Autre recherche fondamentale

Les souris infectées par le virus de l'encéphalite à tiques sont mises à mort dès l'apparition de signes neurologiques. 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune porte sur le dos une capsule remplie de larves, de nymphes ou de tiques femelles qui se gorgent de son sang, ce qui provoque des démangeaisons, et 2 250 d'entre elles subissent trois prélèvements de sang par le sinus rétro-orbitaire, aux sixième, dixième et quatorzième jours, avant que sang, oreille et organes soient prélevés après la mort. L'effectif se déduit du nombre de tiques gorgées récupérables sur chaque souris, le porteur précisant qu'aucune analyse statistique ne sera réalisée sur le nombre de souris utilisées.

Objectifs

Les tiques sont les premiers vecteurs d’agents pathogènes en Europe et constituent un risque majeur pour la santé humaine et animale en transmettant la plus grande variété de microorganismes (bactéries, parasites et virus). La plupart des agents pathogènes transmis par les tiques sont zoonotiques (transmissibles de l’animal à l’Homme), certains ne touchent que les animaux mais avec un impact économique très important et d’autres sont découverts chaque année. Les principales maladies liées aux tiques en Europe sont la Borréliose de Lyme, l’Anaplasmose granulocytaire et l’Encéphalite à tiques, et leur vecteur est la tique Ixodes ricinus, qui présente une très large répartition géographique. Dans ce projet nous étudions la compétence vectorielle des tiques Ixodes ricinus vis-à-vis de différents agents pathogènes, en infection simple (un seul agent pathogène à la fois) et en co-infection (deux agents pathogènes à la fois). En effet la compétence vectorielle des arthropodes est un caractère sous contrôle génétique et peut varier selon la souche de tique, et la souche de l’agent de pathogène étudié. De plus, dans diverses études il a été mis en évidence que les co-infections dans les tiques (plusieurs microorganismes présents dans une même tique) pouvaient être très fréquentes. Chez l’Homme, des patients présentant une maladie de Lyme chronique rapportent également des co-infections par d’autres bactéries ou d’autres parasites. Enfin en laboratoire il a été démontré que chez des souris co-infectées par deux bactéries (Borrelia et Anaplasma) on constatait une différence de réponse immunitaire de la souris suite à l'infection, une différence de pathogénicité des bactéries chez la souris ainsi qu'un impact sur l'acquisition de ces bactéries par les tiques comparativement à des infections simples. Nos travaux visent à comparer la compétence vectorielle des tiques lors d’infection simple et de co-infection par des bactéries (Borrelia, Anaplasma) et des virus (différentes souches du virus de l’encéphalite à tiques). Pour étudier cette compétence vectorielle, il nous faut etudier 3 étapes clés en laboratoire : (i) l’acquisition de l’agent pathogène ; (ii) la transmission transstadiale de l’agent pathogène (c'est à dire la persistance de l’agent pathogène au fil des stades de développement) ; (iii) la transmission de l’agent pathogène de la tique infectée vers un hôté vertébré sain (souris naïve).

Bénéfices attendus

Les tiques sont d'importants vecteurs d'agents pathogènes qui provoquent des maladies graves chez l'Homme et les animaux. Les phénomènes de co-infections peuvent aggraver ces maladies mais ne sont pas étudiés en laboratoire. Notre projet vise à mieux comprendre le risque lié aux tiques pour l’Homme et l’animal, notamment en comparant les infections simples avec les co-infections.

Procédures

Pour 750 souris maximum, Pas de prélèvement durant l’expérimentation, uniquement récupération tiques gorgées. Pour 2250 souris maximum, a J6, J10, J14 = prélèvement de 10µL de sang par souris (sinus rétrorbital). Après mise à mort des animaux, récupération sang, biopsie oreille et organes souris.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris utilisées mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques(larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort de la souris. Pour les souris potentiellement infectées par les bactéries Borrelia et Anaplasma, pas de signes cliniques attendus. Pour les souris infectées par le virus TBE, signe neurologique attendu, les animaux seront mis à mort dès que les signes neurologiques seront observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les tests de transmission des agents pathogènes, le sang des animaux et les organes sont nécessaire pour rechercher les agents pathogènes par amplification de leur matériel génétique afin de valider la transmission par les tiques.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé, il peut être utilisé lors des essais d’acquisition ou de transmission des agents pathogènes. Ce système sera privilégié dès que possible mais ne fonctionne malheureusement pas pour tous les agents pathogènes (notamment ne fonctionne pas pour Borrelia et Anaplasma et donc ne fonctionne pas pour les coinfections utilisant une de ces bactéries). Les expérimentations de co-infection proposées dans cette saisine de peuvent malheureusement pas être réalisées sans l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal (maximum 50% des tiques déposées dans la capsule) et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Dès que nous obtiendrons le nombre de tiques gorgées nécessaire aux analyses et à la suite des expérimentations, la répétition de l'expérimentation pour chaque modèle de co-infection sera stopée. Le nombre annoncé de répétition (10) est le nombre maximal annoncé. Nous espérons pouvoir réduire ce nombre à 5 ou 6 répétitions par type de co-infection. Il n'y aura pas d'analyses statistiques réalisées concernant le nombre souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des souris avec une maison en plastique par cage, un support pour grimper (roue), des carrés de coton. Lors des manipulations, elles seront hébergées en condition individuelle car les souris auront chacune une capsule avec des tiques sur le dos et les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Les souris individuelles seront hébergées avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris, support pour grimper (roue)), et même si elles sont isolées elles pourront voir les souris des cages d’à côté. Les animaux sont isolés au maximum 21 jours.

