Éthologie / comportement / biologie animale

960 canards mulards vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'épointage du bec et le dégriffage par cautérisation infrarouge à un jour d'âge, puis tous sont élevés en claustration et gavés pour la production de foie gras. Le porteur reconnaît que l'épointage provoque un stress et une douleur aiguë modifiant le comportement jusqu'à deux semaines. L'étude compare ces pratiques dans le mode d'élevage qu'il décrit lui-même comme "le plus contraignant" pour l'animal.

Objectifs

En élevage le canard de Barbarie et le canard Pékin peuvent manifester des comportements anormaux, dont la cause principale n’a pas été identifiée, générant des problématiques de picage et de griffures causant des lésions et portant ainsi atteinte à leur bien-être. Les méthodes principales permettant de prévenir ou de contrôler ces comportements sont l’épointage et le dégriffage. L’épointage est réalisé par cautérisation de l’extrémité bec du caneton à 1 jour à l’aide d’un faisceau infrarouge afin de limiter sa croissance. Le dégriffage est réalisé selon le même procédé sur la pointe des griffes. Il n'existe pas de données bibliographiques sur ces problématiques chez le canard mulard, hybride issu d’un mâle Barbarie et d’une femelle Pékin. Or, ces pratiques préventives sont potentiellement douloureuses. L’objectif du premier essai est donc de caractériser et de comparer le comportement, l’état corporel et les performances zootechniques (croissance pondérale, efficacité alimentaire, poids des pièces de découpe) de lots de canards ayant été soit épointés, soit dégriffés, épointés et dégriffés ou n’ayant eu aucune intervention (lot témoin) afin d'obtenir des données liées à ces pratiques. Ces animaux seront élevés en claustration, le mode d’élevage le plus contraignant pour l’animal qui soit pratiqué en élevage, notamment lors de la mise à l’abri en période d’influenza aviaire. Un environnement contraignant devrait mettre en exerge les différences entre lots. Selon les résultats issus de ce premier essai, un second essai nous permettra de tester un levier pour limiter les effets indésirables en l’absence des pratiques d’épointage et de dégriffage (enrichissement de l'hébergement, lumières, accès extérieur, densité...). L'objectif appliqué étant de définir les modalités d'élevage les plus adaptées à la biologie du canard afin de favoriser son bien-être .

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer de données spécifiques au canard mulard sur les problématiques du picage et des griffures en conditions de confinement, ce mode d'élevage étant celui devant être adopté lors des périodes d'influenza aviaire. Ces essais permettront d’évaluer, faute de données disponibles pour cette espèce et ce mode de production, les conséquences de l’arrêt de ces traitements en conditions défavorables (confinement), sans autre changement dans la conduite, dans un objectif d’amélioration du bien-être animal. En fonction des résultats obtenus, différents leviers seront in fine proposés à partir d’éléments issus de la bibliographie disponible chez d’autres espèces afin de pallier les problèmes rencontrés et l'un d'entre eux sera testé expérimentalement

Procédures

Les animaux seront soumis à des contentions (manipulation individuelle par un opérateur formé et mise en caisse adaptée à l’âge et l’espèce des animaux) nécessaires à leur pesée et à l'évaluation de leur état corporel (7 au maximum par animal au cours des 12 semaines d’élevage). La durée totale de chaque contention n'excèdera pas 30 minutes. A l'âge de 84 jours ils seront placés dans des caisses de transport et transférés de loges de 30 animaux à des parcs collectifs de 4 canards. Ce transfert n'excèdera pas 1 heure. 120 animaux seront épointés au couvoir à 1 jour d'âge par application d'un faisceau infrarouge sur la pointe du bec. 120 animaux seront dégriffés selon la même méthode, le faisceau infrarouge étant appliqué sur la pointe des griffes, parmi ces 240 animaux. 120 animaux seront à la fois épointés et dégriffés selon ces procédés.

