Éthologie / comportement / biologie animale

300 diamants mandarins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans être tués à l'issue, les adultes rejoignant l'élevage et les jeunes étant proposés à l'adoption. Les couples reproduisent trois mois en cages plus petites que les volières, une partie des jeunes est séparée du père, et chaque jeune passe six jours isolé lors d'un test de mémorisation spatiale, en contact auditif avec ses congénères. Le porteur décrit l'inconfort du confinement et le stress possible de l'isolement, qu'il dit atténuer par un environnement enrichi. Il affirme que l'étude de l'influence sociale sur le développement cognitif "nécessite" une espèce d'oiseau nidicole et exclut tout remplacement.

Objectifs

Chez les vertébrés et les oiseaux, il est reconnu que la qualité des soins parentaux et l’environnement peuvent avoir une incidence importante sur le développement des jeunes, notamment pour les espèces nidicoles. L’environnement social est ainsi essentiel pour les processus d’apprentissage des jeunes. A l’heure actuelle, la majorité des études se sont focalisées sur des comportements particuliers (ex : chant) ou sur la phase post-natale de développement au nid. Au contraire, l’impact de l’environnement social lors de la phase d’adolescence sur les capacités cognitives a été beaucoup moins étudié. Est-ce que l'instabilité du noyau parental affecte le développement cognitif des jeunes oiseaux ? Est-ce que la proximité sociale avec les autres membres de la famille améliore, ou au contraire, détériore le développement cognitif des jeunes oiseaux ? Est-ce que la proximité sociale permet d’atténuer les effets potentiels d’une perturbation du noyau parental ? Pour répondre à ces questions, nous visons à suivre le développement de 60 nichées de diamants mandarins confrontées à des conditions sociales différentes durant leur adolescence. Nous aurons ainsi 4 groupes d’oiseaux dont l’environnement social diffère durant la phase d’adolescence des jeunes. Lors de l’adolescence (après envol du nid) : (1) 15 nichées seront maintenus avec leurs deux parents dans un environnement social classique (grandes cages) ; (2) 15 nichées seront confrontées au retrait temporaire du père dans un environnement social classique (grandes cages) ; (3) 15 nichées seront maintenus avec leurs deux parents dans un environnement de proximité sociale (cages de taille modérée) ; (4) 15 nichées confrontées au retrait temporaire du père dans un environnement de proximité sociale (cages de taille modérée)). Une fois l'adolescence terminée, des tests cognitifs (mesures de mémorisation spatiale) seront effectués chez les individus devenus adultes pour répondre à nos questions. Cette espèce d'oiseau très social a été selectionnée car le père peut rester près des jeunes durant les deux semaines suivant l'envol, mais il peut également laisser sa descendance juste après l'envol pour entamer un nouvel épisode de reproduction. Ces deux conditions (absence ou présence du père) sont donc fréquemment retrouvées dans la nature et correspondent à uns situation "naturelle".

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer nos connaissances concernant l’apprentissage et la mise en place des comportements cognitifs chez les oiseaux nidicoles. Il permettra notamment de mieux comprendre l’impact de l’environnement social (noyau parental et proximité sociale) lors de l’adolescence sur la capacité de mémorisation spatiale des individus.

Procédures

Les animaux reproducteurs seront capturés pour transfert de leurs volières d'hébergement vers les cages de reproduction (2 captures par adulte en plus des captures hébdomadaires pour le suivi de la masse et de la santé des individus). Ces individus seront recapturés pour le retour en volière d'hébergement 3 mois après la mise en cage de reproduction quand les jeunes auront atteints l'age adulte. Les jeunes seront capturés 1 fois pour le transfert de la cage de naissance vers leurs volières d'hébergement. Il seront ensuite capturés 2 fois pour être transférés dans le dispositif de test de mémorisation et pour retourner dans leur volière d'hébergement. Pendant la phase de test de mémorisation, les individus seront isolés de leurs congénères (pendant 6 jours), mais ils resteront en contact auditif. Les procédures de capture et de transfert prendront 3 minutes au maximum. Les jeunes seront également capturés une fois par semaine pour le suivi de leur masse et de leur état de santé).

Impact sur les animaux

La reproduction des individus dans les cages plus petites que les volières pendant 3 mois peut représenter un léger inconfort. Tous les individus concernés seront placés dans des volières de très grande taille suite au projet. L’effet du retrait du père devrait être limité car c’est un âge où les jeunes ne sont plus dépendants de leurs parents pour l’accès à la nourriture. Dans la nature, c’est également un âge ou le père abandonne fréquemment les jeunes en les laissant sous la garde de la mère uniquement. Les tests de mémorisation spatiale pourraient provoquer un stress (6 jours consécutifs) et sera minimisé par des conditions optimisées durant le test (contact auditif avec congénères, reconstitution de l’environnement de la cage de naissance).

Devenir

Du fait des procédures légères utilisées, tous les animaux seront gardés en vie et seront réintégrés à l'élevage de l'établissement utilisateur (adultes) ou adoptés (jeunes).

