Autre recherche fondamentale

9 170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections d'hormones pour produire de nombreux embryons puis sont mises à mort pour les récupérer, tandis que les mâles servent à la reproduction et sont tués dès la baisse de leur fertilité, une seconde procédure consistant à injecter un liquide coloré pour entraîner les expérimentateurs au geste. Le projet étudie les forces mécaniques qui façonnent l'embryon aux premiers stades. Le porteur affirme que seule l'étude de l'embryon entier permet cette compréhension et que les modèles "blastoïdes" ne reproduisent que la dernière étape.

Objectifs

La morphogenèse se définit par l’ensemble des transformations que subit l'embryon avant d'acquérir sa forme spécifique. Pendant la morphogénèse, les tissus changent de forme sous l’action de forces générées par les cellules qui les composent. Afin de mieux comprendre ces changements, nous avons développé des techniques permettant de mesurer les forces cellulaires qui façonnent l’embryon pendant le développement préimplantatoire des mammifères. La période préimplantatoire de développement s’étend de la fécondation à l’implantation de l’embryon dans l’utérus de la mère, pendant cette période l’embryon peut être cultivé in vitro. Notre modèle d’étude est la souris car c’est un mammifère, comme l’homme, qui a un temps de gestation court et des capacités de reproduction élevées. Son génome, proche du génome humain, est parfaitement connu et permet ainsi de générer des animaux génétiquement modifiés. Nous utiliserons des lignées de souris transgéniques pour différents gènes d’intérêt ce qui permettra l’étude du rôle de protéines spécifiques intervenant durant la morphogénèse. L’objectif de notre projet est d’identifier les événements moléculaires et mécaniques mis en jeu pendant la morphogenèse de l’embryon de souris. Les avancées de notre compréhension fondamentale du développement précoce de l’embryon de souris nous permettent de mieux comprendre de ce qui se passe chez l’humain et ainsi d’améliorer les technologies de procréation médicalement assistée.

Bénéfices attendus

Les morphogénèses de l’embryon de la souris et de l’embryon humain sont extrêmement proches et son étude chez la souris nous apportera par conséquent de nouvelles perspectives quant à la compréhension de notre propre développement. Ceci aura un impact direct sur la médecine reproductive qui aboutit à plus de 25 000 naissances par fécondation in vitro chaque année en France (Agence de la Biomédecine). Certaines de nos études sur la souris ont d’ailleurs permis une confirmation directe sur des embryons humains.

Procédures

Dans une première procédure visant à obtenir de nombreux embryons à partir des femelles, les animaux de ce projet recevront deux injections d’hormones à 48 heures d’intervalle directement dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Ces injections durent quelques secondes et seront réalisées sur animaux vigiles. Dans une deuxième procédure visant à enseigner le geste d’injection péritonéale aux expérimentateurs, les souris recevront une seule injection de liquide coloré qui permettra de valider l’efficacité du geste.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles liées à l’injection de produits non toxiques et non irritants dans l’abdomen des animaux.

Devenir

Toutes les femelles seront mises à mort pour récupération de leurs embryons. Les mâles seront mis à mort dès diminution de leur fertilité.

Remplacement

De nombreuses études ont été réalisées in vitro sur des cellules de mammifères ou encore sur des modèles de mouches drosophiles, de vers nématodes ou de poissons zèbre et ont permis de mettre en évidence les gènes impliqués dans les mécanismes en jeu dans la morphogenèse animale. Récemment, des modèles d’embryons reconstitués à partir de cellules souches de type organoïdes ont été développés. Les « blastoïdes », supposés équivalents aux blastocystes formés par l’embryon, ne permettent de modéliser que la toute dernière étape du développement préimplantatoire, ceci avec une fidélité encore mal caractérisée. Ainsi, seule l’étude de l’embryon, modèle intégré, permet la compréhension complète du développement préimplantatoire des mammifères et des forces intervenant dans ces événements.

