Autre recherche fondamentale
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Utilisation de nouvelles nanoparticules dans deux modèles de cancer du pancréas chez la souris
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- Oncologie
Choisies pour leur immunité fortement réduite, qui facilite la prise de la tumeur greffée, 140 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, une injection intraveineuse de nanoparticules puis une séance d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Il s'agit d'une étude pilote, destinée à lever des verrous techniques avant un second dossier où le protocole thérapeutique sera détaillé. Le porteur qualifie la prise tumorale d'"indispensable" au projet et annonce, à la rubrique des bénéfices, une nanoparticule pour le traitement des glioblastomes, quand tout le reste du dossier porte sur le cancer du pancréas.
Objectifs
Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est : Hommes =environ 9% et Femmes = environ 10%. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lévera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement in fine de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des macrophages humains ou dans des cellules souches mésenchymateuses humaines qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisement, les NP particules utilisées seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour le projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement des glioblastomes. Cette partie courte nous aidera à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur en quantité suffisante pour une efficacité in vivo supplémentaire par activation par hyperthermie magnétique. Une deuxième étape sera ensuite réalisée, sur la base des résultats de l'étude pharmacocinétique/biodistribution pour planifier l'étude de l'efficacité thérapeutique, limitant les groupes expérimentaux.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions avec les durées moyenne - max : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales = 5-10 min /souris - injection IV molécule d'intérêt (véhicule, particule avec dose 1 ou dose 2 couplée aux macrophages ou cellules mesenchimateuse) = 10-15 min /souris - imagerie corps entier sous anesthésie gazeuse = 15-20 min / souris - mis à mort = 5-10 min / souris. Les souris suivront donc 1 intervention pour linoculation des tumeurs, 1 injection de la molécule et 1 imagerie suivie de la mise à mort.
Impact sur les animaux
D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Cette étude vise des tumeurs controlées et réduites. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des nanoparticules véhiculées dans les macrophages, cellules mesenchimateuses ou contrôle est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.
Devenir
Tous les animaux seront inclus dans cette procédure qui prévoit une mise à mort pour prélèvement d'organes à la suite de l'imagerie.
Remplacement
L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui même est une première étude pour valider la biodistribution de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers. Ayant eu cette validation, une suite est prévue une fois ces informations traitées pour l'étude des effets thérapeutiques avec la réduction des groupes expérimentaux.
Réduction
Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre l’évolution de la tumeur pour l’utilisation des nanoparticules dans les macrophages et les cellules mesecnhimateuses. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la litérature. Ces simulations ont été faites à l’aide d'un outil informatique.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de 4 individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite deux fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Cette surveillance inclut également un scoring avec des paramètres d’interaction sociale, associés à la perte de poids et motricité autour de l’évaluation du point limite. La procédure a été pensée de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés.
Choix des espèces
Concernant le choix des souris, nous nous intéressons aux souris qui sont immunodéficientes et fréquemment utilisées dans les modèles précliniques de cancérologie, en particulier pour greffes de cellules humaines. L'immunité de la souche utilisée est spécifique pour une réponse immunitaire très réduite et une très bonne tolérance, ce que améliore la prise tumorale, indispensable à ce projet. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.
« Imagerie métabolique cardiaque par TEP [11C]Palmitate et Spectroscopie du phosphore par RMN dans un modèle de rat diabétique de type 2 : évaluation de l’effet de la dapagliflozine » 2/2
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Deux injections de streptozotocine, quatre semaines de régime gras, un cathéter poussé dans une artère du cou pendant trois quarts d'heure à une heure : ce second volet du projet, réparti sur deux établissements, utilise 100 rats Wistar. La procédure est déclarée sans réveil, dans un protocole qui s'étend pourtant sur environ seize semaines. Le porteur décrit en effet une surveillance de la fréquence cardiaque et respiratoire "jusqu'au réveil complet" après les anesthésies, puis un suivi de cinq jours, ce qui suppose des animaux réveillés entre les étapes. Tous sont tués par surdosage de pentobarbital, cœur, muscle et peau prélevés pour analyses histologiques et biochimiques.
Objectifs
La dapagliflozine est un médicament couramment utilisé pour traiter le diabète de type 2. En plus de son effet sur la glycémie, plusieurs études ont montré qu’elle réduit le risque de décès d'origine cardio-vasculaire, un effet encore mal compris. Nous souhaitons donc étudier comment ce médicament influence le fonctionnement du cœur, en particulier la manière dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie. Normalement, le cœur consomme du sucre et des graisses pour produire l’énergie dont il a besoin. Nous pensons que la dapagliflozine modifie cet équilibre : elle réduirait l’utilisation du sucre et favoriserait celle des graisses, ce qui pourrait améliorer l’efficacité énergétique du cœur. Pour vérifier cette hypothèse, nous observerons comment le cœur des animaux utilise les graisses et le sucre grâce à des techniques d’imagerie avancées (Tomographie par Emission de Positon et Imagerie par Résonance Magnétique). Nous relierons ces résultats à des mesures complémentaires portant sur le fonctionnement du cœur, la composition des tissus et certains marqueurs biologiques. Enfin, nous vérifierons si les effets du médicament sont similaires chez les mâles et les femelles. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : Ce projet permettra de mieux comprendre comment la dapagliflozine agit sur le cœur. Grâce à l’imagerie, nous pourrons observer en temps réel les changements dans la façon dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie après l’administration du médicament. Ces observations seront comparées aux données sur le fonctionnement du cœur, l’inflammation et la structure du tissu cardiaque. Le projet montrera également l’intérêt decombiner les techniques d’imagerie pour mieux évaluer les effets bénéfiques des traitements du diabète sur le cœur. Enfin, il apportera des données expérimentales sur une possible différence d’effet du médicament entre les mâles et les femelles, un aspect encore peu étudié. Bénéfices à long terme : À plus long terme, ce travail contribuera à améliorer les connaissances sur les mécanismes d’action des traitements antidiabétiques de la famille de la dapagliflozine. Il permettra notamment de mieux comprendre le lien entre les troubles du fonctionnement cardiaque et les modifications du métabolisme énergétique chez les personnes diabétiques. Ces découvertes pourraient aider à identifier de nouvelles pistes de traitement des complications cardiovasculaires du diabète. Les résultats obtenus pourront également guider la pratique clinique, en précisant quels profils de patients pourraient tirer le plus de bénéfices de la dapagliflozine. Sur le plan méthodologique, le projet favorisera le développement de nouvelles approches d’imagerie cardiaque non invasive. Ces outils pourront ensuite être utilisés pour d’autres maladies du cœur, comme l’insuffisance cardiaque. Enfin, les données issues de ce travail constitueront une base solide pour de futurs essais cliniques chez l’humain. Si les résultats observés chez l’animal se confirment, ils pourraient contribuer à améliorer la prévention et la prise en charge des atteintes cardiaques liées au diabète. En résumé, ce projet apportera rapidement de nouvelles connaissances expérimentales sur les effets de la dapagliflozine sur le cœur, et à plus long terme, il pourrait ouvrir la voie à des progrès cliniques concrets dans le traitement des patients diabétiques.
