Éthologie / comportement / biologie animale

2 000 poissons sauvages, truites, chabots et blageons, vont être capturés et relâchés après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, 1 950 individus reçoivent un transpondeur implanté par incision ventrale et 50 truites une seconde incision de deux centimètres pour un émetteur radio suturé, afin d'évaluer le franchissement de deux passes à poissons. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et évoque une mortalité post-opératoire qu'il estime très faible. Il affirme que l'étude comportementale in situ ne peut se faire que sur des individus vivants dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce aux technologies RFID (Radio Frequency IDentification) et radiotélémétrie, la franchissabilité de 2 aménagements réalisés au niveau de 2 seuils infranchissables (ponts routiers) pour rétablir la continuité écologique un grand cours d'eau alpin. Sur ce cours d'eau, de nombreuses améliorations ont été réalisées ces dernières années, notamment sur la continuité écologique : les deux seuils visés ont été aménagés pour le franchissement piscicole il y a 9 ans. Ces aménagements permettent une circulation (montaison et dévalaison) a priori facilitée qu’il convient de vérifier en combinant deux technologies au regard du gabarit du cours d’eau : la RFID et la radiotélémétrie. La radiotélémétrie est utilisée en complément de la RFID car cette technologie permet d'envoyer un signal à longue portée (100-200m), permettant de travailler dans des grands milieux et de caractériser des comportements / franchissements au niveau de voies de passages qu'on ne peut pas équiper par RFID.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » des deux seuils éuipés de passes à poissons à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'950 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau. Pour 50 individus, un double-marquage sera réalisé et un émetteur radio sera implanté manuellement en plus du PIT tag, impliquant une incision ventrale de 2 cm, qui sera suturée. La procédure durera au total 2 à 3 minutes, pendant lesquelles les individus seront maintenus sous sédation dans un bain d’anesthésiant

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux.

Devenir

Remise à l'eau après marquage

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le chabot et le blageon. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité des ouvrages. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Pour la RFID : Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Pour la radiotélémétrie : après anesthésie, les poissons seront placés dans un bac rectangulaire de 10L contenant une concentration plus légère de benzocaïne (30 mg/L) pour maintenir les conditions d’anesthésie sur toute la durée de l’opération. Seule la tête sera maintenue dans l’eau et une canule introduite dans la bouche et reliée à une pompe d’aquarium pour assurer une irrigation permanente des branchies. Un champ stérile sera placé sur l’animal, la zone d’incision sera nettoyée à la vétidine, et un scalpel stérile sera utilisé. L’opérateur portera des gants stériles. Tout le matériel chirurgical sera désinfecté au steranios, ainsi que l’émetteur, puis rincés à l’eau purifiée. La taille de l’émetteur F1170 sera adapté et toujours < 2% du poids de l’animal (Annexe 1). Pour la suture, une aiguille pointe ronde diamant, 3/8 cercle 26mm, sera utilisée avec un fil monofilament résorbable Monosyn en glyconate. La pommade iodée sera ensuite appliquée. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, le blageon (Telestes souffia), petit cyprinidé rhéophile, sera étudié car jugé caractéristiques du secteur d’étude. Enfin, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage et de migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. 50 truites adultes de plus de 200g, soit environ 25 cm, seront également marquées à l’aide d’un émetteur radio (double marquage). Pour les blageons et chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

