Autre recherche fondamentale

30 xénopes femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée et le reste réopéré à plusieurs reprises. Chacune subit une chirurgie de prélèvement d'ovocytes d'une dizaine de minutes sous anesthésie, répétée jusqu'à dix fois au cours de sa vie avec un intervalle minimal de six mois, pour étudier des systèmes de transport végétaux. Le porteur indique qu'une infection au site opératoire reste possible et que les femelles de plus de onze ans ou ayant subi dix laparotomies ne sont pas réveillées puis euthanasiées. Il qualifie l'ovocyte de xénope de modèle "indispensable" reconnu depuis plus de trente ans, difficilement remplaçable par des cellules en culture plus petites.

Objectifs

Notre laboratoire étudie les mécanismes permettant aux plantes de mieux répondre aux stress environnementaux liés notamment au changement climatique. Nous nous intéressons en particulier aux systèmes de transport membranaires nécessaires à l'acquisition et au transport d'eau et de minéraux par les plantes et les champignons vivant en symbiose avec les plantes. Pour nos travaux, l'utilisation d'ovocytes de grenouilles xénopes est cruciale. Ce système est reconnu depuis plus 30 ans comme modèle pour l'étude des transporteurs et canaux ioniques de plantes. Dans notre laboratoire, l'utilisation d'ovocytes de xénopes a par exemple contribué de manière déterminante à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des canaux potassiques végétaux impliqués dans les mouvements des stomates (pores qui assurent les échanges gazeux avec le milieu extérieur et permettent la résistance des plantes au déficit hydrique) et des aquaporines qui permettent le transport de l’eau depuis la racine. Ce projet se déroulera sur 5 ans et permettra de caractériser les systèmes de transport impliqués en combinant des approches pluridisciplinaires (génomique, biophysique, physiologie moléculaire, modélisation) pour comprendre comment les plantes coordonnent leur développement en s'adaptant aux contraintes environnementales.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes gouvernant la nutrition minérale des plantes et leur réponse aux stress environnementaux est un enjeu majeur de la recherche fondamentale en Sciences des Plantes. Les résultats de nos travaux devraient notamment permettre à court terme d'avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces systèmes de transports chez la plante (conditions ioniques saturant leur activité, sélectivité, régulation de leur activité en fonction de différents stimuli environnementaux, ...), des voies de signalisation qu’ils déclenchent et des régulations cellulaires qui en résultent. A plus long terme ils pourraient contribuer au développement d’une agriculture durable, économe en ressources naturelles et respectueuse de l’environnement.

Procédures

Le projet ne comporte qu'une seule procédure permettant l'obtention d'ovocytes par chirurgie sur animal anesthésié (procédure chirurgicale simple d'une dizaine de minutes). La durée de vie de ces animaux étant longue (une quinzaine d'années en captivité, une dizaine d'années dans notre animalerie) les femelles issues de la procédure pourront être opérées à plusieurs reprises au cours de leur vie (jusqu'à 10 fois en respectant un intervalle de repos de 6 mois au minimum entre chaque opération), en s'assurant de la complète récupération de l'animal et après accord du vétérinaire chaque année.

Impact sur les animaux

Toutes les mesures seront prises pour limiter au maximum tout stress et toute douleur à l'animal lors de la procédure de chirurgie (10 min) en réduisant notamment au maximum les étapes de manipulation de l'animal pour ne pas lui causer de stress au moment de l'anesthésie et du réveil. Une infection au site de prélèvement restant possible, l’animal sera mis en observation pendant quelques jours afin de s’assurer qu'il a pleinement recouvré son état de santé avant de retourner en stabulation avec ses congénères.

Devenir

La durée de vie des xénopes est longue (une quinzaine d'années). Les femelles issues de la procédure pourront être à nouveau opérées, en respectant un intervalle de repos d'au minimum 6 mois entre chaque opération et après accord du vétérinaire. Le suivi du poids de l'animal à une fréquence semestrielle et la pesée avant chaque opération permet également de s'assurer de la bonne récupération de l'animal entre 2 opérations (5 à 10% de tolérance de perte de poids) et les animaux seront sytématiquement mis "au repos" pendant un an au moindre doute. Les animaux âgées de plus de 11 ans ou ayant subi 10 laparotomies ne seront pas réveillées à la fin de la procédure et seront euthanasiées en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce.