Procédures
Induction du diabète de type 2: Les animaux reçoivent pendant 4 semaines une alimentation riche en graisses afin de reproduire un état de pré-diabète. Ils reçoivent ensuite deux injections à une semaine d’intervalle d’un produit (streptozotocine) qui perturbe légèrement la production d’insuline et permet de stabiliser un diabète modéré, similaire au diabète de type 2 humain. Les injections sont réalisées sous une anesthésie légère pour limiter le stress et la douleur. L’évolution de la glycémie est ensuite suivie pendant 8 semaines. Durée: environ 12 semaines. Traitement médical: Les animaux reçoivent ensuite la dapagliflozine, un médicament utilisé chez l’homme pour traiter le diabète, pendant 4 semaines, administrée dans l’eau de boisson de façon naturelle, sans contrainte pour l’animal. Durée : 4 semaines. Imagerie cardiaque: Chaque animal bénéficie d’un examen d’imagerie (Tomographie par Emission de Positons et Imagerie par Resonance Magnetique) pour observer la manière dont son cœur fonctionne et consomme les graisses comme source d’énergie. L’examen est réalisé sous anesthésie et dure environ 1 h 30 par animal. Une petite aiguille est placée dans une veine de la queue pour injecter un traceur non douloureux et prélever de très petites quantités de sang (trois fois au maximum, soit moins de 1 mL au total). Nombre d’animaux : 100. Spectroscopie du phosphore et mesures de relaxation cardiaque: Une seconde séance d’Imagerie par Resonance Magnetique permet de mesurer la composition énergétique du muscle cardiaque. Cette étape est aussi réalisée sous anesthésie et dure environ une heure par animal. Test d’effort: Les animaux effectuent un test d’endurance sur un tapis roulant, dans des conditions non douloureuses et sans stimulation électrique. La vitesse augmente progressivement jusqu’à ce que l’animal montre des signes de fatigue. Durée : environ 30 minutes par séance, une à deux fois par animal. Mesure des pressions cardiaques (PV loop): Cette procédure terminale se déroule sous anesthésie générale et analgésie. Un petit cathéter est inséré dans une artère du cou pour enregistrer la fonction mécanique du cœur pendant 45 à 60 minutes. À la fin de la mesure, l’animal est euthanasié sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance. À la fin de l’expérimentation, les tissus (cœur, muscle et peau) sont prélevés après euthanasie pour réaliser des analyses biologiques, histologiques et moléculaire.
Impact sur les animaux
Les effets secondaires liés aux procédures expérimentales et au traitement par dapagliflozine pourraient inclure : - Des douleurs et inconfort après injection IP de la streptozotocine: bien que limitée grâce aux mesures de gestion de la douleur - Une perte de poids : une surveillance stricte du poids sera effectuée pour détecter toute variation anormale. - En cas d’inactivité ou mobilité réduite : une diminution de l'activité spontanée peut être observée immédiatement après les interventions chirurgicales ou anesthésiques, mais elle devrait se résorber en 48 à 72 heures. - Le stress dû à l’expérimentation pourrait se manifester par une réduction du toilettage, une diminution de l'exploration ou des comportements de prostration. Le suivi post-procédure inclura une surveillance immédiate post-injection, avec observation de la fréquence cardiaque et respiratoire jusqu’au réveil complet. Une plaque chauffante sera utilisée pour maintenir la température corporelle des animaux sans augmenter leur consommation énergétique. Un suivi quotidien ou biquotidien sera assuré tout au long de l’expérimentation afin de détecter rapidement toute anomalie. L'état des animaux sera évalué en se basant sur des critères objectifs : comportement alimentaire normal, absence de perte de poids, comportement de fouissage et de toilettage normal, interactions sociales adaptées (absence d'agressivité), absence de stéréotypies et observation d'un déplacement actif. L’ensemble de ces mesures permettra de limiter au maximum les effets indésirables et d’assurer des conditions expérimentales respectueuses du bien-être animal. Le suivi quotidien des animaux inclura une évaluation clinique systématique. Une couverture analgésique est prévue pour toutes les procédures potentiellement douloureuses. Produit et voie d’administration : buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané (forme standard) ou 0,1 mg/kg (forme à libération prolongée) selon la durée de la procédure. Fréquence et durée d’administration : Une première injection est réalisée 30 minutes avant la manipulation. Une réinjection est prévue toutes les 12 heures pendant 24 à 48 h en cas de signes de douleur légère à modérée (évalués selon les grilles de Morton & Griffiths et l’échelle 4Avet). Si une douleur persistante ou plus marquée est observée, un traitement complémentaire par tramadol per os (5–10 mg/kg) mélangé à la nourriture (gelée aromatisée) pourra être administré pendant 48 à 72 h.
Devenir
A la fin de la procédure, les rats (n=90) seront euthanasiés par surdosage en pentobarbital pour analyses histologiques et biochimiques. Concernant les 10 animaux supplémentaires pour la mise en place du traceur ([¹¹C]Palmitate), ils seront également euthanasiés afin de permettre une analyse histologique de la distribution tissulaire du traceur au niveau cardiaque.
Remplacement
L’étude du métabolisme myocardique et de ses modifications sous l’effet de la dapagliflozine, de même la perte urinaire de glucose qu’elle engendre, nécessite une approche prenant en compte les interactions systémiques entre les organes (cœur, foie, rein, système vasculaire). L’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable pour : étudier les modifications dynamiques du métabolisme cardiaque en temps réel à l’aide d’imagerie métabolique comme la TEP au [¹¹C]Palmitate et la spectroscopie RMN du phosphore, évaluer l’impact fonctionnel du traitement sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose, ce qui ne peut être réalisé sur un modèle ex vivo ou in vitro, reproduire un état pathologique complexe (diabète de type 2) qui intègre l’ensemble des interactions systémiques affectant le cœur. Les cultures cellulaires, notamment les cardiomyocytes en culture, permettent d’étudier certains aspects du métabolisme énergétique et des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, elles ne reproduisent pas la complexité d’un organe fonctionnel, notamment les interactions entre les cellules myocardiques, l’environnement extracellulaire et le métabolisme global. De plus, l’impact de la dapagliflozine sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose ne peut pas être correctement évalué sur un modèle cellulaire isolé.
Réduction
Se basant sur le principe de réduction du nombre d’animaux nécessaires, l’ensemble du projet inclura 100 animaux : 90 rats pour la phase principale d’imagerie, ainsi que 10 animaux supplémentaires pour la mise en place de l’utilisation du traceur ([¹¹C]Palmitate). En absence de données préliminaires chez l'animal, un calcul d'effectif ne peut pas être réalisé. Toutefois, un calcul de puissance sera réalisé après l’évaluation de 50% de l’effectif de façon a ré-évaluer ce chiffre en fonction des résultats et tenter de réduire le nombre total d’animaux finalement nécessaires.
Raffinement
Concernant le raffinement des conditions expérimentales, les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV) avec une pression de 20-25Pa avec un renouvellement de 25 fois le volume d’air de la pièce toutes les heures et une température de 21°±1C. L’exposition à la lumière sera de 6h45 à 18h45. La nourriture, la boisson et la litière seront changées une fois par semaine. La litière de peuplier "aspen small", plus douce et variée pour les animaux permet de réduire le niveau de stress. Cette litière est plus chère mais possède les avantages d'être peu poussiéreuse, moins allergisante que le résineux. Les animaux sont hébergés par groupe de 2 afin de conserver les interactions sociales. La litière est enrichie avec de la litière cellulose Alpha Dry permettant la confection de nid. Les procédures expérimentales sont effectuées sous anesthésie et analgésie. A la suite des procédures, un suivi régulier est effectué pendant 5 jours par du personnel expérimenté et formé à l'évaluation des point limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Dans cette étude, l’espèce sélectionnée est le rat Wistar, un modèle préclinique couramment utilisé pour l’évaluation des effets métaboliques et cardiovasculaires des traitements. Le stade de développement choisi est celui de rats âgés de 8 à 9 semaines au moment de l’expérimentation. L’utilisation de rats adultes permet de limiter les biais liés aux changements physiologiques associés à la croissance.
Détection et compréhension de la signalisation des rétinoïdes à l’aide de sondes issues de la chimie click
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Un gavage de quelques secondes, une seule fois dans la vie de l'animal, suffit à justifier l'utilisation de 360 souris. Elles sont 900 en tout, toutes tuées pour prélever leurs organes, 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 180 un niveau modéré, ces dernières subissant une chirurgie d'une vingtaine de minutes sous anesthésie générale. L'objet est de cartographier dans les tissus les formes actives de la vitamine A grâce à des sondes chimiques, méthode que l'équipe a déjà validée en culture cellulaire. Le porteur affirme qu'un remplacement est impossible et retient des souris de quatre semaines, âge qui selon lui limite aussi la durée d'élevage en captivité.
