opposés, par exemple à une hyperanxiété ou une hypoanxiété. Chez l’Homme, il est très difficile de déterminer si ces traits comportementaux et émotionnels sont dus à la consommation d’alcool, ou s’ils correspondent à des traits de personnalité qui préexistent, voire facilitent cette consommation. A ce jour, les traitements ne prennent généralement pas en compte les différents types alcooliques, ce qui pourrait expliquer au moins en partie le taux de rechute élevé (80 à 90% selon les études). L’un des principaux intérêts de notre projet est donc de mieux comprendre la relation entre les traits comportementauxs socio-émotionnels et la consommation d’alcool, en permettant de dissocier les effets de la consommation chronique d’alcool du profil de personnalité préexistant. De façon importante, ces traits sont aussi fortement liés au sexe, par exemple les profils hyperanxieux sont principalement observés chez les patients de sexe féminin, à l’inverse l’hypoanxiété et l’émoussement émotionnel sont principalement observés chez les patients de sexe masculin. Pour cette raison, nous comparerons les réponses comportementales et neuronales de souris mâles et femelles. Ainsi, l’apport éventuel de notre projet pourrait se situer à plusieurs niveaux. Premièrement, en prenant en compte les profils émotionnels et non simplement le niveau de consommation, il pourrait aider à comprendre les mécanismes par lesquels une mutation des récepteurs a5 induit un risque de dépendance à l’alcool. Si le lien entre profils socio-émotionels et risque de dépendance à l’alcool est observé chez l’animal, cela permettrait de tester certaines interventions thérapeutiques, qu’elles soient pharmacologiques ou psychologiques, pour adapter les traitements de façon « personnalisée » chez l’Homme. De nouvelles stratégies pharmaco et/ou psychothérapeutiques prenant en compte le profil socioémotionnel des patients pourraient ainsi se révéler beaucoup plus efficaces pour faciliter l’arrêt de la consommation d'alcool, voire de diminuer les risques de rechute.
Procédures
Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique), dure environ 30 minutes (n=230). • L’enregistrement de l’activité electrophysiologique dans l’hippocampe (geste effectué sur animal anesthesié) pendant une période maximale de 60 minutes (n=230). • L’activation neuronale via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=82). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=84). • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=360). • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=80). • Un isolement en cage individuel
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique) qui dure environ 30 minutes (n=230). Cette procédure induit une perte de poids légère et transitoire normale (1-2j) et une douleur modérée qui répond bien à une injection sous-cutanée d’AINS (INFLACAM©) efficace pendant plus de 12h. • L’enregistrement de l’activité électrophysiologique de deux régions du cerveau : le CA1v et CA1d pendant une période maximale de 60 minutes (n=230). Ce geste est effectué sur animal en anesthésie générale profonde. • L’activation neuronale des voies BLA-CA1v via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=82). Ce geste peut générer éventuellement une anxiété légère qui n’est pas systématique (Feliz-Ortiz et al, 2015). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=84). Ce traitement, qui dépend d’un choix libre de l’animal, génère plutôt des effets psychopharmacologiques et physiques positifs de type anxioloytiques, relaxant et euphorisants. • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=380). Induit un stress léger, comparable au stress induit par de nombreux tests comportemntaux considérés comme faiblement stressants. • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=80) et considéré comme un stress psychogène modéré auquel les animaux s’habituent. • L'isolement en cage individuelle pendant les 7 jours qui succèdent aux chirurgies stéréotaxiques: Cet isolement est prévu pour éviter que les animaux se blessent entre eux lors de la phase de cicatrisation post-opératoire. Au bout de 7 jours les animaux seront replacés en hébérgement collectif en respectant les mêmes compositions de cage qu'avant les chirurgies (n=230).
Devenir
A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Le projet étant basé sur la reconnaissance des émotions chez la souris et sa relation avec la consommation d’alcool, il n’est pas possible à ce jour de remplacer l’utilisation d’animaux par une autre approche. En revanche, les effectifs peuvent être optimisés en remplaçant les tests indépendants par l’utilisation d’une batterie de tests longitudinaux qui permet d’optimiser le recueil des données pour chaque animal. Ceci implique d’une part de choisir, sur la base de la littérature et de résultats préliminaires, des tests ne modifiant pas le comportement à long terme; et d’autre part d’espacer ces tests dans le temps. Ainsi, deux tests à court terme réalisés en séquentiel divisent par deux l’effectif total sans impacter significativement les résultats.