Réduction

La superovulation permet de diminuer de manière très importante les souris qui seront utilisées pour ces expériences. La mise en commun des embryons obtenus entre les différents membres du laboratoire permet également de limiter le nombre de souris qui vont faire l’objet de cette procédure. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

La procédure de superovulation pour notre projet consiste en deux injections hormonales par voie intrapéritonéale non douloureuses espacées de 48h. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections, toutefois, une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Nous utilisons par ailleurs les injections de crisper-cas9 ou les KO conditionnels qui permettent de générer nos modèles d’études, des embryons préimplantatoires sans générer d’individus aux phénotypes potentiellement délétères.

Choix des espèces

Le choix du modèle murin repose à la fois sur la physiologie de ce mammifère, sa morphogenèse très proche de celle de l’humain et sur la connaissance du génome murin. La souris est une espèce très bien caractérisée en termes de génétique, de biologie du développement et de la reproduction, qui est de plus accessible pour l’obtention de modèles génétiquement modifiés par génie génétique. Ces critères en font donc un modèle de choix pour notre projet d’étude. De plus, le modèle murin satisfait l’exigence d’utilisation de mammifères les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. La superovulation ne concerne que des souris femelles adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. Les mâles sont utilisés pour la fécondation des leur maturité sexuelle vers 8-10 semaines à 12 mois car il y a une diminution de leur fertilité chez les animaux vieillissants.

16 souris immunodéficientes sans poils vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection de vésicules extracellulaires dans la veine de la queue, subissent sept anesthésies gazeuses pour des imageries de fluorescence, puis un prélèvement sanguin terminal avant mise à mort pour l'analyse des organes. Le porteur compare trois modifications chimiques censées stabiliser ces vésicules dans le sang. Il décrit la souche sans poils comme "indispensable" pour éviter l'autofluorescence liée au pelage.

Objectifs

L'intérêt de cette étude est de pouvoir évaluer si des modifications apportées à des vésicules extracellulaires (EVs ou exosomes), issues de cellules souches mésenchymateuses, induisent une meilleure stabilité dans un organisme après une injection intraveineuse via la veine caudale. Les vésicules extracellulaires sont des particules produites naturellement par les cellules de l'organisme. Il est possible d'utiliser ces particules afin de transporter différents éléments biologiques comme des fragments d'anticorps ou de petits acides nucléiques. En effectuant des modifications chimiques à la surface des vésicules nous espérons qu'elles soient plus stables (ou dégradées moins rapidement ?) dans le sang. L'objectif est donc de comparer trois modifications différentes par rapport à des vésicules extracellulaires nues. Les EVs seront suivies dans la souris grâce à un marqueur fluorescent fixé à leurs surfaces.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer si différentes modifications chimiques réalisées à la surface des vésicules extracellulaires permettent une meilleure stabilité et une meilleure durée dans l'organisme par rapport aux vésicules sans modifications.

Procédures

Chaque animal reçoit deux injections, une par voie intraveineuse au niveau des veines de la queue et contenant les vésicules extracellulaires et une autre en fin de procédure par voie intrapéritonéale pour induire une anesthésie et analgésie. La durée des injections est au maximum de 30 secondes. Une anesthésie gazeuse sera réalisée avant l'administration des vésicules. Un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie et analgésie est réalisé au terme de la procédure. Enfin, pour la réalisation des imageries, les animaux ont 7 anesthésies gazeuses. La durée de chaque imagerie est d'environ 5 minutes. Tous les actes réalisés sur les animaux sont de classe légère n'entraînant que très peu d'effets sur les animaux.

Impact sur les animaux

Un stress de quelques secondes pourra être induit lors de la préhension des animaux pour les mettre dans la boite d'induction de l'anesthésie gazeuse. Une douleur légère pourra être induite lors de l'injection intraveineuse pour l'administration des vésicules extracellulaires et pour l'administration intrapéritonéale de l'anesthésie et analgésie chimique, cette douleur sera d'une durée maximale de 30 secondes. Enfin, un stress de quelques secondes pourra être induit lors de la préhension de l'animal avant l'administration de l'anesthésie et analgésie chimique.

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir faire un prélèvement sanguin d'un volume important et également réaliser des imageries d'organes isolés et de coupes histologiques.