Remplacement

L'ovocyte de xénope est un modèle de choix pour l’étude de certaines protéines végétales permettant le passage des éléments minéraux, des sucres, des hormones au travers des membranes des cellules de la plante : les canaux ioniques et les transporteurs. Les ovocytes de xénopes sont de grosses cellules (1 mm de diamètre) capables de produire en quantité importante des protéines végétales fonctionnelles sur leur membrane qu’il est ensuite facile de caractériser, notamment car la grande taille des ovocytes rend leur manipulation simple à réaliser. De plus, cette cellule étant d'origine animale, les canaux ioniques et transporteurs animaux initialement présents dans les ovocytes sont de nature clairement différente de celle des canaux ioniques et transporteurs végétaux que nous souhaitons caractériser, et il est donc aisé de distinguer les deux. Les autres alternatives à l'expression en ovocyte de xénopes ont été envisagées et nous réaliserons, quand cela sera possible et parallèlement aux expérimentations sur ovocyte de xénopes, des études sur cellules animales en culture (non humaines) et/ou végétales. Cependant, les cellules animales en culture et les cellules végétales sont beaucoup plus petites (quelques dizaines de micromètres), ce qui nécessite d'autres savoir-faire et équipements beaucoup plus délicats à mettre en oeuvre que sur ovocytes, et engendre des temps de caractérisation rallongés d'un facteur 5 à 10. Les cellules végétales possèdent de plus une paroi autour des cellules qui rend l'accès à la membrane plasmique impossible pour des mesures directes et elles ont de plus de nombreux systèmes de transport natifs actifs sur leur membrane contrairement aux ovocytes qui sont des cellules "au repos". Tout ceci rend l'utilisation des ovocytes de xénope indispensable pour étudier de façon précise les systèmes de transport végétaux.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Ainsi les besoins des utilisateurs seront regroupés pour limiter le nombre d'opérations réalisées (2-3 opérations par mois en moyenne) et à chaque procédure les ovocytes obtenus sur une xénope femelle serviront pour les lots contrôles (non-injectés) et pour les lots injectés. Il pourra également être envisagé de mutualiser les opérations avec d'autres établissements utilisateurs toujours pour réduire le nombre d'animaux opérés (chaque opération peut permettre d'obtenir plus de 5000 ovocytes qui peuvent être conservés une semaine environ pour l'étude).

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour favoriser le bien-être de l’animal dans le cadre du projet. Les xénopes sont élevées dans une animalerie agréée où elles bénéficient d'un environnement social et physique enrichi en étant regroupées par bac de 4-5 individus (ce qui autorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur besoin d'interaction) et en laissant à leur disposition des cachettes dans chaque bac. Lors de la chirurgie, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés et l'utilisation d'une alèse humidifiée permettra de maintenir une hydratation permanente de la peau. La manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre un réveil d'anesthésie sans stress en abaissant le niveau de l'eau dans le bac de réveil. Enfin une attention particulière sera apportée à ne pas isoler longtemps un animal après son opération tout en lui apportant un soin optimal qui sera poursuivi lorsqu'il aura rejoint son bac en stabulation grâce à un suivi journalier personnalisé de l'animal opéré. Ceci sera rendu possible par l'identification aisée de l'animal au vu du nombre limité d'animaux par bac. Les possibilités de raffinement supplémentaire seront explorées tout au long du projet par la structure du Bien-être animal (qui comprend un vétérinaire spécialisé dans les espèces aquatiques) et testées pour continuer à améliorer en permanence le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le système ovocyte de xénope est reconnu depuis plus de 30 ans comme modèle de choix pour l'étude des canaux ioniques et transporteurs animaux comme végétaux. Les ovocytes permettent de réaliser facilement des études fonctionnelles car ils sont capables d’exprimer de nombreuses protéines en grande quantité qu’il est ensuite aisé de caractériser. Les autres modèles de cellules animales en culture ou de cellules végétales modifiées pour éliminer leur paroi (protoplastes), sont beaucoup plus difficiles utiliser et à mettre en oeuvre notamment en raison de leur très petite taille (de l'ordre du micromètre alors qu'un ovocyte de xénope fait un millimètre de diamètre). Pour pouvoir obtenir des ovocytes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés d'au moins 2 ans. Les ovocytes doivent être obtenus par chirurgie et non après ponte afin que les systèmes de transport endogènes de l'ovocyte restent peu actifs (ce qui n'est pas le cas lorsque la grenouille a été stimulée par injection d'hormones pour pondre). Outre ces caractéristiques propres à l'ovocyte, le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire et les opérations de chirurgie pour récupérer les fragments d'ovaires sont simples et rapides à réaliser.