Choix des espèces

Les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par les 3 agents pathogènes que nous ciblons : Borrelia afzelii, Anaplasma phagocytophilum, Virus de l’Encéphalite à tiques. Les micromammifères étant notamment impliqués dans les cycles de transmission naturels de ces agents pathogènes, les souris représentent donc le modèle idéal en laboratoire. Dans les essais d'acquisition, les souris utilisées n'auront pas besoin d'être réceptives aux agents pathogènes, par contre, dans les essais de transmission, les souris utilisées devront être sensibles à l'infection par Anaplasma phagocytophilum, Borrelia et TBEV. Adultes. Minimum 4-5 semaines. Suffisamment grand pour pouvoir poser une capsule sur leur dos avec des tiques.

Trois interventions chirurgicales d'une heure à une heure trente chacune, sous anesthésie générale : 6 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs vaisseaux sanguins. Avant ces opérations, ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome dans leurs artères, et sont hébergés en cages individuelles. L'enjeu déclaré est de tester un prototype de sonde d'imagerie endovasculaire miniaturisée, dont le porteur affirme que la validation in vivo reste "indispensable" malgré les essais préalables sur explants et sur fantômes d'artères. Ces lapins pèseront environ 3 kg et auront 10 à 12 semaines, poids minimum retenu par le porteur pour y introduire les cathéters expérimentaux.

Objectifs

L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se réalisera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.

Procédures

Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.

L'objet du projet est un instrument, un prototype de sonde d'imagerie optique miniaturisée à valider dans des conditions proches de l'usage clinique. 6 lapins, 5 exposés et 1 témoin, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'examen histologique de leurs vaisseaux. Ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome, puis subissent trois opérations sous anesthésie d'une heure à une heure et demie chacune, hébergés seuls en cage et transportés d'un établissement à l'autre. Le porteur retient le lapin parce que la taille de ses vaisseaux approche celle des vaisseaux humains visés, et parce qu'un poids d'environ trois kilos, atteint vers dix à douze semaines, correspond au minimum permettant d'introduire les cathéters.

Objectifs

L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.

Procédures

Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.

Tuées pour qu'on prélève la moelle de leurs os, 150 souris donneuses fournissent les cellules souches injectées à 450 souris receveuses, elles-mêmes tuées à la fin de la reconstitution pour analyse de leurs organes. Les 600 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses sont irradiées une fois pendant une vingtaine de minutes, ce qui détruit leurs cellules souches et provoque une immunodéficience transitoire, couverte par deux semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson. Le porteur annonce que les connaissances produites permettront, à terme, de reconstituer le développement de ces cellules immunitaires in vitro et donc de s'affranchir du recours au vivant.

Objectifs

Les cellules lymphoïdes innées (CLI) ont été récemment découvertes et jouent des fonctions très importantes et uniques dans l’immunité et l’homéostasie. Les CLI pourraient également jouer un rôle bénéfique dans la lutte contre les tumeurs solides. La compréhension des mécanismes contrôlant le développement des CLI permettrait de moduler et optimiser ce processus à des fins immuno- thérapeutiques. Dans ce but, nous souhaitons examiner le rôle de facteurs de transcription dans le développement des CLI chez la souris. Pour cela, nous allons modifier génétiquement les facteurs d'intérêt dans les cellules souches hématopoïétiques de souris, et examiner l'effet de ces modifications sur le développement des CLI. Les cellules souches hématopoïétiques seront isolées à partir de « souris donneuses », modifiées génétiquement "in vitro", puis injectées dans des « souris receveuses » dans lesquelles elles se développeront ou non en CLI.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement des CLI chez la souris in vitro et in vivo, et d’identifier des moyens d’optimiser la génération de populations spécifiques de CLI chez l’Homme in vitro. Les connaissances générées par ce projet permettront, à terme, de récapituler le développement des CLI in vitro, et donc de s’affranchir du modèle in vivo.