Réduction
En plus de l'utilisation de batteries de tests (voir ci-dessus), des études pilotes avec un petit nombre de sujets (n=4-5) permettront de déterminer si les effets justifient l'application d'un protocole complet, ce qui peut réduire de façon importante l'effectif total. Ce nombre n’est pas suffisant pour garantir un effet statistique solide mais il permet de décider, sur la base de statistiques descriptives, de compléter l’expérience à 10 animaux par groupe qui est l’effectif minimum nécessaire pour une significativité acceptable avec les tests statistiques paramétriques d’analyses de moyenne et de variance.
Raffinement
Toutes les dispositions permettant de préserver le bien-être des animaux seront prises: anesthésie générale pour l'opération, traitement post-opératoire anti-inflammatoire préventif. Par ailleurs l'ensemble des animaux est maintenu dans des conditions d'environnement enrichi, avec à disposition un matériau pour construction de nid. Après chaque intervention chirurgicale (classe modérée) les animaux seront isolés afin d’éviter tout risque de blessures ou de souffrance. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens formés en expérimentation animale (niveau appplicateur) qui informent le concepteur/expérimentateur immédiatement lorsque que des dispositions doivent être prises en cas de signe de souffrance. L'atteinte des points limites entraine l'application du protocole de réponse en fonction du score défini dans chaque procédure. Il faut noter que les tests sociaux utilisés, en permettant aux animaux d’interagir librement de façon quotidienne pendant la durée des expériences, peuvent être considéré comme un enrichissement. L’ensemble des expérimentateurs/soigneurs intervenant sur les animaux a suivi une formation à l’expérimentation animale (niveau 1 ou 2).
Choix des espèces
La souris représente une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux murin permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus chez la souris à l’espèce humaine. Par ailleurs, la souris est une espèce qui peut être manipulée génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Par exemple, l'implication de mutations des récepteurs cholinergiques nicotiniques dans la dépendance à l’alcool peut être étudiée à l'aide des souris dépourvues (α5KO) de certains de ces récepteurs et à des souris exprimant un polymorphisme génétique humain (α5KI) qui sont utilisées dans le projet présent. Les animaux seront utilisés au stade âge adulte mature (3–6mois). Cet âge constitue une période de stabilité durant laquelle on considère que le développement est achevé et les effets liés au vieillissement minimum.
Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 60 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Dans leurs deux premières semaines de vie, les souriceaux reçoivent des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires sous anesthésie, séparés de leur mère, puis passent des enregistrements de vocalisations ultrasoniques, de l'actimétrie et un test de nidification. À trois mois, chaque animal est isolé pendant trois semaines avant le test d'interaction sociale, pour stimuler ses comportements sociaux. Le porteur présente ces tests comme "non invasifs" tout en décrivant par ailleurs le stress lié à la séparation maternelle, à l'hébergement individuel et aux prélèvements sanguins.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés à deux âges différents, le second prélèvement sera suivi d’une euthanasie.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, les prélèvements sanguins (douleur légère liée à la piqûre de la veine et risque possible d’hémorragie), la mise en place d’une période d'hébergement individuel pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1380 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1380 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent plus ou moins 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification ainsi que d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Recherche d’un traitement pour une maladie neurologique rare MCOPS12.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Chaque souriceau est amputé d'une phalange par patte entre le septième et le dixième jour après la naissance, pour l'identifier et le génotyper en une seule opération. 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gavées chaque jour pendant quatre semaines ou injectées dans l'abdomen, puis soumises à des tests de locomotion en environnement nouveau et de coordination des membres. Le porteur écrit pourtant que les expériences réalisées ici "ne sont pas douloureuses" et qu'elles consistent uniquement en des études comportementales. Toutes sont tuées à la fin pour récolter le matériel biologique qui complétera les résultats de comportement.
