Autre recherche fondamentale

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le foie, les muscles ou le pancréas. Elles subissent une à quatre prises de sang sur animal vigile, jusqu'à huit injections, pour certaines une chirurgie de moins de trente minutes, et une privation de nourriture ou d'eau de douze à quarante-huit heures. Le projet vise à valider chez la souris un biomarqueur sanguin déjà observé chez des patients atteints de lésions aiguës du foie, du muscle ou du pancréas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces interactions dans un "organisme entier" et conclut que l'expérimentation animale reste "indispensable".

Objectifs

Certaines lésions aiguës affectant des organes vitaux tels que le foie, les muscles ou le pancréas peuvent déclencher des réponses inflammatoires et métaboliques systémiques sévères. Ces atteintes sont observées dans différents contextes pathologiques humains, notamment lors d’intoxications aiguës, de sepsis ou de maladies auto-immunes et peuvent évoluer vers une défaillance multiviscérale. Ces processus sont fréquemment associés à l’activation de mécanismes de mort cellulaire régulée, tels que l’apoptose, la nécroptose et la ferroptose, qui, lorsqu’ils sont activés de manière excessive ou non contrôlée, peuvent contribuer à l’aggravation des lésions tissulaires. L’objectif général du projet est d’identifier et de caractériser un mécanisme commun de signalisation systémique des lésions tissulaires aiguës reposant sur la libération, dans la circulation sanguine, d’un biomarqueur intracellulaire lors de la mort cellulaire. Le projet vise à valider et à approfondir des observations réalisées chez l’homme, notamment dans des cohortes de patients présentant des pathologies inflammatoires aiguës ou métaboliques, afin d’évaluer la valeur prédictive de ce biomarqueur vis-à-vis de la morbidité et de la mortalité, en complément des marqueurs actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués lors de lésions aiguës touchant des organes vitaux. En s’appuyant sur plusieurs modèles expérimentaux complémentaires, il permet d’analyser comment des dommages cellulaires sévères peuvent être associés à la libération de signaux circulants reflétant l’intensité des atteintes tissulaires et la réponse globale de l’organisme. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les liens entre les lésions locales d’un organe, les réponses systémiques observées dans l’organisme et l’évolution vers des formes graves de la maladie. Cette approche intégrée, combinant des observations issues de différents niveaux d’analyse, vise à identifier des indicateurs biologiques globaux permettant de mieux apprécier la sévérité des atteintes et leur évolution dans le temps. À plus long terme, ces travaux pourront apporter des connaissances utiles pour la recherche biomédicale, en particulier pour l’étude de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques pouvant conduire à une altération de plusieurs organes. Les bénéfices attendus concernent principalement l’amélioration des connaissances fondamentales sur les mécanismes en jeu, susceptibles de contribuer indirectement au développement de stratégies de prise en charge ou de prévention de ces pathologies chez l’homme ou l’animal.

Procédures

Toutes les souris feront l'objet de manipulations de routine nécessitant d'être brièvement maintenues. Afin de clarifier le parcours des animaux, les interventions se répartissent ainsi, selon les groupes étudiés : Prélèvements sanguins : chaque animal subira entre 1 et 4 prises de sang, réalisées sur animal vigile. Chaque geste dure quelques secondes. Injections : certains animaux recevront entre 1 et 8 injections, réalisées sur animal vigile ou sous anesthésie selon la nature de l’intervention. Chaque injection dure quelques secondes. Lorsque l’intervention est susceptible d’induire une douleur, un traitement analgésique préventif est administré en amont. Ces traitements analgésiques sont intégrés au nombre total d’injections prévues. Injection sous anesthésie générale : pour un groupe spécifique, une injection nécessaire à l’induction du modèle expérimental sera réalisée sous anesthésie générale de très courte durée. Le geste dure quelques minutes. Un traitement analgésique sera ensuite maintenu pendant la phase d’observation. Chirurgie : certaines souris subiront une unique intervention chirurgicale de moins de 30 minutes. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale profonde, associée à des traitements analgésiques préventifs locaux et généraux. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie liée à l’anesthésie. Contrôle de l’alimentation ou de l’accès à l’eau : avant le début de certaines expériences, certains animaux vigiles seront soumis à une période unique et temporaire de retrait de la nourriture ou de l’eau, d’une durée comprise entre 12 et 48 heures selon la procédure concernée. Cette étape est nécessaire pour standardiser leur état métabolique ou reproduire les conditions physiopathologiques du modèle.