1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.

Objectifs

La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter

Bénéfices attendus

Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.

Procédures

Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.

Devenir

Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

600 anguilles vont être utilisées puis relâchées près de leur lieu de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturées par pêche électrique, elles reçoivent sous anesthésie une puce RFID implantée chirurgicalement, pour suivre leur comportement migratoire. Le porteur indique que la pêche électrique peut provoquer des blessures spinales et une gêne cardiorespiratoire, et le marquage un saignement et une douleur post-opératoires brefs. Il justifie l'étude par la protection d'une espèce en "danger critique d'extinction", dont la migration reste mal connue.

Objectifs

L'approche RFID vise à étudier le comportement migratoire des anguilles (Anguilla anguilla) de Méditerranée. L'objectif est d'identifer les facteurs environnementaux qui stimulent cette migration, ainsi que le périodes clefs où elle est susceptible de survenir. Ces connaissances permettront de prendre des mesures de gestions plus efficaces pour protéger cette espèce en "Danger critique d'extinction".

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance du comportement de migration permettra de mieux identifer les périodes clefs où elle survient, et quels sont les paramètres qui la déclenchent. Une mortalité importante des futurs géniteurs de cette espèce est observée lors de cette migration, en particulier lors du passage par les turbines d'ouvrages hydroélectiques. L'identification de périodes clefs de migration permettra donc aux exploitants d'adapter efficacement leur gestion en période critique de migration.

Procédures

Capture par pêche électrique de tous les individus (environ 20-30 minutes), puis sédation/anesthésie profonde (5-10 minutes), puis Intervention chirurgicale avec implantation d'une puce RFID 23 mm (environ 1 minute), suivi d’un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation (environ 1h30 en observation).

Impact sur les animaux

Nuisances induites classiquement par la pêche électrique sur les espèces piscicoles : blessures spinales / infleunce sur le rythme cardique et respiratoire / stress et changement de comportement. Nuisance induite par l'anesthésie et la biométrie : stress des individus Nuisance induite par le marquage : saignement léger lors de l'incision, stress et douleur/gêne post-opératoire de courte durée (le poisson retrouve très rapidement un comportement de nage normal).

Devenir

Toutes les anguilles capturées sont relachées dans le milieu naturel, à proximité immédiate de leur lieu de capture.

Remplacement

L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvage dans leur milieu naturel. De plus, l'Anguille est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer. Il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre ou de trouver un substitut.

Réduction

Le marquage a été à un total de 600 individus sur la durée du projet. Cette approche permet de limiter l'impact sur le milieu, tout en assurant un nombre d'individus suffisant pour que les résultats soient exploitables sur le plan scientifique.

Raffinement

Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant leur stabulation (blocs pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité).

Choix des espèces

L'anguille européenne est un migrateur amphihalin dont les modalités de reproduction sont mal connues. En Méditerranée, le déclenchement du comportement migratoire de cette espèce vers son aire de reproduction est mal connu. Les anguilles marquées sont des "anguilles jaunes" (stades FI, FII), des anguilles jaunes en cours de métamorphose (stades FIII, FIV), et des anguilles argentées (Stades FV (femelles) / MD (mâles)) Tous ces stades sont des morphotypes plus ou moins agés, qui appartiennet à la même espèce : Anguilla anguilla.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie d'environ deux heures sous anesthésie, des injections d'antibiotique et une inoculation d'Enterococcus faecalis, avant d'être tué pour prélèvements. Le porteur indique que les douleurs post-opératoires constituent l'effet indésirable majeur et prévoit une analgésie associée. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut remplacer ce modèle intégrant le dialogue entre microbiote, organisme et pathogène.