Objectifs
Des mutations d’un récepteur de la vitamine A sont à l’origine d’une maladie neurologique rare (MCOPS12) responsable de symptômes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodéveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostic vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations. Les souris mutantes présentent des symptômes moteurs similaires (n’affectant pas fondamentalement la vie des animaux qui peuvent marcher et se redresser sans aucun problème) à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle de ce récepteur dans le développement et dans la fonction du striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire ce récepteur contrôle le développement d’une sous-population de neurones, alors qu’à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une autre sous-population de neurones. Notre objectif est de prévenir et/ou de normaliser les symptômes moteurs et cognitifs en modulant l’activité de ces neurones afin de prévenir leur mort et/ou leur dysfonctionnement pour éviter l’apparition des symptômes. Les effets liés au mode d’administration des traitements seront contrôlés grâce à un traitement supplémentaire avec une solution saline, pour s’assurer qu’aucun effet observé ne soit en réalité que le résultat du stress causé par l’administration des composés. Nous avons donc 6 traitements différents à tester.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter de nouvelles pistes de traitements pour la maladie sur laquelle nous travaillons. En effet, notre objectif est de prévenir l’apparition et/ou réduire des symptomes moteurs et cognitifs grâce aux différents traitements que nous allons utiliser en empêchant la perte de certains neurones responsables de ces symptomes, ou en régulant leur activité. Si un ou plusieurs traitement(s) montre(nt) des effets bénéfiques, nous pourrions envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients.
Procédures
La technique d'identification utilisée dans notre EU est la phalangectomie. Celle-ci permet d'identifier les animaux et également de les caractériser génétiquement en une seule étape. L’identification sera réalisée entre les 7è et 10è jours postpartum conformément aux recommandations de la CNREEA. Cependant des méthodes alternatives sont en développement afin de remplacer la phalangectomie par une autre méthode moins invasive. 3 traitements pharmacologiques visant à prévenir les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 4 semaines. Tous les traitements se feront par voie orale (gavage des animaux, 15 secondes par traitement) pendant 4 semaines, à raison d’un traitement par jour. Nous utiliserons 12 animaux par groupe et par traitement (12 x 4 x 4), soit 192 mâles et 192 femelles = 384 animaux au total. 2 traitements pharmacologiques visant à atténuer les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 10 à 25 semaines (adulte). Tous les traitements se feront par injection intrapéritonéale (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et le traitement contrôle (solution saline) (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 120 mâles et 120 femelles = 240 animaux au total. Ensuite, des tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 = 30 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 = 3 x 5 minutes, évaluation de la coordination des membres, test 3 = 32h, évaluation de l’activité locomotrice, test 4 = 30 minutes, évaluation des réflexes, test 5 = 30 minutes, évaluation de la mémoire. Un délai minimum de 1 jour sera respecté entre chaque test afin de diminuer l’effet du stress sur les résultats obtenus. Les mêmes cohortes recevront une seconde dose de traitement et s'en suivra les mêmes tests à des fins de réduction et pour évaluer la meilleure dose dans l'efficacité du traitement dans l'atténuation des symptômes. La moitié des animaux de chacun des 6 traitements (pharmacologique + contrôle) = 312 animaux (156 mâles et 156 femelles), sera ensuite utilisée pour réaliser des analyses cellulaires. L’autre moitié sera utilisée à des fins d’analyses moléculaires.
Impact sur les animaux
Les phalangectomies réalisées entre le 7e et 10e jour postpartum comme recommandé par le CNREEA provoqueront une douleur de durée légère. Elles seront limitées à une seule phalange par patte pour ne pas compromettre la préhension que les animaux exercent avec leurs pattes. Les autres effets indésirables ne dépasseront pas la gêne occasionnée par le gavage des animaux. En effet, les tests comportementaux effectués ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive et un léger stress sont à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables majeurs. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. Amendement : Les injections intrapéritonéales des traitements, et du mélange anesthésie/analgésie lors des perfusions intracardiaques, peuvent provoquer une légère douleur à l'animal ainsi qu'un stress. De plus, nous injecterons une seconde dose des traitements sur les mêmes cohortes expérimentales, espacée d'une semaine
Devenir
L’ensemble des animaux utilisé sera mis à mort afin de récolter le matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui compléteront les résultats obtenus en comportement.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique de la signalisation calcique et de la neurotransmission ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée. De plus, nous n’utiliserons qu’un seul groupe d’animaux traités avec le vehicule (contrôle). En effet, les différents traitements seront préparés et administrés de la même manière, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux contrôle. Enfin, la réalisation de la procédure numéro 2 dépendra des résultats obtenus dans la procédure numéro 1. En effet, nous n’utiliserons la seconde procédure uniquement si les résultats de la première procédure ne sont pas concluants. En effet le caractère moins séléctif de la seconde molécule, permettra de moduler la signalisation calcique plus largement.