Impact sur les animaux

Des périodes de contrôle alimentaire sont prévues et peuvent induire une sensation de faim, une baisse transitoire d’activité et une gêne liée au jeûne. Un contrôle alimentaire plus prolongé peut majorer la sensation de faim, entraîner une perte de poids transitoire et une altération temporaire de l’état général. Un contrôle hydrique est également prévu et peut induire une sensation de soif et une gêne transitoire. La contention, les manipulations répétées, les administrations et les prélèvements réalisés sur animaux vigiles peuvent induire un stress aigu transitoire, une réaction d’évitement et une détresse ponctuelle. Le placement en dispositif de contention pour certaines administrations, ainsi que la répétition de gestes techniques au cours de certaines procédures, peuvent majorer ce stress transitoire. Certaines étapes impliquent une anesthésie et une intervention chirurgicale, susceptibles d’induire un stress physiologique, une baisse transitoire de la thermorégulation et, plus rarement, une détresse cardio-respiratoire pendant l’anesthésie ou au réveil. Certaines administrations nécessitent un réchauffement transitoire, pouvant constituer un stress thermique. Les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur légère et transitoire, ainsi qu’un risque d’hématome ou de saignement local. Les administrations par injection peuvent induire une douleur brève au point d’injection et une irritation locale ; lorsqu’elles sont répétées, elles peuvent augmenter le risque de réaction inflammatoire locale et de complication interne. Les administrations intramusculaires peuvent induire une douleur locale et une gêne locomotrice transitoire. L’intervention chirurgicale peut induire une douleur post-opératoire, un risque d’inflammation locale, un risque d’infection et une altération transitoire de la mobilité. L’induction expérimentale de lésions aiguës peut entraîner une maladie avec inconfort, douleur modérée, baisse d’activité, troubles transitoires de l’alimentation et de l’hydratation.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre laboratoire met en œuvre, en amont des expérimentations animales, des approches de remplacement visant à limiter le recours aux animaux lorsque cela sera possible. Les phases exploratoires et de mise au point reposent notamment sur des modèles in vitro (essais sur des cultures de cellules) et sur des approches in silico, utilisés pour tester des hypothèses, optimiser des conditions expérimentales et sélectionner les paramètres à mesurer. Toutefois, les objectifs de ce projet nécessitent des investigations in vivo. Les modèles retenus reposent sur l’induction de lésions d’organes ainsi que sur l’évaluation de leurs conséquences métaboliques. Ces phénomènes impliquent des interactions intégrées entre plusieurs organes et systèmes (notamment immunitaire, métabolique et nerveux). À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de façon suffisamment fidèle l’ensemble de ces interactions et leur dynamique dans un organisme entier, ni d’évaluer de manière intégrée les effets des procédures sur l’état général, la réponse inflammatoire et les paramètres biologiques mesurés aux temps précoces définis. En conséquence, l’expérimentation animale reste indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un nombre total maximal de 240 souris. La stratégie de réduction repose sur l’optimisation du plan expérimental afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maintenant la validité scientifique des résultats. Afin de réduire le recours à des animaux témoins distincts, chaque animal sera utilisé, lorsque le protocole le permet, comme son propre contrôle, grâce à la réalisation de prélèvements ou de mesures avant et après l’administration expérimentale. Cette approche permet des comparaisons pour un même individu et contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet. Par ailleurs, les expérimentations seront regroupées et planifiées de manière à mutualiser les lots lorsque cela est possible. Plusieurs tissus seront prélevés chez un même animal et utilisés pour différentes analyses afin de maximiser les informations obtenues. De plus, les échantillons seront partagés avec des collaborateurs dans un cadre défini afin d’éviter la réalisation d'expériences redondantes et de limiter la production de nouveaux lots d’animaux. La taille des effectifs a été établie de manière stricte grâce à un calcul de puissance : cette méthode permet de déterminer l’effectif minimal nécessaire pour observer un effet. En conséquence, chaque groupe expérimental comprendra 15 souris, ce qui permet de prendre en compte la variabilité naturelle entre les individus tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, sur ces effectifs réduits, il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques rigoureux pour garantir une interprétation fiable et solide des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de prise en charge des animaux respecteront strictement la réglementation en vigueur ainsi que les pratiques validées au sein de l’établissement utilisateur. Les animaux seront hébergés en cages collectives, avec un accès permanent à une alimentation standard et à l’eau ad libitum, sauf lorsque des périodes de privation ou de restriction seront explicitement prévues par certaines procédures expérimentales. L’environnement sera enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, afin de favoriser l’expression de comportements naturels et de limiter le stress. Une surveillance clinique régulière, adaptée à chaque procédure, sera assurée tout au long du projet. Elle permettra l’identification précoce de tout signe de mal-être ou d’altération de l’état général, tels qu’une diminution de l’activité, une posture anormale, une piloérection ou des modifications du comportement. Des points limites spécifiques à chaque modèle expérimental sont définis afin de limiter la douleur, la souffrance ou la détresse des animaux. L’apparition d’une altération marquée de l’état général ou de signes cliniques sévères conduira à une évaluation immédiate et, le cas échéant, à l’arrêt anticipé de la procédure pour l’animal concerné. Les sites d’injection et, lorsque cela est applicable, les zones chirurgicales feront l’objet d’une observation régulière afin de détecter précocement toute réaction locale ou complication. Un suivi attentif sera également assuré après les administrations ou les interventions chirurgicales, en particulier durant les phases critiques définies pour chaque procédure. Des mesures adaptées de prise en charge seront mises en œuvre afin de limiter l’inconfort lié aux actes expérimentaux, incluant le recours à des protocoles d’anesthésie et d’analgésie appropriés ainsi que des mesures de maintien de la température corporelle lorsque cela est nécessaire. En cas de diminution de la prise alimentaire, un apport nutritionnel complémentaire sous forme de gel alimentaire pourra être mis à disposition afin de garantir un apport énergétique suffisant. L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé par du personnel formé et habilité à l’expérimentation animale, conformément aux exigences réglementaires, afin d’assurer des manipulations maîtrisées, reproductibles et respectueuses du bien-être animal.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris, incluant des souris commerciales non transgéniques et des souris génétiquement modifiées pour cibler des gènes spécifiques liés aux maladies étudiées. Ces souris sont fertiles, possèdent un système immunitaire normal et ne présentent aucun problème de santé lié à leur génétique dans des conditions d’élevage classiques. Le choix de la souris se justifie par la pertinence de cette espèce pour étudier les inflammations aiguës, les lésions des organes et les mécanismes de mort des cellules. La souris permet d’explorer globalement les interactions entre les systèmes immunitaire, métabolique et sanguin, qui sont au cœur de ce projet. Ces réactions complexes à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent pas être reproduites de façon adéquate par des méthodes alternatives (comme des cultures de cellules). De plus, la souris constitue un modèle de référence pour lequel il existe une grande expertise en élevage, en soins vétérinaires, et de nombreux outils d’analyse fiables. La disponibilité de souris génétiquement modifiées et la grande similitude des mécanismes biologiques étudiés avec ceux observés chez l’humain rendent cette espèce particulièrement adaptée à nos objectifs. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 8 semaines. À ce stade, les souris ont terminé leur développement et présentent un système immunitaire et un métabolisme adultes, ce qui est indispensable pour garantir la fiabilité scientifique des résultats de cette étude.