Objectifs

Le microbiote intestinal forme un écosystème en équilibre composé de plusieurs milliards de bactéries représentant des milliers d’espèces. Si son effet bénéfique en santé humaine a été démontrée, il est également considéré comme un réservoir de pathogènes opportunistes souvent résistants aux antibiotiques. Par exemple, les entérocoques sont des bactéries inoffensives du tractus digestif de l'homme et des animaux. Bien qu’habituellement inoffensives chez l'homme en bonne santé, certaines souches de Enterococcus faecalis en particulier celles résistantes à la vancomycine sont à l'origine d'infections opportunistes chez des patients fragilisés. Nous cherchons à comprendre les mécanismes qui permettent à E. faecalis de proliférer au niveau intestinal et de disséminer dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. L’ensemble de ces recherches vise à générer des connaissances pour développer de nouvelles stratégies pour contrôler les agents pathogènes multi-résistants. E. faecalis est une bactérie qui possède autour d’elle une enveloppe constituée d'une membrane et d'une épaisse paroi. Le peptidoglycane (PG) est un composant majeur de cette paroi bactérienne. Le métabolisme du PG joue un rôle crucial dans la structure et la forme de la cellule bactérienne, et la résistance aux antibiotiques et aux anti-microbiens. La formation du PG et son renouvellement au cours de la vie de la bactérie nécessite des enzymes spécifiques c’est-à-dire des protéines dont le rôle est de réaliser des réactions chimiques assurant la synthèse et le recyclage du PG. L’objet de cette demande vise à comparer la susceptibilité de E. faecalis à des antibiotiques ciblant la paroi au moment de sa prolifération intestinale. Afin de comprendre les mécanismes de résistance aux antibiotiques, plusieurs souches de E. faecalis seront testées en fonction de leur capacité à synthétiser ou recycler leur paroi. Enfin, nous testerons si la présence d’un autre type d’anti-microbien dirigé contre E. faecalis peut augmenter l’effet des antibiotiques. Ces travaux permettront de mieux comprendre la sensibilité de E. faecalis aux agents anti-microbiens qui ciblent le PG et les mécanismes de résistance qui y sont associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettta de produire de nouvelles connaissances fondamentales sur une voie métabolique essentielle et partagée par plusieurs espèces bactériennes dont des espèces pathogènes. Les résultats générés permettront d'améliorer notre compréhension globale de la synthèse de la paroi bactérienne, une cible courante des antibiotiques que nous consommons et pour lequels des résistances apparaissent au cours du temps. Nous apporterons de nouveaux éléments pour le développement de stratégies antibactériennes innovantes, comme celles visant à potentialiser l’action d’un antibiotique par une autre molécule présentant une activité anti microbienne comme les bactériocines. Ceci est d’un intérêt majeur dans la mesure où les médicaments ciblant la biogénèse des parois bactériennes sont parmi les antibiotiques les plus efficaces. Ce projet représente donc un fort potentiel pour leur exploitation ultérieure dans des stratégies antibactériennes, telles que le ciblage des enzymes impliquées dans la synthèse et le recyclage de l’enveloppe des bactéries.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à environ 2h de chirurgie et à 24h de soins post-opératoires. Ils seronts mis à jeun la nuit précédent l’intervention chirurgicale. Ces interventions nécessiteront de réaliser sur le même animal et sur tous les animaux mentionnés dans la demande : - Des Injections sur animaux vigiles o 3 fois un antibiotique, 1 fois par jour, 3 jours consécutifs o 1 fois un analgésique le jour de la chirurgie avant l’anesthésie o 1 fois pour l’anesthésie généréale o 1 fois un analgésique en fin de journée pour prévenir les douleurs post-opératoires o 1 fois d’une solution saline pour la réhydradation - Une Laparotomie sous anesthésie générale pendant 2h

Impact sur les animaux

L’inoculation par E. faecalis ne sera pas à l’origine de symptômes sévères car nous utiliserons des doses faibles de E. faecalis bien tolérés par les souris. L’absence d’effets indésirables sera néanmoins contrôlée au cours de l’expérience. Le poids, le poil ébouriffé (ou hérissé), les yeux clos, la léthargie et le dos courbé seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. L’utilisation d’un antibiotique pendant 3 jours pourra générer un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement. Les effets indésirables de l’anesthésie sont l’hypothermie et l’abolition des reflexes comme pour avaler ou cligner des yeux. Les effets indésirables majeurs sont les douleurs post-opératoires. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et avec une analgésie associée pour limiter les douleurs et souffrances pré et postopératoires.