Remplacement

Des études préliminaires sur des lignées cellulaires ont été réalisées afin de n'inclure que les modifications les plus intéressantes. Il s'agit, ici, de réaliser une étude de biodistribution et d'interaction à l'intérieur de l'organisme pour visualiser le comportement des vésicules extracellulaires.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum pour réaliser cette étude. Cela correspond à 16 animaux répartis en 4 lots de 4 animaux. Chaque lot correspond à un type de vésicule extracellulaire. Tous les animaux étant suivis par fluorescence à tous les temps (0, 15 minutes, 30 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures et 6 heures) cela permet de diminuer drastiquement le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser l'étude. Les résultats feront l'objet d'une analyse statistique.

Raffinement

L'anesthésie gazeuse sera privilégiée à l'anesthésie chimique car elle permet une récupération plus rapide des animaux. Les animaux seront anesthésiés le temps de réaliser chaque image soit environ 5 minutes par image puis remis dans leur cage afin qu'ils puissent récupérer. Les animaux seront surveillés tout le long de la procédure à l'aide d'une grille de soin spécifique.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris immunodéficiente sans poil car elle permet de s'affranchir des problèmes immunofluorescence lié au poil de l'animal. Il s'agit d'une espèce de référence au sein de notre laboratoire. Ce type de souris est indispensable car elle permet de s'affranchir des problèmes d'autofluorescence. Les animaux seront réceptionnés à l'âge de 6 semaines à l'animalerie. A la suite d'une semaine d'acclimatation, ils pourront intégrer le projet. Les animaux des études précédentes étaient agés de 7 semaines, afin de pouvoir comparer les études entre elles, nous devons garder le même âge pour les animaux.

80 poissons cichlidés Astatoreochromis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est anesthésié et reçoit une injection intrapéritonéale de marqueur, puis est conservé un temps variable avant d'être tué par surdose d'anesthésique pour prélever ses mâchoires. Le projet mesure la durée du cycle de remplacement des dents pharyngiennes de cette espèce. Le porteur indique que des approches numériques existent mais restent limitées aux mammifères, et affirme devoir poursuivre des études in vivo pour développer un modèle adapté.

Objectifs

Le but du projet est de déterminer la durée du cyle de remplacement des dents pharyngiennes chez le cichlidé Astatoreochromis afin de mieux comprendre la plasticité dentaire et élaborer des modèles de plasticité dentaire. En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; malachophage non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, l'Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des implications importantes pour notre compréhension du rôle du développement dans la dynamique des radiations évolutives post-crises. Il permettra également de mieux exploiter les fossiles d'espèces qui ont vécu au moment de la transition Permien-Trias qui représente un des épisodes majeurs d'extinction massive d'espèces et de mettre en évidence certains des mécanismes sous-jacent aux phénomènes d'extinctions massives tel que nous vivons actuellement.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés individuellement par balnéation et recevront une unique injection intrapéritonéale. L'intervention durera une dizaine de minutes en incluant l'anesthésie, l'injection et le reveil. Les animaux seront ensuite conservés pour des durées variables puis mis à mort par surdose d'anesthésique en balnéation afin de prélever leurs machoires pour analyse.

Impact sur les animaux

Faibles. Le projet implique de réaliser, en début de protocole, des injections péritonéales qui peuvent présenter dans de rares cas des séquelles. Une vigilance particulière sera donc apportée lors de la récupération des animaux après ces injections. Pour le reste du projet, les animaux sont conservés en groupe sociaux et nourris suivant un régime alimentaire équivalent à celui qu'ils adoptent dans le milieu naturel.

Devenir

L'analyse de la forme des dents nécessite de prélever les mâchoires des animaux et de réaliser des coupes qui seront analysées au microscope. Ceci nécessite donc la mise à mort de l'ensemble des animaux utilisés dans le projet.

Remplacement

Des approches in silico existent pour l'étude de la topologie dentaire malheureusement elles ne sont adaptées qu'aux mammifères. Nous souhaitons développer des modèles numériques équivalent mais qui soient adaptés aux espèces que nous étudions. Pour développer ces modèles, il est nécessaire de poursuivre des études in vivo pour fournir les données nécessaires à leur élaboration. Une fois établis, ces modèles pourront être utiliser pour étudier la topologie dentaire d'autres espèces de vertébrés.