Remplacement

L’essence de ce projet est de tester l’influence des conditions sociales lors de l’adolescence sur le développement cognitif des oiseaux nidicoles. De ce fait, le remplacement n’est pas possible et l’utilisation d’une espèce modèle d’oiseau nidicole est nécessaire.

Réduction

La taille des 4 lots permettra de disposer d’une quinzaine de couples par traitement, et de 45 jeunes par traitement. Ceci représente une taille adaptée pour tester l’effet des variables considérés sur la mémorisation spatiale. Le nombre de 45 jeunes par condition a été établi à l'aide d'un test dit de puissance et garantit l'obtention de résultats exploitables. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés.

Raffinement

La souffrance et l'angoisse des mandarins seront réduites au minimum en (1) fournissant un environnement enrichi aux individus reproducteurs et aux jeunes mandarins (cages enrichies avec jouets, bains, et abris, photopériode adéquate, température optimale); (2) réduisant la durée des interventions pour chaque cage (passage journalier de 10 minutes par cage avec observation des comportements et « scoring » des individus) ; (3) en faisant réaliser les tests cognitifs par du personnel expérimenté et en réalisant ces tests derrière un miroir sans tain.

Choix des espèces

Le diamant mandarin est une espèce classiquement utilisée pour étudier les oiseaux nidicoles en laboratoire. Leur élevage est facile et très bien maitrisé. De plus, c’est une espèce modèle pour étudier la cognition chez les oiseaux et les protocoles de tests cognitifs ont été validés dans de multiples études. C'est par ailleurs une espèce très sociale qui vit avec une proximité des individus très importante. Les individus seront étudiés durant la reproduction (60 couples) et le développement des jeunes issus de cette reproduction (180 individus).

270 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées pendant une à six semaines, subissent des tests moteurs répétés et un électromyogramme sous anesthésie, pour tester l'hypothèse d'un lien entre déficit en macrophages thymiques et myasthénie. Le porteur indique que les molécules injectées peuvent provoquer une fébrilité transitoire. Il justifie le recours à l'animal par un "besoin" de valider chez la souris des observations faites chez des patients et in vitro.

Objectifs

La myasthénie grave est une maladie auto-immune rare. Elle est liée à la production d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur à l’acétylcholine (RACh), situé à la jonction entre le nerf et le muscle. Ces auto-anticorps altèrent la transmission du message nerveux entre le nerf et le muscle conduisant à des faiblesses musculaires plus ou moins invalidantes. Il n’existe actuellement aucun traitement pour guérir de la myasthénie. Les traitements actuels proposés aux patients sont essentiellement pour limiter les symptômes ou non-spécifiques, et doivent être pris à vie. Dans la myasthénie, si le muscle est l’organe cible, l’organe effecteur est le thymus. Une diminution du nombre des macrophages dans le thymus des patients myasthéniques a été récemment mise en évidence. Notre hypothèse est que ce défaut en macrophages de l’inflammation du thymus à l’origine de la myasthénie. Ce projet de recherche a pour but de démontrer chez la souris qu’une diminution du nombre de macrophages thymiques induit des changements thymiques comme ceux observés chez les patients, et à long terme une myasthénie.

Bénéfices attendus

La myasthénie autoimmune est une maladie chronique invalidante. On ne sait pas exactement encore pourquoi des personnes développent cette maladie. La compréhension des mécanismes étiologiques est donc très importante pour proposer de nouveaux traitements plus adaptés aux patients. En effet, à l’heure actuelle, les traitements proposés sont souvent des immunosuppresseurs à vie et/ou une ablation radicale du thymus. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un défaut en macrophages thymiques serait à l’origine de l’inflammation thymique conduisant à la myasthénie. Il n’y a pas de modèle spontané connu de cette pathologie chez la souris. Nous souhaitons utiliser une combinaison de molécules pour : 1) Démontrer que l’injection intrapéritonéale de ces molécules peut induire au bout d’une semaine, une inflammation dans le thymus. 2) Démontrer que les effets ces molécules sont exacerbés chez des souris transgénique qui ont moins de macrophages. 3) Sur des manipes plus longues (6 semaines), rechercher chez des souris ayant moins de macrophages thymiques, l’apparition de symptômes myasthéniques. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment la myasthénie se met en place afin de proposer ensuite de nouvelles approches thérapeutiques aux patients.