Devenir

Les souris seront mises à mort à l’issue des protocoles pour des prélèvements d’échantillons en raison de leur infection par un agent pathogène.

Remplacement

Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre le microbiote intestinal, l’organisme et le pathogène. A ce jour, aucune approche in vitro n’est disponible pour remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions complexes. En effet, les approches in vitro bien que complémentaires ne peuvent pas remplacer un modèle intégrant des interactions in vivo. L’utilisation d’animaux vivants est par conséquent un outil essentiel à la caractérisation des mécanismes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés nous porterons une attention particulière à la reproductibilité des expériences. Nous réaliserons des expériences préliminaires pour déterminer les concentrations optimales des molécules d’intérêt. Nous veillerons également à diminuer le nombre de groupes contrôles en comparant plusieurs mutants pour une seule souche sauvage. Pour calculer le nombre d’individus à utiliser par groupe, nous avons estimé sur la base de nos précédents travaux que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 15 pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre, ne seront pas soumises à de longues périodes de jeûne pendant la durée de l’expérience. Une évaluation préopératoire pour contrôler le bon état général de l’animal sera réalisée avant la chirurgie. Seuls les animaux en parfait état de santé seront utilisés. Une prémédication avec un dérivé morphinique sera effectuée pour réduire le stress des animaux, faciliter leur contention et potentialer l’effet des anesthésiques. Les 4 qualités requises pour une anesthésie générale (narcose, analgésie, myorelaxation et sécurité) seront respectées. Un anesthésique local sera utilisé au site d’incision pendant la chirurgie et un anti-inflammatoire sera utilisé pour prévenir les douleurs post-opératoires pendant la nuit. Une solution saline sera aussi utilisée pendant le temps de la chirurgie pour prévenir l’assèchement des tissus. Pour palier les effets négatifs de l’anesthésie : i) les souris seront maintenues sur un matelas chauffant ii) leurs yeux seront protégés de la dessiccation par l’application d’une compresse imbibée d’eau, iii) un fluide de remplacement sera injecté pour palier les pertes de fluide pendant l’intervention, iv) un environnement calme et un approvisionnement en nourriture molle sera proposé pendant les 24h qui suivront la procédure chirurgicale. Un matelas chauffant sera aussi utilisé pour lutter contre l’hypothermie pendant la phase de réveil. Pour la surveillance post-opératoire, un personne responsable bien-être veillera à ce que toutes les souris se réveillent. L’aire de réveil sera confortable dans une zone calme et sombre. Puis les souris réveillées seront remises au fur et à mesure dans leur cage d’origine sur une litière propre. Le milieu sera enrichi avec des « maisons » en carton et du sopalin. Enfin, pour prévenir les douleurs post-opératoires, les animaux seront médicamentés avec un anti-inflammatoire non stéroidien sous réserve de l’absence d’interaction potentielle avec l’infection par E. faecalis.

Choix des espèces

Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d'expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’homme. E. faecalis est capable de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine à la suite d’une dysbiose post-antibiotique comme cela est observé chez l’homme. Notre organisme modèle est un pathogène opportuniste issu du microbiote intestinal. Des modulations du microbiote intestinal des souris femelles peuvent se produire au cours de leur cycle menstruel. Afin de limiter ce facteur potentiel de variation, nous utiliserons des souris mâles pour les expérimentations. Dans cette étude conformément à nos travaux antérieurs, des souris « jeunes adultes mâles » âgées au minimum de 8-10 semaines seront donc utilisées. Leur poids devra être supérieur ou égal à 18 g.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des antiviraux anti-VIH par gavage ou injection dans l'abdomen cinq jours par semaine, pendant huit à seize semaines, pour créer un modèle de vieillissement accéléré qui n'existe pas encore. Le porteur indique que le protocole peut provoquer perte de poids, chute de poils, lésions au site d'injection et altération de l'état général, et que les animaux trop atteints sont mis à mort. Il affirme que le vieillissement de l'organisme ne peut se réduire à des études in vitro et justifie ainsi le développement du modèle murin.

