Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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Étude de la senescence dans la rétine par l’utilisation de souris transgéniques ciblant les cellules exprimant p16
- Recherche fondamentale
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- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 372 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 372 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intravitréales répétées dans l'œil et, pour une partie, une induction de diabète par la streptozotocine, avec une mortalité annoncée de 10 %. Le porteur décrit ces injections comme proches de celles pratiquées chez les patients et signale un possible prurit lié à une fibrose hépatique chez les souris âgées. Il justifie le recours à l'animal par la complexité de la sénescence, présentée comme un processus d'"organisme entier" impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
En vieillissant, l’organisme accumule des cellules potentiellement toxiques appelées « cellules sénescentes » ou CS. L’impact des CS sur le corps reste incompris mais réduirait l’espérance de vie en favorisant l’apparition de différentes pathologies liées à l’âge comme l'athérosclérose, la prise de poids ou le diabète. Il est donc généralement considéré que leur délétion augmenterait l’espérance de vie et diminuerait les comorbidités associées au vieillissement. Néanmoins, leurs rôles et fonctions restent largement incompris. Elles apparaissent après une exposition à un stress et peuvent donc s’accumuler de 2 façons différentes : soit lentement et graduellement tout au long de la vie, reflétant ainsi la multitude d’agressions auxquelles tous tissu est normalement exposé, soit au contraire à la suite d’un stress intense éventuellement induit par une pathologie. L’œil, et notamment la rétine, est un exemple de tissu développant des pathologies liées à la senescence, tel que le glaucome et la dégénérescence de la macula. Ces maladies sont clairement associées à l’âge mais peuvent également constituer des conséquences d’autre pathologie, en particulier le diabète. L’objectif de ce projet de recherche fondamentale est de caractériser la senescence au niveau de la rétine ainsi que de mettre en évidence son lien avec d’autres pathologies, notamment le diabète. Cette étude pourrait ainsi aider à la compréhension et à la prise en charge de maladies provoquant des pertes ou des altérations de la vision.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules sénescentes dans la rétine, laquelle est une partie de l’œil indispensable pour son fonctionnement. Il aidera à comprendre comment la senescence participe à la genèse de l’organe, puis son impact sur le vieillissement et sa contribution à la rétinopathie induite par le diabète. Enfin, ce projet permettra également de déterminer si les CS constituent une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour soigner les rétinopathies et les déficiences visuelles induites par l’âge.
Procédures
Procédure 1 : Activation de la CreER par exposition au tamoxifène. Traitement 3 fois par jour pendant 5 jours consécutifs par dépôt de gouttes sur les yeux. -- Procédure 2 : Traitement aux senolytiques. 1 ul de solution sera injecté dans l'œil par de façons intravitreal 3 jours avant leurs mises à mort. Les souris auront été préalablement anesthésiées. --Procédure 3 : Traitement au liposome-clodronate. Cette procédure consistera donc à traiter les yeux des souris du modèle 1 (p16-Cre/GFP) par injection intravitreal d’1 ul. Les souris auront été préalablement anesthésiées. Ce traitement sera fait sur des souris de 20 jours avant leurs mises à mort à 40 jours, mais également, une fois par mois, sur des souris de 1 an jusqu'à leurs mises à mort à 18 mois (donc 4 injections). --Procédure 4 : Traitement à l'anti-VEGF. Administré aux souris de modèle 1 (p16-Cre/GFP) et 2 (p16-Cre/DTA) par injection intravitreal a raison de 1ul par œil. Nous réaliserons cette procédure sur des souris jeunes (20 jours) et plus vieilles (1 an). Les souris jeunes seront mises à mort à 40 jours après une seule injection à 20 jours. Les souris âgées seront mises à mort à 18 mois après une injection tous les mois à partir d'un an (donc 4 injections). Les souris auront été préalablement anesthésiées. --Procédure 5: Induction du diabète par injection IP de STZ. 1 injection par jour durant 5 jours consécutifs sur des souris de 8 semaines. Les souris seront mises à jeun les 4 heures précèdent les injections.
Impact sur les animaux
1--Dans les procédures 1, 2 et 4, les souris p16-Cre/DTA (modèle 2) de 12 mois et plus pourraient développer une fibrose hépatique se traduisant par un prurit. En effet, nos analyses précédentes montrent les souris avant 1 an n’auront pas le temps d’activer le gène p16 dans un nombre significatif de cellules, tandis qu’a 12 et 18 mois la déplétion de CS pourrais être assez importante pour affecter la santé de la souris. Par conséquent, nos souris en reproduction générant les animaux expérimentaux seront mises à mort avant 1 an, tandis que les souris assignées aux différentes procédures seront suivies de façon hebdomadaire à l’aide d’une feuille de score adaptée. 2—Dans les procédures 2, 3 et 4, les souris devront subir des injections intravitreal. Ce type d’administration est similaire à ce qui se fait pour traiter les patients contre la dégénérescence maculaire ou les rétinopathies d’origine diabétique. Les souris seront anesthésiées pendant la procédure et ne devraient subir qu’un inconfort passager et limité apres leur réveil. 3—Dans la procédure 1, le traitement se fera par application d’une solution non toxique et non irritante sur les yeux. Nous n’attendons pas de toxicité liée à ces molécules dans le cadre d’une application topique. 4—La procédure 5 consiste à réaliser des injections de streptozotocin (STZ) pour induire le diabète. Le STZ est une toxine connue pour induire le diabète en ciblant spécifiquement les cellules sécrétrices d’insuline du pancréas. Ce produit est relativement spécifique avec peu d’effet secondaire et une toxicité réduite. Cette toxicité survient très rapidement, avant dix jours, et est due à une hypoglycémie induite par un relâchement important d’insuline dans le sang lors de la mort de cellules sécrétrices du pancréas : l’ajout de sucrose dans l’eau pendant 48 heures permet de limiter celle-ci à moins de 5%. Une mortalité évaluée à 10% survient ensuite durant une période allant de 10 jours à 9 semaines après l’injection de STZ, mais est due aux complications de l’hyperglycémie induite par le traitement. Les paramètres importants à observer pour limiter la souffrance chez l’animal sont faciles à détecter : perte de poids, torpeur, prostration. On notera que la souris sera mise à jeun 4 heures avant chaque injection, générant potentiellement un stress et un inconfort limité en intensité et en durée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
L'étude de la sénescence est un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire. Il est ainsi impossible de mimer in vitro ou in silico le vieillissement de la rétine et l’effet du système immunitaire sur ce processus. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable et trop complexe pour être mimé in vitro.
Réduction
Les effectifs ont été choisis en prenant en compte 2 paramètres : -Le nombre minimum de souris permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous obtenons 16 souris/groupe en utilisant le logiciel Gpower avec un test de student unilatéral et paramétrique (comparaison de 2 groupes indépendants sous loi normale) de puissance statistique modérée (0.7) associé à un effet taille important (0.8) pour p≤0.05. -Le taux de mortalité/echec associe au travail sur les animaux et à la part d’incertitude des différentes procédures. Nous n’attendons pas de mortalité particulière pour la plupart des procédures exceptées dans la procédure 5. En effet, les injections de STZ induiront une certaine mortalité (15%) et nous estimons que 20% ne développeront pas au traitement. Par conséquent, seulement 65% des souris deviendront diabétiques. Par conséquent, la plupart des groupes comprendront 20 souris exceptés pour la procédure 5 où nous choisirons 31 souris/groupe STZ de façon à compenser cette mortalité/resistance au traitement.