Procédures

1) L’injection intra péritonéale consiste à injecter un produit directement dans le péritoine, en bas de l’abdomen, afin d’induire une réponse systémique rapide. Cette manipulation se fait sur souris vigiles et dure quelques secondes. Geste réalisé sur chaque souris et selon les procédures: - 3/sem pendant 1 semaine pour 90 souris – 3/sem pendant 4 semaines pour 36 souris – tous les jours pendant 1 semaine 36 souris – 2/sem pendant 6 semaines pour 108 souris. 2) Les tests cliniques visent à étudier l’activité motrice des différents animaux afin d'évaluer l'apparition de la pathologie et les effets du traitement. L’évaluation comportementale de l’activité motrice des souris est pratiquée à l’aide de tests usuels, basés sur le comportement spontané des rongeurs (Grip test après une course sur tapis de 5 minutes et grille retournée) et la mesure du poids. 5 mesures sont faites par souris pour le grip test et un test de la grille retournée; chaque test durant 1 minute maximum. Ces tests concernent 108 souris et sont menés tout au long du protocole expérimental : une séance d’habituation (pour minimiser le stress associé aux manipulations répétées) est effectuée quelques jours avant la première injection et ensuite des séances régulières sont espacées de 8 à 12 jours. 3) L’electromyogramme permet de suivre le statut myasthénique suite à une stimulation du muscle squelettique. Pour ce protocole les souris sont anesthésiées. Après l’examen, les souris sont ensuite replacées dans leur cage initiale. L’examen, qui dure en totalité de 10 à 15 minutes par animal, sera pratiqué quelques heures avant l’euthanasie de la souris à la fin du protocole expérimentale et ne sera donc réalisé qu’une seule fois par animal. Cette procédure concerne 108 souris dans ce projet.

Impact sur les animaux

Les molécules injectées peuvent entrainer une fébrilité transitoire due à l’activation du système immunitaire. Les injections intrapéritonéales ne sont pas invasives pour les souris, le geste étant rapide et n’entrainant pas de blessure chez l’animal ou de gêne pour le déplacement. Les tests cliniques n’entrainent pas de stress particulier chez la souris. L’électromyogramme sera effectué sur les souris anesthésiées et elles ne ressentiront pas la douleur dût au test. Dès la fin de la manipulation, l’animal est euthanasié et n’est donc pas impacté pour la suite par cette procédure.

Devenir

Tous les animaux à la fin de ce projet sont euthanasiés. Effectivement à la fin de chaque protocole, il est nécessaire de prélever différents organes et tissus pour pouvoir étudier l’impact physiologique et moléculaire des différents traitements utilisés. Ceci a pour but d’optimiser l’utilisation des souris de ce projet.

Remplacement

A ce jour notre projet découle d’observations faites chez des patients myasthéniques et d’expériences in vitro. Maintenant, nous avons besoin de valider nos observations avec des modèles animaux, afin de démontrer que la myasthénie pourrait être due à une diminution des macrophages thymiques

Réduction

Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données et par un test de puissance, pour obtenir des résultats fiables à la suite de nos expériences, tout en utilisant le minimum d'animaux. En tout 270 souris sont nécessaires à la réalisation de ce projet expérimentale

Raffinement

Lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris sont acclimatées pendant au moins 1 semaine. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). L'utilisation de "Sizzlenests" (bandes de papier Kraft autoclavées) permet aux rongeurs de faire rapidement des nids. Le nid leur permet d’être moins dérangés par le bruit, la lumière, le mouvement et les changements de température. Il donne un sentiment de sécurité, ce qui réduit le stress des animaux et donc leur agressivité. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles d'aller chercher la nourriture en hauteur. Afin de limiter au maximum la douleur et le stress chez les animaux lors des injections intrapéritonéales, elles seront effectuées alternativement à gauche et à droite dans la partie basse de l’abdomen. Une séance d’habituation aux tests cliniques est effectuée quelques jours avant la première injection pour minimiser le stress associé aux manipulations. Le score clinique complet est évalué tous les 8-12 jours. Lors de l’électromyographie, la souris est anesthésié afin qu’elle ne ressente pas la douleur. La souris est ensuite euthanasiée juste après les mesures et ne ressent pas les conséquences de ce protocole. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers pour repérer d’éventuels signes de mal-être, de blessures ou si elles atteignent des points limites. Dans ces cas la souris est euthanasiée.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées pour la mise en place de modèles pour des maladies autoimmunes, dont la myasthénie. L’avantage de la souris est que le système immunitaire est bien mieux connu et que des souris transgéniques, déficientes pour des gènes précis, peuvent être utilisées. Des souris femelles seront utilisées car la myasthénie est une maladie qui touche majoritairement les femmes. Les expériences seront effectuées sur des souris de 6 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence, période d’apparition de la maladie chez l’humain.

200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'extraction de leur cerveau. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique d'une à trois heures pour l'implantation d'une barre en acier et une injection virale, avec des fibres optiques dans le cerveau pour 100 d'entre elles, puis un à cinq mois d'entraînement en réalité virtuelle, tête fixée, isolée en cage et maintenue par restriction hydrique à 85 % de son poids d'origine. Environ 180 subissent ensuite une craniotomie, et des électrodes leur sont insérées dans le cerveau, parfois chaque jour, pendant un à quinze jours d'enregistrement. Le but est d'observer comment le cerveau prépare plusieurs décisions à la fois pendant une recherche de nourriture ou d'eau, comportement que le porteur qualifie d'"éthologiquement intéressant". Il écarte la drosophile au motif que son circuit neuronal diffère de celui des mammifères, et conclut qu'il "s'avère donc nécessaire" de recourir à la souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'identifier les principes neuronaux et computationnels indispensables à la flexibilité comportementale. L’hypothèse centrale est que le cerveau peut imaginer et préparer plusieurs décisions simultanément pour pouvoir changer plus facilement de décisions lorsqu'une situation change. Nous combinerons des tâches comportementales réalisées en réalité virtuelle chez la souris avec des techniques innovantes d’électrophysiologie et de stimulation optique (optogénétique), et des modèles théoriques de décodage de l’activité neuronale. Cette approche nous permettra d’enregistrer et de manipuler simultanément des centaines de neurones dans un large réseau cortico-sous-cortical impliqué dans le contrôle volontaire de l’action durant la prise de décision. Nous choisirons d’étudier un comportement éthologiquement intéressant : le « foraging », qui consiste en la recherche de ressources en nourriture ou en eau.