2 vaches vont être utilisées, gardées vivantes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la caillette, huit semaines de perfusions digestives continues de nutriments, puis l'obturation chirurgicale du cathéter, avec un suivi comportemental et des prises de sang pour mesurer le stress et l'inflammation. Le projet cherche à mettre au point une chirurgie moins invasive que la canule permanente du duodénum, présentée comme un raffinement au service d'études futures sur la digestion des ruminants. Le porteur affirme que les systèmes in vitro et in silico ne peuvent reproduire la répartition des nutriments entre organes et justifie le recours à l'espèce bovine.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’alternatives à l’utilisation de ruminants fistulés avec des canules permanentes pour développer de futurs essais sur la digestion et le métabolisme avec des vaches opérées par des techniques chirurgicales moins invasives. Il répond ainsi aux principes de réduction du nombre de bovins canulés de façon permanente et de raffinement des approches chirurgicales (règles des 3R). L’élevage des bovins doit faire face à de nombreux enjeux, tels que limiter les impacts environnementaux et la compétition avec l’alimentation humaine. Pour cela, il est nécessaire de bien connaitre les processus de digestion afin d’optimiser l’apport de nutriments (azotés, minéraux, vitamines) à l’animal et les processus métaboliques qui permettent à l’animal à la fois d'utiliser ces nutriments pour les différentes fonctions (immunitaire, reproduction, la synthèse de viande et de lait) et limiter leurs rejets dans l’environnement (pollutions). Du fait de la digestion microbienne dans le rumen, pour établir les recommandations sur les nutriments absorbés dans l’intestin grêle, il faut pouvoir maitriser leurs apports, ce qui ne peut se faire que par des perfusions de ces nutriments dans un compartiment post-rumen (comme la caillette ou le duodénum). L'objectif de cette demande d’autorisation est donc de soumettre à l’évaluation, une procédure chirurgicale moins lourde que la pose de la canule permanente du duodénum en la remplaçant par la pose d’un cathéter dans la caillette de petit diamètre. La chirurgie se fera sous anesthésie et analgésie locale. Une vérification de l’adéquation de la prise en charge de la douleur à la pose et de la bonne récupération des animaux à l’issue de la pose et après l’obturation du cathéter sera effectuée par un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et paramètres sanguins du stress et de l’inflammation). Une vérification de la fonctionnalité du système de perfusion des nutriments dans la caillette sur un temps comparable à un essai de perfusions de nutriments dans le duodénum sera également réalisée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de ce projet est de pouvoir réduire le nombre de bovins canulés du tube digestif de façon permanente et de raffiner les procédures en permettant de développer une approche chirurgicale (règles des 3R) moins invasive (anesthésie et analgésie multimodales locales vs. anesthésie et analgésie générale). Le bénéfice scientifique de la mise au point d’une telle procédure est de poursuivre le travail sur l’amélioration des systèmes d’alimentation des ruminants visant à calculer au plus juste les apports alimentaires en terme de nutriments absorbés dans l’intestin et leur effet sur le métabolisme. Ces différentes études nécessitent la connaissance / la maitrise des apports par perfusions digestives des nutriments étudiés. Pour éviter les modifications (transformations, utilisations, synthèses) dues à la digestion microbienne dans le rumen, ces perfusions doivent être réalisées dans les compartiments digestifs se situant en aval du rumen (comme la caillette équivalent de l’estomac chez les monogastriques). En effet, les recommandations alimentaires actuelles en acides aminés, vitamines et minéraux sont incomplètes en termes de composés et de situation d’élevage. Il est important, dans une démarche de transformation agroécologique des systèmes d’élevage, de pouvoir préciser les besoins des ruminants, les apports réels dans la ration, la biodisponibilité pour l’animal et le statut de déficit (carence en calcium, insuffisances en vitamine, acides aminés limitants), ou d’excès (pollutions) correspondant. Ces aspects ne peuvent être évalués qu’au travers d’expérimentations visant le plus souvent à relier des apports maitrisés de ces différents composés aux réponses de leurs biomarqueurs sanguins chez les ruminants. Ainsi, des projets sur l’étude de l’effet de certaines vitamines, minéraux et acides aminés (méthionine) sur la fourniture d’antioxydants et la santé des ruminants laitiers dans un concept d'une seule Santé (nutrition de l’animal et santé de l'animal et de l’homme par les produits laitiers) sont en cours d’évaluations. De plus, des études seront menées pour maitriser l’apports de nutriments tels que les acides aminés et le phosphore pour établir leurs recommandations tout en limitant leurs impacts environnementaux (excès d’azote ou de phosphore, deux sources de pollutions). Ces études nécessiteront le recours à l’apport de nutriments pour l’intestin par perfusions digestives dans la caillette.

Procédures

Les 2 vaches subiront 3 étapes décrites ci-dessus : - Etape 1 : Pose d'un cathéter dans la caillette sous anesthésie locale et analgésie. Dans cette procédure qui dure 14 jours, l’animal aura une intervention chirurgicale et la douleur sera gérée grâce à des antalgiques adaptés, et grâce à un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress). - Etape 2 : Perfusions digestives de nutriments sur deux vaches munies d'un cathéter dans la caillette. Ces perfusions seront réalisées en continue (24h/24) durant 4 séquences de 7 jours (soit 8 semaines, ce qui correspond aux temps de perfusions de nutriments dans le duodénum). Ces perfusions ne sont pas douloureuses, et sont réalisées sur animal vigile. - Etape 3 : Obturation du cathéter de la caillette placé en sous-cutané sous anesthésie locale. Dans cette procédure qui dure 14 jours, le suivi de la bonne cicatrisation se fera par une approche mutiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress).