Réduction

L’organisation du projet en 3 procédures distinctes permet de réduire le nombre d’animaux utilisés sur l’ensemble du projet. La première procédure permet de définir avec précision la dose de calcéine nécessaire à un marquage efficace. La seconde procédure permet d'évaluer la durée du cycle de remplacement dentaire avec un pas de temps important (2 semaines). Elle permet de fournir une durée approximative du cycle qui sera utilisée dans la troisième procédure pour évaluer avec une meilleure précision la durée du cycle (précision à 2 jours). Cette organisation permet de limiter le nombre d'animaux utilisés à 80 (20 pour la première procédure et 30 chaque pour les deux suivantes). Un approche statisitique sera utilisée pour mettre en évidence d'éventuelles différences de longueur de cycle entre les dents positionnées au centre et celles positionnées en périphérie de la machoire.

Raffinement

La dose minimale nécessaire au marquage des dents va être déterminée dans la première partie du protocole et sera utilisé dans le reste de l'étude. L'injection intra-péritonéale en début de protocole sera réalisés sous anesthésie et les poissons seront placés dans des bacs de réveil et surveillé lors de leur sortie d'anesthésie. Par ailleurs, les Astatoreochromis sont maintenus en groupes sociaux dans des bacs qui leur permettent d'exprimer leurs comportements naturels. Afin de favoriser le bien-être des animaux, les aquariums disposent d'un substrat (sable) qui permettent aux animaux d'exprimer leur comportement fouisseur. De même, afin de limiter les possibilités d'agression par les individus dominants de nombreuses cachettes (gouttières renversées, pots en terre) sont mises à disposition des animaux. Ils disposent d'une alimentation variée proche de celle de leur milieu naturel. Les animaux sont observés quotidiennement et les animaux malades ou stressés sont isolés et placés dans un environnement différent. Après l'injection péritonéale, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation au site de l'injection. Les signes de déséquilibres homéostatiques seront observés après l'injection(hydropisie, écailles hérissées), ainsi que les signes pouvant indiquer une atteinte de la vessie natatoire (flottabilité positive ou négative). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou d'atteinte à la vessie natatoire seront mis à mort par une surdose d'anesthésique en balnéation (Tricaine 0,2 % tamponnée à pH 7).

Choix des espèces

En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; malachophage non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, l'Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet. Les animaux utilisés seront des juvéniles de moins d'un an.

5840 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles prépubères reçoivent deux injections hormonales pour provoquer une superovulation, puis sont tuées le lendemain pour récupérer leurs gamètes ou embryons, impossibles à prélever autrement. Le projet vise à congeler des lignées génétiquement modifiées afin de les conserver et d'éviter d'en produire en continu. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de modéliser in vitro un "organisme entier" et présente la cryoconservation comme un moyen de réduire globalement le nombre d'animaux non-humains.

Objectifs

Les lignées de souris ou de rats génétiquement modifiées constituent une ressource précieuse tant pour les différents projets scientifiques en cours que pour d’éventuels projets futurs. Pour éviter une perte accidentelle de ces lignées précieuses, parfois uniques et n’ayant pas d’équivalent ailleurs, mais également pour éviter de continuer à produire inutilement des animaux lorsque le(s) projet(s) scientifique(s) autorisé(s) utilisant ces lignées est(sont) fini(s), la plupart des lignées sont cryoconservées à -196°C sous azote liquide, sous forme de gamètes ou d’embryons congelés.

Bénéfices attendus

La cryoconservation de lignées permettra de sécuriser le patrimoine génétique (en cas de perte de lignées, de problème sanitaire), réduire la dérive génétique (accumulation au hasard de nouvelles mutations qui peuvent être fixées ou non et faire évoluer la lignée) et réduire globalement le nombre d’animaux dans les établissements d’expérimentation animale (une lignée qui n’est plus utilisée peut être congelée et décongelée le moment venu au lieu d’être maintenue à l’état respirant)..

Procédures

Les animaux ne seront soumis qu’à 2 injections hormonales en intrapéritonéal, à 48h d’intervalle. Chaque acte dure moins d’une minute et se décompose en : sortir l’animal de la cage, le mettre en contention, réaliser l’injection intrapéritonéale et le remettre dans sa cage.