Objectifs
La vitamine A est indispensable au développement et à la physiologie des organismes vertébrés. Les données de nombreuses études scientifiques ont révélé des fonctions extrêmement complexes des formes actives de cette vitamine, dans quasiment tous les types de tissus composant notre organisme. Un déséquilibre de sa signalisation est associé à diverses pathologies, y compris des déficits immunitaires, visuels, et des maladies neurodégénératives. On connait encore peu de choses sur les mécanismes sous-tendant le transport, la biodisponibilité et/ou le stockage des formes (molécules) actives de la vitamine A ou rétinoïdes dans les cellules de l’organisme. Il s’agit de petites molécules qui, à la différence des protéines, sont impossibles à détecter par les méthodes classiques d’analyses de cellules et tissus en histologie et microscopie. Notre équipe a consacré plusieurs années à développer une méthode novatrice pouvant permettre une telle détection. Brièvement, elle repose sur une méthode développée dans le domaine de la chimie du vivant, récompensée par un récent Prix Nobel de chimie. Dans notre cas, et en collaboration avec une équipe de pointe en chimie du vivant, nous avons produit par synthèse chimique des formes modifiées de la vitamine A, et avons prouvé que ces formes réagissent avec des molécules sondes détectables, par exemple, par fluorescence. Cette méthode a été validée en particulier dans des systèmes de culture cellulaire. Le projet va maintenant permettre, pour la première fois, de détecter et de cartographier ces molécules rétinoïdes dans l’organisme au niveau cellulaire grâce à l’histologie et à la microscopie à très haute résolution. De plus, il sera possible de déterminer les formes moléculaires précises de rétinoïdes produites in vivo dans les tissus, en analysant ces molécules capturées dans des extraits tissulaires.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier de nouvelles molécules bioactives à fort potentiel pour le traitement ou le diagnostic de diverses maladies neurologiques. Les nouveaux outils validés dans le cadre de ce projet seront essentiels pour déterminer leur localisation avec une résolution au niveau de la cellule. De telles connaissances permettront d'étudier et de faire progresser de manière significative notre compréhension de la physiolopathologie de plusieurs troubles neurologiques dont la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington. En effet, des travaux scientifiques ont indiqué un lien possible entre la voie des rétinoïdes et les causes possibles de ces maladies. L’amélioration des connaissances sur le métabolisme et la distribution des rétinoïdes au sein des tissus de l’organisme pourraient donc aboutir (en agissant sur cette voie biologique) à des stratégies pour la prévention ou le traitement de ces maladies. Au-delà des connaissances spécifiques sur ces maladies, les données obtenues devraient faire progresser les connaissances sur l'absorption et la signalisation des vitamines. Les techniques et outils spécifiques validés dans le cadre de ce projet devraient être applicables à toutes petites molécules biologiques et à leur analyse dans un organisme vivant.
Procédures
Des souris non-génétiquement modifiées âgées de 4 semaines recevront l’administration d’un soluté par gavage oral. Cet acte ne sera réalisé qu’une fois pour chaque animal, et ne durera que quelques secondes. Etant donné le nombre de molécules (solutés) et les temps post-administration à analyser, cet acte concernera 360 souris. D’autres souris seront soumises à des injections intra-péritonéales : 180 souris recevront une seule injection, 360 recevront une injection supplémentaire pour anesthésie générale, entraînant un endormissement rapide pour effectuer chirurgie terminale sans réveil et des prélèvements d'organes sans réveil. Chaque injection (seringue fine de type insulinique) ne durant que quelques secondes. Un acte chirurgical sera réalisé sur 180 animaux sous anesthésie générale. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les administrations de solutés par voie orale ou intra-péritonéale peuvent générer un stress de courte durée et un inconfort pour les animaux. Les procédures n’ayant qu’une durée totale de 1 heure (minimum) à 24 heures (maximum), les animaux pourront être surveillés pour tout signe d’inconfort. Les solutés injectés ne comportent pas de principe (molécule) directement actif, ils ne sont pas de nature à avoir un effet indésirable dans le laps de temps précédant la mise à mort de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort, en vue du prélèvement et de l’analyse d’organes par des techniques de pointe.
Remplacement
Il n’est ici pas possible de remplacer le modèle animal, l’essence même du projet étant de pouvoir cartographier par une méthode novatrice, dans l’organisme et en condition de vie réelle - potentiellement jusqu’à l’échelle sub-cellulaire - les molécules et métabolites d’une voie de signalisation impliquée dans divers processus physiologiques ou pathologiques. Les données obtenues seront transposables et amélioreront les connaissances de ces processus dans l’espèce humaine.
Réduction
Dans notre projet nous utilisons un faible effectif d’animaux permettant toutefois d’effectuer des analyses statistiques (n=5). Ces effectifs ont été déterminés en fonction des données de la littérature et des procédures en vigueur dans l'animalerie. De plus, si l’une des deux voies d’administration des molécules rétinoïdes s’avérait plus efficace, elle sera immédiatement privilégiée, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En vue de raffiner les procédures, les injections seront exercées par un manipulateur expérimenté. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur aux animaux lors des administrations orales ou injections de solutés. Il s’agira de plus d’actes isolés ou répétés seulement 1 ou 2 fois pour les injections en vue d’anesthésie générale. Les procédures chirurgicales sont ainsi réalisées sous anesthésie générale par injection d’un mélange d’anesthésie et d’analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie des précautions sont prises pour protéger les yeux des animaux d’un éventuel dessèchement. Les animaux sont préservés du refroidissement généré par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Finallement, des points limites ont été définis et seront appliqués. A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort par un personnel expérimenté.
Choix des espèces
La souris est une espèce mammifère dont les processus physiologiques sont dans l’ensemble proches voire comparables à ceux de l’homme. Il s’agit aussi, et ceci est particulièrement important, d’un modèle pour lequel de nombreuses lignées génénétiquement modifiées ont été créées, modèles de mutations et/ou de processus pathologiques affectant les humains. Les résultats de notre étude pourront immédiatement servir de base pour une exploration des voies biologiques impliquant la vitamine A dans n’importe lequel de ces modèles, si les données de la recherche le justifiaient. Les procédures concerneront des animaux âgés de 4 semaines, âge auquel le développement post-natal des organes (particulièrement le cerveau) peut être considéré comme complet. Ceci minimisera la durée d’élevage des animaux en captivité.
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- Oncologie
100 rats vont être utilisés, chacun passant douze semaines à devenir diabétique avant une heure trente d'imagerie TEP, une heure d'IRM, trente minutes de tapis roulant et jusqu'à une heure de cathétérisme cardiaque terminal. Le diabète est provoqué par un régime gras puis deux injections de streptozotocine, dont le porteur reconnaît qu'elles causent douleurs et inconfort. La procédure est classée sans réveil et tous sont tués sous anesthésie profonde à l'issue de la mesure de pression, cœur, muscle et peau prélevés. Les retombées annoncées, mieux prévenir les atteintes cardiaques du diabète et guider la pratique clinique, sont renvoyées au conditionnel et à de futurs essais chez l'humain, quand les douze semaines d'hyperglycémie provoquée sont immédiates.