Raffinement
Pour limiter la douleur que nos procédures expérimentales pourraient induire, les souris seront suivies par les expérimentateurs et le personnel technique avec une fiche de score fournie (annexe 1). Notre fiche de score est basée sur plusieurs observations d’ordre général (feuille de score standard) ou plus spécifique, car associée à un génotype ou traitement particulier (injection de produit dans différentes parties de la souris ou traitement par goutte). Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres cités plus haut et seront remplies tout au long de l'expérimentation. Ces points limites seront adaptés au modèle et suffisamment précoces afin d’anticiper toute souffrance à l’animal, notamment dans le cadre de la procédure 5 avec ‘induction du diabète. Etant donné que les yeux de nos souris seront fréquemment traités, un suivi particulier orienté sur cet organe sera fait. Les injections intravitreals seront réalisées sous anesthésie. De façon plus général : -Par souci de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage et conservés intact -Un enrichissement permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, abris dans la cage...). -les animaux seront manipulés dans le calme, hébergés 4 par cages, avec un rythme nycthéméral de 12h, eau et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude exploratoire et innovante avec l’utilisation de modèles murins récents (P16-Cre et P16CreER) qui n'existent pas chez d'autres espèces. La sénescence est un phénomène complexe impliquant plusieurs types cellulaires, voire plusieurs organes différents, comme le prouve sa composante immunitaire. Elle correspond à un processus impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, qui nécessite une étude au niveau de l’organisme entier.
Rôles des NKs lors de l’infection par une bactérie chez la souris déficiente en protéine IRF2
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
- Système immunitaire
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Francisella novicida par voie intradermale, certaines après une injection dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine IRF2 dans la réponse immunitaire. Le porteur décrit des points limites, léthargie, prostration, détresse respiratoire, déclenchant la mise à mort, et affirme que la phase précoce de l'infection reste peu agressive. Il qualifie ces expériences d'"absolument indispensables" et justifie le recours à la souris par l'accès aux animaux génétiquement modifiés.
Objectifs
La tularémie est une maladie causée par la bactérie Francisella novicida. Elle touche les mammifères, particulièrement les lièvres et les rongeurs. Ceci permettra d’utiliser la souris comme modèle d’étude, afin d’avoir accès aux KO. La tularémie est une zoonose et peut être transmise à l’homme et causer des problèmes cutanés, digestifs ou respiratoires. C’est une maladie à déclaration obligatoire. Environ 50 cas de tularémie sont déclarés chaque année en France. La tularémie représente également une arme bactériologique. L’objectif de l’équipe est de mieux caractériser les réponses immunes induites lors d’une infection par Francisella, et notamment le rôle des Interferon Regulatory Factors (IRFs), facteurs de transcription impliqués dans la régulation de l’expression ainsi que la réponse aux interférons de type 1, cytokines essentielles pour la régulation de l’inflammasome mais dont le rôle n'est pas bien connu lors des infections bactériennes. Grâce à des travaux préliminaires dans l’équipe, un rôle d’IRF2 dans la régulation de l’inflammasome in vitro a été identifié. L'objectif serait donc de tester si IRF2 joue également un rôle in vivo dans la régulation de l’inflammasome. Pour ce faire, un modèle d’infection murin intradermal par la bactérie Francisella novicida sera utilisé. De plus, étant donné le rôle majeur des cellules Natural Killer (NKs) durant la réponse anti-bactérienne innée contre Francisella, les rôles des NKs et leur état d’activation lors de l’infection par Francisella novicida dans des souris WT ou déficientes pour IRF2 seront étudiés. Le ciblage d'IRF2 pourrait fournir de nouvelles modalités thérapeutiques pour le traitement de pathologies médiées par l'inflammasome. Les résultats attendus in vivo sont une susceptibilité à Francisella novicida conduisant à une mort prématurée des animaux IRF2 -/- infectés comparés aux WT. Le nombre d’UFC dans les organes des souris WT et IRF2 -/- sera quantifié. Les concentrations des cytokines IL-1b, IL-18 et IFN-g seront également dosées dans le sérum de ces animaux. Les résultats obtenus lors d’une infection par Francisella pourraient être extrapolés pour d’autres pathogènes intracellulaires. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Des souris déficientes pour la Gasdermine D, protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome, seront donc également utilisées.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux caractériser comment le facteur de transcription IRF2 affecte la réponse immunitaire de l’hôte. Une meilleure compréhension de ce système devrait aider au développement de nouveaux médicaments impliqués dans la réponse immunitaire chez l’hôte, notamment en ciblant la voie des IFN de type 1.
Procédures
Les animaux subiront une injection IV à J0 dans le sinus rétro-orbital une fois (2 minutes par injection), puis 3h après, à J0, ces mêmes animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida (2 minutes par injection) (Procédure #2). Les animaux seront sacrifiés 48h pi 51 minute par injection) avant la collecte des organes et du sang. Pour les Procédures #1 et 3, les animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida à J0 (2 minutes par injection) et seront mis à mort 48h post infection (1 minute par injection) avant la collecte du sang et des organes pour la procédure #1, et au plus tard une semaine après à J7 pour la procédure #3 (développement des symptômes).
Impact sur les animaux
Le transfert de NKs ne devrait créer aucun stress. Cependant, les injections en rétro-orbitale seront réalisées sous brève anesthésie à l'isoflurane après application d'un collyre anesthésique sur l'oeil. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroide et un antibiotique à large spectre (framycétine). Concernant l’infection, les animaux seront surveillés tous les jours avec des points limites parfaitement définis. La souche bactérienne utilisée est très bien caractérisée et les souris ne resteront pas plus de 48h en sa présence (Procédures #1 et 2), ce qui correspond à la phase précoce de l’infection, connue pour être moins agressive. Les animaux ne perdent pas de poids dans les 48 premières heures de l'infection. Pour la procédure #3, expérience de développemnt des symptômes, le nombre de CFU utilisé est moindre (1000 CFU) par rapport aux procédures #1 et 2 (5000 CFU) et les animaux seront surveillés une fois par jour dès 24h puis deux fois par jour à partir de 72h d’infection pour détecter toute forme de souffrance. Les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte des points limites suivants: pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébourrifés, détresse respiratoire.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux
Remplacement
Les questions posées ici nécessitent un système complexe, et ne peuvent pas être investiguées dans des modèles in vitro ou dans des modèles in vivo utilisant des animaux invertébrés. Toutes les expérimentations préliminaires ont été réalisées in vitro, afin de valider notre hypothèse.
Réduction
De nombreux paramètres de l’hôte et de la bactérie seront étudiés sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre de répétitions expérimentales. Une étude bibliographique a été réalisée pour utiliser les doses les plus adéquates de pathogènes au cours des expériences. Les expériences réalisées ici sont considérées comme absolument indispensables pour connaitre le rôle d'IRF2 et des NKs, in vivo. L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique de nos résultats. Ainsi, un minimum de 7 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Pour les conditions naives, 3 animaux par groupe seront utilisés. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus, notamment si le projet in vivo n’est pas concluant. Ainsi, si la procédure #1 ne montre aucun phénotype notable, les procédures #2 et #3 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Avant les procédures, les animaux seront entrainés à être contentionnés pour éviter tout stress pendant la procédure. Lors des procédures, les points limites sont suffisamment prédictifs pour éviter l’utilisation des antalgiques et il sera toujours possible d'arrêter la procédure de manière anticipée pour qu’à aucun moment, un animal ne souffre. En effet, en cas de souffrance, l’animal sera mis à mort. Une surveillance journalière (à partir de 24h d’infection) sera réalisée pour détecter toute forme de souffrance pour les procédures #1, #2 et #3, et bijournalière à partir de 72h pour la procédure #3. Plus concrètement pour l'infection: les souris seront suivies une fois par jour pour les procédures #1 et #2 pour détecter l’apparition du moindre point limite défini plus bas. Les souris seront mises à mort par injection d’exagon en cas d’atteinte de l’un des points limites suivants : animal léthargique : pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébouriffés, détresse respiratoire. Pour l'injection de NKs, dans le cas où l'oeil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticosteroide et un antibiotique (framycétine).
Choix des espèces
La pertinence physiologique d’IRF2 et de Gasdermine D dans la réponse immune à Francisella ne peut être investiguée dans des modèles in vitro ou dans des modèles utilisant des animaux invertébrés du fait de la nécessité i) de travailler dans un système intégré, et ii) d'utiliser les souris pour avoir accès aux souris KO. Par ailleurs, les invertébrés ne présentent pas d’inflammasome. De plus, la souris est un très bon modèle d’étude de la réponse immune contre des bactéries intracellulaires. Nous utiliserons des souris transgéniques IRF2 KO ainsi que des souris non transgéniques IRF2 WT issues de mêmes portées. Il ne s'agit pas d'un phénotype dommageable. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Nous réaliserons donc les procédures #1 et #3 également sur des souris déficientes pour Gasdermine D. La Gasdermine D est une protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome. Souris de 6 à 8 semaines. Système immunitaire mature à l’âge adulte.
