Autre recherche fondamentale

250 lamas vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des anticorps par immunisations suivies de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la plupart sont gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, une minorité étant tuée pour prélever la quasi-totalité du sang. Les effets décrits se limitent au stress de la contention, des injections et des prélèvements, répartis sur environ vingt-cinq études par an pendant cinq ans. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode substitutive" et que cette production animale est "indispensable" à la recherche.

Objectifs

Les lamas sont aujourd'hui des animaux très utilisés dans la recherche basée sur les anticorps, les biotechnologies... En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, le plus faible coût de production, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de lamas. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic…

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements.

Devenir

Dans certains cas (très rares chez le lama), les animaux inclus pourront être mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité de volume sanguin circulant. Dans le cas où le prélèvement terminal de la quasi-totalité du volume sanguin circulant n'est pas nécessaire (très souvent le cas), les animaux inclus pourront être gardés en vie et maintenus sur le site avec leurs congénères. Ils pourront ensuite être réutilisés dans d'autres études après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux nécessite une immunisation de l'animal et donc son utlisation. Il n'existe aucune méthode substitutive pour cette production qui est indispensable à l'avancement de la recherche, de la médecine, du développement de test de diagnostic...

Réduction

Le nombre d'animaux est choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Le lama permet d'obtenir des quantités de sérum suffisantes à l'atteinte des objectifs du projet, sans porter atteinte au bien-être animal. Ainsi, 1 ou 2 lamas seront immunisés par étude permettant ainsi d'obtenir une quantité suffisante de sérum. Le nombre de 2 lamas pour une étude sera choisi dans le cas de certaines études où il y a besoin de prendre en compte le facteur diversité/variation génétique qu'il peut y avoir entre 2 animaux. Un nombre de 25 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 250 lamas sur 5 ans. Sur ces 250 lamas, il y aura des possibilités de réutilisation de lamas d'une étude pour une autre étude, après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser. Dès que le caractère naïf des lamas n'est pas demandé et n'est pas utile pour l'étude, des lamas issus d'études précédentes seront utilisés dans le respect de leur bien-être et si leur état de santé le permet. Ainsi, cela permettra de réduire le nombre de lamas différents utilisés.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : pâture extérieure, litière de paille, brosse à vache, objects à manipuler...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lama sera ici utilisé pour la production d’anticorps. En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. Les animaux sélectionnés seront de jeunes adultes (entre environ 9 mois et environ 6 ans) car c'est à ce stade qu'ils sont entièrement immunocompétents.

260 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 230 tués à l'issue et 30 lapins proposés à l'adoption. Des tiques sont placées sur leur dos dans des capsules pour se nourrir de leur sang, ce que le porteur reconnaît provoquer une gêne et des démangeaisons. Chaque animal ne sert qu'une fois en raison de l'immunité développée contre les tiques. L'élevage vise à maintenir des colonies de tiques saines pour des expériences d'infection.

Objectifs

Le présent projet vise au maintien, en laboratoire, de colonies de tiques, dont les tiques de l’espèce Ixodes ricinus, « sans agent pathogène» afin de pouvoir réaliser des expériences d’infection expérimentale avec divers agents pathogènes pour analyser leur transmission par cet arthropode. Les tiques étant des hématophages stricts(ne mangent que du sang), il est nécessaire de les nourrir régulièrement avec du sang, ce qui est réalisé suivant les stades concernés sur souris vigiles (pour les larves et les nymphes) ou sur lapin vigile (pour les nymphes et les adultes). Pour cela les différents stades de tiques sont placés sur les animaux (dans une capsule fixée sur le dos des souris ou capsules fixées sur le dos des lapins) afin de permettre leur gorgement. Une fois gorgées, les tiques se détachent toutes seules, sont récupérées puis placées en flasque de culture cellulaire en attendant leur métamorphose.

Bénéfices attendus

Le maintien d'un élevage de tiques saines permet de pouvoir développer des projets de recherche portant sur les tiques elle-mêmes : étude du microbiote des tiques, développement de vaccin antimicrobiote de tique, neurophysiologie des tiques ; mais également sur les interactions entre les tiques et les agents pathogènes qu'elles vectorisent (bactéries, parasites et virus) afin de mieux comprendre ces systèmes et de trouver des moyens de lutte contre les tiques et les agents pathogènes qu'elles transmettent.