Impact sur les animaux

En l’absence de traitement du bec, les animaux sont susceptibles d'exprimer des comportements mutuels d’arrachage des plumes (picages), pouvant amener à des lésions plus ou moins graves et donc à une altération de leur bien-être. Ce risque est généralement accru vers l'âge de 6 semaines. L'épointage est effectué au couvoir peu après l'éclosion par chauffe de la pointe du bec à l'aide d'un faisceau infra-rouge. Cette méthode inhibe la multiplication des cellules à la pointe du bec et limite son développement. L’épointage provoque également un stress et une douleur aiguë transitoires qui, chez les canards Pékin et Barbarie, se manifestent par des changements comportementaux (augmentation du repos et diminution des comportements nécessitant l'utilisation du bec tels que l’alimentation, l’abreuvement, le lissage des plumes et l’exploration) pouvant être observés jusqu'à 2 semaines après l’épointage. En l’absence de traitement des griffes et d'accès à l'extérieur pour assurer leur abrasion, les animaux sont susceptibles de se blesser mutuellement (griffures), notamment si le lot s’avère réactif à des évènements soudains (réactions au bruit notamment). Le dégriffage est une procédure similaire à l'épointage avec un traitement infrarouge sur l'extrémité des griffes afin de limiter leur croissance. Les canards en phase d’engraissement suivront une procédure de gavage, susceptible dans de rares cas où elle serait mal réalisée de générer des lésions dans leur oesophage. Le mode d’hébergement en loges collectives limitera leurs possibilités de mouvements, bien qu’en engraissement les animaux aient une activité amoindrie et plus de repos immobile lié à la digestion.

Devenir

Les animaux seront abattus en abattoir agrée en fin d'essai afin d'effectuer des mesures sur leurs performances zootechniques (poids des pièces de découpes: cuisse, magret, peau du magret, poids du foie, test de fonte).

Remplacement

Le comportement des animaux en élevage étant étudié, l’animal vivant ne peut pas être remplacé par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Réduction

960 animaux répartis en deux essais de 480 canards mulards mâles seront requis. Pour chaque essai cela représente 120 canards par modalité, soit 30 animaux par parc. Pour comparer statistiquement les modalités et détecter des différences entre-elles, un effectif minimal de 99 animaux par modalité est nécessaire, soit 25 animaux par parc. Après vérification sur des données de croissance pondérale d'un essai précédent, cet effectif permettra de différencier les lots dès un écart de moyenne de 343g. Ce projet étant le premier mesurant des paramètres liés à l'épointage et au dégriffage, un tel effectif permettra également de détecter des effets faibles lors de l’utilisation des tests statistiques. Afin de pallier les aléas expérimentaux, l'effectif par loge est fixé à 30 animaux pour s'assurer un nombre minimal de valeur pour tester statistiquement les hypothèses. L'hétérogénéité des réponses chez les canards mulards sera également prise en compte au sein de chaque modalité.

Raffinement

Les mesures de comportement seront réalisées par vidéos pour ne pas cause de stress par la présence d’un humain. Les mesures nécessitant la manipulation des animaux seront regroupées afin de limiter les contentions, qui seront réalisées sur le nombre minimal d'animaux nécessaire (25 par loge). Le transport de l'élevage à l'engraissement se fera parcs par parcs pour minimiser le temps passé en caisse de transport (moins d'1h). Les animaux seront élevés en groupe et surveillés quotidiennement. En engraissement avant chaque repas un contrôle du jabot sera effectué par le gaveur par palpation. Ce contrôle de la digestion permet de limiter le risque de blessures en limitant le volume du jabot et la dilatation de l'oesophage, en ajustant la dose d'aliment donnée. Cela permet aussi de détecter les éventuelles lésions. En cas de lésions sévères ou de perforation de l'oesophage l'animal est euthanasié car cette blessure est irréversible. Le gaveur étant entraîné à réaliser l'embucage, le nombre d'animaux lésés est rare. Le picage et les griffures pouvant occasionner des lésions sévères, une grille d’indicateurs sera mise en place afin de déterminer le point limite, c’est-à-dire le moment ou la souffrance et/ou la détresse de l’animal doit être pris en charge et des actions mises en place. La grille regroupe des critères auquel un score est attribué selon leur déviation d'un état normal (aspects : taille, poids, état du plumage, lésions ; physiologie : respiration, consommations ; comportement : agressivité, isolement, postures, boiteries, troubles de l’équilibre). Lorsque la déviation est mineure la surveillance est renforcée jusqu’à retour à un état normal. Les conditions d’ambiance pourront être modifiées (ventilation, température). En cas de déviation modérée des mesures sont prises pour atténuer la souffrance (nettoyage de la plaie, mise en infirmerie jusqu’à cicatrisation, modifications de la complexité de l’hébergement : ajout d’objets à manipuler, de litière…). En cas de déviation grave l'animal sera euthanasié si le retour à l’état normal est impossible ou nécessite un isolement prolongé, source importante de stress car le canard est un animal social. Si dans un parc au moins la moitié des animaux présentent des déviations modérées à sévères la surface de la loge pourra être doublée et le vétérinaire pourra être consulté.