Objectifs
La dapagliflozine est un médicament couramment utilisé pour traiter le diabète de type 2. En plus de son effet sur la glycémie, plusieurs études ont montré qu’elle réduit le risque de décès d'origine cardio-vasculaire, un effet encore mal compris. Nous souhaitons donc étudier comment ce médicament influence le fonctionnement du cœur, en particulier la manière dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie. Normalement, le cœur consomme du sucre et des graisses pour produire l’énergie dont il a besoin. Nous pensons que la dapagliflozine modifie cet équilibre : elle réduirait l’utilisation du sucre et favoriserait celle des graisses, ce qui pourrait améliorer l’efficacité énergétique du cœur. Pour vérifier cette hypothèse, nous observerons comment le cœur des animaux utilise les graisses et le sucre grâce à des techniques d’imagerie avancées (Tomographie par Emission de Positon et Imagerie par Résonance Magnétique). Nous relierons ces résultats à des mesures complémentaires portant sur le fonctionnement du cœur, la composition des tissus et certains marqueurs biologiques. Enfin, nous vérifierons si les effets du médicament sont similaires chez les mâles et les femelles. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : Ce projet permettra de mieux comprendre comment la dapagliflozine agit sur le cœur à court terme. Grâce à l’imagerie, nous pourrons observer en temps réel les changements dans la façon dont le muscle cardiaque utilise ses sources d’énergie après l’administration du médicament. Ces observations seront comparées aux données sur la fonction du cœur, l’inflammation et la structure du tissu cardiaque. Le projet montrera également l’intérêt des techniques d’imagerie combinées (TEP et IRM) pour évaluer les effets bénéfiques des traitements du diabète sur le cœur. Enfin, il apportera des données expérimentales sur une possible différence d’effet du médicament entre les mâles et les femelles, un aspect encore peu étudié. Bénéfices à long terme : À plus long terme, ce travail contribuera à améliorer les connaissances sur les mécanismes d’action des traitements antidiabétiques de la famille de la dapagliflozine. Il permettra notamment de mieux comprendre le lien entre les troubles du fonctionnement cardiaque et les modifications du métabolisme énergétique chez les personnes diabétiques. Ces découvertes pourraient aider à identifier de nouvelles pistes de traitement des complications cardiovasculaires du diabète. Les résultats obtenus pourront également guider la pratique clinique, en précisant quels profils de patients pourraient tirer le plus de bénéfices de la dapagliflozine. Sur le plan méthodologique, le projet favorisera le développement de nouvelles approches d’imagerie cardiaque non invasive. Ces outils pourront ensuite être utilisés pour d’autres maladies du cœur, comme l’insuffisance cardiaque. Enfin, les données issues de ce travail constitueront une base solide pour de futurs essais cliniques chez l’humain. Si les résultats observés chez l’animal se confirment, ils pourraient contribuer à améliorer la prévention et la prise en charge des atteintes cardiaques liées au diabète. En résumé, ce projet apportera rapidement de nouvelles connaissances expérimentales sur les effets de la dapagliflozine sur le cœur, et à plus long terme, il pourrait ouvrir la voie à des progrès cliniques concrets dans le traitement des patients diabétiques.
Procédures
nduction du diabète de type 2 Environ 90 rats reçoivent pendant quatre semaines une alimentation riche en graisses afin de reproduire un état de pré-diabète. Ils reçoivent ensuite deux injections à une semaine d’intervalle d’un produit (streptozotocine) qui perturbe légèrement la production d’insuline et permet de stabiliser un diabète modéré, similaire au diabète de type 2 chez l’humain. Les injections sont réalisées sous une anesthésie légère pour limiter le stress et la douleur. L’évolution de la glycémie est ensuite suivie pendant huit semaines. Durée totale de cette phase : environ 12 semaines. Traitement médicamenteux Les animaux reçoivent ensuite la dapagliflozine, un médicament utilisé chez l’homme pour traiter le diabète, pendant quatre semaines. Elle est administrée dans l’eau de boisson de façon naturelle, sans contrainte pour l’animal. Durée : 4 semaines. Imagerie cardiaque par TEP et IRM Chaque animal bénéficie d’un examen d’imagerie pour observer le fonctionnement de son cœur et la manière dont il consomme les graisses comme source d’énergie. L’examen est réalisé sous anesthésie et dure environ 1 h 30 par animal. Une petite aiguille est placée dans une veine de la queue pour injecter un traceur non douloureux et prélever de très petites quantités de sang (trois fois au maximum, soit moins de 1 mL au total). Nombre d’animaux : 90 répartis en trois groupes. Spectroscopie du phosphore et mesures de relaxation cardiaque Une seconde séance d’imagerie (IRM haute résolution) permet de mesurer la composition énergétique du muscle cardiaque. Cette étape est également réalisée sous anesthésie et dure environ une heure par animal. Test d’effort Les animaux effectuent un test d’endurance sur un tapis roulant, dans des conditions non douloureuses et sans stimulation électrique. La vitesse augmente progressivement jusqu’à ce que l’animal montre des signes de fatigue. Durée : environ 30 minutes par séance, une à deux fois par animal. Mesure des pressions cardiaques (PV loop) Cette procédure terminale se déroule sous anesthésie générale et analgésie. Un petit cathéter est inséré dans une artère du cou pour enregistrer la fonction mécanique du cœur pendant 45 à 60 minutes. À la fin de la mesure, l’animal est euthanasié sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance. sÀ la fin de l’expérimentation, les tissus (cœur, muscle et peau) sont prélevés après euthanasie pour réaliser des analyses biologiques, histologiques et moléculaire.
Impact sur les animaux
Les effets secondaires liés aux procédures expérimentales et au traitement par dapagliflozine pourraient inclure : - Des douleurs et inconfort après injection IP de la streptozotocine: bien que limitée grâce aux mesures de gestion de la douleur - Une perte de poids : une surveillance stricte du poids sera effectuée pour détecter toute variation anormale. - En cas d’inactivité ou mobilité réduite : une diminution de l'activité spontanée peut être observée immédiatement après les interventions chirurgicales ou anesthésiques, mais elle devrait se résorber en 48 à 72 heures. - Le stress dû à l’expérimentation pourrait se manifester par une réduction du toilettage, une diminution de l'exploration ou des comportements de prostration. Le suivi post-procédure inclura une surveillance immédiate post-injection, avec observation de la fréquence cardiaque et respiratoire jusqu’au réveil complet. Une plaque chauffante sera utilisée pour maintenir la température corporelle des animaux sans augmenter leur consommation énergétique. Un suivi quotidien ou biquotidien sera assuré tout au long de l’expérimentation afin de détecter rapidement toute anomalie. L'état des animaux sera évalué en se basant sur des critères objectifs : comportement alimentaire normal, absence de perte de poids, comportement de fouissage et de toilettage normal, interactions sociales adaptées (absence d'agressivité), absence de stéréotypies et observation d'un déplacement actif. L’ensemble de ces mesures permettra de limiter au maximum les effets indésirables et d’assurer des conditions expérimentales respectueuses du bien-être animal. Le suivi quotidien des animaux inclura une évaluation clinique systématique. Une couverture analgésique est prévue pour toutes les procédures potentiellement douloureuses. Produit et voie d’administration : buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané (forme standard) ou 0,1 mg/kg (forme à libération prolongée) selon la durée de la procédure. Fréquence et durée d’administration : Une première injection est réalisée 30 minutes avant la manipulation. Une réinjection est prévue toutes les 12 heures pendant 24 à 48 h en cas de signes de douleur légère à modérée (évalués selon les grilles de Morton & Griffiths et l’échelle 4Avet). Si une douleur persistante ou plus marquée est observée, un traitement complémentaire par tramadol per os (5–10 mg/kg) mélangé à la nourriture (gelée aromatisée) pourra être administré pendant 48 à 72 h.
Devenir
A la fin de la procédure, les rats (n=90) seront euthanasiés par surdosage en pentobarbital pour analyses histologiques et biochimiques. Concernant les 10 animaux supplémentaires pour la mise en place du traceur ([¹¹C]Palmitate), ils seront également euthanasiés afin de permettre une analyse histologique de la distribution tissulaire du traceur au niveau cardiaque.
Remplacement
L’étude du métabolisme myocardique et de ses modifications sous l’effet de la dapagliflozine, de même la perte urinaire de glucose qu’elle engendre, nécessite une approche prenant en compte les interactions systémiques entre les organes (cœur, foie, rein, système vasculaire). L’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable pour : étudier les modifications dynamiques du métabolisme cardiaque en temps réel à l’aide d’imagerie métabolique comme la TEP au [¹¹C]Palmitate et la spectroscopie RMN du phosphore, évaluer l’impact fonctionnel du traitement sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose, ce qui ne peut être réalisé sur un modèle ex vivo ou in vitro, reproduire un état pathologique complexe (diabète de type 2) qui intègre l’ensemble des interactions systémiques affectant le cœur. Les cultures cellulaires, notamment les cardiomyocytes en culture, permettent d’étudier certains aspects du métabolisme énergétique et des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, elles ne reproduisent pas la complexité d’un organe fonctionnel, notamment les interactions entre les cellules myocardiques, l’environnement extracellulaire et le métabolisme global. De plus, l’impact de la dapagliflozine sur la perfusion myocardique, l’inflammation et la fibrose ne peut pas être correctement évalué sur un modèle cellulaire isolé.