Bénéfices attendus

Le projet produira une quantité sans précédente de données utiles à un large éventail d'études scientifiques. Ces données seront partagées avec la communauté scientifique après publication des résultats. Ces données seront donc réutilisables pour répondre à des questions scientifiques variées. Plus particulièrement, les résultats de ce projet pourront offrir une nouvelle approche de la flexibilité cognitive au cours de la prise de décision. Ce projet éclairera également les variations individuelles dans les processus décisionnels, ouvrant la voie pour mieux comprendre la diversité comportementale et ses dysfonctionnements cognitifs.

Procédures

(1) Implantation d’une barre en acier et de fibres optiques : cette phase expérimentale consiste en une procédure chirurgicale qui s’effectuera sur tous les animaux (N = 200) sous anesthésie générale. Durant la procédure, une injection virale sera réalisée à l’aide d’un nano-injecteur et des fibres optiques miniatures seront insérées dans le cerveau de certains animaux (N = 100) sur lesquels nous effectuerons des expériences de stimulations optiques. Ces chirurgies stéréotaxiques durent entre 1h et 3h pour chaque animal. (2) Entrainement : cette phase durera entre 1 mois et 5 mois en fonction de la performance de l’animal. Les animaux (N = 200) seront placés dans la plateforme expérimentale 5 jours par semaine pendant 20 à 60 min et pesés quotidiennement avant la séance. (3) Craniotomies : certains animaux entrainés (approximativement N = 180) subiront une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui permettra de réaliser de petites craniotomies. Cette intervention est rapide (20 à 30 min). (4) Enregistrement : l’animal sera placé dans sa plateforme expérimentale et une ou plusieurs électrodes seront lentement insérées jusqu’à leurs positions finales. Cette procédure pourra être répétée quotidiennement pendant plusieurs jours. Cette phase peut durer entre 1 et 15 jours en fonction des résultats. (5) Mise à mort : Tous les animaux (N = 200) seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets plus ou moins nuisibles à la santé des animaux peuvent être attendus. 1) Isolement : pour leur protection, les animaux devront être hébergés individuellement dans leur cage 2) Restriction hydrique : les animaux seront maintenus à 85% de leur poids originel 3) Interventions chirurgicales sous anesthésie : les conséquences de ces interventions sont parfois néfastes (hémorragie, infection, détresse respiratoire, douleurs post-opératoires) 4) Implants : potentielle gêne occasionnée par un corp étranger 5) Stress lié à la manipulation : les animaux seront manipulés durant les phases de tests 6) Restriction des mouvements : les animaux auront la tête fixée durant les périodes de tests

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure dans le but de procéder à l'extraction du cerveau à des fins histologiques.

Remplacement

Pour évaluer la complexité des comportements adaptatifs, comme proposé dans ce projet, il est fondamental d'utiliser un modèle animal approprié qui ne peut être facilement remplacé par des expériences in vitro ou des modèles informatiques. D’autre part, l'étude des bases neuronales de la prise de décision par l’enregistrement et la manipulation sélective de l’activité des neurones nécessitent des techniques invasives qui ne peuvent pas être réalisées chez des sujets humains sains et extrêmement rarement chez des sujets malades. Certaines espèces d'invertébrés, telles que la mouche des fruits (drosophile), pourrait sembler adaptées à l’étude du comportement de foraging et aux manipulations génétiques des systèmes cérébraux. Cependant, l'anatomie du circuit neuronal de la drosophile est considérablement différente de celle des mammifères. Ainsi, les résultats scientifiques obtenus chez ces espèces ne sont pas facilement généralisables aux questions abordées dans ce projet. En l'absence de méthode de remplacement possible, il s’avère donc nécessaire d'avoir recours au modèle animal murin dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des résultats statistiques fiables et significatifs. L'utilisation d'outils électrophysiologiques comportant des centaines de sites d'enregistrement réduira aussi considérablement le nombre de sessions d'enregistrement et d'animaux nécessaires pour obtenir des statistiques fiables. Par ailleurs, les données comportementales et neuronales seront extraites des mêmes individus pour réduire encore d’avantage le nombre d’animaux. D’après nos études précédentes, nous estimons que 45 souris par axe de recherche sont nécessaires, et le double pour l'axe de recherche necessitant un comparaison entre un groupe test et un groupe contrôle (soit 180 animaux au total). Etant donné la difficulté technique qu’implique la réalisation des enregistrements et la bonne performance des animaux dans la tâche, un pourcentage de perte de l’ordre de 10% ou plus est à prévoir, ce qui augmente l’estimation finale à 200 animaux pour les 5 ans.