Choix des espèces

Les travaux ont un objectif finalisé d’application au sein de la filière palmipède à foie gras (canard). Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le canard gras, et en l’occurrence le canard mulard mâle, espèce légalement autorisée pour la production de foie gras (règlement CE 1538/91 de la commission du 5 juin 1991, portant modalités d'application du règlement (CEE) n° 1906/90 du Conseil établissant des normes de commercialisation pour les volailles). Les animaux utilisés pour l’essai seront âgés de 1 à 94j. De 1 à 83j, ils seront élevés au sol en loges collectives de 6m². Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards en élevage. Après transfert dans un autre bâtiment, les animaux seront engraissés par gavage de 84 à 95j en loges collectives afin de mesurer les effets potentiels des paramètres testés jusqu’à la fin du cycle de production classiquement suivi pour la production de foie gras. Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards lors de l’engraissement par gavage. Ces âges correspondent à ceux retrouvés en élevage de canard gras standard.

10 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures pour implanter des électrodes et un dispositif d'enregistrement sous la peau, reste isolé cinq semaines, puis est exposé à des odeurs et images de chats pour provoquer un stress de prédation. Le porteur reconnaît que l'isolement prive l'animal de son comportement social et que la présence simulée d'un prédateur induit "probablement" un stress, objet même de l'étude. Ce projet préliminaire vise à obtenir des données pour une demande de financement, et les animaux sont tués pour analyser leur cerveau et les tissus entourant l'implant.

Objectifs

Ce projet utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10) est une demande préliminaire à une demande ANR jeune chercheur. Il a pour but de valider la fonctionnalité et la pérennité d’un système d’enregistrement électrophysiologique, la tolérance de l’animal à l’implantation sous cutanée du dispositif dans une durée de 30 jours maximum. Il aura également pour but d’exposer le rat à un contexte de prédation, uniquement sous réserve d’une totale cicatrisation des plaies et de scorage de suivis nuls. Cette expérience permettra de récolter des données préliminaires de sommeil simulant l’exposition à un contexte de prédation le plus écologique possible. Ces données serviront de base à une resoumission de projet à l’ANR en mars 2022. L’objectif global de l’ANR est de comprendre comment la prédation (l'un des principaux facteurs de sélection naturelle) a façonné le phénotype et l'évolution du sommeil. En effet, l’omniprésence du sommeil dans le règne animal suggère qu'il est essentiel à la survie, cependant, le sommeil et ses sous-états restent mal compris. Les animaux exposés à la prédation doivent être plus vigilants pour augmenter leur chance de survie, cependant quand ils dorment ils sont potentiellement plus vulnérables car moins sensibles à leur environnement. Le sommeil constitue donc un comportement extrêmement risqué pour de nombreuses espèces. Pour cette raison, la pression de prédation a été proposée comme explication de la diversité des habitudes de sommeil observées chez les mammifères et autres animaux. Une variabilité de certaines caractéristiques du sommeil, telles que sa durée quotidienne chez les paresseux, les quantités relatives de sommeil paradoxal et sommeil lent chez les rats, la durée quotidienne de sommeil chez les rats, le sommeil unihémisphérique chez les canards et la fragmentation du sommeil chez les colombes, a pu être corrélée indirectement avec une pression de prédation. Cependant, aucune étude n'a testé expérimentalement (sur des animaux élevés en laboratoire ou sauvages) comment les phénotypes du sommeil à plusieurs niveaux (physiologie, activité cérébrale, métabolisme et comportement) sont affectés par la pression de prédation, et si les processus associés à cette interaction sont plastiques (régulé par les effets environnementaux) ou génétiques et donc héréditaires. C’est le but de du projet ANR, qui se basera sur l’étude du sommeil de populations de rats sauvages ayant grandi avec ou sans prédation.