Réduction
Se basant sur le principe de réduction du nombre d’animaux nécessaires, l’ensemble du projet inclura 100 animaux : 90 rats pour la phase principale d’imagerie, ainsi que 10 animaux supplémentaires pour la mise en place de l’utilisation du traceur ([¹¹C]Palmitate). En absence de données préliminaires chez l'animal, un calcul d'effectif ne peut pas être réalisé. Toutefois, un calcul de puissance sera réalisé après l’évaluation de 50% de l’effectif de façon a ré-évaluer ce chiffre en fonction des résultats et tenter de réduire le nombre total d’animaux finalement nécessaires.
Raffinement
Concernant le raffinement des conditions expérimentales, les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV) avec une pression de 20-25Pa avec un renouvellement de 25 fois le volume d’air de la pièce toutes les heures et une température de 21°±1C. L’exposition à la lumière sera de 6h45 à 18h45. La nourriture, la boisson et la litière seront changées une fois par semaine. La litière de peuplier "aspen small", plus douce et variée pour les animaux permet de réduire le niveau de stress. Cette litière est plus chère mais possède les avantages d'être peu poussiéreuse, moins allergisante que le résineux. Les animaux sont hébergés par groupe de 2 afin de conserver les interactions sociales. La litière est enrichie avec de la litière cellulose Alpha Dry permettant la confection de nid. Les procédures expérimentales sont effectuées sous anesthésie et analgésie. A la suite des procédures, un suivi régulier est effectué pendant 5 jours par du personnel expérimenté et formé à l'évaluation des point limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Dans cette étude, l’espèce sélectionnée est le rat Wistar-Kyoto, un modèle préclinique couramment utilisé pour l’évaluation des effets métaboliques et cardiovasculaires des traitements. Le stade de développement choisi est celui de rats âgés de 8 à 9 semaines au moment de l’expérimentation. L’utilisation de rats adultes permet de limiter les biais liés aux changements physiologiques associés à la croissance.
Evaluation d’immunothérapies par anticorps monoclonaux déplétant les mastocytes dans des modèles murins de mastocytose humaine.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Irradiées puis greffées, à trois jours de vie, avec des cellules souches prélevées sur des patients atteints de mastocytose, ces souris développent un système immunitaire humain et des tumeurs de mastocytes. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une anémie possible, des ulcérations sur les tumeurs sous-cutanées, un rejet des nouveau-nés par leur mère après manipulation et des chocs anaphylactiques faisant chuter la température corporelle de plus de huit degrés. Il écrit que "100 %" des animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs organes.
Objectifs
La mastocytose est une maladie rare due le plus souvent à des mutations activantes d’un récepteur entraînant une différentiation et une prolifération aberrante de cellules immunitaires appelées mastocytes. La mastocytose est classée en trois types principaux selon le degré de sévérité et les organes atteints: la mastocytose cutanée (MC), qui affecte uniquement la peau ; la mastocytose systémique (MS), allant des formes indolentes aux formes sévères ou agressives, dans lesquelles au moins un organe extra-cutané est atteint ; et le sarcome mastocytaire, caractérisé par la présence d'une tumeur solide composée de mastocytes malins présentant une capacité d’infiltration destructrice et un potentiel métastatique. Selon la localisation tissulaire et la sévérité de la maladie, les symptômes peuvent inclure une irritation cutanée, des symptômes allergiques tels que l’anaphylaxie, ainsi que des déficits cellulaires, organomégalies (augmentation du volume des organes), et de l’ostéoporose. La forme la plus grave de mastocytose est la mastocytose agressive, dans laquelle il y a formation de tumeurs de mastocytes dans de nombreux tissus et dans la moelle osseuse et, dans la majorité des cas la survie des patients atteints de mastocytose agressive n’excède pas 3 à 5 ans après le diagnostic. Au-delà des traitements mis en place permettant de réduire les symptômes associés tel que les réactions allergiques, l’ostéoporose ou les atteintes cutanées, les thérapies visant à la destruction des mastocytes tumoraux induisent de nombreux effets secondaires et présentent un manque de spécificité, ce qui limite leur utilisation aux formes les plus graves de la mastocytose. Il n’existe pas à l’heure actuelle de solution thérapeutique satisfaisante dans cette pathologie. Ce programme de recherche a pour but de développer de nouvelles approches d’immunothérapie dans la mastocytose. Les résultats attendus des expériences que nous projetons de réaliser contribueront à mieux comprendre le développement de cette pathologie grave et à identifier de nouvelles approches d’immunothérapie pour soigner cette maladie.
Bénéfices attendus
La preuve de l’efficacité des anticorps déplétant les mastocytes in vivo dans les modèles murins décrits ci-dessous représente une étape essentielle pour la validation thérapeutique dans le traitement de la mastocytose et la justification du démarrage d’essais précliniques.
Procédures
L’irradiation n’aura lieu qu’une fois par animal (25 sec). Chaque injection des traitements (de 2 à 4 ; une fois par semaine) se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que d'autres ainsi que le rasage de la zone d’injection se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; injection : 30 sec). L’imagerie non-invasive se fera sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; prise de l'image : 5 min). Les prélèvements de sang seront réalisés également sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées : L’irradiation peut entrainer une perte de poids transitoire, une léthargie et/ou alopécie. Le développement d’un système immunitaire humain chez la souris peut entrainer une anémie. Les données existantes suggèrent que ces effets apparaissent plus de 20 semaines après ce développementet se manifestent par des symptômes d’anémie, incluant pâleur des extrémités, baisse importante de l’activité et perte de poids rapide. Outre les effets indésirables décrits ci-dessus qui s’appliquent également dans le cas de souris humanisées à partir de nouveaux nés, la manipulation de ces animaux avant sevrage peut entrainer un rejet de la part de la mère. De plus, il est impossible d’évaluer le développement des cellules souches hématopoïétiques dérivées de patients mastocytose in vivo et on ne peut exclure la survenue de symptômes liés à une prolifération anormale des mastocytes et des atteintes comparables aux symptômes observés chez l’Homme. Les traitements ciblant les mastocytes peuvent induire des réactions allergiques de type choc anaphylactique se traduisant par une perte de température corporelle rapide et transitoire, supérieure à 8°C. Le développement de tumeurs solides sous cutanées dans les souris humanisées peut mener à l’apparition d’ulcérations cutanées et une potentielle perte de poids. Une perte de température corporelle rapide, transitoire et supérieure à 8°C peut survenir lors d’in modèle d’anaphylaxie systémique passive
Devenir
100% des animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes post mortem.
Remplacement
Devant la complexité de cette pathologie, due notamment à l’implication de différents organes, le recours aux modèles animaux est indispensable. Toutes les études préliminaires visant à sélectionner les anticorps déplétant les mastocytes ont été réalisés in vitro dans des modèles de cultures de mastocytes humains. De ce fait, seuls les anticorps présentant le meilleur potentiel thérapeutique seront testés dans ce projet dans des modèles murins. De plus, l’utilisation d’un modèle in vivo pour tester les effets thérapeutiques d’anticorps déplétant les mastocytes nous permettra d’évaluer leur efficacité dans les différents tissues (bio-distribution), et leur capacite à induire la déplétion des mastocytes médiée par les cellules du système immunitaire inné.