Procédures

Il n'y aura aucun prélèvement réalisé sur les animaux, juste la récupération des tiques gorgées présentes dans les capsules.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris ou les lapins utilisés mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques (larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez le lapin ou la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort du lapin/souris.

Devenir

Pour les souris, tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les lapins: environ la moitié (30) seront mis à mort si les tiques gorgées avaient des agents pathogènes (tiques collectées en forêt) , et l'autre moitié (30) seront proposés à l'adoption via une association. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé au sein de notre équipe, il est utilisé lors des essais de transmission des agents pathogènes. Cependant son efficacité ne permettant pas toujours de maintenir un assez grand nombre de tiques, il est donc necessaire de maintenir l’élevage de tiques sur lapins et souris.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. Pour chaque élevage, les gorgements seront réalisés au rythme de 1 par stade de tiques (3 stades) tous les 3 mois nécessitant à chaque fois 4 lapins et 5 souris. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Raffinement

Les souris et les lapins sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des lapins et souris avec pour les souris : un maison en plastique par cage, un support pour grimper ; pour les lapins : une balle en plastique dure, un baton de bois à ronger. Les souris sont hebergées à raison de une souris par cage pour éviter le retrait de la capsule par ses congénères.

Choix des espèces

Les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et n'acceptent de se gorger que sur certains animaux dont les souris (larves et nymphes) et les lapins (nymphes et adultes). De plus, afin de maintenir un élevage, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade. Les tiques adultes et nymphes prélevant un volume de sang important, le gorgement sur lapin évite (1) la spoliation sanguine de l’animal hôte contrairement au gorgement sur souris, et (2) le recours à plus d’animaux. Adultes pour les souris et les lapins Age Minimum 5 semaines pour les souris pour pose des capsules Age indifférent pour les lapins

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées d'une semaine à vingt-quatre mois, elles subissent des prélèvements de sang deux fois par mois et des injections intrapéritonéales, pour étudier le vieillissement des vaisseaux sanguins. Le porteur présente les manipulations lors des prises de sang et des injections comme les seuls effets indésirables. Les rubriques réduction et raffinement reprennent mot pour mot le texte de la rubrique remplacement, sans mesure propre à chacune, avant mise à mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons 1/ caractériser l’endothélium vasculaire vieillissant 2/ explorer le rôle de médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système d’hémostase (thrombose, coagulation et fibrinolyse). Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation du vieillissement vasculaire Dans cet axe, une étude pilote sera menée pour la mise au point des immunomarquages de sénescence et de caractérisation. Pour ce faire, un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites jeune (1 semaine à 1mois) et un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites âgées (12 ou 24 mois) seront utilisées (n=10).

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’apporter de la connaissance sur le vieillissement vasculaire ainsi que l’impact de la physiologie plaquettaire et de l’endothélium, inconnu à ce jour et peu réalisable sur les humains à la vue de la diversité du système vasculaire. En effet, il est irréalisable d’obtenir sur le même individu des biopsies endothéliales (veines, artères et capillaires), à cause des méthodes invasives et des conséquences délétères (hémorragies). Par ailleurs, le second axe permettra de déterminer un composé diminuant ou stoppant le vieillissement vasculaire. Ces travaux serviront à l’ensemble de la population en général et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets. éral et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animeaux vigiles, 2 fois par mois. La durée de la prise de sang est de maximum 2minutes Les injections en intraperitoneale durent maximum 1minute.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent.

Devenir

Au cour de l'étude, les souris feront l'objet d'un suivi quotidien et de prise de sang bi mensuel. Al fin de l'etude, tous les animaux seront mis à mort afin de faire une etude des tissus murins.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Réduction

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Raffinement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 1 semaine à 24 mois. Les souriceaux a une semaine de vie presentent un arbre vasculaire incomplet au niveau des retines et permet d'avoir un temps de reference "jeune". Les vaisseaux sanguins cerebrales sont matures chez les souriceaux de 1 semaine. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (1 semaine à 1mois) et souris vieillissante de 3 à 24mois. Ces dernieres ont un stade de developpement complet.