Deux à trois semaines à 4-6 °C, vingt-quatre heures sur vingt-quatre, en cage individuelle, avec une prise de température rectale quotidienne : 610 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Pour 94 d'entre eux, le froid arrive après huit semaines passées à 28 °C, transition que le porteur décrit comme "un stress plus important", avec sortie du protocole si la température corporelle reste durablement sous 33,5 °C. L'objectif déclaré est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur, piste explorée contre l'obésité. Le rat a été préféré à la souris parce que sa taille fournit davantage de tissu adipeux brun par animal, ce qui permet d'en utiliser moins pour une même expérience.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire). Début de modification [Le protocole pour le lot supplémentaire (exposition des animaux à la neutralité thermique (28°C) pendant 8 semaines avant leur exposition au froid (4-6°C) constituera un stress plus important que le passage de 22°C au froid (94 animaux sont concernés), mais au vu des premiers résultats obtenus avec le protocole initial d'exposition au froid, cela semble nécessaire pour favoriser le brunissement du tissu adipeux blanc inguinal (en plus de l'induction du TAB interscapulaire). Les études utilisant ce type de protocole ne décrivent aucune nuisance majeure sur l’animal. On a pu également observer durant notre protocole initial d’exposition au froid, qu'aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et qu'aucune mesure corrective n'a été nécessaire.] Fin de modification.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Début de modification [Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) ont été mis en place et seront également appliqués y compris dans ce nouveau protocole. Les animaux mis en cage individuelle, pourront se voir et se sentir dans les armoires ventilées. Afin de réduire le stress, l'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée et en cage individuelle se fera en 2 temps. Durant notre protocole initial d’exposition au froid, aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et aucune mesure corrective n'a été nécessaire. Dans ce nouveau protocole, où la transition au froid sera plus marquée, la surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux sera maintenue. Les points limites déjà définis permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C.] Fin de modification. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Début de modification [afin de limiter le développement du TAB avant l'exposition au froid, les animaux seront placés à la neutralité thermique dès l'âge de 4 semainesleur réception Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.

Le fer injecté dans la tumeur est chauffé par impulsions de radiofréquences pour léser le tissu environnant sur environ un millimètre cube, trois jours de suite, chez 258 souris immunodéficientes porteuses d'un glioblastome humain, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe sous anesthésie pour l'injection, quinze minutes d'imagerie, trente minutes d'hyperthermie, puis une IRM de trente minutes une semaine après la dernière séance. Le projet annonce des tumeurs contrôlées entre 150 et 200 mm³ qui "ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité", tout en fixant un point limite à 1 500 mm³, et décrit l'injection des nanoparticules tantôt en intratumoral tantôt en intraveineux. Les souris sont tuées sans reprise de conscience à la fin de l'IRM, pour chercher dans les tissus la nécrose de la tumeur.

Objectifs

Sur la base d'études in vitro réalisés fin 2025, visant à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur à une quantité jugée suffisante pour une efficacité in vivo supplémentaire par activation par hyperthermie magnétique, et d'études in vitro qui sont réalisées fin 2025, des études de preuve d'efficacité de l'hyperthermie seront menées. L’hyperthermie magnétique se base sur une impulsion de radiofréquences ciblée. Ceci permet de faire une hyperthermie localisée augmentant la température autour de l’endroit où il y a présence de fer. Injectant le fer à l’intérieur de la tumeur, cela fait une cible dans le tissu autour de la localisation de fer d’environ 1 mm3. Dans ce sens, l'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. Ainsi, pour atteindre cet objectif, un modèle tumoral humain et une voie d'administration du composé intra tumorale sont envisagés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour le projet global sont de valider une nouvelle nanoparticule en lien avec l’hyperthermie magnétique, approche thérapeutique en plein essor. Ce projet nous aidera à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur en quantité suffisante pour une efficacité in vivo par activation par hyperthermie magnétique. L'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. De plus, la robustesse du processus de fabrication de cette molécule d'intérêt pourra être validée également avec un duplicat d'expériences.

Procédures

Les animaux auront une acclimatation à l’animalerie avec marquage et pesées. L’inoculation de la tumeur est prévue 10 jours environ après l’arrivée à l‘animalerie. Deux mesures de poids et de volumes de tumeurs seront faites par semaine avant d’atteindre le volume tumoral ciblé (environ 6 mesures qui se feront avec une légère contention) et réaliser la randomisation des groupes. L’injection intra tumorale des produits d’intérêt sera faite sous anesthésie au gaz et le suivi par imagerie des particules magnétiques et hyperthermie suivra à J0 puis J1 et J2 respectant 30 minutes de repos entre l’injection et imagerie puis hyperthermie. Les pesées et mesures du volume tumoral seront faites encore à J0 ; J2 puis J6 et J9. Une semaine après la dernière séance d’hyperthermie (J9), une IRM sera faite pour vérifier la présence de nécrose tumorale. Sans reprise de conscience, la mise à mort permettra de réaliser des examens post-mortem sur les tissus collectés. Les acquis en imagerie des particules magnétiques dureront environ 15 minutes et se feront sous anesthésie, les séances d’hyperthermie dureront environ 30 minutes et se feront sous anesthésie, la séance d’IRM durera environ 30 minutes et se fera sous anesthésie également ; la mise à mort se fera sans reprise de conscience à la fin de l’IRM.