Réduction
Les expériences décrites dans ce projet de recherche (incluant le nombre d’animaux par groupe) ont été élaborées sur les bases de travaux antérieurs et sur la base de notre expérience et de nos données préliminaires dans le domaine des mastocytes et des souris humanisées. Ceci dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de données statistiques robustes permettant de répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons une moyenne de 5 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet sont maintenus dans un département de zootechnie dédié (environnement stérile), et soumis à une surveillance journalière. Les soins sont prodigués par des personnels spécialisés, avec une connaissance des procédures animales et des projets scientifiques que nous menons, dont la priorité est le bien être animale et le respect des lois bioéthiques en vigueur. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour, permettant une détection précoce de toute altération de l’état de santé et une adaptation rapide des mesures nécessaires, contribuant ainsi à la réduction de la souffrance animale. Pour chaque procédure, des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera mis à mort s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif, nécessite peu de place, et il existe de nombreux modèles bien établis grâce aux progrès scientifiques réalisés ces dernières années. Les lignées transgéniques nécessaires pour ce projet sont d’ailleurs principalement disponibles chez la souris, avec un contrôle précis de leur fond génétique. De plus, la physiologie de la souris, en particulier dans les modèles « humanisés » que nous utiliserons, présente de fortes similarités avec celle de l’être humain. Cela permet de reproduire de manière fiable des maladies proches de celles observées chez les patients. Les animaux seront utilisés entre 0 (injection des cellules souches hématopoïétiques dérivés de patients mastocytose) et 20 semaines (immunisation vaccin à ARNm, regreffe de lignées de cellules tumorale, traitement avec des anticorps déplétant) après la naissance. Pour maximiser le succès de la regreffe des souris avec des cellules souches humaines, des souris nouveaux-nés (jour 3 après la naissance) seront regreffées, avant que le système immunitaire murin ne soit trop développé. Les souris sont dites « humanisées » lorsque leur système immunitaire humain est composé de plus de 25% de cellules immunitaires humaines (dans la circulation) entre 12 et 16 semaines après l’injection des cellules souches hématopoïétiques ; c’est pourquoi, les animaux seront utilisés entre 0 et 20 semaines.
fourniture de produits biologiques de primates non humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Macaques à longue queue : 400
Macaques rhésus : 30
Singes vervets : 20
Gardés en hébergement standard ou transférés vers d'autres projets, 600 primates vont être prélevés à répétition dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger: 400 macaques à longue queue, 150 ouistitis et tamarins, 30 macaques rhésus et 20 singes vervets. Chaque individu peut être prélevé une à six fois par an, sang, liquide céphalo-rachidien, moelle osseuse, urine, lait, sperme, humeurs oculaires, biopsies de peau ou de muscle, lavage broncho-alvéolaire. Pour recueillir le lait, les petits sont séparés de leur mère jusqu'à six heures, et pour le sperme, le mâle est isolé de son groupe la veille. Le porteur présente ces prélèvements comme un moyen de remplacer l'utilisation d'animaux "entiers" et affirme qu'ils suivent "parfaitement" la règle des 3R.
Objectifs
L’accès à des échantillons biologiques de primates non humains (PNH) est un élément clé dans le développement préclinique. Ils permettent de valider in vitro différentes hypothèses scientifiques et de tester l’efficacité ou la toxicité de candidats médicaments. Autrement dit, utiliser des échantillons de PNH 1) permet de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire en les remplaçant par l’utilisation in vitro de cellules (plusieurs produits testés avec les cellules d’un seul animal) ; 2) rend le développement d’un médicament plus fiable, grâce à une sélection objective de l’espèce animale la plus proche de l’homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. De plus, un hébergement spacieux en groupe sociaux et un enrichissement du milieu adapté sont fournis à ces animaux. Anesthésie, analgésie, hébergement en groupe sociaux et enrichissement participent ainsi au principe de raffinement. La réalisation de prélèvements biologiques suit donc parfaitement la règle des 3R, tant dans son concept que dans sa réalisation. Pour les besoins de la recherche scientifique , l'objectif de ce projet est de proposer et fournir à la communauté scientifique la fourniture d’échantillons biologiques (sang et dérivés sanguins, cellules, tissus, fluides…). Le besoin en prélèvements biologiques/cellules de PNH est dépendant de projets extérieurs à la plateforme
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, les prélèvements de sang, moelle osseuse, liquide céphalo-rachidien, urine, humeur aqueuse, humeur vitrée, sperme, biopsies cutanées, biopsies musculaires, lait et liquide bronco-alvéolaire peuvent avoir de nombreuses utilisations. On peut notamment citer parmi les utilisations faites par les utilisateurs de ces prélèvements : (i) des recherches sur les cellules primaires pour développer de nouvelles molécules de biothérapie en oncologie ou contre les maladies inflammatoires ; (ii) des pré études de sécurité pour mettre en place avec les doses adaptées les futures études de toxicologie sur les primates non humains ; (iii) des comparaisons avec le sang humain afin d’étudier la compatibilité des résultats obtenus sur les primates non humains lors de leur application chez l’Homme (iv) des études de bioanalyses pour le développement de médicaments ; (v) des recherches pour découvrir de nouvelles molécules pour inhiber l’immunité innée pour le traitement des maladies à médiation immunitaire.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux dans ce projet diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain. De plus, contrairement à ce qui est fait chez l'Homme, ces procédures sont ici réalisées sur animaux anesthésiés et analgésiés. Chaque intervention dure entre 15 min à 1 heure le temps de l'anesthésie et du prélèvement. 30 min à 1 heure supplémentaires sont ensuite nécessaires après le retour de l’animal dans son animalerie jusqu'à son réveil complet. Pour les prélèvements de sang, un prélèvement vigil pourra être effectué dans le seul cas où l'anesthésique affecteraits les analyses ou les expériences menées par le chercheur. L'ensemble de interventions sont des prélèvements biologiques : prise de sang, prélèvement de LCR, moelle osseuse, urine, lait, sperme et humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lavage broncho-alvéolaire. Un même animal peut être prélevé de manière répétée, en respectant des volumes et des temps de récupération spécifiques afin de préserver la bonne santé de l'animal. En se basant sur les dernières années, un individu peut être prélevé en moyenne entre 1 à 6 fois par an, tout échantillon confondu.
Impact sur les animaux
La réalisation des prélèvements biologiques nécessite au minimum la capture et la contention des animaux. Ces deux actes sont stressants car réalisés de manière contrainte. La capture consiste à diriger les animaux vers un tunnel de capture installé dans chaque animalerie. Une fois dans le tunnel de capture, les animaux peuvent être triés et dirigés vers le sabot de contention au bout du tunnel équipé d’un fond de contention. Le fond de contention permet de manière sécurisée (i) d’attraper le bras de l’animal afin de pouvoir le tenir et le sortir en vigil du tunnel à l’aide de gants de contention, ou (ii) d’accèder à sa cuisse afin de pouvoir effectuer une injection intra-musculaire du produit anesthésiant. A noter que l’habituation des animaux ainsi que le renforcement positif permet de réduire la durée et l’intensité du stress de capture. Ces méthodes de raffinement sont appliquées le plus souvent possible. Les effets post-prélèvements peuvent également représenter une nuisance en termes de récupération physiologique et/ou physique des animaux. Il s’agira au maximum des effets secondaires liés à l’anesthésie (somnolence, nausée). Toutes les nuisances sont considérées comme légères. De plus, des mesures de raffinement sont mises en place propres à chaque type de prélèvements. A noter que -pour le prélèvement de lait, les petits sont séparés de leur mère pour une durée de 6h maximum engendrant un stress de séparation. Cette séparation sera la plus courte possible et n’entraine pas d’effet à long terme sur le petit. Des mesures particulières sont mises en place afin de limiter le stress immédiat des petits due à cette séparation comme la présence d’une peluche pour s’agripper si le petit est seul ou la mise en groupe des petits s’ils sont plusieurs. - pour le prélèvement de sperme, le mâle est séparé de son groupe la veille pour obtenir le meilleur prélèvement possible. Cette séparation engendre un stress chez l’animal. Afin de réduire au maximum ce stress, le temps de séparation est limité à 24h maximum et le mâle est relâché dans son groupe dès que possible. Le contact visuel avec le groupe est maintenu si possible.
Devenir
Les procédures de prélèvements biologiques étant des procédures très légères, les animaux sont gardés en hébergement standard ou pourront être réutilisé pour d'autres projets scientifiques.