Raffinement

Des méthodes de raffinement seront mises en place dans le but d’atténuer les nuisances provoquées par les procédures expérimentales. Le poids des animaux sera surveillé quotidiennement et la poursuite du protocole de restriction hydrique sera décidée en fonction du bien-être des animaux. L’eau naturelle ad-libitum sera remise à disposition pour assurer la récupération totale du poids si la perte de poids est supérieure à 20%. Afin de réduire le stress, les animaux seront habitués, par étapes, à la présence et aux interactions avec l’expérimentateur plusieurs jours avant le début des tests. L’angoisse éventuellement ressenti par l’animal due à la contention sera atténuée par une habituation renforcée positivement via des récompenses (eau sucrée).  Pour prévenir la douleur et les inflammations, nous administrerons à chaque chirurgie des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti-inflammatoires.En cas de sècheresse ou rougeur légère de la peau autour de l’implant, l’animal sera traité localement par une solution dermatologique. Dès l’apparition de comportements anormaux (ex : absence de toilettage, perte de plus de 20% du poids) ou autres signes de souffrance (évalués sur une grille d’évaluation de la douleur) survenant après l’implantation, l’animal recevra un traitement analgésique en sous cutané. Si des signes de souffrances persistent plus de 72h l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle animal le plus approprié pour ce projet et il n'existe pas d'alternative méthodologique. Tout d’abord, l'organisation du néocortex chez la souris comporte des similitudes avec d'autres espèces de mammifères, y compris les humains, et peut donc être utilisée pour révéler des principes généraux de prise de décision. Les souris peuvent aussi être entraînées à effectuer des tâches assez complexes dans des environnements expérimentaux contrôles. Les outils génétiques pour cibler et moduler des populations spécifiques de neurones sont également très bien développés chez la souris et relativement faciles à utiliser. Comme les souris ont un cerveau relativement petit, il est aussi possible d’enregistrer plusieurs régions cérébrales simultanément. Le fait que toutes ces procédures soient devenues l'état de l'art chez la souris facilitera et accélèrera donc grandement l'avancement du projet. Nous utiliserons de jeunes adultes au moment de l’implantation (âgées de 8 à 12 semaines). Il est important que les animaux soient relativement jeunes pour un apprentissage plus rapide et une meilleure performance dans la tâche. Cependant, les animaux doivent avoir terminé leur croissance pour éviter que la taille de la boite crânienne ne change au cours de l’expérience.

50 cailles japonaises vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme dans le premier volet du projet, elles subissent une castration chirurgicale sous anesthésie, pour 40 d'entre elles la pose d'implants de testostérone, puis des tests de comportement dont le détail n'est pas précisé, avant le prélèvement du cerveau. L'étude prolonge la recherche sur la régulation des comportements par la photopériode chez cette espèce. Le porteur affirme que ces études comportementales n'ont "pas de système alternatif" et ne se mesurent que sur animal vigile.

Objectifs

En élevage intensif, les volailles de chair sont soumises à des programmes lumineux avec une longue période de jour (18 h de lumière / 6h de nuit). Ces programmes augmentent le temps d’accès de ces animaux diurnes à la nourriture ce qui accélère leur croissance et augmente la productivité. Néanmoins, de tels programmes lumineux ont des effets délétères bien établis sur la santé des animaux. L’exposition continue à des jours longs augmente la fréquence de certaines pathologies, favorise l’apparition de comportements aberrants et apparaît comme une source notable de stress ; de tels programmes lumineux impactent donc négativement le bien-être de l’animal. Dans une précédente étude que nous avons conduite chez la caille japonaise, nous avons pu mettre en évidence que la photopériode a un effet sur des comportements clés de l'adaptation de l'animal à son environnement, tels que la représentation mentale de son environnement, la cognition au sens large, l’agressivité et le contrôle de l’activité sexuelle. Chez les mammifères, tous ces comportements sont fortement régulés par les hormones sexuelles, en particulier la testostérone chez les mâles. La production de ces hormones sexuelles varie chez les animaux saisonnés, dont la caille japonaise, en fonction de la durée du jour. Les cailles sont sexuellement actives en jours longs, mais complètement inactives en jours courts ; chez les mâles la taille des testicules – et donc la production de testostérone - varie d’un facteur 100 selon la photopériode. Bien que la testostérone soit un modulateur hormonal reconnu de nombreux comportements, dont l’agressivité, il est établi que, chez les oiseaux, ce comportement n'est pas nécessairement corrélé au taux de testostérone. Il semble donc que la photopériode impacte certains comportements via des voies indépendantes des stéroïdes sexuels. Ce projet a donc pour but de tester cette hypothèse, en dissociant l'influence de la photopériode de celles des hormones sexuelles. Nous utiliserons pour nos expériences la caille japonaise qui est un modèle d’étude d’intégration du signal photopériodique depuis plus d’un demi-siècle. De ce fait il existe chez cette espèce de robustes outils endocrines et moléculaires qui permettent de suivre précisément l’intégration du signal photopériodique.

Bénéfices attendus

Avoir une meilleure compréhension des mécanismes de régulation des comportements par la photopériode chez la caille japonaise.