Impact sur les animaux

La présence d'un cathéter de la caillette n'engendre pas de nuisance pour les animaux, une fois qu'ils ont récupéré de la chirurgie (sous anesthésie locale, anti-inflammatoire et analgésique de type dérivé morphinique). La contention physique pour la réalisation des prises de sang (via des cathéters à la jugulaire) sera brève et très légère (tenue de la tête avec un licol) par des personnes formées et habituées à ces manipulations. Ce stress sera de courte durée et sans douleur pour les animaux. Lors des essais de perfusions de nutriments il existe un petit risque de développement d'un point d'infection à la sortie du cathéter au niveau de la peau. Pour pallier à ce risque, une surveillance quotidienne de cette zone sera effectuée avec un nettoyage par des antiseptiques de la zone deux fois par semaine. En cas de début d'infection, notre vétérinaire sera consulté. Ce cathéter ne peut pas être retiré car il est cousu à la caillette mais il peut être raccourci (coupé au raz de la peau) et obturé par un nœud avant d'être placé en sous-cutané. Ceci permet une cicatrisation complète de la peau au niveau du point de sortie. Pour éviter toute nuisance au moment de l'obturation du cathéter et de son placement en sous cutanée, les animaux seront de nouveau placés sous anesthésie locale et un suivi multiparamétrique sera effectué sur les jours suivants. Une fois le point de sortie du cathéter cicatrisé, nos collègues n'ont constaté aucun développement d'infection sous cutanée. Cependant, la zone sous-cutanée où se trouve placé le cathéter fera l'objet d'une surveillance hebdomadaire des animaux tout au long de leurs vies (par exemple au moment de la traite ou de l’alimentation) pour vérifier l’absence de rejets.

Devenir

A chaque étape (pose d'un cathéter à la caillette, perfusions de nutriments et obturation du cathéter en sous-cutanée) l'animal est gardé en vie. Cette décision sera prise par le responsable de l'établissement utilisateur ou son délégataire.

Remplacement

Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives en remplacement de la pose de canules permanentes du duodénum, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal à ces variations de flux de nutriments digérés. Les réponses multiples des animaux en termes de digestion et répartition des nutriments entre différentes fonctions comme la synthèse de lait par la mamelle (ex : exportation de calcium dans le lait), la reconstitution des réserves (ex : calcification osseuse) et les fonctions de santé ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants ; les cultures cellulaires de différents tissus ne miment en effet pas la répartition des nutriments qui s’opère entre différents organes et fonctions. Des systèmes ayant été mis en œuvre par le passé pour étudier des phénomènes d’absorption épithéliale (type cellules ou chambres de Ussing) nécessitent d’utiliser des fragments de paroi du tube digestif fraichement prélevés mais sont peu reproductibles et donc peu utilisables pour des comparaisons entre groupes d’individus recevant des alimentations contrastées, par exemple. Leur intérêt repose plutôt pour l’étude de mécanismes biologiques d’absorption ou de transfert trans-épithélial. Enfin, les systèmes in vitro d’étude des phénomènes de digestion intestinale (comme le TIM gastro-intestinal system proposé par le TNO) ne sont pas adaptés aux modèles ruminants dont l’étape de digestion et fermentation ruminale entraine une modification trop importante du bol alimentaire pour le mimer dans un système in vitro de ce type et les spécificités des phénomènes biologiques d’absorption (liés à l’espèce ou au type de composés d’intérêt dont certains nécessitent des protéines de transport membranaires ou intracellulaires) ne sont pas transposables à des systèmes de membranes non biologiques. Compte tenu de l’absence presque totale de données dans la littérature pour certains de composés d’intérêt (vitamines par exemple), une approche in silico est actuellement impossible.