Remplacement
Dans la mesure où les produits de synthèses ne permettent pas encore de reproduire toutes les réactions des différentes cellules visées dans ce projet, l’utilisation d’animaux en tant que donneurs non terminaux reste indispensable. Les prélèvements biologiques réalisés sur animaux vivants proposés dans ce projet permettent justement de remplacer l’utilisation d’animaux vivants « entiers » par des produits biologiques issus de ces animaux permettant ainsi d’éviter l’injection de composants en tests à ces animaux et de multiplier les essais réalisés sur les produits biologiques testés sans multiplier le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
L’utilisation de produits biologiques à la place d’animaux entiers permet en soi de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques puisqu’un même animal peut être réutilisé pour le prélèvement de plusieurs produits biologiques, dans la limite des volumes et de la fréquence maximale permettant à l’animal de retrouver son état de santé et de bien-être général entre chaque prélèvement. Concernant les prélèvements biologiques eux-mêmes, ceux-ci sont réalisés après une demande spécifique validée d’un demandeur (en général client chercheurs). Les animaux ne sont pas prélevés systématiquement s’il n’y a pas de demande pour la fourniture de produits biologiques qui ne seraient pas utilisés. Dans la mesure du possible, toutes les demandes sont couplées afin de limiter le nombre d’interventions pour un même groupe d’animaux hébergés ensemble et réduire le stress lié à la capture dans une même animalerie. Ainsi tout est fait pour prélever un minimum d’animaux pour satisfaire les demandes des chercheurs.
Raffinement
La plupart des prélèvements est réalisée sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations de prélèvement correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. Dans les rares cas où l’anesthésie n’est pas réalisée (pour les prélèvements sanguins uniquement : demande spécifique de l'utilisateur : interraction de l’anesthésique avec leur recherche), il est jugé que le dommage engendré par la réalisation du prélèvement en vigil ne diffère pas de celui engendré par l’anesthésie (douleur de la piqure d’une aiguille + stress d’un prélèvement vigil vs douleur de la piqure d’une aiguille + réveil, respectivement). De plus, tous les animaux disposent d’un hébergement répondant à la règlementation en vigueur, avec accès extérieur (volume supplémentaire par rapport à la réglementation) le cas échéant et en groupes sociaux. Les animaleries intérieures et extérieures sont équipées d’enrichissements du milieu adaptés à chaque espèce (au minimum perchoirs, reposoirs, barrières visuelles, matériaux variés, jouets, litière). En ce qui concerne les méthodes de prélèvements des produits biologiques, des mesures de raffinement spécifique (dont analgésie si nécessaire) sont mises en place pour chaque procédure.
Choix des espèces
De nombreuses thématiques de recherche sont menées sur les PNH et peuvent nécessiter l’utilisation de produits biologiques (ici sang et dérivés, LCR, moelle osseuse, urine, humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lait, liquide broncho-alvéolaire, sperme) soit pour des études préliminaires soit comme témoin négatif en comparaison aux produits récoltés lors de l’expérimentation. Les espèces PNH choisies sont celles utilisées le plus couramment en recherche biomédicale et pour lesquelles la communauté scientifique dispose du plus de données bibliographiques et de connaissances (Macaques cynomolgus, rhésus, singes verts et ouistitis). L’espèce prélevée est choisie sur demande du chercheur. Animaux de tous âges en fonction des demandes des utilisateurs. Les volumes prélevables sont ajustés en fonction de l’âge et du poids de l’animal.
Étude de l’implication de cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Le cœur prélevé chez les unes, greffé au niveau du cou chez les autres en une opération d'environ soixante minutes : 1 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une greffe d'îlots pancréatiques au niveau du rein, puis un contrôle de glycémie par prélèvement sanguin à la queue deux fois par semaine, l'expérience pouvant durer 56 jours. Le porteur écrit que ces procédures sont "bien tolérées" et n'affectent pas l'état général des animaux, après avoir listé la gêne au réveil, la douleur malgré le traitement, les difficultés de mouvement et les démangeaisons pendant la cicatrisation. Toutes sont tuées par dislocation cervicale, pour prélever le sang, les organes lymphoïdes et les greffons.
Objectifs
La transplantation est souvent le traitement le plus efficace, voire le seul, pour les patients en insuffisance terminale d'organe. Elle permet de remplacer un organe malade par celui d’un donneur génétiquement différent.Cependant, son efficacité à long terme est limitée par le rejet, principal facteur de perte de greffon. Ce rejet survient car le système immunitaire du receveur reconnaît le greffon comme un tissu étranger. Actuellement, le rejet est attribué à la reconnaissance du greffon par la réponse immunitaire adaptative. Nos recherches récentes explorent le rôle d’un autre bras du système immunitaire, l’immunité innée, révélant un potentiel thérapeutique inédit pour éviter et traiter le rejet du greffon. Le projet consiste à étudier l’implication des cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe. Les ojectifs du projet sont : 1) tester une nouvelle approche thérapeutique visant à modifier le greffon pour limiter l’activation de cellules innée et donc le rejet de greffe ; 2) analyser les intéractions entres cellules de l’immunité adaptatives et les cellules innée impliquées dans le rejet de greffe. Cette approche optimiserait la sélection des donneurs et prolongerait la survie des greffons, tout en améliorant la qualité de vie des receveurs. Le projet est divisé en 2 procédures, une pour chaque objectif. Des études récentes montrent que le type de rejet varie selon les cellules immunitaires impliquées et le type de greffe. Nous utiliserons donc diffèrents modèles de greffes. D’une durée de 5 ans, le projet pourrait impliquer jusqu’à 1184 souris, avec des expériences réalisées en séquence et arrêtées en cas d’hypothèse invalidée.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires dans le rejet de greffes et de leurs échanges avec d’autres cellules du système immunitaire. Ces connaissances permettront d’identifier de nouvelles stratégies pour limiter les réponses immunitaires indésirables après transplantation. L’évaluation de différentes approches aidera à sélectionner les plus prometteuses pour réguler ces interactions. Les résultats obtenus serviront de base à des études mécanistiques complémentaires, ouvrant la voie au développement de stratégies innovantes pour améliorer la survie des greffons et la prise en charge des patients transplantés.
Procédures
Chez les souris donneuses, une anesthésie et une analgésie sont administrées par injection abdominale (5 secondes), puis le cœur est prélevé (durée : 15 minutes). Chez les souris receveuses de greffon cardiaque, une anesthésie et une analgésie sont réalisées par injection abdominale (5 secondes). La greffe est effectuée au niveau du cou et dure environ 60 minutes. La douleur est prise en charge par trois injections abdominales d’analgésique (15 secondes chacune), complétées par un traitement supplémentaire (injection derrière l’œil, 5 secondes). L’expérience peut durer jusqu’à 56 jours. Chez les souris receveuses de greffon d’îlots pancréatiques, un traitement préparatoire est administré par injection abdominale (5 secondes). Une anesthésie et une analgésie sont ensuite pratiquées par injection abdominale (5 secondes). La greffe est réalisée au niveau du rein, sous anesthésie, et dure une dizaine de minutes. Un traitement complémentaire est administré par injection abdominale (5 secondes). Une seconde intervention est réalisée au niveau de l’abdomen pour la greffe (15 minutes), avec un suivi de la douleur assuré par trois injections abdominales d’analgésique (15 secondes chacune). Le suivi de la glycémie est effectué deux fois par semaine à l’aide d’un glucomètre (prélèvement sanguin à la queue, durée maximale : 5 secondes par prélèvement). L’expérience peut durer jusqu’à 56 jours.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements de sang peuvent provoquer du stress et une légère douleur. Les greffes de cœur et de cellules pancréatiques sont des interventions connues, et les problèmes éventuels sont surtout liés à l’anesthésie ou aux sutures pendant la chirurgie. Chaque opération peut causer une gêne au réveil, de la douleur malgré le traitement, ainsi que des difficultés de mouvement ou des démangeaisons pendant la cicatrisation. De manière générale, ces procédures sont bien tolérées et n’affectent pas l’état général des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure par dislocation cervicale, avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Les mécanismes de rejet d’organe ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
Un nombre suffisant de souris sera utilisé par groupe (prévu initialement 12 animaux pour obtenir 8 souris analysables par groupe), afin de permettre une analyse statistique fiable des données. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1280 souris (mus musculus).