Procédures

Les souris donneuses de cellules souches hématopoïétiques (150 souris) recevront une injection (une minute environ). Les souris receveuses de cellules souches hématopoïétiques (450 souris) seront irradiées une fois en début de procédure (20 minutes environ) ou recevront deux injections, en plus de l'injection de cellules souches hématopoïétiques (une minute environ par injection).

Impact sur les animaux

La destruction des cellules souches hématopoïétiques des souris receveuses induit une immunodéficience transitoire. Pour pallier à cet effet, les souris seront traitées avec des antibiotiques à large spectre dans l’eau de boisson. Le traitement commencera le jour précédant l’irradiation, pour accommoder les souris au gout des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation, le temps que les cellules immunitaires innées soient reconstituées.

Devenir

Les souris donneuses seront mises à mort afin d'isoler leurs cellules souches hématopoïétiques présentes dans la moëlle osseuse. Les souris receveuses seront mises à mort à la fin de la reconstitution hématopoïétique, afin d'analyser en détail le développement des CLI dans différents organes (ex. moëlle osseuse, thymus, poumon, intestin, foie,...).

Remplacement

Les facteurs de transcription dont nous souhaitons examiner le rôle dans le développement des CLI ont déjà été impliqués dans ce processus, ou sont prédits comme jouant des fonctions importantes par des modélisations bioinformatiques du développement des CLI. Leur rôle sera tout d’abord examiné in vitro, puis confirmé in vivo. Le passage in vivo est nécessaire pour récapituler tous les stades de développement des CLI et identifier précisément les stades nécessitant les facteurs de transcription d’intérêt.

Réduction

Le modèle de chimères hématopoïétiques pour étudier le développement des CLI donne des résultats très robustes. Le nombre de souris nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs est donc faible (n=5 par groupe).

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages enrichies. Tous les actes douloureux seront effectués sous anesthésie générale. Après chaque acte, les souris seront réintégrées dans leurs cages et groupes d'origine pour éviter le stress. Les souris déficientes pour le développement de CLI ne développent pas de pathologies. Les chimères hématopoïétiques de cette étude ne devraient donc pas développer de pathologies. Les souris seront donc suivies quotidiennement, et en cas d’apparition du moindre signe clinique, les souris concernées seront sorties du protocole et mises à mort.

Choix des espèces

Les processus développementaux sont très conservés entre l’homme et la souris, donc la souris est un bon modèle d’étude pour comprendre le développement de cellules humaines. De plus de nombreux outils permettant l’analyse du développement des CLI ont été générés chez la souris et seront utilisés dans cette étude (anticorps, souches génétiquement modifiées). Les souris seront utilisées à l’âge jeune adulte (6-12 semaines) pour une meilleure récupération des souris après la procédure.

84 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes et de plumes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées à quatorze jours et tuées au plus tard à quarante-deux jours, elles subissent deux à cinq prises de sang et deux à quatre arrachages de plumes, dans des isolateurs où la compétition alimentaire dépend de la fréquence des nourrissages. Le porteur annonce que de rares animaux développeront la maladie de Marek, tout en décrivant une infection fatale à la majorité des oiseaux atteints, avec fièvre, paralysie, lymphome ou mort subite. L'objet du projet reste de mettre au point une contamination par les poussières d'élevage, présentée comme un moyen de diviser par deux le nombre d'animaux utilisés par expérience.

Objectifs

Le virus de la maladie de Marek est un herpesvirus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux en quelques semaines. Ce virus se transmet entre animaux par l'intermédiaire de poussières d'élevage contaminées. Les virions présents dans l'environnement sont excrétés à partir des follicules plumeux infectés, contaminant durablement l'environnement. En effet, l'infectiosité de ce virus dans l'environnement perdure pendant plusieurs mois, ce qui est une propriété inhabituelle pour un herpesvirus. L’objectif de ce projet est d’établir un protocole d’infection par voie aérienne, la voie naturelle d’infection des animaux, à partir de poussières d’élevage contaminées (issues d’un environnement ayant hébergé des animaux infectés), le matériel infectieux physiologique ou bien à partir de squames infectés produites in vitro. Dans ce cas, il s’agira de tester leur infectiosité et d’obtenir du matériel infectieux transmissible sans avoir recours à des animaux. Ce projet nous permettra de mieux caractériser la nature du matériel infectieux et d'approfondir nos connaissances sur les premières étapes de l’infection par voie respiratoire. Dans le cadre de ce projet, nous testerons différents dispositifs de nébulisation ou de préparation/formulation des squames. Si ce protocole est établi, il permettra à terme d’être utilisé pour tester la protection de l’infection par voie aérienne de candidats vaccins.