Impact de la protéine NCOA7 sur les réponses anti-virales, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 765 modéré. Elles sont infectées par la grippe H1N1 par voie intranasale, certaines irradiées puis greffées de moelle osseuse, avec injections et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les doses peuvent être létales et provoquer jusqu'à 25 % de perte de poids, seuil au-delà duquel les souris sont mises à mort. Il justifie le recours à l'animal par la complexité de la réponse immunitaire antivirale, impossible selon lui à reproduire in vitro, et par l'accès à des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Les virus de la grippe (virus Influenza A, IAV) est un agent pathogène responsable de la mort de près de 500 000 personnes par an dans le monde. Une meilleure compréhension de la réplication du virus de la grippe, de sa propagation dans les hôtes infectés et de son inhibition par le système immunitaire est essentielle dans le développement de nouvelles stratégies prophylactiques et thérapeutiques. L’isoforme courte de la protéine NCOA7 (ici dénommée NCOA7) est une protéine présentant une activité antivirale contre le virus de la grippe au cours des réponses immunes innées. Les données de la littérature indiquent également que la protéine NCOA7 pourrait impacter les réponses immunes adaptatives. Ces données ont été obtenues in vitro. Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’impact de NCOA7 sur le contrôle de la réplication du virus de la grippe ainsi que sur la mise en place des réponses antivirales de l'immunité innée et adaptative in vivo, dans un modèle murin. Pour cela, des souris C57Bl/6J WT et NCOA7-/- (que nous avons générées) seront infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe (souche H1N1 A/WSN/1933). L’analyse du nombre, du phénotype et des fonctions des cellules immunitaires ainsi que la mesure de la charge virale dans le poumon et de la production de cytokines dans les organes et le lavage broncho-alvéolaire seront effectuées à différents temps post-infection.
Bénéfices attendus
Le virus de la grippe est un problème de santé publique majeure et les risques liés à l’émergence de souches virales responsables d’une pandémie sont très élevés. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme, contre une infection par le virus de la grippe et de caractériser l’importance de NCOA7 dans la mise en place des réponses immunitaires innée et adaptative.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Procédure 1 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 2 : - - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes Procédure 3 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 4 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 5 : - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales ou intraveineuses; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang, l’irradiation et le transfert de moelle osseuse ; iv) le stress généré par le transport entre l’animalerie et l’irradiateur. L'infection par le virus influenza A est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire et qui, aux doses sous létales utilisées, , ne génère pas de souffrance visible sur les animaux. Les doses utilisées dans la procédure 1 et 3 pouvant être létales, notre expérience a montré que les animaux pouvaient expérimenter une perte de poids allant jusqu’à 25% de leur poids initial entre jour 6 et 10 après infection, avant de revenir à leur poids initial entre jour 12 et 15 après infection. Dans ce cas, un point limite de 25% de perte de poids est fixé.
Devenir
Mise à mort des animaux pour analyse des organes, par dislocation cervicale ou surdose de pentobarbital. La méthode par surdose de pentobarbital sera utilisée sur des groupes d’animaux, pour permettre l’analyse des lavages broncho-alvéolaires.
Remplacement
Le role antiviral de la protéine NCOA7 a été mis en évidence in vitro, dans des cellules pulmonaires humaine. Nous souhaitons à présent mettre en évidence un rôle de NCOA7 in vivo, dans un contexte global d'infection par le virus de la grippe. De plus, des résultats préliminaires indiquent que NCOA7 pourrait égalemet jouer un rôle dans la mise en place des réponses antivirale adaptatives. La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé sur la base des expériences antérieures, afin d’assurer un calcul statistique précis et permettre une interprétation robuste des résultats.
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) les prélèvements de sang seront réalisées sous anesthésie à Isoflurane et après application d'un collyre; iii) les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie légère; iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux; vi) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure. vii) pour les procédures 1 et 3, les animaux serons surveillés et pesés quotidiennement (mêmes jours fériés et week-end) après infection.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris WT (fond C57Bl/6J), des souris F5 (transgénique pour le récepteur à l’antigène des lymphocytes T et spécifique du peptide NP68) et des souris invalidées pour NCOA7 (fond C57Bl/6J CD45.2) seront utilisées. Adultes de 6 semaines à 3 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (6 à 8 semaines) et certains animaux seront gardés jusqu’à 50 jours après infection afin d’étudier la mise en place des réponses immunitaires mémoires.
Compréhension des mécanismes de transmission virale par les femelles moustiques après infection lors d’un repas artificiel, préparé avec des globules rouges de lapin.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
12 lapins vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec des prises de sang à l'oreille jusqu'à quinze millilitres par semaine. Leur sang sert à nourrir artificiellement des moustiques femelles pour étudier la transmission d'arbovirus. Le porteur décrit les lapins comme des "fournisseurs de sang" intégrés une fois leur poids suffisant. Il indique que des alternatives à leur mise à mort sont à l'étude.
Objectifs
Dans les écosystèmes naturels, les moustiques femelles zoo-anthropophiles prélèvent le sang de vertébrés (oiseaux, mammifères, humains) avec lesquels elles cohabitent. Le sang leur fournit les substances nutritives indispensables à la maturation de leurs œufs. Ces sources de sang peuvent être porteurs d’arbovirus (Dengue, Chikungunya, Fièvre jaune, West Nile, etc....) qui seront alors transmis à l’insecte. Après passage de la barrière du tube digestif, l’arbovirus se propage et se multiplie dans tout le corps de la femelle de moustique. Si les glandes salivaires sont infectées, la femelle pourra transmettre le virus lors de ses prochains repas de sang. L’issue de l’infection dépendra de de nombreux facteurs intervenant dans les interactions virus/vecteurs. Pour étudier, comprendre et contrôler ces maladies à transmission vectorielle, nous devons mimer au mieux les conditions naturelles d’infection des populations de moustiques.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à mimer l’infection des moustiques en leur offrant un repas « artificiel » se présentant sous la forme d’une capsule contenant des globules rouges de lapin et une suspension virale, le tout maintenu à 37°C. Ce système nous affranchira d’utiliser des animaux que nous aurions dû infecter par injection intradermique avec une certaine dose (à définir) de particules virales. Les moustiques sont alors présentés à l’animal infecté (ayant atteint son pic de virémie ; temps et niveau à définir) pour assurer l’infection du moustique. A court terme, ce système d’infection « artificiel » permettra davantage de flexibilité dans nos évaluation : titres viraux, temps de contact, coinfections… À long terme, il nous permettra de maintenir une reproductibilité de nos expériences, ce qui facilitera les comparaisons selon les combinaisons virus-moustique.
Procédures
Les lapins seront soumis à une prise de sang artériel auriculaire au maximum une fois par semaine et non systématique. Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie.
Impact sur les animaux
Le prélèvement est effectué à l’oreille. Le lapin est maintenu en contention dans un sac souple, équipé de scratchs, afin de l’adapter à sa taille, sans risque de blessure. Les lapins font au minimum 3 kg et sont pesés avant chaque prélèvement pour vérifier qu’ils n’ont pas perdu de poids. Leur comportement dans la cage est observé avant la préhension. Les lapins ne seront prélevés qu’une fois par semaine et le volume de sang ne dépassera pas 15 mL maximum.
Devenir
En fin de procédure les animaux sont mis à mort. Ils ne peuvent pas a priori être utilisés à d’autres fins de recherche mais des alternatives à la mise à mort sont en cours d’étude.
Remplacement
Le système d’infection artificielle sur membrane nous permet de contrôler tous les paramètres du repas sanguin pris par la femelle moustique (choix du/des virus, charge virale). La prise d’un repas de sang, indispensable à la femelle moustique pour pondre, est la voie d’entrée naturelle du virus dans l’insecte.