Objectifs

Le vieillissement est responsable de nombreuses pathologies (Cancer, diabète). De nombreux stimuli sont responsable d'un vieillissement accéléré. Plusieurs études ont montré que certains traitements médicamenteux peuvent induire des effets secondaires induisant un vieillissement accéléré. C'est le cas des antiviraux (notamment utilisées chez les patients atteints du VIH), qui en plus d'avoir des effets secondaires à court terme, accélèrent le vieillissement du sujet (niveau cardiovasculaire, osseux, ...). Toutefois aucun modèle animal de vieillissement accéléré via l'administration de ce type de molécules anti-VIH n'a alors été mis au point. Or cela permettrait de proposer des solutions thérapeutiques pour lutter contre ce vieillissement accéléré. Le but de ce protocole est (1) de mettre au point un modèle de vieillissement accéléré via l'administration d'antiviraux de type antiprotéase utilisés par les personnes atteintes notamment du VIH et (2) dans un second temps de tester des solutions pour éviter ce vieillissement accéléré. Dans cette seconde partie il y a un premier axe dans lequel l'effet de l'induction de la mort des cellules sénescentes sur le phénotype de vieillissement accéléré sera testé. Deux nouvelles molécules induisant la mort de cellules vieillissantes seront testées. Dans un second axe le rôle de gènes pro-vieillissement dans ce modèle sera testé. Cela permettrait alors de proposer des solutions thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra dans un premier temps de mettre au point un nouveau modèle de vieillissement accéléré par administration d'antiviraux anti-VIH, modèle qui n'existe pas à l'heure actuelle et qui mimera ce qui se passe chez l'Homme. Cela permettra également de tester de nouvelles molécules pour voir si elles permettent la réversion de ce vieillissement accéléré et apporter des solutions thérapeutiques à ces patients afin d'améliorer leur confort de vie. De plus l'implication potentiel de gènes pro-vieillissement dans ce modèle pourra être mise en évidence. Les bénéfices attendus sont (1) la création d'un nouveau modèle animal qui n'a pas encore développer et (2) potentiellement l'identification de solutions thérapeutiques pour palier les effets secondaires du traitement du VIH avec les antiviraux.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à différents traitements, administrés soit par gavage (1 gavage par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. La durée du geste par souris est estimé au maximum à une minute à chaque gavage) soit par injection intra-péritonéale (1 injection par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. Depuis l'anesthésie locale à base de pommade à la lidocaïne à l'injection en elle-même, le temps est estimé à 5 minutes par souris à chaque fois. Cette durée tient compte du temps entre la pose de la pommade et l'injection pour que l'anesthésie soit effective). Un prélèvement d'urine pourra également être réalisé lors de la mise au point du protocole. Lors de la préhension de la souris on peut récolter de l'urine dans un tube. Le temps maximum entre la prise de l'animal et l'arrêt du prélèvement d'urine est estimé à 1 minute.

Impact sur les animaux

Nous allons développer un nouveau modèle de vieillissement accéléré, et de ce fait cela peut amener des phénotypes de type perte de poids, alopésie, altération de l'état général. C'est pour cela que les animaux inclus dans ce projet seront suivi très fréquemment afin de rapidement identifier ces effets indésirables et apporter des solutions pour les atténuer, et dans le cas où cela n'est pas possible les animaux seront alors mis à mort et sortis du protocole. Des nuisances peuvent également dues à la fréquence de traitement et/ou au mode d'injection. Nous testerons l'injection intra-péritonéale avec une fréquence d'injection de 5 fois par semaine. Nous serons alors vigilant sur la possible apparition de lésion au niveau de la zone d'injection. En cas d'apparition de ce type de lésion le traitement sera stoppé pendant 3 jours, la zone sera alors traitée avec de la Vétédine. En cas d'amélioration le traitement sera repris. En absence d'amélioration l'animal sera mis à mort. Pour palier à l'apparition de lésion au niveau du site d'injection nous chercherons à alterner tous les jours les sites d'injection. Il faut également noter que notre équipe a une expérience importante sur le suivi du vieillissement des animaux, que ce soit du vieillissement "physiologique" ou bien du vieillissement induit par un stress métabolique. Cela permettra une très bonne prise en charge des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes d'intérêt et réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