Bénéfices attendus

Outre l’obtention de données préliminaires qui permettront grandement d’augmenter les chances de financement, ce projet permettra le développement d’une méthodologie d’enregistrement complet du sommeil des animaux en conditions semi-naturelles. En effet, le développement d’un implant sous cutané, miniature, de grande autonomie, dédié au sommeil ouvre de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension des animaux en veillant à leur bien être puisqu’ils ne seront plus équipés de câble et pourrons même être, à terme, stabulés en groupe. C’est une vraie amélioration d’un point de vue qualité et quantité des données acquises, permettant ainsi de répondre à des questions plus complexes tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, étudier l’effet de la prédation sur le sommeil permet aussi de comprendre le lien entre stress/peur et sommeil, deux états étroitement liés et source de nombreux troubles chez l’homme.

Procédures

Les 5 animaux seront isolés durant les 5 semaines prévues pour la procédure. Ils subiront une anesthésie générale pour une intervention chirurgicale consistant à implanter des électrodes pour les enregistrements des paramètres physiologiques (activités cérébrales, musculaires, oculaires, cardiaques et température) et un dispositif autonome sous cutané de récolte des données physiologiques pendant 40 jours. La durée de l'intervention chirurgicale durera 2 heures maximum. Après 15 jours de récupération et validation de la tolérance à l'implant sous cutané et 1 semaine pour ceux ayant un implant externe, les animaux seront exposés au protocole de prédation pendant 1 semaine (à raison de 2 fois 3 heures par jour).

Impact sur les animaux

Ils subiront d’abord une anesthésie générale pour une chirurgie implantatoire (pose d’électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques du sommeil et d’un implant sous cutané au niveau dorsal pour enregistrer le sommeil en autonomie totale). La procédure chirurgicale de la pose des électrodes est maitrisée. Le caractère novateur de ce projet d’un point de vue expérimental sera la présence d’un implant sous cutané dont la taille a été réduite au maximum (1cm x 4cm x 1.5cm et 15g) et rendu biocompatible (encapsulation en silicone). Ceci pourra donc entrainer une gêne pour l’animal. C’est d’ailleurs ce que nous chercherons à évaluer et à éviter grâce à un suivi quotidien des animaux et à l’optimisation de notre implant. Enfin, si l’aspect implantation sous cutané est validé et ne pose aucun problème aux animaux, durant les 15 jours de récupération, ils seront exposés individuellement et de façon périodique pendant une semaine des stimuli olfactifs et visuels provenant de chats. Bien que les animaux soient en totale sécurité dans leur cage dotée d’un abri, ils vont ressentir probablement un stress dû cette présence. C’est d’ailleurs aussi tout l’objet du projet, évaluer l’impact de ce stress sur leur sommeil. Enfin, dans l'intérêt de leur bonne récupération, l'obtention de résultats reproductibles en éliminant toute interférence provoquée par l'effet groupe, les rats seront isolés durant les 5 semaines de la procédure. Ils n'auront donc pas la possibilité d'exprimer leur comportement social durant cette procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Bien que rendu biocompatible, il sera nécessaire d'évaluer le degré de tolérance de l'implant sous cutané. Pour cela, l'implant sous cutané sera retiré. Les données d'enregistrements seront récoltées et les tissus environnants seront prélevés pour effectuer une analyse histologique qui nous indiquera le degré éventuel d'inflammation provoqué par sa présence. De plus, il sera primordial de prélever le cerveau des animaux et d'analyser histologiquement les potentielles structures cérébrales impactées par le contexte de prédation et les perturbations attendues du sommeil.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer le modèle animal dans le cadre de ce projet qui s’intéresse à la réponse complexe d’un organisme. Le rat est le modèle idéal de par sa taille, sa disponibilité et l’étendu des connaissances que nous avons déjà sur sa physiologie.