Réduction
Le nombre de lapins nécessaires a été décidé en fonction de nos besoins en globules rouges en limitant le nombre de prélèvements à une prise de sang/lapin /semaine en période d’activité́ maximale.
Raffinement
Après le prélèvement, une réhydratation cutanée avec le sérum physiologique NaCl 0,9% est réalisée. Le lapin est surveillé jusqu’ à arrêt du saignement au point de prélèvement avant d’être ramené dans sa cage. L’expérimentateur vérifie les bonnes conditions d’hébergement, enrichissement et alimentation. La constatation du moindre problème de santé (blessure, amaigrissement, prostration) est signalé au zootechnicien ainsi qu’au veterinaire responsable du Bien-Être Animal. Le recours à un appareillage de gorgement artificiel témoigne de la prise en considération du principe de remplacement et raffinement en évitant l’infection d’animaux vivants par des virus et leur exposition à des moustiques hématophages. Nous utilisons alternativement un des 4 lapins comme source de sang frais, à partir duquel on prépare la suspension de globules rouges soigneusement « lavés ». Cela évite que ces lapins ne développent une anémie. Les valeurs des constantes sanguines sont, ce faisant, maintenues à des valeurs physiologiques témoignant des processus de reconstitution de leur moelle hématopoïétique. En moyenne, un lapin est prélevé deux fois par mois. Un registre (cahier de laboratoire) est conservé dans le laboratoire principal de notre unité sur lequel sont notés pour chaque lapin : la date du prélèvement, le poids de l’animal, le volume de sang prélevé́ et le nom de l’expérimentateur. Cette traçabilité nous permet de gérer la répartition des prélèvements et diminuer les nuisances infligées par lapin.
Choix des espèces
Le choix du lapin se justifie par la possibilité́ d’hébergement à l’animalerie de notre institution et par son volume total de sang (150-250 mL pour un lapin de plus de trois kilogrammes) suffisant pour nos besoins (2 à 16 mL) sans nuire à la santé de l’animal. Les lapins sont commandés chez le fournisseur à l’âge de 85-90 jours (2,7-3 kg). Après adaptation à leur nouvel environnement, ils sont intégrés comme fournisseur de sang quand leur poids atteint 3 kg.
Etudes des interactions hôtes-pathogènes appliquées à la recherche de nouveaux types d’antituberculeux.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
6704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1676 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose, parfois co-infectées par le SARS-CoV-2, la grippe ou le pneumocoque, et reçoivent des composés par gavage jusqu'à sept jours par semaine. Le porteur indique que les surinfections peuvent provoquer des signes cliniques graves pouvant aller jusqu'à la mort des animaux. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'infection et revendique la souris comme un "modèle incontournable".
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose, et d'évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. L'intéraction entre la tuberculose chronique et d'autres pathogènes pulmonaires étant encore mal caractérisée, un autre objectif de ce projet sera de caractériser et d'étudier l'évolution de la co-infection (tuberculose et agents pathogènes viraux/bactériens pulmonaires, tels que les virus SRAS-CoV-2 et Influenza H3N2/H1N1 et les bactéries Streptococcus pneumoniae Sérotype 1) dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,5 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2020 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19 (et avant le sida). Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent (i) à identifier de nouveaux types d'antituberculeux efficaces sur les souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis, (ii) à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec ces mycobactéries, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’infection, et (iii) à caractériser et étudier l'impact d'une co-infection pulmonaire chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage ou voie intrapéritonéale ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale ou intranasale peut également être utilisée 3 à 4 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes pulmonaires est réalisée par voie intranasale sous anesthésie ou par voie intraveineuse ou sous cutanée sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis, puis (ii) un des autres pathogènes pulmonaires étudiés. Pour l'imagerie, les animaux sont anesthésiés et placés dans une cassette de contention pendant une durée de 5 minutes pour permettre l'acquisition des images (1 à 2 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés, pouvant aller jusqu'à entrainer la mort des animaux.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire active.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires. Une approche par imagerie du petit animal, sous anesthésie, sera développée au sein du Laboratoire de Haute Sécurité pour permettre le suivi de l'infection d'un seul groupe d'animaux au cours du temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Nous espérons à terme que cela puisse réduite le nombre d'expériences.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l''infection ou le gavage. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des anmaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux (Balb/C et C57BL/6, wild-type et KO) utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Evaluation d’un agent de contraste dans l’amélioration de la fertilité féminine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles sont vasectomisés par une chirurgie de trente minutes puis gardés huit mois, les femelles reçoivent des stimulations hormonales, un agent de contraste par voie vaginale et une insémination, pour comprendre comment ce produit améliore la fertilité. Le porteur indique que l'agent de contraste iodé peut provoquer chez les femelles une réaction allergique avec difficulté respiratoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne permet d'obtenir des gamètes fécondables et que l'étude de la fertilité ne peut se passer d'animaux reproduisant les atteintes humaines.
Objectifs
L'infertilité touche près de 15% des couples en age de concevoir. Les causes de cette infertilité peuvent être multiples et touchent aussi bien les hommes que les femmes. L'une des causes féminines est l'imperméabilité des trompes de Fallope, ce qui aura pour conséquence d'empecher le passage des spermatozoides vers l'oviducte et donc la fécondation ovocytaire. Afin de tester cette hypothèse, les femmes subissent une hystérosalpyngographie qui consiste en l'injection d'un agent de contraste monitoré sous rayons X et qui permet de visualiser l'utérus et les oviductes. Cet examen médical peut se faire à l'aide d'agents de contraste soit huileux (oil-soluble contrast media dénommé ci-après OSCM), soit soluble dans l'eau (water-soluble contrast media, ci-après WSCM). Une amélioration du taux de grossesse a été montrée lorsque les patientes sont traitées avec le OSCM (39.7%) vs le WSCM (29,1%). Cette amélioration est visible jusqu'à 6 mois après l'hystérosalpyngographie. Le but de notre projet est donc de comprendre dans un modèle murin à quel niveau un OSCM agit : épithélium utérin/oviductal, implantation embryonnaire, physiologie spermatique et améliore ainsi la fertilité. La souris étant un mammifère hyperfertile, il faudra donc dans un premier temps générer un modèle sous-fertile puis analyser si un traitement avec un OSCM rétablit une fertilité normale.
Bénéfices attendus
A court terme, cela permettra de comprendre comment un OSCM améliore la fertilité et sur quel type cellulaire il agit. A plus long terme, une fois la cible déterminée, de nouvelles molécules pro-fertilisantes pourront être developpées et proposées aux patients.
Procédures
Chirurgie sur les males pour la vasectomisation (30 minutes par souris, une chirurgie par souris). Injection intra-péritoneale pour les stimulations hormonales, les anesthésies et les analgésies (2 à 4 par souris femelle). Injection avec l'agent de contraste par voie vaginale (1 par souris femelle). Insémination intra-utérine ou tranfert d'embryon (1 par souris femelle)
Impact sur les animaux
La stimulation hormonale et l'insémination des souris femelles nécessitera leur préhension, de même que l'anesthésie et l'analgésie des souris males et femelles. Les males ayant une vasectomie pourront perdre du poids. Les souris femelles traitées au lipiodol pourraient faire une réaction allergique (difficulté respiratoire, rougeur) due à la présence d'iode dans le produit de contraste.
Devenir
Les males vasectomisés sont maintenus en vie pendant 8 mois puis euthanasiés. Nous ne pouvons réutilier les femelles traitées au lipiodol car nous ne connaissons pas la durée d'action du composé.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male).
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte (ANOVA, test de Tukey's). Lorsque les gamètes sont utilisées en fécondation in vitro, la stimulation hormonale des souris permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, cela permet de réduire le nombre de souris femelles. Plusieurs fécondation in vitro ou insémimation intra-utérine seront réalisées avec les spermatozoides d'un seul male, ce qui permet de réduire le nombre de males utilisés dans l'étude. Les males vasectomisés serviront tout au long du projet.