720 souris et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever et infecter des moustiques Anopheles vecteurs du paludisme. Les lapins sont exposés vingt minutes par semaine pendant six mois aux piqûres d'environ 500 moustiques femelles, les souris à quarante piqûres par semaine pendant deux mois, certaines étant en outre infectées par des parasites Plasmodium. Le porteur présente ces piqûres et les prélèvements de sang associés comme les seuls effets indésirables. Il justifie le gorgement sur animaux vivants par la difficulté de certaines lignées à se nourrir sur membrane, et met à mort lapins et souris à l'issue de chaque cycle.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire régulièrement des moustiques femelles du genre Anopheles pour l’étude des interactions Plasmodium-Anopheles. Selon les questions scientifiques, il s’agira soit de colonies bien établies, soit de nouvelles lignées récemment établies ou à établir à partir de populations sauvages. Trois programmes scientifiques sont en cours. Programme 1 : Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae (souche Yaoundé) conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants. Programme 2 : Analyse fonctionnelle de gènes d’Anopheles arabiensis dont l’expression est régulée par P. falciparum et Plasmodium vivax. Programme 3 : Infection d’Anopheles darlingi par P. vivax pour le cyclage au laboratoire de ce parasite.

Bénéfices attendus

Globalement, le projet contribuera à une meilleure compréhension des interactions Anopheles-Plasmodium avec pour objectif principal la recherche de stratégies nouvelles et innovantes pour lutter contre la transmission du paludisme. Spécifiquement le programme 1 (Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants) doit permettre d’identifier des facteurs de type épigénétique impliqués dans la susceptibilité du moustique Anopheles gambiae, vecteur majeur du paludisme en Afrique sub-saharienne, à P. falciparum et guider vers le choix de nouvelles stratégies de contrôle des populations de ce moustique sans avoir recours à des insecticides. Le programme 2 a pour objectif une meilleure connaissance des gènes du moustique spécifiquement régulés par P. vivax, un parasite négligé mais d’importance croissante en Asie et Amériques et ainsi orienter les programmes de stratégie de blocage de la transmission de ce parasite, tel que des vaccins bloquant la transmission. Le succès du programme 3 (cyclage au laboratoire de P. vivax) ouvrira un pan nouveau de recherches, notamment pour agir sur les formes quiescentes du parasite au niveau du foie, sensibles à une seule famille de molécule (primaquine et tafénoquine), qui présente de nombreux effets indésirables chez les patients déficients en G6PD. Sur le plan transmission de P. vivax, ce programme permettra de compléter les études développées dans le programme 2, facilitant et accélérant la validation des gènes d’intérêt du moustique.

Procédures

Dans la procédure 1, les lapins sont exposés pendant 20 minutes à une cage contenant environ 1000 moustiques (donc seulement 500 sont des femelles), une fois par semaine, pendant 6 mois. Dans la procédure 1, les souris sont exposées pendant 20 minutes aux piqures de moustiques, à raison de 40 anophèles femelles par souris, une fois par semaine, pendant 2 mois. Dans la procédure 3, les souris reçoivent une injection intra péritonéale (quelques secondes), puis subissent un prélèvement d’un micro-volume de sang par une micro incision à l’extrémité de la queue de la souris à l’aide de ciseaux stérilisés (quelques secondes par prélèvement), puis sont exposées aux femelles adultes d’Anopheles, pour un repas de sang sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale/ quelques secondes par injection ; repas sanguin pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables sur les animaux peuvent être dus à l’inconfort lié aux piqures par moustiques et la quantité de sang qu’il leur sera prélevé à cette occasion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure : au bout de 6 mois pour les lapins, au bout de 2 mois pour les souris non infectées par Plasmodium, 3 à 5 jours après l’infection pour les souris infectées par des Plasmodium de rongeurs

Remplacement

Le choix de nourrir les moustiques sur animaux et non par gorgement sur membrane est guidé par la difficulté de lignées à se gorger sur membrane (An. arabiensis, An. darlingi) et l’impact potentiel d’altérer l’effet maternel étudié chez An. gambiae souche yaoundé (programme 1). En effet le comportement et la physiologie du moustique sont très sensibles à l’origine du sang, aux odeurs émises par les animaux et au mode de piqure. Par ailleurs des souris infectées par un Plasmodium de rongeur (P. berghei ou P. yoeli) sont utilisées comme substitut à des infections avec les parasites infectant l’homme (P. falciparum ou P. vivax) difficiles à produire au laboratoire.