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses et effectuées par des personnes compétentes et qualifiées (formations conception et chirurgie des rongeurs). Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans traitement préalable de composés pharmacologiques à des doses faibles. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses qui permettent simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Ces cinq traitements ont déjà été utilisés aux mêmes doses, sans causer de souffrance chez les animaux. Les traitements par gavage seront réalisés par des expérimentateurs formés à l’aide de canules souples afin d’éviter toute lésion interne. Les animaux seront surveillés méticuleusement tous les jours à l'occasion des traitements et un suivi de poids sera réalisé 2 fois par semaine (le mardi et le vendredi) pour contrôler leur bien-être. En cas de mal être de l’animal sera exclu de l’étude et un examen vétérinaire sera immédiatement réalisé. Amendement : Différentes injections intrapéritonéales seront réalisées lors des procédures expérimentales 4 et 5 d'une part pour administrer les traitements pharmacologiques, et d'autre part pour administrer le mélange anesthésie/analgésie. En effet, les perfusions intracardiaques seront réalisées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale d’un mélange anesthésie/analgésie afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections intrapéritonéales sont peu douloureuses également. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort après une anesthésie sans réveil par exsanguination par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle des mutations d’un gène dans la mise en place et la progression d’une maladie neurologique progressive rare, les performances comportementales et les fonctions des signalisations calcique, dopaminergique et glutamatergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans un premier temps des animaux de 4 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements, avant même l’apparition de des symptômes. Dans un second temps, nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 25 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements visant à réduire les symptômes moteurs et cognitifs.
Etude multi-échelle à court, moyen et long terme de la maltraitance infantile chez des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Secoués quinze secondes, laissés sept jours dans un environnement appauvri ou séparés de leur mère trois heures par jour pendant deux semaines, des souriceaux sont utilisés pour reproduire trois formes de maltraitance infantile. Ils seront 2 464 en tout, dont 1 989 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 419 d'un niveau léger et 56 d'un niveau modéré. Le porteur annonce chez les nouveau-nés une baisse temporaire de la température corporelle et un retard du développement psychomoteur, chez les adultes un stress social important, puis prélève systématiquement le sang et le cerveau des animaux expérimentaux. 475 souris échappent à la mise à mort, les visiteuses des tests d'interaction sociale ainsi que les mères et les pères, gardées vivantes pour d'autres projets, l'avis du vétérinaire étant sollicité pour celles qui ont subi l'agressivité de congénères.
Objectifs
Les violences faites aux enfants et adolescents sont un fléau sanitaire et sociétal mondial. Un quart des adultes déclarent en avoir été victime mais une minorité d’entre eux est repérée suffisamment précocement pour éviter les conséquences « vie entière » somatiques et neuropsychiatriques de ces violences et leur impact socio-économique majeur. Les violences faites aux enfants et adolescents sont définies par l’OMS comme « toutes les formes de mauvais traitements physiques […] de négligences ou d’exploitation, entraînant un préjudice réel ou potentiel pour la santé de l’enfant, sa survie, son développement […] ». Dans les pays à économie développée, on estime la fréquence des maltraitances physiques de 4 à 16% chez les mineurs et de1 à 15% pour la négligence (et carence de soins). Pour les enfants survivants aux violences physiques du syndrome du bébé secoué, les conséquences à long terme sont majeures sur le plan neurologique et développemental (périmètre crânien diminué, épilepsie, déficiences motrices visuelles intellectuelles, trouble du langage, et anomalies comportementales). Pour les enfants victimes de négligence physique et carence de soins les conséquences sont les plus graves pour leur développement cognitif et l’insertion sociale. Dans ce projet, nous étudierons les effets spécifiques et communs de différents aspects de la maltraitance chez le souriceau par l’utilisation d’un modèle du syndrome du bébé secoué et deux modèles de négligence. Des analyses multi-échelles seront réalisées à différents temps de la maturation du cerveau : enfance, adolescence et adultes. Nous établirons 1) un profil comportemental individuel sur plusieurs composantes émotionnelle, sociale et cognitive ; 2) Les effets au niveau moléculaire de ces maltraitances seront également étudiés afin de permettre un futur transfert chez l’humain. Les analyses seront ciblées sur les marqueurs moléculaires de deux axes identifiés chez l’humain comme perturbés après exposition à des maltraitances dans l’enfance : la neuroinflammation et la production d’hormones. Les études protéiques et génétiques seront réalisées dans le sang périphérique et le cerveau des animaux à trois âges ; 3) Enfin des approches thérapeutiques comportementales (précoces et tardives) permettant de contrecarrer les effets de la maltraitance, seront entreprises.