Réduction

Notre stratégie d’expérimentation est de réduire au maximum le nombre d’animaux participant à ces tests méthodologiques de raffinement des procédures chirurgicales. Pour la procédure de pose de cathéters dans la caillette, il s’agit d’adapter une technique pratiquée couramment en médecine vétérinaire, l'omentopexie, qui consiste en la fixation de la caillette sur le flanc droit. L’introduction d’un cathéter dans la caillette est pratiquée par nos collègues Canadiens (Doepel et al., 2006) qui nous ont guidé dans le développement du mode opératoire. Nous souhaitons faire la demande pour seulement 2 chirurgies pour 2 vaches, sachant que 2 autres vaches ont déjà été utilisées pour réaliser la même procédure sur un autre site. Notre vétérinaire maitrise à la fois la technique d’omentopexie et celle de poses de cathéters. Ce nombre de deux animaux a été raisonné avec notre vétérinaire pour rester faible mais suffisant pour être capable de reproduire le geste. Ainsi 4 animaux auront (2 par sites) été utilisés pour mettre au point cette nouvelle méthodologie sachant que les essais futurs nécessitant ces techniques utiliseraient également 3 à 5 animaux.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le raffinement des conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose du cathéter à la caillette, et de son obturation, le protocole médicamenteux est adapté afin de s'assurer de la prise en charge de toute douleur lors de ces actes. Pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien-être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en œuvre (au moment de la pose et de l'obturation du cathéter à la caillette) deux fois par jour de J-2, J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et des critères liés à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour vérifier si une douleur résiduelle existait malgré l’analgésie multimodale pratiquée.

Choix des espèces

Ces techniques permettront de continuer de travailler sur les recommandations alimentaires en nutriments et micronutriments des vaches dans un concept d’évolution agroécologique. En effet, il s’agit de réduire certains apports nutritionnels pour diminuer les rejets polluant pour l’environnement tout en maitrisant le volume et la qualité technologique du lait. Il s’agit aussi d’intégrer dans ces conditions le concept d’une seule santé pour l’animal et l’homme en apportant les nutriments nécessaires à une bonne santé de la vache, du veau, tout en améliorant la qualité nutritionnelle des laits pour l’homme (protéine idéale, calcium, vitamines, antioxydants, micronutriments etc.). Pour cela, des études de digestion et métabolisme de certains nutriments et métabolites spécifiques sur les vaches laitières sont requises pour diffuser des recommandations d’alimentation d’animaux adultes. Il faut donc travailler sur l'espèce bovine. Le troupeau est constitué de vaches Prim'Holstein, la race de vaches laitières la plus utilisée.

1 910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales d'injection virale et d'implantation d'électrodes et de fibres optiques, l'implantation sous-cutanée de puces RFID, puis une exposition à la nicotine et une manipulation optogénétique de leurs circuits neuronaux. Le porteur indique que les bagarres entre animaux peuvent les blesser gravement, que les manipulations répétées peuvent diminuer leur bien-être et qu'une trop forte dose de nicotine risque une overdose. Il affirme que seul l'animal vivant permet cette étape d'intégration entre comportement social et neurophysiologie, le bénéfice annoncé visant les troubles addictifs et psychiatriques.