Raffinement
Les souris seront placées en conditions de température régulée, ad libitum. Afin de limiter l'angoisse et le stress, les souris sont hébergées à plusieurs par cage. Pour qu'elles puissent interargir avec leur environnement, faire leur nid et se cacher, des rouleaux et du papier sont ajoutés lors du change. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne, le traitement au lipiodol ou les anesthésiants/analgésiants. Le sacrifice des animaux sera effectué dans une pièce différente de celle de l'hébergement. Suite aux inséminations, les femelles seront placées individuellement avec un male vasectomisé pendant 24h puis rassemblées à raison de 2 souris par cage. Les males ne pouvant être rassemblés entre eux, ils seront replacés avec une femelle afin qu'ils ne restent pas isolés.
Choix des espèces
L'étude des mécanismes de la spermatogenèse et de l'ovogenèse, ainsi que de l'infertilité nécessite l'utilisation d'animaux car 1/ ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. Il n'existe pas de système de culture cellulaire permettant d'obtenir des gamètes viables. 2/ La fécondation nécessite l'obtention de gamètes matures, qui ne peuvent être obtenus que sur des animaux 3/ l'étude des phénotypes d'infertilité humaine nécessite des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients Il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, aucun modèle alternatif ne permet encore de reproduire en globalité, la complexité de la gamétogenèse et les impacts sur la fertilité en général et la fécondation en particulier. Il n'existe pas de modèle utérin in vitro assurant toute la complexité d'interaction entre la muqueuse utérine et l'embryon. Les souris males seront utilisés à maturité sexuelle soit 8-9 semaines. Les souris femelles seront utilisées à maturité sexuelle soit à partir de 6 semaines et pas au delà de 12 semaines car elles répondent alors moins bien à la stimulation hormonale.
Modèles murins pour comprendre les fonctions de p53 dans la moëlle osseuse.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
174 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des prélèvements sanguins tous les deux mois pendant un an après inactivation d'un gène dans leur moelle osseuse, pour étudier le rôle de la protéine p53 dans la production des cellules du sang. Le porteur indique que cette inactivation peut provoquer une insuffisance médullaire ou une leucémie, avec un point limite déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie la souris de "modèle incontournable" et juge son usage "indispensable", les retombées thérapeutiques n'étant évoquées qu'au conditionnel.
Objectifs
La moëlle osseuse est un tissu situé au centre des os où tous les différents types de cellules du sang sont produites : Les globules rouges (qui transportent l’oxygène), les globules blancs (qui protègent des infections) et les plaquettes (qui s’accumulent lors d’une blessure pour arrêter une hémorragie). Ces cellules sanguines ont une durée de vie allant de quelques jours à quelques mois et doivent être continuellement renouvelées tout au long de la vie. Le processus de renouvellement des cellules sanguines est appelé hématopoïèse. Ce processus est finement régulé. Un défaut d’hématopoïèse peut être à l’origine d’une anémie causée par un défaut de production des globules rouges et de transport d’oxygène ou d’une thrombopénie causée par un défaut de production des plaquettes responsable de défauts de cicatrisation et d’hémorragies. A l’inverse une trop grande production de plaquettes peut créer des caillots de sang qui vont obstruer la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Les données du projet permettront peut-être aussi d’identifier une nouvelle stratégie thérapeutique dans les syndromes d’insuffisance médullaire associés à une hyperactivation de p53.
Procédures
Pour assurer le suivi des animaux, des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile tous les deux mois sur une durée maximale d’un an
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiellement associés à l’inactivation de notre gène d’intérêt dans l’ensemble de l’organisme sont inconnus. Les effets indésirables possibles de son inactivation ciblée dans la moëlle osseuse sont le développement soit d’une insuffisance médullaire soit d’une leucémie.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des analyses in vitro réalisées au préalable sur des lignées cellulaires murines et humaines ont révélé que la protéine p53 inhibe l’expression de plusieurs gènes fréquemment inactivés dans les syndromes d’insuffisance médullaire. Ce mécanisme est indirect et dépend du recrutement sur l’ADN d’un complexe protéique ayant un rôle répresseur sur l’expression des gènes. Ces résultats suggèrent la possibilité de prévenir l’insuffisance médullaire en atténuant l’activité du complexe répresseur induit par la suractivation de p53. Le projet a pour but maintenant d’étudier chez la souris, organisme vivant intégré et autonome, les conséquences physiologiques d’une perte de fonction de ce complexe répresseur. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Les stratégies d’accouplement sont optimisées afin d’obtenir le maximum de souris de génotype adéquat et ainsi réduire l’élevage. Pour chaque souris euthanasiée, un maximum d’organes est prélevé et les tissus sont congelés et/ ou fixés pour analyses ARN, protéines et histologiques. Dans les différentes procédures, le nombre d’animaux est suffisant pour mesurer des différences significatives.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet peuvent avoir un phénotype dommageable. Afin d’éviter toute souffrance et/ou détresse, une grille d’évaluation de l’état de l’animal sera appliquée pour définir le point limite à partir duquel l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Grâce à sa parenté biologique avec l’Humain (génome murin/humain, physiologie) et à la possibilité de modifier son génome, la souris est un modèle incontournable pour la compréhension des mécanismes qui contribuent au développement des syndromes d’insuffisance médullaire prédisposant aux cancers. Les conséquences de l’inactivation de notre gène d’intérêt in vivo sont totalement inconnues, c’est pourquoi une analyse phénotypique chez l’embryon et l’adulte sera réalisée. Les conséquences de l’inactivation de notre gène d’intérêt dans le lignage hématopoïétique sont également inconnues. Le suivi d’une éventuelle anémie ou hémopathie maligne sera réalisé chez des animaux adultes.
M. tuberculosis et le modèle murin: essais d’efficacité́ de médicaments contre une épreuve virulente induite par des bacilles de la tuberculose chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, avec une perte de poids pouvant conduire à la mort et une mise à mort à 20 % du poids perdu, avant le prélèvement des poumons et de la rate. Le porteur situe le projet dans un consortium européen et revendique un "besoin" de générer un maximum de données. Il affirme que les essais précliniques reposent sur le recours à l'"organisme entier".
Objectifs
Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.
Bénéfices attendus
Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.
Procédures
1. L'infection des souris par des souches virulentes de bacilles tuberculeux est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours par semaine pendant 4 à 8 semaines. Il y a 1 gavage par jour par souris. Le nombre de gavages total par souris au cours de l’expérience variera selon qu’une souris soit un contrôle du niveau d’infection ou bien reçoive un traitement de 8 semaines, ou encore permette d’obtenir des données pharmacodynamiques à des stades intermédiaires, par conséquent de 0 à 40 gavages. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués au niveau de la queue pour l'étude de la biodisponibilité́ des composés. Un faible volume de sang (~ 30 µl) sera prélevé au niveau d’une incision faite sur la veine caudale. L’animal, vigile, est pour cela placé dans un dispositif l’immobilisant et ne laissant dépasser que la queue. Une pression est ensuite effectuée au niveau de l’incision avec une compresse imbibée d’alcool pour stopper le saignement. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – pour chaque souris sélectionnée pour l’étude pharmacologique. Il s’agit d’un acte rapide qui doit prendre 1 à 2 min. 4. Pour l’analyse de biomarqueurs, des prélèvements de sang seront effectués par ponction cardiaque sur animaux anesthésiés avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Sont concernés l’ensemble des animaux de l’expérience (maximum 120). Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.
Devenir
Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.
Remplacement
Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.
Réduction
Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.
Raffinement
Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.
Choix des espèces
Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.