Réduction

Le nombre requis d’animaux découle de la longue expérience de l’équipe qui veille à respecter les recommandations 3R. L’utilisation d’un même lapin au-delà de 6 mois résulterait à une production réduite de moustiques incompatible avec les objectifs scientifiques du fait de l’apparition d’un taux trop élevé d’anticorps anti-salive de moustiques ayant pour conséquence une perte de qualité des repas sanguin pour les moustiques et donc une perte en nombre de descendants moustique. Il en va de même pour les souris, auquel s’ajoute l’effet cumulé d’une anesthésie hebdomadaire qui amènerait à avoir recours à des doses d’anesthésiant plus importante et les conséquences possibles sur le bien-être de la souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales d’hébergement répondant aux normes européennes, avec une surveillance de l’état général (observation de la mobilité, du pelage, et de la couleur des oreilles) et du poids. Avant et après chaque repas sanguin des suppléments alimentaires sous forme de gel seront proposés aux animaux.

Choix des espèces

Le choix des lapins et souris pour maintenir ou produire des lignées de moustiques anophèles est guidé par la qualité du sang fourni par les animaux vivants et le fait que certaines lignées ne se gorgent que très faiblement à travers une membrane produisant des progénitures dont la taille est incompatible avec les programmes scientifiques. Le programme 1 interroge une composante épigénétique pour laquelle une modification du mode de gorgement des moustiques (Lapin versus poche de sang) pourrait être dommageable sachant que de nombreux paramètres peuvent être impliqués dans l’expression de signatures épigénétiques. Stade de développement des animaux : souris et lapins adultes jeunes car les animaux vieux sont difficiles à « piquer » et leur poids est trop important et pour les souris hôtes de Plasmodium, pour leur sensibilité aux parasites.

520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'induction d'une infection urinaire par sondage de l'urètre sous anesthésie, répétée une fois, puis un traitement par l'eau de boisson pendant douze semaines associant une mycotoxine et un carcinogène. Il indique que l'infection provoque un inconfort et qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraînerait la sortie de l'animal du protocole. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", l'interaction entre plusieurs organes ne pouvant selon lui être modélisée in vitro.

Objectifs

Nous sommes constamment exposés à une multitude de contaminants chimiques ou toxines biologiques, qui même à faible doses peuvent affecter notre santé, par exemple en provoquant le cancer. La plupart des recherches examinent l'effet de ces contaminants ou toxines une par une, mais rarement en combinaison. Dans ce projet, nous étudierons si la combinaison d'une toxine produite par une bactérie pathogène et d'un contaminant naturel des aliments, une mycotoxine, pourrait provoquer un cancer de la vessie. L'une des infections les plus courantes est l'infection urinaire causée par Escherichia coli. Ce microbe produit des toxines qui peuvent endommager notre ADN et induire des mutations cancérigènes. Une femme sur deux est touchée par cette infection au cours de sa vie. Des études antérieures ont montré que les personnes souffrant de ce type d'infection ont tendance à avoir plus de cancers de la vessie. Nous sommes aussi fréquemment exposés à des toxines prédentes dans l'alimentation, comme celle produite par des moisissures qui poussent sur les céréales: une mycotoxine appelée déoxynivalénol ou DON. Le DON est éliminé par notre corps dans l'urine. On trouve des traces de DON dans 40 à 98% des Européens, c'est donc un contaminant très fréquent. On sait que lorsqu'ils sont ensemble, DON et Escherichia coli induisent encore plus de dommages à notre ADN. Est-ce que manger un aliment contaminé par le DON tout en ayant une infection urinaire pourrait endommager nos cellules et favoriser le cancer de la vessie?

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous répondrons à cette question en étudiant si la combinaison du deoxynivalenol et de l’infection avec Escherichia coli induisent des lésions cancéreuses à long terme. Si nous confirmons qu'ensemble ils peuvent conduire au cancer de la vessie, nous alerterons les médecins et les régulateurs, pour éventuellement modifier la façon de traiter les infections de la vessie et pour diminuer les quantités tolérables de DON dans nos aliments.