Impact sur les animaux

En vue d’obtenir une superovulation, de jeunes femelles prépubères reçoivent 2 injections d’hormones à 48h d’intervalle avant d’être accouplées, ou non, et mises à mort le lendemain. Seuls des animaux en bonne santé sont injectés, par du personnel compétent et formé. Le délai est très court entre injections et mise à mort. Cette procédure est en place depuis 5 ans et aucun cas d’effet indésirable sur les animaux n’a été observé et rapporté. Si les injections sont correctement réalisées la superovulation est efficace.

Devenir

Les animaux utilisés dans chaque procédure sont mis à mort en fin de procédure afin de récupérer leurs gamètes ou embryons. Ces gamètes ou embryons sont ensuite congelés. ll n’est pas possible de récupérer ces gamètes ou embryons sans mettre à mort l’animal.

Remplacement

Il n’est pas encore possible de modeler in vitro la complexité d’un organisme dans son entier. La création et l’utilisation de lignées génétiquement modifiées in vivo reste à l’heure actuelle nécessaire pour étudier les mécanismes et les interactions complexes qui se déroulent à l’échelle d’un organisme entier. La cryoconservation de ces lignées permet de les conserver de façon stable dans le temps, les échanger plus facilement entre instituts et de ne pas avoir à les produire à nouveau.

Réduction

Il est impossible de prévoir le nombre exact d’animaux qui seront utilisés pour chaque congélation car il y a une variabilité entre lignées. Nous nous basons sur >10 ans d’expérience pour utiliser le moins d’animaux possibles dans chaque cas de figure et le nombre de séances est arrêté dès que le but (nombre d’embryons, d’oocytes fixés…) est atteint. Le projet a été soumis à un biostatisticien qui a conclu qu’il n’y avait pas de test statistique utilisable pour prédire ce nombre. Les quantités d’animaux nécessaires pour mener à bien ce projet seront réduites au strict minimum. L’un des objectifs et bénéfices de la cryoconservation est d’arrêter le maintien à l’état respirant de lignées inutilisées et donc de globalement réduire le nombre d’animaux. En congélation d’embryons, en règle générale ~200 embryons/lignée sont nécessaires pour cryoconserver une lignée. Notre expérience montre qu'il faut en moyenne 5 séances de FIV et congélation pour obtenir le nombre suffisant d'embryons. Par séance 7 femelles sont utilisées. En congélation d’oocytes, là encore, il y a des variations en fonction des lignées. En moyenne, trois séances sont nécessaires et 7 femelles sont utilisées par séance. En test de décongélation de sperme 2 femelles sont utilisées pour tester chaque mâle congelé.

Raffinement

Toutes les cages sont pourvues de coton comme enrichissement. Les mâles utilisés pour cryoconservation de sperme sont stimulés par accouplement puis hébergés en cage isolés au maximum pendant 2 semaines avant mise à mort et congélation de leur sperme. Les mâles utilisés pour cryoconservation d’embryons sont hébergés en cage isolés et reçoivent toutes les semaines pendant 1 jour/nuit une femelle superovulée. Ils sont ensuite laissés seuls, au repos, jusqu’à la semaine suivante. Un enrichissement supplémentaire est fourni à ces animaux isolés, sous la forme de dôme/maisonnette en carton ajoutées dans chaque cage individuelle. Les animaux sont suivis de façon régulière, lors du suivi quotidien et/ou des diverses actions : injections des femelles, mise en accouplement avec les mâles, mise à mort des animaux. Si un animal présente des signes cliniques de mal-être (prostration, poil hérissé ou amaigrissement et body-score condition BC1) il sera mis à mort par exposition à une concentration croissante en CO2.

Choix des espèces

La plupart des projets de recherche fondamentale menés à l’Institut Pasteur utilisent la souris ou le rat comme modèles animaux. Le génome des rongeurs de laboratoire est facilement modifiable à façon et il existe plusieurs milliers de lignées de souris ou de rats génétiquement modifiées. La pertinence du choix de la souris ou du rat pour ces projets est justifiée dans les projets eux-mêmes. Les mâles reproducteurs (hors procédure) sont des adultes. Les femelles donneuses d’oocytes sont de jeunes adultes, généralement prépubères pour bien répondre au traitement hormonal de superovulation.