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Cette étude vise des tumeurs controlées et réduites, entre 150 et 200mm³ qui ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité. Néanmoins, nous prévoyons un point limite si les tumeurs atteignent 1500m³. L’inoculation de la tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs juste après l’inoculation. L’injection des nanoparticules véhiculées dans les cellules est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Concernant l'imagerie et l'hyperthermie, elles se dérouleront sous anesthésie générale sur 15 minutes. Nous nous attendons pas de nuisances supplémentaires.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir réaliser des examens post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui même est une deuxième étude sur la base d’études in vitro réalisées fin 2O25 pour valider la biodistribution de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers grâce aux effets thérapeutiques associés à l'hyperthermie.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre l’évolution de la tumeur pour l’utilisation thérapeutique des nanoparticules. Une permière partie de validation est prévue et une deuxième partie suivra avec ces groupes minimaux. Des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature. Ces simulations ont été faites à l’aide de l’outil en ligne.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de 4 individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Cette surveillance inclut également un scoring avec des paramètres d’interaction sociale, associés à la perte de poids et motricité autour de l’évaluation du point limite. La procédure a été pensée de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés.

Choix des espèces

Concernant le choix des souris, nous nous intéressons aux souris qui sont immunodéficientes et fréquemment utilisées dans les modèles précliniques de cancérologie, en particulier pour greffes de cellules humaines. L'immunité de la souche choisie est spécifique pour une réponse immunitaire très réduite et une très bonne tolérance, ce que améliore la prise tumorale, indispensable à ce projet. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 7-8 semaines à l'arrivée à l'animalerie. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

Le virus respiratoire syncytial et le SARS-CoV-2 sont instillés dans le nez des souris, une à deux fois, au cours d'expériences de cinq à dix jours. 176 souris génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain ACE2 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées au dioxyde de carbone pour le prélèvement de leurs poumons, de leur liquide broncho-alvéolaire et de leur sang. L'objet est de savoir si une enzyme pulmonaire, la MMP-7, freine l'entrée de ces virus dans les cellules, question déjà abordée en culture cellulaire. Le porteur affirme que les animaux "ne ressentent aucune gêne" et qu'aucune manipulation n'a lieu sur animal conscient, tout en listant une gêne respiratoire pendant un à cinq jours, un isolement et une posture recroquevillée pendant vingt-quatre à soixante-douze heures, et une hypothermie possible après anesthésie.

Objectifs

Ce projet part de l’idée que certaines molécules produites par les cellules des poumons lors d’une infection en particulier une enzyme qui décompose certaines protéines et qui pourraient aider le corps à se défendre contre des virus respiratoires. La molécule est naturellement présente en grande quantité dans les cellules qui tapissent nos voies respiratoires, et elle semble jouer un rôle important dans plusieurs maladies pulmonaires. Nos premières expériences en laboratoire montrent que cette enzyme pourrait empêcher ces virus d’infecter les cellules. Mais il reste à vérifier si elle joue le même rôle dans un organisme vivant. L’objectif du projet est donc de comprendre comment la molécule contribue à la défense immunitaire : -influence-t-elle l’entrée des virus dans les cellules ? -participe-t-elle à activer ou réguler la réponse immunitaire ? -permet-t-elle de réduire la gravité ou la progression de l’infection, y compris lors d’une co-infection par les deux virus ? En bref, ce projet cherche à déterminer si l’enzyme en question est un acteur clé de la protection naturelle des poumons contre ces infections virales.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension du rôle d’une molécule dans l’inflammation des voies respiratoires et dans les problèmes pulmonaires provoqués par les infections virales. En étudiant comment cette molécule influence l’infection et la réaction du corps, nous espérons identifier des mécanismes importants qui pourraient aider, à terme, à mieux prévenir, diagnostiquer ou traiter ces infections chez l’homme. Les observations recueillies permettront de comprendre : -comment les virus se développent dans les poumons, -comment l’organisme réagit (inflammation, substances libérées par le système immunitaire, production de mucus), -et dans quelle mesure la molécule aide à éliminer les virus. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour le développement de traitements ou d’outils médicaux destinés aux infections respiratoires. Le modèle utilisé dans ce projet deviendra également un outil précieux pour la recherche future, notamment pour étudier d’autres virus respiratoires ou pour tester de potentielles stratégies vaccinales.