Réduction

En augmentant la quantité des paramètres collectés nous réduisons le nombre d’expérience et donc le nombre d’animaux. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, le nombre a été limité au strict minimum (5 animaux avec implant sous cutané et 5 avec implant externe) pour permettre la validation du dispositif et la collecte de données préliminaires. De plus, nos connaissances et notre maitrise en chirurgie implantatoire sur cette espèce nous permet de prévoir un nombre d'animaux minimal. A noter que ces effectifs ne seront pas utilisés dans leur totalité si nous sommes capable d'enregistrer la totalité des expériences prédation avec les animaux avec implant. L'objectif global est recolter des données de sommeil en contexte de predation sur 4 animaux au total et de valider la fiabilité de l'implant sur deux animaux (car sa tolérance a déja été validée sur deux animaux pendant 30 jours) cf DAP V6.

Raffinement

En développant un implant sous cutané, nous permettons à l’animal de se déplacer librement et d’exprimer toute la complexité de son comportement. Ce projet préliminaire s'inscrit d'ailleurs dans un projet futur plus large, qui nous permettra d'enregistrer des animaux en milieu semi naturel donc hautement enrichi. L’enregistrement de plusieurs paramètres physiologiques et cérébraux permet aussi en une expérience d’accumuler beaucoup d’information qui aurait nécessité plusieurs dispositifs parfois filaires auparavant et donc plus gênant pour l'animal.

Choix des espèces

Ce projet est préliminaire et permettra, une fois validé expérimentalement, d’utiliser le dispositif d’enregistrement dans le cadre d’un futur projet de plus grande envergure sur des rats sauvages en milieu naturel. Le rat est suffisamment gros pour supporter notre instrumentation et son sommeil est très bien connu en laboratoire. Par ailleurs c’est une espèce invasive. Il est donc disponible facilement à l’état sauvage. Il a aussi colonisé différent milieu plus ou moins exposé à la prédation, il est donc un modèle de choix pour notre projet. De plus, le sommeil est un état complexe. L’objectif de l’étude est de déterminer quelle part de son expression est influencée par la prédation (rythme, physiologie, mouvement, position, localisation, activité cérébrale). Des rats adultes de 4 mois seront utilisés pour ce projet. Les animaux devront d’une part avoir un âge avec unepleine maturité cérébrale et, d'autre part, une taille et un poids suffisants (400g environ) afin de supporter l’implant sous cutané.

60 brebis de race Lacaune vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes gardées en vie dans l'établissement à l'issue. Chaque animal reçoit un implant de mélatonine et une injection intramusculaire, et subit dix-huit prises de sang, pour tester une hormone de synthèse censée déclencher et synchroniser les ovulations en dehors de la saison sexuelle. Le porteur inscrit le projet dans le remplacement d'une hormone existante par une molécule posant selon lui moins de problèmes de "bien-être animal", à des fins d'insémination en élevage. Il affirme qu'aucune alternative n'existe pour étudier l'efficacité de ces hormones sur l'ovulation.

Objectifs

La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Chez les deux sexes, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel (contre-saison), en général de février à juillet. La durée de la saison sexuelle est très variable selon les races. La reproduction des brebis et des chèvres en contre-saison permet aux éleveurs d’étaler la production de lait ou de viande sur l’année, et ainsi de répondre à la demande des consommateurs.

Bénéfices attendus

La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Dans le cadre d’une mise à la reproduction des brebis et des chèvres en période de contre-saison (période de repos sexuel, pratique appelée « désaisonnement »), l’insémination animale est pratiquée chez les petits ruminants quasi exclusivement après un traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations (mimant les mécanismes endocriniens), méthode aujourd’hui la plus efficace pour désaisonner la mise à la reproduction. Le projet s'inscrit dans un contexte d'évolution des pratiques de maîtrise de la reproduction vers la réduction, voire la suppression, de l’utilisation de traitements hormonaux pour la synchronisation des chaleurs et des ovulations. La recherche de méthodes alternatives est en cours via le développement et/ou l’évaluation de traitements vétérinaires (molécules de synthèse) posant moins de problème en termes de bien-être animal et d’enjeux environnementaux.