Impact du ciblage des cellules sénescentes sur la longévité et l’espérance de vie en bonne santé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Laissées vieillir jusqu'à 18 à 24 mois, elles reçoivent un anticorps ou un composé sénolytique par injection ou gavage tous les quinze jours, avec prélèvements de sang et d'urine, pour étudier l'élimination des cellules sénescentes dans le vieillissement. Le porteur anticipe la mort d'environ 20 % des animaux avant la fin, et la mise à mort de ceux qui perdent 15 % de leur poids. Il justifie le recours à la souris par la nécessité d'étudier un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes dans le vieillissement, les maladies liées à l’âge et le cancer. Ce projet est basé sur les résultats obtenus au sein du laboratoire qui démontrent un lien entre la surexpression d’un glycolipide à la surface des cellules pulmonaires sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer l’effet du blocage de glycolipide par un anticorps sur la réponse immunitaire et le développement de maladies liées à la senescence chez la souris âgée. L’interaction et la communication entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiées pour établir le mécanisme par lequel ces cellules exercent des pressions d’adaptation mutuelles observée in vitro. Le développement et l’avancement de diverses maladies liés à l’âge (Fibrose pulmonaire, fibrose rénale, fibrose hépatique, arthrose, ostéoporose, cancer) seront également suivis afin d’évaluer l’effet thérapeutique de l’anticorps comparé à un sénolytique connu (une combinaison de molécules éliminant les cellules sénescentes). Nous voulons évaluer si cette approche immunothérapeutique pourrait augmenter la durée de vie des souris ainsi que diminuer leur état de fragilité générale. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surfaces associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âges incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement mais également de déterminer le rôle et l’importance des point de contrôles immunitaires associés à la sénescence dans l’élimination des cellules sénescentes. Nous nous attendons également à comprendre si une approche immunothérapeutique visant ce ganglioside pourrait être envisagée afin de traiter et prévenir les maladies liées à l’âge et la comparer à un traitement déjà connu.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Administration de l’anticorps ou le sénolytique de référence ou les solutions contrôles (PBS ou isotype contrôle) par injection intrapéritonéale ou par gavage, pour tous les animaux, une fois tous les 15 jours pour 6 injections/gavages; durée d'environ 3 minutes par animal par injection/gavage - Pesée (toutes les semaines pour tous les animaux; durée moins d'une minute par pesée - Prélèvement sanguin (200µl une fois par mois pour tous les animaux) ; durée d'environ 5 minutes de manipulation (dilatation de la queue puis incision etrécupération, coagulation par pensement coagulant) par animal par injection - Collecte d’urine (tous les mois pour tous les animaux) sur animal vigile; durée moins d'une minute par anaimal - Imagerie µCT sur animal anesthésié (5 par groupe), durée d'environ 7 minute par animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype âgé est un phénotype dommageable car il peut induire l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 24 mois nous nous attendons à avoir 20% de perte d’animaux par mort « naturelle ». Une feuille de score adaptée au vieillissement sera faite pour suivre le bien-être des animaux. On notera que les souris seront systématiquement pesées chaque semaine. Une baisse de 15% du poids de la souris par rapport à la précédente pesée conduira à sa mise à mort.
Devenir
Pour les 2 procédures, nous voulons déterminer l’état physiologique de l’animal et sa durée de vie. Pour cela, nous devons analyser sa survie globale sans souffrance et mettre à mort tous les animaux qui ne seraient pas décédés de causes naturelles pour pouvoir prélever les organes et les analyser en histologie, cytométrie et RNAseq mais aussi de tester les capacités fonctionnelles des cellules ex vivo. L’analyse concernant les tissus ne peut se faire autrement que ex vivo. La mise à mort de l’animal est donc nécessaire afin de pouvoir prélever les organes. Un maximum de tissus seront récupérés afin que de tirer le plus d’information possible de cette expérience. Ainsi, l’objectif scientifique de ce projet nécessite la mise à mort (ou la mort naturelle) de tous les animaux.
Remplacement
La sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Notre projet vise à étudier les mécanismes biologiques à l’origine du vieillissement et en particulier à l’origine du vieillissement pathologique. Nous voulons comprendre comment un organisme peut vieillir et déterminer si de nouvelles stratégies thérapeutiques peut empêcher le vieillissement pathologique et l’incidence de nombreuses maladies liées à l’âge. Ces mécanismes reposent sur de nombreuses interactions entre différentes cellules telles que les cellules âgées dites « sénescentes » ou les cellules immunitaires mais également sur la communication entre différents organes. À la vue de la complexité des mécanismes étudiés aucun modèle in vitro ou synthétique ne peut mimer le niveau de complexité de ces interactions ni remplacer l’étude sur l’animal. Seul l’analyse au niveau d’un organisme vivant pourra nous permettre de déterminer si le ciblage des cellules sénescentes par notre anticorps permet de limiter la présence des cellules sénescentes dans les tissus, d’évaluer l’état d’activation du système immunitaire, les conséquences sur l’incidence de maladies liées à l’âge, l’effet sur la longévité et sur l’espérance de vie en bonne santé. En revanche, lorsque les mécanismes principaux seront identifiés, leur étude mécanistique sera réalisée le plus possible par des méthodes de remplacement en réalisant des expériences in vitro de coculture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre minimum de souris pour les 2 approches expérimentales (longévité globale et vieillissement en bonne santé). L’ensemble du projet a donc été conçu pour REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance statistique robuste. Pour cela nous avons utilisé 3 approches complémentaires. - Tout d’abord une analyse complète des données de la littérature sur les agents sénolytiques pour connaitre la taille des effets biologiques et connaitre les nombres d’animaux et les effets statistiques déjà observés. - Ensuite, nous avons choisi de coupler nos analyses avec un suivi longitudinal des animaux par utilisation de l’imagerie par scanner (microCT ; technique équivalente au PET-Scan utilisé en clinique pour l’évaluation de la fibrose chez l’homme mais adaptée au petit animal). Ceci a pour effet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en procédant à un suivi individualisé de chaque souris. - Nous avons « croisés » les contrôles pour les 2 procédures. Ainsi, le groupe contrôle recevra 6 IP d’anticorps isotype contrôle et 6 gavages contrôles, le groupe expérimental D+Q recevra 6 gavages de D+Q et 6 IP d’isotype contrôle et enfin le groupe anti ganglioside recevra les 6 IP d’anticorps anti ganglioside et 6 gavages contrôles. Ceci est exactement identique pour les 2 procédures. Cette stratégie a permis de supprimer complètement un groupe contrôle et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. - Nous réaliserons les 2 procédures en parallèle puisque les animaux sont issus du même lot chez le fournisseur et seront stabulés initialement et traités exactement de façon identique. Ceci permettra de comparer les résultats entre les 2 procédures, d’utiliser les mêmes animaux contrôles de 18 mois (les 15 animaux t0) et donc de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés en évitant de reproduire des contrôles inutilement. - Enfin, nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif nécessaire pour notre étude grâce au logiciel Gpower avec un test ANOVA oneway de puissance statistique de 0.8 associé à un effet taille moyen calculé sur les données déjà publiées d’effet de sénolytique (0.5) pour p≤0.05.
Raffinement
Les procédures de ce projet comprennent les éléments de raffinement suivants : Suivi quotidien des animaux, à l’aide d’une fiche de suivi appuyée par une grille de score clinique comprenant des points limites précoces et adaptés. Les animaux sont hébergés dans des pièces spécifiquement dédiées aux expériences sur le vieillissement permettant d'exercer un suivi plus précis et de limiter le stress et les risques de contamination en réduisant le passage dans ces zones. La conservation d’une cohésion sociale durant la durée de vie de l’animal. L’ajout d’éléments supplémentaire d’enrichissements incluant des maisons à ronger et des twists pour modifier la nidification en complément de l’enrichissement standard incluant des maisons rouges solides et des cotons carrés. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de les habituer et de limiter le stress lors des procédures. Les protocoles d’imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal sont menés sous anesthésie gazeuse. L'ensemble de ces mesures de raffinement visent à assurer le bien-être des animaux et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter toute reproduction expérimentale inutile.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix avec une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court (animal âgé à 18 mois). Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, l’avancement des maladies et l’expression du ganglioside. La physiopathologie des tissus est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour en tirer des données exploitables. La souris est le seul modèle accessible pour ce genre d’étude afin de répondre au questionnement scientifique de ce projet. Des souris âgées de 18 mois au début des expérimentations seront utilisées. Voulant étudier un large panel de maladies liées à l’âge et à la sénescence, le modèle le plus pertinent est donc d’utiliser des souris en vieillissement, soit ici 18 mois d’âge équivalent à 60 ans chez l’Homme. Les deux procédures décrites ici utiliseront donc des animaux au même stade de développement. Les données de la littérature montrent que certains phénotypes liés à l’âge émergent à partir de 12 mois mais que leur incidence est significativement plus élevée à partir de 18 mois. Pour analyser les capacités thérapeutiques de l’anticorps anti ganglioside et les conséquences de celui-ci sur l’émergence de ces maladies liées à l’âge et la longévité des animaux, nous allons utiliser donc des souris adultes âgées de 18 mois. Ceci nous permettra d’étudier comment le traitement fonctionne dans un organisme déjà vieillissant. D’autre part, en démarrant l’étude avec des animaux issus des mêmes croisements et directement âgés, en provenance du même fournisseur et avec un statut sanitaire SOPF très contrôlé, nous limiterons les effets de variabilité expérimentale.