Procédures

Aucune manipulation n’est réalisée sur des animaux conscients. Les virus sont administrés par voie intranasale uniquement lorsque les animaux sont complètement anesthésiés, ce qui évite toute douleur ou stress. L’administration des virus sera réalisée une à deux fois au cours des expérimentations, dont la durée totale est de 5 à 10 jours. Tous les prélèvements nécessaires à l’étude (sang, liquide pulmonaire, poumons) sont effectués uniquement après l’euthanasie, afin que les animaux ne ressentent aucune gêne. Par ailleurs, les animaux ne sont manipulés qu’une seule fois par jour, pour une durée courte de 2 à 3 minutes, afin d’assurer le suivi de leur bien-être. Ainsi, toutes les manipulations pouvant provoquer de l’inconfort sont réalisées sous anesthésie ou après l’euthanasie, et les animaux ne sont jamais vigiles pendant ces procédures.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet pourraient présenter certains effets liés à l’infection expérimentale ou aux procédures nécessaires à l’étude. Ces effets resteront en général modérés et temporaires, et feront l’objet d’une surveillance étroite. Les nuisances possibles sont les suivantes : 1.Gêne respiratoire légère à modérée : Les animaux pourraient respirer plus rapidement ou avec un certain inconfort durant les premiers jours après l’infection (environ 1 à 5 jours). Les signes respiratoires très marqués seront considérés comme un critère d’arrêt immédiat pour protéger l’animal. 2.Changements de comportement : Une baisse d’activité, un isolement ou une posture recroquevillée peuvent apparaître temporairement (24 à 72 heures). Ces réactions sont courantes lors d’infections ou après des interventions légères. 3.Baisse temporaire de la température après anesthésie : Une légère hypothermie peut survenir dans les heures suivant l’anesthésie, mais elle est corrigée rapidement grâce au maintien au chaud. Une hypothermie prolongée serait un critère d’arrêt. 4.Léger inconfort lié aux instillations intranasales : Des éternuements, toux légères ou irritations du nez peuvent apparaître juste après la procédure, mais ces signes sont brefs et disparaissent en quelques minutes ou heures. 5.Diminution transitoire de l’appétit ou de l’hydratation : Certains animaux pourraient manger ou boire un peu moins pendant 1 à 3 jours, entraînant parfois une légère perte de poids. Une perte trop importante ou persistante entraînera l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. 6.Sensibilité accrue des lignées génétiquement modifiées : Les souris utilisées, dont certaines présentent des modifications génétiques, peuvent être plus sensibles aux infections. Elles pourront donc montrer des signes un peu plus marqués, ce qui justifie une surveillance renforcée et des mesures de prise en charge adaptées. Toutes ces nuisances prévues seront limitées au maximum grâce aux pratiques de raffinement, à un suivi rigoureux et à l’application stricte de critères d’arrêt pour garantir le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés, car le protocole prévoit un prélèvement terminal des poumons, du liquide broncho-alvéolaire et du sang. Ces échantillons ne peuvent être obtenus que post-mortem et justifient que l’euthanasie soit réalisée en fin de procédure, garantissant la qualité et la validité des analyses prévues. Cette approche assure également que la procédure est uniforme et compatible avec le respect du bien-être animal. Les animaux seront euthanasiés à l’aide de dioxyde de carbone (CO₂), conformément aux recommandations réglementaires et éthiques en vigueur. Le gaz est introduit de manière progressive dans une chambre adaptée, ce qui entraîne une perte de conscience rapide. Les animaux sont observés en continu afin de garantir que la procédure se déroule correctement, et le décès est confirmé par l’absence de respiration et de réflexes. Cette méthode est réalisée uniquement par du personnel formé et autorisé. Une méthode secondaire validée peut être utilisée si nécessaire. L’utilisation du CO₂ permet de limiter les manipulations individuelles et d’assurer une procédure uniforme, réalisée dans des conditions contrôlées et compatibles avec le respect du bien-être animal.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons d’abord réalisé toutes les études possibles sans modèle animal. Nous avons notamment travaillé sur des cellules cultivées en laboratoire et utilisé des outils informatiques permettant de faire des prédictions. Ces méthodes nous ont permis d’obtenir de nombreuses informations et de réduire autant que possible le recours aux animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des réactions d’un organisme vivant, en particulier pour comprendre l’inflammation des poumons et la manière dont le corps réagit à une infection ou une coinfection. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux reste nécessaire pour certaines étapes du projet.

Réduction

Le projet est conçu pour utiliser le minimum d’animaux nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre de souris est défini en tenant compte de la quantité de données nécessaires pour répondre aux questions scientifiques, tout en évitant les groupes trop nombreux. Chaque animal sera étudié de manière optimale : plusieurs mesures et analyses seront effectuées sur le même animal (ex. analyse des poumons, du sang, observation de l’infection), ce qui permet de réduire le nombre total de souris. Nous utiliserons également des plans expérimentaux optimisés, qui combinent différentes analyses et exploitent au maximum les informations de chaque animal, sans compromettre la qualité des résultats. Cette approche respecte le principe des 3R : réduire le nombre d’animaux tout en obtenant des données fiables et significatives, et limiter les nuisances pour chaque animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont conçues pour réduire au maximum toute douleur, stress ou inconfort. Elles sont réalisées par du personnel spécialement formé et expérimenté. Des mesures spécifiques seront appliquées pour le bien-être des souris : Les anesthésies seront faites de manière sûre avec un gaz adapté, et la température corporelle sera maintenue pour éviter toute hypothermie. Les yeux seront protégés pendant l’anesthésie, et les animaux seront surveillés de près jusqu’au réveil pour détecter tout signe de malaise. La douleur sera gérée avec des médicaments si nécessaire, et les signes de détresse ou de changement de comportement déclencheront une intervention immédiate. Les animaux disposeront d’un environnement enrichi, avec matériaux de nidification, objets pour explorer et cachettes, pour favoriser leur comportement naturel. Toutes les manipulations seront limitées au strict nécessaire, la durée des expériences sera réduite au maximum, et des critères d’arrêt sont prévus pour interrompre immédiatement toute procédure si un animal montre des signes de souffrance. Ces mesures permettent de garantir le bien-être des animaux tout en recueillant des données scientifiques fiables et pertinentes

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont le modèle le plus approprié pour étudier, dans un organisme vivant, les infections respiratoires virales. Elles permettent de mieux comprendre les mécanismes immunitaires et les réactions des voies respiratoires, ce qui n’est pas possible uniquement avec des cellules en laboratoire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle de la molécule MMP-7 lors d’infections simples ou de co-infections. Ces modèles animaux sont nécessaires pour observer l’ensemble des réponses immunitaires et les interactions complexes entre les différents types de cellules impliquées dans l’infection. Les souris auront entre 5 et 12 semaines, correspondant à de jeunes adultes avec un système immunitaire mature. Cette tranche d’âge permet d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la gravité des symptômes et le stress pour les animaux. Elle représente donc un bon compromis entre pertinence scientifique et bien-être animal, conformément aux principes de raffinement.