Procédures

Les brebis seront soumises à une pose d'implant sous-cutané de mélatonine (une seule fois par brebis, durée moyenne d'environ 30 secondes), à des injections par voie intramusculaire (une seule injection par brebis, durée de quelques secondes) et à des prises de sang (au total 18 prélèvements/brebis, durée de prélèvement moyenne d'environ 30 secondes par brebis).

Impact sur les animaux

Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Une surveillance journalière de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. La contention des animaux pour les interventions réalisées par les animaliers (en binôme) est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins est associée à une diminution du stress des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie dans l'établissement utilisateur à l'issue du projet.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des hormones gonadotropes sur l’induction et la synchronisation des ovulations chez les brebis ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative n’existe.

Réduction

Le projet utilisera 60 brebis réparties en 5 lots de 12 brebis. Les variables étudiées seront la proportion de brebis ovulant après traitement, le jour d’augmentation de progestérone plasmatique > 0,5 ng/ml et la proportion de brebis gestantes. Des calculs de puissance ont été faits avec ces 3 variables afin de déterminer le nombre de brebis/lot. Le nombre minimum de brebis à inclure par lot est déterminé par la variable proportion de brebis gestantes. Avec 12 brebis par groupe, nous pourrons montrer : # une différence notable pour la proportion de brebis ovulant après traitement, entre 67 % (8/12, observée dans des études antérieures avec GnRH) et 100 % (12/12, attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 5 % et une puissance de 83 %. # une différence (>= 1,5 jours ± 1 jour) du jour moyen d’augmentation de progestérone après ovulation (entre le groupe avec eCG et un groupe avec GnRH) avec un risque alpha de 5 % et une puissance de 92 % (test de Mann et Whitney). # une différence notable pour la proportion de brebis gestantes, entre 17 % (2/12, échec de fertilité dans les lots avec GnRH) et 67 % (8/12, fertilité attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 10 % et une puissance de 83 %. L’objectif de cette étude exploratoire est de déterminer si les ovulations induites par la GnRH de synthèse sont fertiles et si la fertilité obtenue nous incite à poursuivre (ou pas) cette stratégie pharmacologique.

Raffinement

Les brebis passeront 6 semaines en bergerie de quarantaine avec une visite journalière pour l’alimentation et l’observation sanitaire. L’habituation des brebis à la manipulation dans ce nouvel environnement commencera au bout de 2 semaines après leur arrivée en quarantaine, avec une pesée. Après 4 semaines, les deux prises de sang pour le test de cyclicité seront réalisées. Après 6 semaines en bergerie de quarantaine, les brebis intègreront la bergerie de l’installation pour commencer le traitement de synchronisation des ovulations. Les lots expérimentaux seront alors constitués (habituation au parc de tri et marquage de la toison avec une peinture adaptée, pour repérer les lots). Afin de respecter la grégarité de l’espèce, les brebis sont placées ensemble sur litière paillée et leur contention pour les différentes interventions est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins aux animaux est associée à une diminution du comportement de stress. Les brebis sont surveillées de façon journalière. Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Les animaux seront tondus au niveau du cou pour une visualisation aisée des veines. Dans la mesure du possible, les prélèvements seront réalisés en alternant les veines jugulaires droite et gauche. Une surveillance de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. En cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé sur 48 h, anorexie, perte de poids >à 15%...) un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil ou avec son intervention si nécessaire.

Choix des espèces

L’espèce ovine, et notamment la brebis de race Lacaune laitière, est la cible de l’étude de façon à remplacer l’utilisation de l’hormone eCG dans le cadre du traitement d’induction et de synchronisation des ovulations utilisé en élevage (afin de pratiquer l’insémination animale). De façon à tester l’efficacité d’hormones gonadotropes pour contrôler le cycle oestrien des brebis, le projet utilisera des brebis adultes de race Lacaune, sexuellement matures et ayant déjà agnelé lors d’une reproduction antérieure.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.