Procédures

Une infection urinaire sera induite chez les animaux par injection via leur urèthre, avec une sonde, sous anesthésie générale. Le sondage et l'injection sont effectués par une personne expérimentée, en 1 minute environ. L'injection est répétée une fois sur chaque animal une heure après la première (pour garantir l'infection). Le suivi des animaux est ensuite effectué par des prélèvement d'urine quotidiennement, sur animal vigile avec une simple contention manuelle. Le traitement des animaux avec le contaminant alimentaire et le carconogène urinaire est effectué par l'eau de boisson, sans intervention, pendant 12 semaines. Ces produits ne montrent pas d'effet sur la prise de boisson aux doses utilisées.

Impact sur les animaux

Les traitements avec le contaminant alimentaire et le carcinogène urinaire ne sont pas connus pour induire de la douleur. Les infection urinaires induisent de l'inconfort au niveau de l'aine, mais aucun autre signe clinique est attendu.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à l'issu de l'expérience afin de prélever les tissus qui seront analysés. La technique d'euthanasie est la même que celle utilisée chez les vétérinaires.

Remplacement

Remplacer : des études ont été préalablement conduites sur des cellules en culture permettant d’élucider comment agissent les toxines produites par les UPEC sur les cellules eucaryotes. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’évaluer les répercussions à long terme de cette bactérie et ses toxines sur la vessie. Une veille scientifique sera mise en œuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.

Réduction

Réduire : Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Le nombre maximum de rats envidagé est de 520 animaux. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, nombre de bactéries, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Raffiner : Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur. Une perte de poids (non attendue) supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt plus stricts seront mis en place.

Choix des espèces

L'utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l'impact des différentes toxines et métabolites sur la cellule eucaryote en culture. Cependant, le recours à l'animal est irremplaçable car les objectifs sont i) de découvrir les rôles des toxines bactériennes produites pendant l'infection urinaire et le cancer de l'urothélium, ii) de déterminer le lieu et la cinétique de production de ces toxines dans le tissu de la vessie et iii) de mesurer les effets des facteurs alimentaires sur leur production lors de l'infection urinaire. Étant donné que les infections urinaires sont des infections ascendantes impliquant plusieurs organes, que la production de toxines bactériennes peut être affectée par les réponses de l'hôte à différents endroits dans l'organisme, cette interaction complexe ne peut pas être modélisée in vitro.

100 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un défaut osseux est créé de part et d'autre de la mandibule sous anesthésie, suivi d'imageries avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste, avant une mise à mort au CO2, pour mettre au point un modèle d'implantation de biomatériaux. Le porteur qualifie les douleurs post-opératoires de modérées pendant 48 à 72 heures, avec hématomes et fracture mandibulaire. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que le recours au modèle in vivo est "indispensable".

Objectifs

La sphère cranio-faciale est particulièrement exposée aux pertes osseuses d'origine traumatique, tumorale, infectieuse ou congénitale, dans lesquelles le défaut de tissu osseux implique des reconstructions complexes. Actuellement, des substituts osseux synthétiques ou biologiques sont développés et nécessite des modèles de défauts osseux pour les valider chez l'animal. Le modèle cranio-facial le plus répandu est celui situé dans la calvaria des souris et des rats. Ces modèles, très utiles pour étudier la réparation osseuse sont néanmoins limités, l’os mandibulaire étant soumis à des contraintes mécaniques fortes. La nécessité de tester des substituts osseux dans des environnements le plus proche de la réalité est indispensable en recherche pré-clinique. Ce projet vise à mettre au point un modèle de défaut osseux mandibulaire chez le rat permettant de tester différents biomatériaux et répondre aux exigences de réduction et de remplacement avant d’envisager de le tester sur de plus gros animaux (lapin ou brebis). Ce modèle permettra ainsi de tester des biomatériaux d'intérêt pour une future application clinique chez les patients souffrant de pertes osseuses de grandes étendues.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet de recherche fondamentale pré-cliniques en ingénierie osseuse cranio-faciale. La stratégie proposée ici va bien au-delà de l'état actuel de l'art avec le développement d'un dispositif adaptable unique pour chaque patient. Le matériau sera dessiné puis imprimé en 3D pour correspondre aux dimensions exactes du défaut. Il devra posséder des propriétés mécaniques comparables à celles de la mandibule d'origine, permettant ainsi la pose d'un implant dentaire pour restaurer la mastication. En parallèle, la partie interne sera adaptée pour favoriser son intégration tissulaire par l'ajout d'une matrice de collagène cellularisé. Ce projet vise à proposer une solution optimisée et centrée sur le patient pour restaurer les défauts osseux orofaciaux, notamment ceux de la mandibule. Il s'attaque à un problème de santé majeur par le biais d'une stratégie d'ingénierie tissulaire innovante combinant la science des matériaux, la bio-ingénierie et les études précliniques, avec des avantages prévisibles tant pour les patients que pour le système de santé et la société dans son ensemble. En outre, l’utilisation d’un modèle de défaut mandibulaire chez le rat permettra de mettre au point différentes étapes d’analyse d’ingénierie osseuse en restant chez le petit animal pour respecter au maximum le principe des 3R.