Isolées en cage individuelle pendant dix mois, dont une partie nourrie à 70 % de sa ration, 420 souris vont être utilisées pour étudier le vieillissement de l'ADN, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées au terme des dix mois pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que ce logement individuel prolongé, qu'il juge nécessaire pour mesurer précisément les apports, induit un stress. Les enseignements espérés sur le vieillissement humain restent une projection.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons comprendre comment les protéines qui contribuent à l'empaquetage de l'ADN dans les cellules évoluent à mesure que les humains vieillissent. Nous nous intéressons également à la manière dont l'alimentation et les habitudes alimentaires, comme le fait de manger moins ou uniquement à certaines heures, peuvent influencer ces protéines. Pour étudier cette question, nous comparerons des groupes de souris qui s'alimentent normalement à des groupes soumis à un régime alimentaire restrictif et à des horaires de repas limités. En observant ces différences, nous espérons en apprendre davantage sur la manière dont le vieillissement et le mode de vie affectent l'organisation de l'ADN dans notre corps.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à comprendre comment les protéines qui organisent l'ADN dans les cellules changent à mesure que les souris vieillissent, et comment ces changements affectent l'activation ou la désactivation des gènes. Nous étudierons également comment deux interventions connues pour favoriser la santé et la longévité, à savoir manger moins et seulement durant la phase active, peuvent influencer ces protéines. Les résultats pourraient fournir des informations sur le processus de vieillissement chez l'homme, identifier des marqueurs permettant de suivre un vieillissement en bonne santé et suggérer des moyens de ralentir les changements liés à l'âge en ciblant l'organisation de l'ADN.

Procédures

Toutes les souris seront hébergées en cage individuelle pendant 10 mois. Une partie des souris seront soumises pendant 10 mois à une restriction calorique associée à une alimentation à durée limitée, recevant 70 % de l’apport calorique individuel de référence, administré une fois par jour au début de la phase active.

Impact sur les animaux

Le logement individuel, nécessaire pour mesurer avec précision la consommation alimentaire et imposer une restriction calorique, peut induire un stress modéré chez les animaux. La pesée des animaux tous les 3 jours provoque un stress bref lié à la manipulation. Le régime alimentaire à restriction calorique et temporelle peut également induire un stress léger.

Devenir

Les animaux feront l’objet d’une mise à mort à la fin des 10 mois afin de prélever leurs organes et de réaliser les analyses ultérieures.

Remplacement

Cette étude examine comment l'organisme dans son ensemble réagit à une alimentation réduite et limitée dans le temps. De telles réponses complexes ne peuvent être reproduites dans des cellules ou dans de petites parties du corps seules, il est donc nécessaire de les étudier chez des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en permettant une analyse statistiquement significative des résultats et en tenant compte de la variabilité interindividuelle des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en prenant en compte la puissance statistique souhaitée (80 %), la différence attendue entre les moyennes des groupes et l’écart type attendu d’après les données publiées. Dans une perspective de réduction, à la fin de l’étude, nous collecterons tous les organes d’intérêt (par exemple, cerveau, foie, poumons, cœur), y compris ceux que nous ne prévoyons pas d’analyser actuellement, et les conserverons au congélateur pour d’éventuelles analyses futures.

Raffinement

Pour limiter l’inconfort et garantir le bien-être des souris tout au long de l’étude, tout animal pesant moins de 20 g au début du protocole ne sera pas inclus. Les souris seront pesées tous les trois jours et leur consommation alimentaire sera surveillée afin de détecter tout signe de détresse. Les animaux seront logés individuellement dans des cages permettant un contact visuel avec les autres souris. Leur environnement sera enrichi afin de favoriser l’expression de comportements naturels, avec la mise à disposition de matériel de nidification et d’éléments d’enrichissement adaptés. Des points limites précis ont été définis, basés notamment sur la surveillance du comportement, de l’apparence physique et du poids corporel des souris.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères présentant de nombreuses similarités avec l’humain, notamment dans leur réponse physiologique à l’alimentation et aux rythmes alimentaires, ce qui en fait un modèle approprié pour étudier les effets d’une alimentation réduite et limitée dans le temps. Pour cette étude, des souris adultes, âgées de 8 semaines au début de l’expérimentation, seront utilisées, car nous souhaitons étudier les effets de la restriction calorique et de l’alimentation à durée limitée chez des animaux adultes.

Soumises à une extraction puis à une réimplantation dentaire sous anesthésie, 40 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Après l'intervention, elles peuvent souffrir d'une infection ou d'un saignement du site opératoire et éprouver des difficultés à se nourrir. Le maxillaire est prélevé quatre semaines plus tard, la mise à mort étant nécessaire à ces prélèvements. L'étude porte sur le rôle d'une protéine dans la régénération du ligament qui fixe la dent à l'os.