Objectifs

L’addiction au tabac est un problème majeur de santé publique. Cependant nous ne sommes pas tous égaux devant l’addiction et les raisons pour lesquelles nous fumons sont souvent très variées. Les mécanismes qui sous-tendent des différences de vulnérabilité, bien qu’essentiels pour comprendre pourquoi un individu devient et reste dépendant, sont peu étudiés d’un point de vue neurobiologique. Dans ce projet, nous développerons une approche intégrative pour lier les variations dans les traits individuels et la vulnérabilité aux drogues. Nous analyserons l’histoire individuelle de souris au sein d’un groupe pour étudier, sur de longues périodes, les dynamiques sociales entre congénères et les différentes stratégies utilisées dans des tâches de prise de décision. La consommation et le sevrage nicotiniques seront ensuite évalués pour lier les variations de comportements individuels observées avant exposition à la drogue et la vulnérabilité à la nicotine. Nous étudierons électrophysiologiquement comment les relations sociales et les prises de décision individuelles façonnent l’activité des circuits neuronaux impliqués dans la réponse à la nicotine et la susceptibilité à la drogue. Nous insisterons sur les circuits dopaminergiques impliqués dans la motivation et la réponse aux récompenses, ainsi que leurs innervations cholinergiques à travers les récepteurs nicotiniques. Ces circuits seront ensuite manipulés à l’aide d’outils optogénétiques, chémogénétiques ou de « modifications de l’environnement de l’animal » afin de modifier la vulnérabilité individuelle. Tous ces paramètres neuronaux et comportementaux seront des facteurs prédictifs utiles pour comprendre la mise en place des dépendances. Ce projet aborde donc le problème de l’individu face à la drogue. Cela représente un effort unique pour comprendre, à plusieurs niveaux d'analyse (de la molécule au comportement), le rôle des caractéristiques et des histoires individuelles dans le processus d’addiction.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle aux substances addictives, mais aussi comment un individu adapte ses stratégies face à celles-ci, dans un milieu social. Les prises de décision dans un environnement social sont d'une importance majeure pour s'adapter à son environnement. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité dans un environnement complexe et social, notamment les troubles du spectre autistique, la schizophrénie ou encore les conduites addictives, souvent favorisées par un contexte favorable à leur développement. Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique, permettra donc d'appréhender plus efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à un enjeu sociétal majeur.

Procédures

Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, mais aussi d'implantations d'électrodes d'enregistrements et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Les chirurgies d'injection durent environ 45 mins à 1h. Les chirugies d'implantation d'électrodes et de fibres aux alentours de 1h aussi. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. A leur réveil, le comportement des animaux sera évalué pour coupler la neurophysiologie et l'aspect comportemental. Des micropuces RFID seront implantées en sous-cutané pour permettre de suivre la position de l'animal au sein de l'environnement étudié. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 semaines où ceux-ci vivront en communauté dans une grande cage enrichie de 50cm sur 50cm et seront placés par 3. Pour la procédure où l'animal sera étudié seul, le comportement dans la cage durera 5 jours pour limiter l'isolement. En fin de certaines procédures, les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir. Les bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris lors du comportement en groupe. Une même souris passera dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation d'animaux. Le fait de passer dans plusieurs expériences d'affilées peut possiblement diminuer le bien-être de l'animal avec les manipulations répétées. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice. Si de tels troubles sont visibles, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. L'administration de nicotine en eau de boisson ou injection intrapéritonéale peut induire un risque d'overdose à trop forte concentration.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure si aucune autre procédure n'est nécessaire à effectuer sur ces animaux. Les animaux n'ayant effectué que du comportement seront euthanasiés. - Soit pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous devons confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité du comportement de la souris. Nous souhaitons utiliser cette méthodologie afin de mesurer de manière automatique les comportements sociaux, la hiérarchie et son incidence sur les comportements individuels ainsi que sur la susceptibilité de certains profils comportementaux à s'administrer des drogues d'abus. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Au sein du laboratoire, l'expérience sur les animaux a été préparée en amont par des méthodes ex-vivo (telle que le patch-clamp recording). Cette dernière étape d'intégration ne peut être réalisée in silico et nécessite donc de se faire sur des animaux vivants. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une litterature vaste et robuste dans des domaines similaires. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. De plus, notre projet s'inscrit dans un temps long, avec l'observation d'une même souris sur une période étirée, limitant de ce fait l'utilisation répétée d'animaux. Les effectifs d'animaux à utiliser ont été calculés au plus juste grâce à des tests de puissance statistique effectuées en amont des expériences. De plus, l'analyse de la littérature dans ce domaine, qui est vaste, nous permet d'estimer au mieux le nombre d'animaux à utiliser pour chaque expérience. Enfin, de notre propre expérience au sein du laboratoire, ayant l'habitude d'effectuer ce genre de procédures, tout ceci nous permet d'estimer un nombre juste d'animaux afin de générer des résultats consistants et interprétables.