Procédures

Procédure 1 : Etape 1 : Imagerie non invasive sous AG (10min) Etape 2 : Réalisation d'un défaut osseux mandibulaire bilatérale sous AG, (30min), Etape 3 : Imagerie scanner sous AG avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste (1min injection, 10min scanner) et mise à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié (4min induction et 3min de repos). Procédure 2 : Etape 1 : Réalisation d'un défaut osseux mandibulaire bilatérale sous AG, avec insertion d’un matériau lors de cette étape (30 à 40min) Etape 2 : Imagerie scanner sous AG avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste (1min injection, 10min scanner) et mise à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié (4min induction et 3min de repos).

Impact sur les animaux

Un stress lié au anesthésie lors des imageries. Les douleurs post opératoires sont considérées "modérées" pendant 48 à 72h (hématomes, fracture mandibulaire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’intéraction de différents types cellulaires. Ces processus complexes ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. La mise au point d’un modèle in vivo de défaut osseux mandibulaire chez le rat permettra de sélectionner les biomatériaux adéquats dans un défaut osseux de ce type avant de passer à un modèle de défaut osseux chez le gros animal qui sera plus proche de l’homme notamment par la présence d’os spongieux (ex le lapin et la chèvre). Il n’existe à ce jour aucune méthode alternative.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit grâce à l’utilisation de l’imagerie en amont des chirurgies pour vérifier sa faisablité (hauteur/largeur osseuse disponible, édification des racines des molaires de rats, situation du canal incisif). Les biomatériaux utilisés seront tous validés préalablement par des tests in vitro pour vérifier leur biocompatibilité cellulaire. Le nombre d'animaux par groupe et par temps d'analyse (6) est justifié en fonction de nos objectifs de mise au point et permettra une étude adéquate sur le plan statistique. Compte tenu des publications relatant ce modèle mandibulaire, un effectif de 6 sujets par groupe et par temps d’analyse est indispensable. Au vu de 3 temps d’analyse histologique prédictible cela fait 18 animaux par groupe que nous augmentons à 20 par groupe pour tenir compte d’éventuelle exclusion d’animaux. Sur 3 ans un nombre maximum de 100 rats seront utilisés, des études par imagerie longitudinale seront effectuées à différents temps afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par temps d’analyse. Une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie générale (Kétamine/xylasine) en IP, l’utilisation d’une anesthésie locale (SC), (Lidocaïne sans épinéphrine et bupivacaïne) et d’analgésique (Buprénorphine) adaptée durant les procédures avec une médication systématique en per et également post-opératoire 72h, et l’établissement de points limites adéquats. Une nourriture en poudre sera donnée la semaine suivant la chirurgie pour prévenir au mieux tout risque de douleur et de fracture. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée les premières 72h puis quotidienne. Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de 3 individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude du tissu osseux. Il permet une faisabilité technique et la biologie de leur tissu osseux est proche de celle de l’homme avec notamment la présence du périoste. Notre laboratoire possède une expertise sur l’étude du tissu osseux du rat. La taille de sa mandibule permet d’y envisager un défaut critique de 4 à 5mm dans l’angle mandibulaire, ce qui n’est pas possible chez la souris, la mandibule étant trop petite. Les animaux seront étudiés entre 5 semaines de vie et 3 mois post chirurgie, les animaux étant alors des jeunes adultes, le potentiel de réparation osseuse y est optimal. Les mâles seront étudiés pour plus de standardisation inter-animal afin de s'affranchir de tout biais lié à l'incidence hormonal oestrogénique variable des femelles. L'âge idéal de ces chirurgies sera validé grâce au suivi par scanner pour sélectionner les rats ayant une taille de la mandibule adéquate. Nous bénéficions d’une animalerie d’élevage au sein du laboratoire.