Procédures

50 animaux subiront une gonadectomie, dont 40 avec une pose d’implants de testostérone à l’âge de trois semaines sous anesthésie générale et analgésie (environ 10 minutes d'intervention) . 20 animaux seront concernés par un retrait des implants de testostérone à 7 semaines sous anesthésie générale et analgésie ( intervention de 5 min). 40 animaux participeront une fois à chaque test de comportement (5 min par tests).

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux par l'expérimentateur peut induire un stress. La mise à jeun pour une nuit la veille de la gonadectomie peut engendrer un stress. La gonadectomie et la pose des implants peuvent entrainer des douleurs viscérales, musculaires et cutanées et peut présenter un risque d'hémorragie, ainsi qu'un stress. Le retrait des implants peut entrainer des douleurs cutanées et un stress. L’isolement lié à l'hébergement et lors des tests de comportements peut entrainer un stress.

Devenir

À la fin de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour être étudié.

Remplacement

Les études de comportement ne sont pas réalisables in vitro ni par modélisation. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tous comportements, ne s'expriment et se mesurent uniquement sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant d'observer des différences statistiques éventuelles sur la base de notre expérience préalable quant à la variabilité des réponses comportementales et physiologiques.

Raffinement

Une anesthésie et une analgésie seront mises en place lors des chirurgies, et un suivi post opératoire sera effectué. L'hébergement des animaux se fera en cage individuelle avec enrichissement et contact sociaux visuel et olfactif. En cas de plaie ou de signe de douleur, le responsable du bien-être animal est informé directement afin de traiter l'animal (analgésiques et/ou antiseptiques, ajout de nourriture appétente). Si le traitement ne fonctionne pas et en accord avec les points limites définis, l'euthanasie sera décidée par les responsables du projet pour éviter des souffrances inutiles.

Choix des espèces

La petite taille, la prolificité et le développement rapide de la caille japonaise font de cet oiseau un modèle idéal pour les études réalisées dans le domaine aviaire, avicole. Par ailleurs, la caille japonaise est un modèle d’étude depuis de nombreuses années sur l’intégration du signal photopériodique en lien avec la reproduction. Des outils spécifiques pour examiner l’intégration du signal photopériodique ont donc déjà été développés sur cette espèce. 50 cailles mâles seront utilisées à partir du stade juvénile.

130 cailles japonaises vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 50 d'entre elles subissent une castration chirurgicale sous anesthésie, dont 40 avec pose d'implants de testostérone, avant de participer à des tests de comportement dont le porteur ne précise pas le détail. L'étude vise à dissocier l'effet de la photopériode de celui des hormones sexuelles sur des comportements comme l'agressivité, avec en perspective déclarée un meilleur contrôle du stress et de l'agressivité des volailles d'élevage soumises aux programmes lumineux intensifs. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun système alternatif à ces études, les comportements ne se mesurant selon lui que sur animal vigile.

Objectifs

En élevage intensif, les volailles de chair sont soumises à des programmes lumineux avec une longue période de jour (18 h de lumière / 6h de nuit). Ces programmes augmentent le temps d’accès de ces animaux diurnes à la nourriture ce qui accélère leur croissance et augmente la productivité. Néanmoins, de tels programmes lumineux ont des effets délétères bien établis sur la santé des animaux. L’exposition continue à des jours longs augmente la fréquence de certaines pathologies, favorise l’apparition de comportements aberrants et apparaît comme une source notable de stress ; de tels programmes lumineux impactent donc négativement le bien-être de l’animal. Dans une précédente étude que nous avons conduite chez la caille japonaise, nous avons pu mettre en évidence que la photopériode a un effet sur des comportements clés de l'adaptation de l'animal à son environnement, tels que la représentation mentale de son environnement, la cognition au sens large, l’agressivité et le contrôle de l’activité sexuelle. Chez les mammifères, tous ces comportements sont fortement régulés par les hormones sexuelles, en particulier la testostérone chez les mâles. La production de ces hormones sexuelles varie chez les animaux saisonnés, dont la caille japonaise, en fonction de la durée du jour. Les cailles sont sexuellement actives en jours longs, mais complètement inactives en jours courts ; chez les mâles la taille des testicules – et donc la production de testostérone - varie d’un facteur 100 selon la photopériode. Bien que la testostérone soit un modulateur hormonal reconnu de nombreux comportements, dont l’agressivité, il est établi que, chez les oiseaux, ce comportement n'est pas nécessairement corrélé au taux de testostérone. Il semble donc que la photopériode impacte certains comportements via des voies indépendantes des stéroïdes sexuels. Ce projet a donc pour but de tester cette hypothèse, en dissociant l'influence de la photopériode de celles des hormones sexuelles. Nous utiliserons pour nos expériences la caille japonaise qui est un modèle d’étude d’intégration du signal photopériodique depuis plus d’un demi-siècle. De ce fait il existe chez cette espèce de robustes outils endocrines et moléculaires qui permettent de suivre précisément l’intégration du signal photopériodique.