Raffinement

Dans nos environnements, l'espace pour chaque souris, ainsi que l'enrichissement, sont supérieurs aux cages conventionelles de stabulation. La taille de la cage, les différentes zones accessibles, la présence d'un nid au centre de l'environnement ainsi que d'un levier permettant d'obtenir de la nourriture ad libitum permettent de diversifier les actions locomotrices et exploratrices des animaux, contribuant à leur bien-être. Tout ceci relève donc d'un plus grand enrichissement. Les souris sont pesées tous les jours et suivies en temps réel via des caméras nous permettant de monitorer à distance le comportement des animaux. Il nous est donc possible d'intervenir rapidement en cas de quelconque soucis. De plus, le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles et de points limites lors des procédures visant à réduire les éventuelles souffrances animales. Par exemple, en cas d'agression entre animaux, des soins seront apportés aux souris blessées et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Si l'animal n'a pas pu récupérer dans une temps raisonnable, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Une fois le regroupement effectué, une surveillance accrue sera effectuée pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si les comportements aggressifs persistent, la procédure sera arrêtée pour l'animal. Notre design d'électrode pour enregistrer l'activité des neurones est plus léger et moins encombrant que les autres systèmes connus et vendus sur le marché. Lors des chirurgies, certaines douleurs peuvent survenir en post-opératoire. Pour diminuer et abolir ces douleurs, des anesthésiques locaux et des anti-douleurs seront administrés. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale gazeuse controlée durant la totalité de la chirurgie afin de permettre un rétablissement rapide de l'animal. Si l'animal n'a pas récupéré dans les 48h, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Un tapis chauffant sera placé sous l'animal afin d'éviter l'hypothermie.

Choix des espèces

Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Les récepteurs nicotiniques et les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de l’addiction clairement établis chez la souris. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Si les modèles d’invertébrés et poisson peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de renforcement aux drogues, l’organisation anatomique est trop différent pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation nicotinique du système dopaminergique. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Enfin, notre environnement élargi et enrichi a été spécifiquement développé et adapté à l'étude de la souris. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte - adulte. Avant 8 semaines, les souris sont considérées comme étant au stade adolescent. Ainsi, sachant que le comportement à cet âge est différent de l'âge adulte, et que notre étude porte sur l'âge adulte uniquement, nous éviterons d'étudier le comportement de souris avant 8 semaines. De plus, l'implantation de fibres et d'électrodes représentant une certaine charge de poids sur la tête de l'animal, nous préférons le faire une fois que ceux-ci sont plus grands et ne pas influencer leur comportement avant 8 semaines. Ainsi, les procédures qui nécessitent des injections virales uniquement se feront sur l'animal entre 4 et 6 semaines afin d'observer un temps d'infection nécessaire par le virus concerné (entre 3 et 6 semaines d'expression). Les souris qui se verront implanter des fibres optiques ou des électrodes d'enregistrement subiront une chirugie à partir de 8 semaines (âge adulte pour une souris). Les expériences comportementales se feront aussi à partir de 8 semaines d'âge.

20 marmousets vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont mis à jeun de 10 à 18 heures, séparés de leur groupe puis anesthésiés pour subir jusqu'à 20 séances d'IRM, avec injection d'un agent de contraste au fer et d'un chélateur, pour comparer le traitement de la voix entre marmousets, macaques et humains. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des complications respiratoires ou cardiaques et que l'agent de contraste affecte le foie. Il revendique un bénéfice de connaissance fondamentale sur les bases cérébrales de la perception vocale, sans application médicale annoncée.

Objectifs

Ce projet vise à utiliser des tests comportements en accès libre ainsi que l'IRMf pour mesurer l'activité cérébrale dans des conditions d'écoute passive et la comparer entre des groupes de sujets de taille comparable entre marmousets, macaques et humains. Les marmousets seront testés grâce à un système de test automatisé accroché à leurs cages et accessible à volonté, et ils seront scannés sous anesthésie en IRM 3T. Pour la partie comportement, deux expériences seront réalisées grâce à des boites de tests automatiques : catégorisation vocalisations par rapport à d'autres sons et discrimination du locuteur. En parallèle deux expériences seront menées dans le box expérimental : l'enregistrement des vocalisations et l'interaction vocale avec des 'singes virtuels' . Pour la partie IRMf, deux expériences seront réalisées: la localisation d'un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des marmousets) et comparaison inter-espèces; puis le codage normalisé de l'identité.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales et comportementales du traitement de l'information vocale chez les marmousets.