Bénéfices attendus
Les maltraitances faites aux enfants et aux adolescents impactent un ensemble de comportements essentiels pour la santé mentale et sociale des individus, pour le reste de leur vie. Les maltraitances majorent la propension à développer des pathologies psychiatriques, aux symptômes plus sévères et de façon plus précoce. Le but de ce projet, qui s’intègre dans un projet de recherche plus large avec des volets cliniques, est de produire des connaissances nouvelles pour identifier les moments clés du développement lors desquels la mise en place de thérapies comportementales et/ou biologiques auraient le plus d’impact sur la réduction des conséquences dramatiques des violences faites aux enfants et adolescents. Le but sera aussi d’identifier si les effets sont liés au genre, ce qui semble être le cas chez l’humain sans en connaitre les mécanismes. Les maltraitances affectent le fonctionnement du cerveau, en particulier la détection des menaces, la régulation des émotions et la motivation. Mais on ne sait pas si ces altérations reflètent les effets toxiques des stress au début de la vie, ou des modifications adaptatives. Les facteurs protecteurs du fonctionnement du cerveau, restent à identifier, de même que les types de traitements réduisant, voir annulant les effets de la maltraitance. Il est nécessaire de mieux comprendre les conséquences psycho-biologiques des maltraitances chez les victimes au cours du développement du cerveau, et de préciser les mécanismes avec des modèles animaux. Le but de ce projet est d’étudier les liens entre types de maltraitances et leurs impacts spécifiques sur la maturation du cerveau selon les sexes et au niveau comportemental et biologique. Ce projet permettra d’identifier pour la première fois, pour chaque type de maltraitance modélisée et par comparaison des types de maltraitance, les mécanismes et la cinétique du 1) traumatisme crânien du syndrome du bébé secoué, 2) de la négligence physique et 3) de la négligence par manque de soins à l’échelle génique, moléculaire et comportementale au cours de la vie des individus. Le but de ce projet est de permettre l’identification spécifique à chaque modèle, de la période la plus propice au traitement de ces individus. Il permettra de préparer des interventions de prévention secondaires adaptées et correctrices.
Procédures
Dans le cadre du modèle du syndrome du "bébé secoué". La procédure de secouement dure 15 secondes maximum (1 seule fois). Dans le cadre du modèle de "négligence physique". L’appauvrissement de l’environnement de vie dure 7 jours. Dans le cadre du modèle de "négligence et séparation maternelle". La séparation maternelle quotidienne est de 3h, sur 7 à 14 jours consécutifs. La prise de sang des animaux à l’âge juvénile et adolescent dure 1 minute maximum. L’implantation sous anesthésie d’une puce d’identification RFID dure 20 secondes
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux adultes sont : 1) un stress social important bien que temporaire chez les animaux expérimentaux et 2) en fonction des conditions expérimentales, un stress modéré temporaire d’un sous-groupe de mère. Chez les nouveau-nés et juvéniles, toujours en fonction des conditions expérimentales, on peut prévoir une légère baisse temporaire de la température corporelle et un retard dans le développement psychomoteur.
Devenir
A la fin de toutes les procédures, pour tous les animaux expérimentaux le sang et le cerveau des animaux seront systématiquement prélevés pour l’analyse moléculaire et génétique des facteurs biologiques modifiés par les maltraitances infantiles et responsables des altérations comportementales observées. C’est également grâce à l’identification de ces marqueurs biologiques que nous pourrons confirmer le rôle bénéfique de notre procédure de remédiation sur les effets de la maltraitance. L’identification de ces facteurs biologiques permettra d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour la remédiation des effets dramatiques de ces violences chez l’homme. Toutes les souris visiteuse, ainsi que les mères et pères seront gardés en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets. S’il les souris visiteuses ont subi de l’agressivité de la part de congénère, l’avis du vétérinaire référent sera sollicité. Dans le cas des mères de la procédure 2, l'avis du vétérinaire référent sera sollicité pour évaluer si elles peuvent être réutilisées ou non.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d’étudier le rôle de différents modèles de maltraitance sur les comportements des animaux et l’expression de processus biologiques complexes périphériques et centraux, nous devons pouvoir observer et analyser ces comportements et ces mécanismes systémiques chez des animaux vivants et se comportant. Nos travaux de recherche ne peuvent donc pas se faire à l’aide d’autres types de procédures expérimentales (simulations informatiques ou cultures cellulaires par exemple).