Analyse des cascades moléculaires du développement de la crête neurale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
200 xénopes femelles vont être utilisées, réutilisées et non tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une stimulation hormonale pour produire des ovocytes, jusqu'à trois fois par an sur une période reproductive de quinze ans, sans autre geste. Le porteur mentionne par ailleurs que les mâles sont tués pour prélever leurs testicules destinés à la fécondation in vitro, sans que ces mises à mort soient comptées dans le projet. Il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" faute de lignée cellulaire et d'ovocytes commerciaux.
Objectifs
La crête neurale (CN) est une population cellulaire spécifique de l’embryon des Vertébrés, qui donne naissance à différentes structures telles que le système nerveux périphérique, les cellules pigmentaires, les os et cartilages de la face et du crâne. Des anomalies du développement ou de fonctionnement de la CN sont responsables d’un grand nombre de syndromes ou malformations néonataux. De même, certains cancers résultent de la transformation tumorale de cellules issues de la CN. L’étude des mécanismes qui contrôlent la formation de la CN et sa différenciation est donc cruciale pour en comprendre les dérégulations. De plus, précocement dans l’embryon, les cellules de la CN subissent un processus appelé « transition épithelio-mésenchymateuse (TEM) », qui leur permet de migrer à travers l’embryon vers de multiples organes ou tissus cibles, où elles se différencient en cellules spécifiques. La TEM est un mécanisme général complexe, permettant à des cellules migrer en petits groupes ou de devenir des cellules migrantes individuelles et c’est ce processus que l’on retrouve lors de la formation de métastases. La CN est donc un modèle de choix pour étudier le contrôle de la TEM, comprendre comment ce phénomène est activé et régulé dans l’embryon et comparer ces régulations aux phénomènes de TEM tumorale. Le projet proposé concerne l’analyse des molécules qui contrôlent le développement de la crête neurale et notamment la mise en place de la TEM. Ce programme tire parti d’outils moléculaires sophistiqués créés spécifiquement chez l’embryon d'amphibien. Le projet utilisera des embryons de Xenopus laevis.
Bénéfices attendus
Xenopus laevis, espèce tétrapode non mammifère, est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés en général car ces mécanismes sont fortement conservés évolutivement. De plus cette espèce est évolutivement plus proche des mammifères que le poisson téléostéen. Les études réalisées à partir de ce modèle permettent de mieux comprendre les processus développementaux des modèles tétrapodes mammaliens dont l’homme, comme ceux des autres vertébrés. En outre, l’analyse du génome de Xenopus montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont des orthologues chez Xenopus laevis et tropicalis. Notre projet permet donc d'identifier des mécanismes moléculaires, cellulaires et tissulaires qui éclairent les mécanismes d'induction et de diversification cellulaires au cours du développement et des cancers, ainsi que les migrations cellulaire normales et pathologiques (métastases, fibrose). Ces recherches éclairent directement la compréhension des malformations congénitales et des cancers ainsi que, à terme, les stratégies de diagnostique et de prise en charge des patients. Le modèle amphibien présente de nombreux avantages techniques tels que la facilité d’accès à ses ovocytes (ponte externe, conservation des femelles), l’accessibilité à l’expérimentation dans le milieu de culture des embryons et l’abondance du matériel d’expérimentation (milliers d'œufs par ponte). L’utilisation de cette espèce permet donc de réduire le nombre de femelles adultes utilisées et de remplacer l’emploi de femelles mammifères.
Procédures
Injection sous cutanée d’une substance non toxique et indolore en une seule administration sur animaux vigiles tous les 4 mois.
Impact sur les animaux
Les femelles seront utilisées uniquement pour la production d’ovocytes. En dehors de la stimulation hormonale, les animaux ne subiront aucun geste. Aucune nuisance n’est donc attendue ici.
Devenir
les femelles retournent en élevage dans les animaleries.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité pour les raisons suivantes : - il n'existe pas de lignée cellulaire immortalisée de cellules de CN, nécessitant de préparer des cellules primaires issues d'embryons ; de plus les analyses en culture ne donnent que des réponses incomplètes des mécanismes in vivo - les analyses in vivo sont indispensable à l'analyse des signalisations endogènes et des migrations cellulaires - il n’existe pas de solution commerciale pour la fourniture d’ovocyte. - le but étant d'étudier le développement des cellules de la crête neurale et la TEM in vivo, il est nécessaire que cela se fasse à l'échelle de l'organisme
Réduction
Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet, nous prenons en compte que : - Nos analyses fonctionnelles sont restreintes aux stades embryonnaires antérieurs à la forme larvaire autonome. - Les femelles ont une période reproductive longue (15 ans et plus), et peuvent donc être induites à pondre de nombreuses fois pendant cette période. Ceci permet donc de restreindre le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, l’induction hormonale de la ponte constitue la seule méthode pour obtenir en grande quantité des embryons. De plus le recours à la fécondation in vitro permet d'obtenir le développement synchrone des embryons et des stades précis, en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques (tests de conformité à un standard). Il s'agit de la seule façon d’obtenir des ovocytes matures de manière non invasive (sans chirurgie). - De plus, bien que le sacrifice d’animaux qui n’ont subi aucun geste expérimental et qui ne présentent pas de phénotype dommageable ne nécessite pas d’autorisation de projet, il est à noter que les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles sacrifiés.
Raffinement
Dans le but de réduire le plus possible toute douleur, souffrance ou stress, nous utilisons les femelles par roulement. Nous limitons les stimulations hormonales à 3 par an (une tous les 4 mois).
Choix des espèces
L'amphibien Xenopus laevis est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique-clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Le génome est séquencé. Nous disposons à présent des génomes pour deux espèces : X.tropicalis et X.laevis et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont des orthologues chez Xenopus laevis ou tropicalis. X.laevis est un modèle de choix en biologie du développement. En effet, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire. Les ovocytes sont récupérés par pontes externes (i.e. par une procédure non invasive) qui peuvent être obtenues toute l'année après stimulation hormonale. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses d’embryologie expérimentale dès la fécondation et une observation non-invasive à tous les stades. Tout comme le poisson zèbré, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Il s’agit d’animaux adultes ayant atteint la maturité sexuelle pour qu’ils puissent se reproduire.
Exploration fonctionnelle des différences sexuelles dans la modulation de la douleur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent selon les groupes une chirurgie sous anesthésie ou une injection dans la patte de carraghénane ou de zymosan pour induire une douleur inflammatoire, neuropathique ou post-opératoire, puis des tests de sensibilité mécanique et thermique (Von Frey, Hargreaves), avant mise à mort au CO2. Le porteur décrit une hypersensibilité "de courte durée et réversible" mais reconnaît une perte de poids et une mobilité réduite après chirurgie. Les bénéfices tiennent en une phrase, développer "de nouvelles stratégies thérapeutiques", et il affirme que l'expérimentation sur souris est "indispensable".
Objectifs
Récemment, nous avons pu identifier des différences sexuelles dans la récupération post-lésionnelle de plusieurs modèles de douleur. Afin de comprendre la physiologie de la douleur, des études comportementales seront réalisées. En effet, le comportement est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cerveau. Notre étude nécessite donc l’utilisation de souris adultes génétiquement modifiées (mâles et femelles) sur lesquelles des tests comportementaux de sensibilité mécanique et thermique, en conditions normales et pathologiques devront être réalisés (inflammatoire, neuropathique et post-opératoire). L’hypersensibilité mécanique et thermique induite lors de la mise en place des conditions pathologiques est de courte durée et réversible dans le temps (sauf procédure 2).