Procédures

Des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie. Lors de la préparation: les animaux vont être mis à jeun la veille de l'intervention (pour une durée minimale de 10 h et maximale de 18 h) et séparés de leur groupe le temps de la session (maximum 4h de séparation). L’imagerie dure environ 4h comprenant la capture de l’animal, le transport jusqu’au scanner, l’acquisition (environ 2h30), le retour à l’animalerie et la réintroduction de l’individu dans son groupe familial. Lors de l'acquisition : les animaux seront anesthésiés et pourront avoir une injection d’agent de contraste mais également être intubés si le protocole d'anesthésie ne nécessite. Après la séance : les animaux ayant eu une injection d'agent de contraste auront une injection d'un chélateur pour capturer le fer libéré dans le foie. L’injection se fait à la sortie de l’IRM quand le singe est pris en contention avant de le remettre dans sa boite de transport, elle dure environ 30 secondes. Au maximum chaque animal subira 20 sessions de scan IRM maximum espacés d’une semaine minimum.

Impact sur les animaux

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu. Cependant des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie lors de la préparation (mise à jeun, séparation de l'animal à son groupe, capture), lors de l'acquisition (l'anesthésie et ses potentielles complications respiratoires et/ou cardiaques, l'injection intraveineuse d’agent de contraste et ses potentiels effets secondaires au niveau du foie, l'intubation si l'anesthésie le nécessite) et après la séance (injection d'un chélateur pour limiter l'effet de l'agent de contraste sur l'organisme et le foie en particulier).

Devenir

A la fin du projet les animaux seront gardés en vie. Ils pourront être réutilisés après avis favorable du vétérinaire désigné.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.

Réduction

Un but essentiel de cette étude comparative est de comparer les performances comportementales et les activations cérébrales de macaques, de marmousets et d’humains de manière robuste. Or un problème majeur dans la littérature jusqu’ici est que les rares études publiées sur les marmousets, notamment en IRMf, rapportent des résultats chez un petit nombre de sujets, typiquement 2 ou 3) alors que le standard de publication pour l’IRMf humaine est d’étudier des groupes d’humains d’au moins 12 sujets permettant des analyses de groupe pour des inférences robustes au niveau de la population générale. Nous voulons dans ce projet adresser ce problème et étudier des groupes d’humains et de marmousets de taille comparable. C’est pourquoi nous prévoyons d’étudier un groupe d’une vingtaine de marmousets (les trois couples reproducteurs initiaux et leur descendance), espérant obtenir des données comportementales et IRMf chez au moins une douzaine d’entre eux, pour une comparaison statistique robuste avec une puissance comparable dans une analyse incluant humains et marmousets. Cette stratégie devrait notamment permettre une estimation puissante de la variabilité interindividuelle des performances comportementales et patrons d’activité cérébrale, un but important de ce projet, qui n’a pas encore pu être réalisée de manière adéquate chez les marmousets du fait du trop petit nombre de sujets typiquement étudié. Par ailleurs ces tailles de groupe familiaux, similaires à celles observées dans le milieu naturel, favoriseront des interactions sociales complexes qui sont une condition importante du bien-être du groupe et un facteur important pour le succès des systèmes de test automatiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes familiaux, avec de l'enrichissement structurel et alimentaire renouvelé fréquemment. L’ajout d’agent de contraste permettrait d’améliorer la qualité des images tout en diminuant le nombre de sessions de scan par animal. La réduction du temps d’isolement du singe de sa famille permet de réduire le stress de tous les singes et également de réduire la possibilité de tensions lorsque le singe sera replacé dans son groupe familial. La modification de la mise à jeun n’affectera pas les autres animaux puisque la mise à jeun aura lieu pendant la nuit, période durant laquelle les animaux dorment et ne s’alimentent pas. Le fait de donner la nourriture quand le singe retourne dans sa cage permet de s’assurer qu’il n’y a pas de tensions entre les individus et d’augmenter la cohésion grâce au partage de nourriture entre eux.