Réduction
La réduction des animaux est faite par le suivi des mêmes animaux de l’âge juvénile à l'adolescence et de l’âge juvénile à l'âge adulte, pour éviter d'avoir trop d'animaux. Le nombre d’animaux est choisi pour tenir compte des difficultés inhérentes des modèles, à la durée totale d’expérimentation pour chaque individu et de prendre en compte la variabilité inter-individuelle. Les différentes procédures expérimentales ont ainsi été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement puissants. Les lots de mise en place (pilote) permettront de sélectionner les meilleures conditions de test et si le premier lot est validé, le second lot ne sera pas utilisé, si aucun des lots n’est concluant la procédure sera stoppée, ce qui contribue à diminuer le nombre d’animaux. Pour réduire le nombre d’animaux visiteurs nécessaires pour nos tests d’interaction sociale, nous passerons plusieurs fois le même animal en tant que visiteur.
Raffinement
L’implantation sous-cutanée de puce RFID (sous anesthésie générale) prend 20 secondes environ. Un suivi post-opératoire sera réalisé. Une analgésie pourra être utilisée en fonction des signes de douleurs. Pendant et après la phase de maltraitance on surveillera l’état général des souriceaux dans et hors du nid à l’aide de documents adaptés au soin des nouveau-nés. Ils permettent d’observer les souriceaux dans la portée avec un minimum de manipulation de la part de l’expérimentateur. Pour limiter le stress des animaux, le(s) même(s) expérimentateur(s) habitueront les animaux à leur présence et à leur manipulation dès la naissance. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions et en dehors pour assurer un bien-être optimal durant toute l’étude. Les animaux isolés socialement bénéficieront des conditions d’enrichissement standard. Les animaux en restriction alimentaire seront suivis attentivement. Dès que l’isolement ou la restriction alimentaire n’est plus nécessaire les animaux sont remis en groupes et l’accès à la nourriture ad libidum. La collecte des fèces des animaux et l’analyse des métabolites présents dans ces fèces sera évaluée comme méthode alternative à la prise de sang à l’âge juvénile et adolescent.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que la souris est un mammifère social dont les capacités cognitives, affectives et sociales sont adaptées aux questions posées dans le projet. Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Les modèles de maltraitance utilisés seront implémentés entre 2 et 14j de vie, ce qui correspond à la petite enfance chez l’humain. Nous étudierons les interactions entre le fonctionnement cérébral en développement et trois modèles de maltraitance ainsi que sur le développement de l’axe du stress. Pour cela il est nécessaire d’utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l’homme. La souris remplit très bien cette condition. Notre projet vise à investiguer les effets comportementaux et biologiques spécifiques de différents modèles murins de maltraitance, à plusieurs périodes sensibles de la maturation du cerveau, chez des animaux juvéniles, adolescents et adultes des deux sexes. Pour chaque modèle la cinétique des effets sera observée à un stade précoce (enfance), puis à moyenne (adolescence) et longue (adulte) distance du traumatisme. Nous utiliserons donc des animaux nouveau-nés (PN inférieur à 15 jours), des adolescents (PN inférieur à 50 J) et des animaux à l’âge adulte (PN supérieur à 70 J) selon les expériences. L’expression adaptée des capacités cognitive, sociales et affectives des individus, dépend largement du fonctionnement de différentes régions cérébrales corticales-sous corticales dont la cinétique de maturation est différente. Nous étudierons les effets de différents types de maltraitance sur la trajectoire de maturation de ces régions cérébrales et la régulation de l’axe HPA et comment ces différences structurelles et moléculaires expliquent les altérations comportementales associées et potentiellement différentes en fonction de l'âge des animaux.