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude pourraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées aux hommes et aux femmes.
Procédures
Pour les chirurgies (procédures 1 et 2), les souris seront sous anesthésie générale (soit 88 animaux au total). Chaque souris ne subira qu’une seule chirurgie et donc une seule anesthésie (chirurgie de courte durée donc une seule injection suffit). Pour les modèles inflammatoires, l’injection intraplantaire de Carraghenane ou de Zymosan ne sera réalisée qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Il est possible qu’après la chirurgie il y ait une perte de poids. D’autre part, une mobilité réduite est engendrée lors des deux premières procédures. Ces effets dureront jusqu’à la fin du comportement douloureux (voir pour chaque procédure).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 (concentrations croissantes). En effet, ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire est de comprendre comment et pourquoi une personne a mal. Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Il est donc nécessaire de réaliser une étude comportementale afin d’étudier l’intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie jusqu’au cerveau. Cette approche globale est d’autant plus nécessaire que ces différences comportementales mâle/femelle peuvent émaner de différences génétiques. Celles-ci peuvent impacter la circuiterie comme la signalisation moléculaire à différents niveaux de l’intégration de l’information sensorielle. Ainsi, l’expérimentation sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Pour les tests en « time course », les résultats obtenus seront analysés en utilisant la Two-way Repeated Measure ANOVA, avec comme facteurs le génotype, le sexe et l'évolution au cours du temps. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce projet nécessitera au maximum 168 souris.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Avant les tests de Von Frey et de Hargreaves, les animaux sont habitués pendant 1h dans l’enceinte. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique est effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation sont mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.
Etude de la pathogénicité de la leptospirose dans les modèles animaux
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Hamsters dorés : 260
Gerbilles de Mongolie : 68
360 animaux non-humains, cobayes, hamsters dorés et gerbilles de Mongolie, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par injection de leptospires pour tester la virulence de souches bactériennes, l'infection provoquant prostration, poils hérissés et perte de poids, les individus moribonds étant mis à mort. Le sang et les organes sont prélevés après mise à mort par CO2. Le porteur affirme que seuls ces animaux développent des signes proches de la maladie humaine et qu'aucun autre modèle n'existe pour étudier la virulence.
Objectifs
Les mécanismes de virulence des leptospires pathogènes restent largement méconnus. Depuis quelques années, le laboratoire a développé des outils génétiques pour l’inactivation de gènes potentiellement impliqués dans la virulence de ces bactéries. Le seul moyen de tester pour la virulence de ces mutants est l’utilisation d’animaux : si un gène code pour un facteur de virulence, l’inactivation de ce gène par l’utilisation d’outils génétiques doit rendre ce mutant non virulent (les animaux survivent à l’infection). Le laboratoire a ainsi publié de nombreux articles sur la caractérisation de mutants non virulents et démontré le rôle de certains mécanismes comme la mobilité et la résistance aux stress, dans la virulence de ces bactéries. Nous envisageons aussi de déterminer les gènes dérégulés lors d’une infection chez la bactérie et l’hôte par des approches de transcriptomique. Le laboratoire peut aussi être amené à tester le caractère virulent de certaines souches cliniques isolées chez des patients présentant des formes plus ou moins graves de leptospirose. Ce projet a donc pour but de tester la virulence de souches de leptospires (mutants obtenus par manipulation génétique ou souches cliniques) et d’identifier les gènes ou voies induites lors d’une infection dans les modèles animaux sensibles (cobayes, hamsters ou gerbilles).
Bénéfices attendus
Les travaux menés jusqu’à maintenant à l’aide de mutants dans les modèles sensibles à la leptospirose ont permis d’identifier de nombreux facteurs de virulence, ce qui nous permet de mieux comprendre les mécanismes de la pathogénèse de la leptospirose. L’analyse transcriptomique de la bactérie et de son hôte permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes impliqués lors de l’infection. Enfin, ce projet permettra de mieux évaluer le degré de virulence de différentes espèces pathogènes ou de certaines souches cliniques. Ceci permettra de mettre en place des outils moléculaires pour la détection rapide de souches plus virulentes chez les patients. .
Procédures
L’infection se fera par injection intra-péritoneale d’une solution de bactéries dans l’animal (10 min). Le sang pourra aussi être prélevé par ponction cardiaque immédiatement après la mise à mort de l’animal (
Impact sur les animaux
Les animaux infectés par des souches virulentes présentent habituellement des signes caractéristiques à partir de J5 après l’infection (le délai peut -être plus long en fonction de la dose injectée ou de la nature de la souche de leptospires utilisée), notamment perte d’activité, prostration, poils hérissés et perte de poids.
Devenir
Les animaux utilisés lors des expériences seront mis à mort par inhalation de CO2. Ces animaux qui sont infectés avec des souches de leptospires potentiellement virulentes ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
La virulence des leptospires est très probablement multifactorielle (mobilité flagellaire, adhésion aux cellules, résistance aux stress, production d'hémolysines, reconnaissance de la surface des leptospires par le système immunitaire, etc) et seul l'animal permet d'étudier l'ensemble de ces mécanismes et leurs rôles au cours de l'infection. Cependant, pour l’étude de certains phénotypes comme l’adhésion des bactéries aux cellules de l’hôte, nous avons maintenant mis en place un modèle de cultures de lignées cellulaires afin d'étudier les interactions bactéries-cellules de l'hôte (notamment la capacité des leptospires à adhérer aux cellules et à traverser une couche monocellulaire). Des collaborations sont aussi envisagées pour utiliser ces modèles. Cependant, aucun modèle autre que celui des animaux existe pour l’étude de la virulence.
Réduction
On procèdera tout d'abord à une sélection rigoureuse des souches à tester dans les modèles animaux. Pour l'étude de la virulence d'un mutant (principale activité de l'unité), on ne sélectionnera que les mutants présentant une forte probabilité d'être atténués dans leur virulence (analyse du gène inactivé, étude préalable du phénotype du mutant in vitro, etc). On pourra regrouper le nombre de mutants à tester afin de le comparer à un seul groupe contrôle. Dans le cadre de l’analyse de la charge bactérienne, du transcriptome ou de la réponse immunitaire au cours de l’infection, on limitera les points de prélèvements à la phase précoce (J1 post-infection) et à la phase tardive (J3 et/ ou J6 post-infection).
Raffinement
A réception, les animaux resteront en cage 1 semaine avant toute intervention pour une bonne acclimatation. Les cages seront enrichies avec de l’aliment sous forme de gel, des cylindres en plastique et du coton. On pourra utiliser les chaufferettes et pratiquer la réhydratation sc avec le sérum physiologique. Une infection par les leptospires pathogènes entraîne chez les animaux sensibles (gerbilles, hamsters, cobayes) une prostration et les poils hérissés. Pendant la période de l'infection aigue chez l'animal (pour l'inoculation de 10e4-10e6 bactéries, la mortalité est maximale entre les jours 5 et 9 après l'infection), on procédera à deux visites dans la journée (matin et après-midi), y compris les week-ends et jours fériés, afin d'observer tous signes extérieurs (poils hérissés et prostration). Pour certaines souches virulentes, une perte de poids avant la mort (une perte de 10% de poids chez le hamster indique une leptospirose avancée et irréversible) est aussi observée. Dans ce cas, les animaux sont pesés quotidiennement. Les animaux moribonds seront mis à mort.
Choix des espèces
Cobaye, Gerbille et/ou Hamster : seuls ces animaux sont capables de développer la maladie avec des signes cliniques proches de la pathologie humaine, en particulier avec atteinte des organes tels que le foie, le rein et les poumons. L’inoculation de souches virulentes chez ces animaux par voie intra-peritonéale entraîne la mort des animaux infectés. L’application de points limites permettra de limiter la douleur. Pour les cobayes et hamsters, on privilégiera l'utilisation d'animaux âgés de 4 semaines; des animaux plus âgés peuvent être plus résistants à l'infection (maturité du système immunitaire). Ce n'est pas le cas pour les gerbilles, on pourra donc utiliser des gerbilles jeunes ou adultes.