Choix des espèces

Cette étude comparative comparera les données du marmouset à celles observées chez l’humain et les macaques. Les raisons justifiant le choix du ouistiti sont les suivantes : Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; Les ouistitis utilisent des vocalisations complexes et variées spécifiques à chaque espèce, bien caractérisées acoustiquement. Il s'agit d’un modèle neuroscientifique hautement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires. Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. La boite de test sera en accès libre pour tous les individus de chaque cage, cependant nous n’effectuerons la procédure IRM que chez les individus jeunes adultes ou adultes (fin de la période juvénile environ 10-12 mois après la naissance). Les trois femelles reproductrices ne seront pas incluses dans la partie IRM afin de ne pas stresser les gestations ni séparer les enfants de la mère. Si un contrôle hydrique doit être mis en place pour encourager l’utilisation des systèmes de tests automatiques les femelles reproductrices et les juvéniles (

1 000 poissons, 700 lamproies et chabots et 300 salmonidés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés dans leur rivière. Chaque individu est capturé, anesthésié, mesuré, pesé, puis reçoit un transpondeur implanté par une incision ventrale, en restant hors de l'eau entre 30 secondes et une minute. Le porteur affirme que la cicatrisation est "généralement très bonne" et que l'implantation a "peu d'impact" sur le bien-être des animaux non-humains, tout en signalant une mortalité post-opératoire possible et une perte de puce chez certains individus. Il justifie l'étude par l'évaluation, en milieu naturel, de dispositifs de franchissement destinés à restaurer la continuité écologique.

Objectifs

L’objectif principal est de mesurer la mobilité des lamproies de Planer avant leur reproduction, dans deux cours d’eau présentant des obstacles à la continuité écologique, puis d’évaluer ensuite le bénéfice de l'installation de dispositifs de franchissement (passes) aménagés pour les lamproies. Les deux cours d’eau étudiés abritent également des populations de truite et de chabot, deux espèces pouvant bénéficier des actions mises en œuvre pour la lamproie, et qui seront également intégrées à l’étude. Les déplacements individuels des trois espèces seront analysés en utilisant des marquages à l'aide de puces électroniques et de dispositifs de détection fixes et mobiles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’acquérir des informations sur les déplacements des lamproies de Planer en milieu naturel et leurs capacités à emprunter des dispositifs de franchissement existants (passes à poissons) ainsi que des dispositifs expérimentaux spécifiquement conçus pour cette espèce (rampes à rugosité). Le bénéfice de ces aménagements pour les autres espèces à enjeu (truite et chabot) sera également analysé. Cette étude servira de retour d’expériences en vue de proposer des adaptations dans le cadre des futurs projets de restauration de la continuité écologique.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur sera implanté manuellement sur 1000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des puces est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel. L'implantation n'a pas ou peu d'impact sur le bien-être animal ou la reproduction, car la puce utilisée présente une taille minimale adaptée à la taille de l'individu. En outre, la taille de l'incision est faible, de l'ordre de 2-3 mm.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la lamproie de Planer, la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si report des marquages en cas de conditions environnementales très défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux dans les deux rivières, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité des ouvrages aménagés (2 aménagements visés / rivière). Il est adapté au gabarit des cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la lamproie, il peut être attendu un taux de montaison de 30%, taux moyen constaté dans une précédente étude en milieu naturel. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des puces ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront stockés dans un vivier placé dans la rivière. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et pour éviter l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie. Les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. L’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal (marquage des lamproies > 120 mm à l’aide de tags de 12 mm). Les individus seront placés sur une éponge imbibée d’eau au moment du marquage. Pour les truites, un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée après marquage au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par le vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible prioritaire est la lamproie de Planer (Lampetra planeri), espèce abondante dans les deux cours d’eau concernés et impactée par la présence d’ouvrages limitant sa migration. A notre connaissance il existe très peu d’études sur la migration de l’espèce, ses capacités de franchissement d’obstacles et le bénéfice réel des passes à rugosité. Les autres espèces cibles sont la truite commune (Salmo trutta) et le chabot (Cottus gobio) qui peuvent également bénéficier des aménagements réalisés (passes) au cours de ce projet. Pour les lamproies, le stade adulte (après métamorphose) sera ciblé, puisqu’il s’agit d’une étude sur le comportement avant reproduction. Toutefois, la métamorphose pouvant intervenir durant l’hiver donc après les opérations de marquage, les ammocètes de grande taille (> 120 mm) seront également marquées si l’effectif d’adultes escompté n’est pas atteint. Pour les truites, les juvéniles seront marqués dès 80 mm, à l’aide de puces de 13 mm ; les sub-adultes et adultes dès 120 mm à l’aide de puces de 23 mm. Pour les chabots, seuls les individus sub-adultes et adultes > 80 mm seront marqués à l’aide de puces de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2% (