La sénescence à l'échelle de la cellule peut être bien étudiée via des modèles in vitro. Ainsi des études préliminaires in vitro ont été réalisées en traitant des cellules primaires humaines de type fibroblastiques ou épithéliales avec des antiprotéases, à savoir le mélange Atazanavir et ritonavir (noté ATV/r). Nous avons alors pu montrer l'entrée en sénescence de ces cellules via les tests classiques comme la mise en évidence de l'activité de la Béta-Galactosidase à pH 6 (coloration bleue) dans les cellules sénescentes, l'arrêt de prolifération (comptage cellulaire), la forme des cellules, l'expression de marqueurs de sénescences comme p16, p21 par qRT-PCR et également la sécrétion de molécules dans le milieu de culture (dosage ELISA), spécifique des cellules sénescentes. Le vieillissement au niveau d'un organisme, qu'il soit du à l'âge ou à l'exposition à différents stress comme un stress métabolique, un stress chimique (ingestion de molécules ayant un effet à long terme), est le résultat d'un processus complexe. Son étude ne pouvant malheureusement pas se résumer à des études in vitro et être modélisé, elle nécessite donc l'utilisation de modèles animaux, comme le modèle murin, dans lesquels l'impact global pourra être visualisé. C'est pour cela que nous avons choisi de développer le modèle murin qui est l'objet de ce protocole expérimental.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole la mise au point du modèle (procédure 1) sera réalisée séquentiellement. Plusieurs voies d'administration, plusieurs doses, deux temps seront testés. Si les premiers tests se révèlent concluant toutes les conditions ne seront pas testées. De plus si la procédure 1 ne permet pas de mettre au point le modèle de vieillissement accéléré alors les procédures 2 et 3 ne seront pas réalisées. C'est pour cela que c'est le nombre maximal d'animaux qui est donné et le nombre d'animaux réellement utilisés pourra être inférieur. Dans la procédure 1 la mise au point du modèle ne nécessite pas d'étude statistique, c'est pour cela qu'il y aura 5 souris par groupe. Dans les procédures 2 et 3 des tests statistiques seront réalisés, c'est pour cela qu'il y a 10 souris par groupe. Enfin pour visualiser l'effet sexe des mâles et des femelles seront utilisées. Cela permettra d'éviter de relancer d'autres protocoles pour vérifier le biais lié au sexe et cela renforcera l'analyse statistique de cette étude.

Raffinement

La grande expérience des équipes qui gèrent les protocoles de vieillissement est un gage quant à la garantie du suivi du bien-être animal. Une surveillance adaptée et individuelle des animauix afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance est mise en place. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (traitement antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. En cas de traitement avec un antalgique de la brupénorphine à la dose de 0,05 mg/Kg sera administrée quotidiennement, pendant 3 jours. En absence d'amélioration après 3 jours de traitement l'animal concerné sera mis à mort. Pour les injections intra-péritonéales, pour éviter le stress d'une anesthésie générale à l'animal, une anesthésie locale du site d'injection avec une pommade à base de lidocaïne quelques secondes avant l'injection sera réalisée. Pour éviter également d'injecter plusieurs jours de suite au même niveau sur l'abdomen de la souris le site d'injection sera modifié tous les jours en alternant entre le haut et le bas de l'abdomen et entre le côté droit et le côté gauche de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans les modèles de vieillissement induit par des stress comme le stress métabolique notamment. En effet on peut alors voir l'impact de ce vieillissement au niveau des différents organes de la souris. De plus la souris est un modèle de prédilection dans la réalisation de modèle transgénique avec notamment la perte d'expression de nombreux gènes. Nous pourrons alors utiliser ces modèles transgéniques au sein de notre protocole de vieillissement accéléré et valider ou non l'implication de gènes d'intérêt dans le phénotype observé. Les expérimentations seront réalisées chez des souris adultes d'environ 5 mois. Chez l'Homme les observations initiales à l'origine de notre protocole ont été faites avec des patients âgés en moyenne de 30 à 40 ans. De plus à 5 mois la prise de poids des souris n'est plus très importante, ce qui permet d'avoir un poids plus stable en début d'expérimentation. Cela sera plus simple pour évaluer la perte de poids en cas de douleur chez la souris. Enfin ces animaux auront atteint la maturité, notamment au niveau du système immunitaire et hormonal.