Bénéfices attendus

Disposer d’une méthode d’administration du virus par voie naturelle qui ne court-circuite pas l’infection par voie respiratoire, comme c’est le cas quand nous inoculons le virus par voie intra-musculaire (IM). Si nous pouvons reproduire l’entrée virale par voie respiratoire avec des cornéocytes produits in vitro, cela nous permettra à l’avenir de tester l’entrée de virus mutants chez la poule directement, sans avoir besoin d’inoculer des poules par voie IM et de les élever avec des poules contacts, découplant ainsi excrétion par les follicules plumeux et entrée virale par voie aérienne. Cela permettra de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés par expérience. Cela permettra aussi de synchroniser les infections des animaux par voie aérienne (ce qui n’est pas possible avec les animaux contacts) afin d’identifier les premières cellules infectées de l’appareil respiratoire dans les 48h post-infection, soit par imagerie sur animaux vivants, soit après sacrifice des animaux sur tissus explantés et analyse microscopique. Au travers de ce projet, nous espérons (i) établir un modèle d’infection MDV par voie aérienne, la voie naturelle d’infection des poules (ii) observer l’infection des animaux à partir de cornéocytes infectés produits dans le modèle d’équivalent de peau et ainsi démontrer que ce matériel et que le modèle des équivalents de peau est un modèle permettant de mimer l’excrétion du MDV au niveau du follicule plumeux. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux à court ou moyen terme : - Maladie de Marek : Capacité à infecter des animaux directement à partir de poussières infectieuses et donc avoir un modèle qui reproduit l’infection naturelle par voie respiratoire. Synchroniser les infections par voie respiratoire. Ouvrir la voie à une meilleure caractérisation de la maladie par une détection des cellules infectées précocement dans l’appareil respiratoire, cet aspect de la physiopathologie de la maladie restant très mal connu. - Virologie : Etude de la fonction des gènes du MDV et mise au point d’une méthode pour l'évaluation de l'infectiosité par voie aérienne de mutants MDV produits in vitro sur équivalents de peau en cornéocytes.

Procédures

Une inoculation de virus sur animaux vigiles + 2 à 5 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 2 à 4 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.

Impact sur les animaux

1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que de rares animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’inoculation par voie intra-trachéale peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle d’infection in vivo par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche très limitée de la maladie. Notamment, actuellement, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro l’infection à partir de poussières. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible à la maladie, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.

Réduction

Dans ce projet, on s’attend à avoir 100% des animaux infectés, comme dans les conditions naturelles avec des animaux contacts. Le 1er objectif de ce projet est d’établir une méthode d’infection des poules par voie aérienne avec les poussières. Avec un virus fluorescent ayant un phénotype sauvage, on obtient 100% de transmission à 5 animaux contacts (animaux utilisés pour tester la transmission par voie aérienne, la voie naturelle/physiologique). Aussi si 100% des animaux ne sont pas infectés dans les expériences pilotes avec les poussières, la voie et/ou le matériel sera considéré comme déficient et sa préparation/administration devra être modifiée/optimisée (c’est l’objet des 3 expériences pilotes).

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe dans des isolateurs adaptés en nombre et en taille, dans des conditions environnementales contrôlées, avec nourriture et boisson à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement social. Dans les isolateurs, des objets à picorer seront à disposition ainsi qu’un tapis grattoir. Une visite des animaux sera effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié. Les animaux présentant des symptômes graves seront euthanasiés après confirmation du diagnostic de la maladie de Marek. Les animaux présentant des symptômes légers seront surveillés plus attentivement pour détecter l'apparition de nouveaux symptômes. Les euthanasies seront réalisées par injection de pentobarbital. L'ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention sera effectuée en douceur et les prélèvements seront réalisés le plus rapidement possible. La contention pour les inoculations en intrachoanale ou en intratrachéale se fait à 2 personnes pour assurer un geste plus sûr et rapide. Les prélèvements de plumes et de sang seront réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements sera réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l'inoculation du virus par voie intra-trachéale, nous utiliserons des sondes adaptées à l’âge des animaux. L’inoculation par voie intra-choanale sera réalisée avec une pipette. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) ou sous isolateur de travail avant l'entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’inoculation intra-trachéale plus simple et moins stressante pour les animaux.

Choix des espèces

Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race White Leghorn permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront inoculés à l’âge de 14 jours (voire à 5 jrs). Ils seront euthanasiés à maximum 42 jours d’âge pour les expériences 0, 0bis, 1, 2, 3 et 4 et à 60 jours pour l’expérience 5. L’âge d’inoculation de 14 jours a été choisi pour 3 raisons : c’est l’âge décrit dans la seule publication relatant l’inoculation de poules par des poussières, cet âge permet d’envisager une administration intra-trachéale, et de réaliser des prélèvements sanguins suffisant dès le début de l’expérience, tout en restant sensible à la maladie.