Bénéfices attendus

Avoir une meilleure compréhension des mécanismes de régulation des comportements par la photopériode chez la caille japonaise, ce qui pourrait permettre de mieux contrôler le stress et l'agressivité des volailles d'élevage soumises aux traitements lumineux.

Procédures

Une gonadectomie sera réalisée sur 50 animaux, dont 40 avec une pose d’implants de testostérone à l’âge de trois semaines sous anesthésie générale et analgésie (environ 10 minutes d'intervention). 20 animaux seront concernés par un retrait des implants de testostérone à 7 semaines sous anesthésie générale et analgésie (intervention de 5 min). 120 animaux participeront une fois à chaque test de comportement (5 min par tests).

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux par l'expérimentateur peut induire un stress. La mise à jeun pour une nuit la veille de la gonadectomie peut engendrer un stress. La gonadectomie et la pose des implants peuvent entrainer des douleurs viscérales, musculaires et cutanées et peut présenter un risque d'hémorragie, ainsi qu'un stress. Le retrait des implants peut entrainer des douleurs cutanées et un stress. L’isolement lié à l'hébergement et lors des tests de comportements peut entrainer un stress.

Devenir

À la fin de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés et leur cerveau prélevé pour être étudié

Remplacement

Les études de comportement ne sont pas réalisables in vitro ni par modélisation. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tous comportements, ne s'expriment et se mesurent uniquement sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant d'observer des différences statistiques éventuelles sur la base de notre expérience préalable quant à la variabilité des réponses comportementales et physiologiques (photopériode).

Raffinement

Une anesthésie et une analgésie seront mises en place lors des chirurgies, et un suivi post opératoire sera effectué. L'hébergement des animaux se fera en cage individuelle avec enrichissement et contact sociaux visuel et olfactif. En cas de plaie ou de signe de douleur, le responsable du bien-être animal est informé directement afin de traiter l'animal (analgésiques et/ou antiseptiques, ajout de nourriture appétente). Si le traitement ne fonctionne pas et en accord avec les points limites définis, l'euthanasie sera décidée par les responsables du projet pour éviter des souffrances inutiles.

Choix des espèces

La petite taille, la prolificité et le développement rapide de la caille japonaise font de cet oiseau un modèle idéal pour les études réalisées dans le domaine aviaire, avicole. Par ailleurs, la caille japonaise est un modèle d’étude depuis de nombreuses années sur l’intégration du signal photopériodique en lien avec la reproduction. Des outils spécifiques pour examiner l’intégration du signal photopériodique ont donc déjà été développés sur cette espèce. 50 cailles mâles seront utilisées à partir du stade juvénile et 80 autres cailles mâles seront utilisées au stade adulte.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne de D-galactose pendant dix semaines pour provoquer un vieillissement accéléré avec déficits de mémoire et anxiété, puis passent cinq tests comportementaux dont un test de peur conditionnée. Le porteur étudie le rôle des exosomes et d'un régime enrichi en oméga-3 dans la protection des fonctions cognitives liées à l'âge. Il affirme que le comportement et les régimes ne s'étudient que sur animal vivant, avant prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le vieillissement s’accompagne d’une inflammation chronique à bas bruit, c’est-à-dire qu’elle est silencieuse, le mécanisme inflammatoire se situe alors sous le seuil de la douleur et cause des dégâts dans l’organisme sans qu’il y ait de foyer inflammatoire précis. Cette inflammation impliquent notamment la communication entre les neurones et les cellules microgliales, les principales cellules du système immunitaire cérébral. Cette communication repose sur des vésicules extracellulaires, les exosomes, qui participent à la fois aux fonctions physiologiques et aux réponses inflammatoires dans le cerveau. L’alimentation est clé dans le bon fonctionnement cérébral et le vieillissement cognitif. Les acides gras polyinsaturés n-3 (AGPI n-3) ou oméga 3, ont un rôle bénéfique sur les fonctions cognitives. Leurs mécanismes d’action restent à ce jour méconnus. Ce projet consiste à identifier les biomarqueurs du cerveau du risque de déclin cognitif accéléré par l'étude des exosomes, et de déterminer le rôle des exosomes dans la protection par la nutrition des fonctions cognitives dans un modèle de vieillissement murin accéléré. Ce projet a pour objectif d’identifier des biomarqueurs cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles ciblant la neuroinflammation pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Nous allons utiliser un modèle de vieillissement accéléré déjà établi, reposant sur l'utilisation du D-galactose, et soumettre une partie des animaux à un régime enrichi en Oméga-3 afin de protéger des effets cognitifs. Nous étudierons alors les capacités de mémoire, la neuroinflammation et les exosomes.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la protection des effets du vieillissement par les oméga-3. Il permettra également de déterminer des marqueurs du vieillissement cérébral au niveau sub-cellulaire (exosomes) et ceci dans le cerveau mais également dans le sang.

Procédures

Injection quotidienne de D-galactose ou Saline chez les souris pendant 10 semaines. Tests comportementaux à la fin du modèle D-galactose (10 semaines) (5 tests par animal) – quelques minutes par test.