Objectifs

Le ligament parodontal est un tissu souple qui relie la dent à l’os de la mâchoire. Très fin (environ un quart de millimètre), il agit comme un véritable amortisseur et permet à la dent de résister aux forces exercées lors de la mastication. Grâce à un réseau de fibres et de cellules spécialisées, il joue un rôle essentiel dans le maintien de la dent et dans le renouvellement des tissus environnants, comme l’os et la surface de la racine dentaire. Il s’agit d’un tissu vivant, riche en nerfs et en vaisseaux sanguins, capable de s’adapter en permanence. Avec l’âge, les infections bactériennes ou certaines maladies chroniques inflammatoires, ce ligament s’amincit, se fragilise et perd progressivement ses fonctions. Cela peut conduire au déchaussement des dents. Dans certaines situations cliniques, notamment lors de la pose d’implants dentaires, ce ligament est totalement absent. Si les fibres et les cellules responsables de l’attachement de la dent et du renouvellement des tissus ont déjà été largement étudiées, les vaisseaux sanguins du ligament restent en revanche mal connus. Pourtant, ils sont indispensables à la vitalité du tissu : ils assurent l’apport de nutriments, le bon fonctionnement des nerfs, le renouvellement des cellules et le maintien de la structure du ligament. Il existe des molécules naturellement présentes dans ce tissu, qui jouent un rôle clé dans la formation et le maintien des vaisseaux sanguins. Lorsque ces molécules sont altérées, le ligament perd sa structure et sa capacité à fonctionner correctement. À partir de ces découvertes, nous avons développé une nouvelle molécule capable de stimuler la réparation des vaisseaux et de favoriser la régénération du tissu. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet réparateur de cette molécule sur la régénération du ligament parodontal. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, basé sur l’extraction puis la réimplantation d’une dent. Les résultats obtenus avec cette nouvelle approche seront comparés à ceux d’un traitement de référence déjà utilisé en dentisterie, ainsi qu’à un support neutre servant de contrôle. Nous analyserons différents paramètres, tels que l’épaisseur du ligament, la dégradation de la racine dentaire ou la fusion anormale entre la dent et l’os. Des analyses microscopiques permettront également de suivre l’évolution du tissu pendant un mois et d’évaluer la qualité de sa régénération.

Bénéfices attendus

L’ambition du projet est d’exploiter des propriétés nouvelles mise en évidence pour une molécule recombinante pour améliorer les performances du ligament parodontal. Cela pourrait permettre une meilleure prise en charge des traumatismes dentaires, le développement d’implants dentaires bio-intégrés, l’optimisation des traitements orthodontiques et le traitement des maladies du ligament parodontal. De plus, le traitement utilisé actuellement est un produit d’origine animale dont le mode d’action est peu connu. Notre molécule recombinante pourrait remplacer ce produit pour réduire l’utilisation de produits d’origine animal.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie avec extraction dentaire puis réimplantation avec ou sans la molécule d'intérêt. Cette intervention durera quelques minutes. Les analyses se feront 4 semaines après l'intervention chirurgicale.

Impact sur les animaux

Des douleurs d'intensités légères pourront être ressenties sur une durée limitée (quelques heures) lors des injections et après la chirurgie. Il y a également des risques d'infection ou de saignement du site opératoire au moment de l'extraction. Les souris pourront ensuite avoir des difficultés à se nourrir correctement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par du personnel formé afin que les prélèvements du maxillaire en vue des études histologiques prévues puissent être faits.

Remplacement

Ces expériences doivent être réalisées sur un modèle animal, car il n’est pas possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un tissu vivant. Seules des études menées chez l’animal permettent d’observer des phénomènes essentiels comme la formation des vaisseaux sanguins et la cicatrisation, dans des conditions proches de celles du corps humain. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés pour mettre au point la molécule utilisée et définir la meilleure façon de l’employer. Toutefois, avant toute application chez l’humain, il est indispensable de passer par des études précliniques sur l’animal. Dans le cadre de ce projet, ces travaux seront menés chez le rongeur. Ces études permettent de vérifier si la molécule est efficace, si elle fonctionne correctement dans un organisme vivant et si elle favorise réellement la régénération du ligament qui maintient la dent. Les résultats obtenus chez l’animal constituent une étape clé avant toute évolution vers une application clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique a priori. Des expérimentations in vitro ont déjà été menées sur cette nouvelle molécule pour déterminer la formulation optimale

Raffinement

Afin de limiter leur stress, une période d’adaptation est prévue pour les habituer progressivement aux déplacements vers la salle de chirurgie. Pendant l’intervention, les animaux seront endormis puis maintenus sous anesthésie de façon adaptée à la chirurgie réalisée dans la bouche. Des traitements contre la douleur seront administrés avant et après l’opération afin d’assurer leur confort. Un gel protecteur sera appliqué sur les yeux pendant l’intervention pour éviter toute sécheresse. À la fin de la chirurgie, une solution hydratante tiède sera administrée afin de prévenir la déshydratation. Le réveil se fera dans des conditions contrôlées, sur un support chauffant, et chaque animal sera placé temporairement dans une cage individuelle pour éviter tout risque lié au contact avec d’autres animaux encore éveillés. Une fois complètement réveillé, l’animal sera replacé dans sa cage habituelle. Après l’intervention, une alimentation molle sera proposée pour faciliter la prise de nourriture et éviter tout déplacement de la dent traitée. Une attention particulière sera également portée à une bonne hydratation. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour veiller à ce que les points limites définis ne soient pas atteints. Une procédure précise de décisions sera mise en place par l'expérimentateur en collaboration avec le personnel de l'animalerie.

Choix des espèces

Le projet utilise un modèle murin déjà décrit. La molécule que nous voulons tester a déjà été utilisée dans le modèle de rétine postnatale de souris et s’est avéré fonctionnelle et sans effet délétère dans cette espèce. Les souris utilisées seront âgées de 4 semaines qui correspond à un âge ou le ligament parodontal est bien établi et fonctionnel.

Menée par une société qui a mis au point sa propre technologie de vectorisation, l'étude soumet 600 souris à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la peau, puis deux à quatre administrations des molécules à tester et jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort en urgence, les autres à la fin du protocole. L'objectif est d'évaluer l'efficacité et la distribution de molécules conjuguées destinées à cibler les cellules cancéreuses.

Objectifs

Les cancers demeurent la première cause de mortalité en France et nécessitent le développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et plus efficaces. L’identification de récepteurs ou transporteurs surexprimés à la surface des cellules tumorales constitue une approche prometteuse pour améliorer la spécificité des agents thérapeutiques et diagnostiques. Notre société a mis au point une technologie qui associe des vecteurs biologiques à différentes molécules d’intérêt. Cette approche exploite les mécanismes naturels de passage des cellules pour permettre aux molécules de franchir certaines barrières biologiques et d’atteindre les tissus ciblés. Le projet vise à évaluer l’efficacité et la distribution dans l’organisme de ces molécules conjuguées (molécules-C) en oncologie, en ciblant des récepteurs ou transporteurs surexprimés par les cellules cancéreuses. Les résultats attendus permettront d’apprécier le potentiel de cette approche de vectorisation pour le développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’évaluer l’efficacité de molécules vectorisées pour délivrer de manière ciblée des agents thérapeutiques et diagnostiques vers des tumeurs. Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension de la distribution et des effets biologiques de ces molécules, ainsi que la validation de modèles précliniques pertinents pour l’oncologie. Ces connaissances pourront contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques et potentiellement moins toxiques, et orienter la conception de futures approches ciblées en oncologie.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La mise en contention (avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 2 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires peuvent être réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances ou effets indésirables sont liés au stress physique et à l’inconfort des animaux : - Lors des manipulations expérimentales : stress lié à la mise en contention, aux différentes administrations (induction tumorale par injection sous-cutanée (100µl), administration des molécules-C par voie intraveineuse ou sous-cutanée (une à trois maximum par individu), administration intrapéritonéale lors de la mise à mort (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris) et aux prélèvements sanguins intermédiaires (maximum 4 prélèvements ≤50 µl par individu, ne dépassant pas 10 % de la volémie sur 14 jours). - Lors de l’implantation et croissance tumorale : inconfort ou gêne locale liée à l’implantation des cellules tumorales et au développement des tumeurs. Les souris athymiques, en raison de leur phénotype immunodéprimé, peuvent présenter une sensibilité aux infections et une altération de l’état général ; ces nuisances potentielles sont toutefois limitées par les conditions d’hébergement (cages individuellement ventilées) et la surveillance régulière appliquées à l’ensemble des souris.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Si, au cours de l’expérimentation, un animal atteint un point limite, il sera euthanasié en urgence après validation par le vétérinaire et le porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont une première série de tests in vitro afin de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires (SPR, mesure d’affinité cellulaire). Cependant, ces tests ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble des paramètres physiologiques (mécaniques, immunitaires, métaboliques et d’élimination) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour évaluer ces paramètres complexes, il est nécessaire de recourir à un modèle vivant, ici la souris, premier modèle animal disponible proche de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Aucun modèle informatique ou in vitro n’est actuellement capable d’intégrer toutes les interactions physiologiques requises pour étudier la pharmacocinétique et l’efficacité pharmacologique de nos vecteurs. La souris reste donc, à ce jour, le système le plus pertinent pour étudier de manière complète la pharmacologie des molécules conjuguées chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs permet d’utiliser des doses réduites, limitant ainsi les effets secondaires indésirables (Raffinement) et le nombre d’animaux nécessaires (Réduction). Le nombre d’animaux par groupe (15) a été défini pour garantir une puissance statistique suffisante, en tenant compte de l’effet biologique attendu, de la variabilité individuelle. Chaque étude comporte 2 groupes expérimentaux (1 contrôle et 1 traité), permettant de tester chaque molécule avec un minimum d’animaux. La planification annuelle et quinquennale a été optimisée pour que le nombre total sur 5 ans ne dépasse pas 600, tout en assurant des données fiables. Enfin, une sélection ciblée des tissus à prélever permet d’éviter des prélèvements inutiles et d’optimiser l’utilisation des animaux pour plusieurs analyses.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 5 individus maximum par cage et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. De plus, une observation quotidienne des animaux porteurs de tumeurs, avec mesure régulière des volumes tumoraux, permettra d’établir quotidiennement un score prenant en considération la perte de poids, la présence de signes de douleur ou de souffrance notable (cardiaque, respiratoire). Toutes les administrations (iv, ip et sc) sont réalisées par un personnel formé, expérimenté pratiquant en routine ce type d’études chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Lorsqu’ils ont lieu, les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : un volume tumoral supérieur à 1000 mm³, une perte de poids supérieure ou égale à 20 % par rapport au poids corporel maximal, ou un score de souffrance supérieur à 10 avec analgésie inefficace après 2 h. A la fin du projet tous les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Des essais in vitro sont réalisés en amont pour vérifier l’interaction des vecteurs avec leurs récepteurs cellulaires. Ces approches ne permettent cependant pas d’évaluer l’ensemble des paramètres physiologiques complexes impliqués in vivo, tels que la distribution dans l’organisme, la pharmacocinétique ou l’efficacité tumorale. À ce jour, aucun modèle alternatif (in vitro ou in silico) ne permet de prédire de manière fiable ces paramètres. Le recours à des modèles murins est donc indispensable pour l’évaluation de vecteurs à visée thérapeutique ou diagnostique dans un contexte tumoral. La souris constitue un modèle mammifère pertinent, intégrant l’ensemble des mécanismes physiologiques nécessaires à l’étude de l’efficacité pharmacologique. Pour cette procédure, des animaux dits « jeunes adultes » seront utilisés, âgés d’environ 6 semaines et pesant en moyenne 24g à 28g, ce qui permet d’optimiser les posologies et la standardisation des expérimentations. Deux souches seront employées selon les besoins expérimentaux : - Une souche déficiente en système immunitaire, permettant l’implantation et la croissance reproductible de tumeurs solides humaines sous-cutanées, facilitant la prise tumorale et le suivi de la croissance tumorale. - Une souche sauvage présentant un système immunitaire fonctionnel, permettant l’évaluation des vecteurs dans un environnement tumoral incluant la réponse immunitaire.