Impact sur les animaux

Le modèle D-galactose peut impacter le bien être de l'animal par l'injection SC journalière durant les 10 semaines. Ce modèle étant un modèle de vieillissement accéléré, il est attendu que les animaux présentent des déficits de mémoire ainsi qu'une augmentation de leur anxiété. Le modèle D-galactose peut entrainer un comportement de maladie, un suivi des animaux est prévu avec la grille de score bien être. Le régime supplémenté en oméga 3 n'impacte en rien le bien-être de l'animal. Les tests comportementaux ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Le test de peur conditionné peut induire un gêne passagère des animaux durant la phase d'acquisition du comportement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou exosomes nécessaires pour les études biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier le rôle des exosomes dans les déficits cognitifs liés à l'âge et la protection de ces déficits par un réfime enrichi en oméga-3. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de biologie cellulaire, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique. Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire au projet sur la base de nos résultats antérieurs permettant d'obtenir des résultats comportementaux ou biochimique/biologie cellulaire robustes. Nous nous sommes également basés sur le nombre d'animaux nécessaire à l'obtention d'une quantité de matériel suffisante pour l'étude des vésicules extra cellulaires, fort de nos résultats préliminaires au laboratoire.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

L’objectif général du projet vise d’identifier des biomarqueurs mécanistiques cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vivo chez la souris par l'utilisation de régimes imitant les statuts nutritionnels humains. Ce projet s'appuie également sur les données issues d'un article utilisant ce modèle et des régimes enrichis en lipides chez la souris. Dans la cadre de cette étude, le recours à ce modèle murin est donc pertinent et adapté aux objectifs fixés dans l'étude. Le modèle D-galactose est introduit à l'âge adulte. Nous utiliserons donc des animaux contrôles adultes dans ce projet.

234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèle de trisomie 21, elles reçoivent des injections dans l'abdomen chaque jour pendant jusqu'à 23 jours, puis passent des tests d'apprentissage et de mémoire. Le porteur indique une douleur accentuée par la répétition des injections et un stress lié à l'isolement et à l'appauvrissement du milieu. L'objectif affiché est de tester trois molécules censées améliorer les performances cognitives, les souris étant tuées pour prélever les cerveaux.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent 3 nouveaux composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer le composé parmi ces 3 candidats (composés 1,2 et 3) qui se révélera le plus efficace en termes de restauration des fonctions intellectuelles. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoire, mémoire de travail et mémoire explicite) dans un modèle souris de trisomie 21, qui montre de faibles résultats dans ces 2 tests.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidienement par voie intraperitonéale avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 23 jours. Le temps de l'injection dure 20 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une aiguille pour l'injection en intraperitoneale. Cette douleur sera accentuée à cause de la repetition des injections, 23 au total, soit 1 par jour. L'isolement des animaux et l'appauvrissement du milieu peut entrainer un stress.

Devenir

Pour la phase 1 (validation de l'activité de la proteine d'intérêt), tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 12 jours de traitement. Les cerveaux seront prelevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeuthique. Pour la phase 2 (test d'apprentissage et de mémoire), tous les animaux seront euthanasiés 24 heures après la fin du test permettant d'evaluer les effets des molécules à visée thérapeuthique sur la mémoire et l'apprentissage. Les cerveaux seront prélevés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons les 3 composés sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. Une première phase visant a s’assurer de l’effet des inhibiteurs sur l’activité kinase de Dyrk1a sera effectuée. Dans le cas où les molécules testées ne montrent pas l’effet inhibiteur attendu, la phase 2 ne sera pas menée. Pour cette 1ère phase, nous utiliserons 90 souris, réparties en 10 souris sauvages non traitées, 10 souris trisomiques non traitées et 10 souris trisomiques traitées, soit 30 souris x 3 composés évalués, soit 90 souris. Pour cette 1ère phase, notre expérience dans ce domaine nous indique que 10 individus sont suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Pour la 2ème phase de projet, nous allons utiliser un total de 144 souris. L'étude se déroulera en 3 groupes d’expériences (1 groupe par composé) comme détaillée ci-dessous : Pour chacun des différents composés nous aurons besoin de 3 lots d’animaux : - 16 Souris contrôles sauvages non traitées - 16 Souris contrôles trisomiques non traitées - 16 Souris trisomiques traitées, pour 3 molécules différentes. Notre experience dans ce domaine nous montre que 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne reponderont pas, c'est pourquoi nous testeront 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de contention, ce qui évite la manipulation par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage pour palier à l'absence de nid, comme enrichissement du milieu. Les animaux seront elevés en groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement, sauf au moment du test du nouvel objet, pour augmenter le niveau d'exploration des souris. Le point d'injection sera alterné droite gauche tous les jours pour limiter la douleur et surveillé quotidiennement. Si des plaies apparaissent au site d'injection, elles seront désinfectées par un antiseptique local + crème cicatrisante (Betadine + Vetramil). Si la plaie devient importante et/ou profonde avec développement d’une infection ou une aggravation à 48h malgré les soins, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, cela permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du Syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents. Dans cette étude, les deux sexes seront utilisés. Nous voulons être sûre que les hormones et donc le sexe n’impactent pas sur l’effet des produits testés.