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l’isolement. Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général et points limites associés à chaque chirurgie). Différents traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés au cours de la chirurgie pour prévenir tout douleur. Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées dans un environnement stérile pour éviter toute infection. Les animaux sont placés en armoire chauffante durant la phase de réveil. Les animaux sont suivis dans les 4-6 h post chirrugie, le lendemain, puis 2 à 3 fois par semaine. La fréquence sera augmentée selon l’apparition des signes cliniques.
Choix des espèces
La souris, grâce à sa similarité génétique et physiologique avec l’homme, est idéal pour étudier la réponse immunitaire allogénique. Notre projet utilise diverses lignées de souris génétiquement modifiées, afin d’étudier le rejet de greffe. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées (age de la maturité sexuelle) Age maximum 6 mois en fin de procédure.
Gestion d’une lignée de souris à phénotype dommageable associé à des dépôts calciques ectopiques pour prélèvements d’organes après euthanasie
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Homozygotes pour une mutation qui provoque des dépôts de calcium dans les artères, ces souris meurent d'une rupture de l'aorte entre 42 et 56 jours de vie. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans autre intervention que le développement de ce phénotype. Les prélèvements d'organes sont échelonnés à 7, 14, 21, 28, 35 et 42 jours, l'âge de 42 jours servant de plafond au-delà duquel aucun animal n'est maintenu en vie. Le porteur indique qu'aucune de ces souris ne peut être réutilisée ni adoptée parce qu'elles sont génétiquement modifiées, et présente leur mise à mort avant l'apparition des signes cliniques comme une gestion "éthique et réglementaire" du phénotype.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’assurer la gestion éthique et réglementaire d’un phénotype dommageable associé à une mutation génétique entraînant des dépôts anormaux de calcium dans plusieurs organes chez la souris. Les animaux présentant ce phénotype (souris homozygotes pour la mutation) développent un problème grave caractérisé par des accumulations importantes de calcium dans leurs artères, pouvant entraîner une mort précoce entre 42 et 56 jours de vie ; pour éviter toute souffrance, elles seront euthanasiées avant ou au début de l’apparition des signes cliniques. Les souris hétérozygotes et sauvages serviront respectivement à la reproduction pour maintenir la lignée et comme témoins pour les expériences. Ce projet permettra d’identifier les mécanismes biologiques responsables des dépôts anormaux de calcium liés à la déficience de la protéine d’intérêt. Les connaissances acquises pourront être transposées à l’homme, en particulier pour mieux comprendre les calcifications liées au vieillissement ainsi que celles observées dans des maladies rares comme le syndrome de Keutel, associé à une déficience de cette protéine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des dépôts anormaux de calcium dans les tissus liées à la déficience d’une protéine empechant ce phénomène et que l’on peut retrouver dans des maladies rares comme le syndrome de Keutel, mais également dans des pathologies chroniques fréquentes telles que l’athérosclérose, le diabète ou l’insuffisance rénale.
Procédures
L’intervention prise en compte dans ce projet correspond au développement spontané d’un phénotype dommageable d’origine génétique, caractérisé par l’apparition progressive de dépôts anormaux de calcium dans plusieurs organes. Ce phénotype qui peut entrainer la mort par rupture de l'aorte entre 1.5 et 2 mois de vie constitue la nuisance à laquelle les animaux peuvent être exposés . Aucune autre intervention n’est réalisée sur les animaux vivants. Les prélèvements d’organes sont effectués exclusivement après euthanasie (hors DAP)
Impact sur les animaux
Le problème qui apparait chez ces souris entraîne une mortalité par rupture de l'aorte entre 1.5 et 2 mois de vie. Ce décès est précédé par des signes cliniques tels qu’un aspect chétif et une posture prostrée, indiquant un risque accru de mortalité dès le stade le plus précoce d’apparition du problème qui se situe autour du jour 42 (J42) après la naissance. La majorité des expériences prévues seront réalisées entre J7 et J30, avant l’apparition de ce problème. Pour les rares souris devant être sacrifiées à J42, c'est-à-dire au moment où problème peut apparaitre, seules celles ne présentant jusqu'à ce stade aucun signe de fragilité ou d’attitude prostrée seront conservées pour prélévements d'organes. En cas d’apparition de tels symptômes ou de tout autre critère de points limites, les animaux seront immédiatement pris en charge par les zootechniciens et/ou les chercheurs qui assureront un suivi quotidien.
Devenir
Tous les animaux devront être euthanasiés à la fin de la procédure pour prélévements d'organes aux différents stades J7, J14, J21, J28, J35 et J42. Comme il s'agit d'animaux génétiquement modifiés, il n’est pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ni de les placer en adoption.
Remplacement
Les dépôts anormaux de calcium apparaissent dans de nombreux organes et tissus et peuvent être influencées par de nombreux paramètres spécifiques à ces organes. Les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions à l’origine de la mise en place de ces phénomènes. A ce jour, il n’existe pas d’alternative de remplacement et seule l’utilisation d’un modèle animal est possible pour l’étude de ces calcifications
Réduction
La reproduction des souris est réalisée de façon à obtenir uniquement le nombre d’animaux nécessaire pour nos recherches. Nous prenons en compte les particularités de la lignée, dont les portées comptent généralement entre 4 et 8 petits. En moyenne, 25 % de ces souris seront des témoins, 25 % des souris présentant la mutation étudiée (toutes deux utilisées pour les expériences), et les 50 % restants (souris porteuses d’une seule copie de la mutation) permettront d’entretenir la lignée et de produire de nouveaux animaux pour les futures études. De plus, nous prévoyons de prélever plusieurs organes sur chaque souris afin de maximiser les données recueillies et ainsi limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, comme les effets de la mutation ne dépendent pas du sexe, nous incluons à la fois des souris mâles et femelles dans nos analyses.
Raffinement
Les souris seront surveillées chaque jour par les soigneurs et/ou les chercheurs pour s’assurer qu’elles ne présentent aucun signe de souffrance. Si un animal montre des signes d’inconfort ou de mal-être, des mesures seront prises rapidement pour le soulager. À la naissance des petits, leur nid sera rendu plus confortable avec l’ajout de coton, en complément des éléments déjà présents dans les cages, comme des tunnels, pour favoriser leur bien-être. Le raffinement spécifique des souris mutées repose sur une anticipation stricte de l’évolution du phénotype dommageable. Aucun animal n’est maintenu au-delà de l’âge auquel des complications graves peuvent survenir (J42=âge plafond). La surveillance est renforcée avec des critères cliniques précoces déclenchant une euthanasie immédiate, garantissant l’absence de souffrance prolongée.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est une référence reconnue par la communauté scientifique internationale spécialisée dans l’étude des calcifications anormales dans des tissus qui normalement ne sont soumis à ces phénomènes. Actuellement, c’est le seul modèle animal génétiquement modifié qui présente des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes du syndrome de Keutel. Chez ces souris, les calcifications apparaissent très tôt et évoluent différemment selon les organes. Par exemple, elles commencent dès la première semaine de vie dans les artères et dès la deuxième semaine dans le système respiratoire. Pour bien comprendre comment ces calcifications se développent, l’étude doit débuter avant leur apparition (vers 7 jours de vie) et se poursuivre jusqu’à ce qu’elles soient complètement installées (vers 42 jours). Afin de suivre précisément cette évolution, nous réaliserons des observations quotidiennes tout au long de cette période.
Réalisation d’une preuve de concept sur la résorption et la tolérance d’un renfort de suture à base d’alginate sur des exérèses partielles d’organes tel que le poumon, l’estomac, le foie et la rate chez le modèle porcin (EU 1/3)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Obtenir le marquage CE d'un renfort de suture à base d'alginate, fabriqué en France plutôt qu'aux États-Unis ou au Japon, suppose une preuve de concept sur des organes de taille humaine. 44 porcs de trois à quatre mois vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Chacun subit une ouverture du thorax ou de l'abdomen d'au plus une heure trente, avec résection d'un morceau de huit centimètres sur trois de poumon, d'estomac, de foie ou de rate, vingt-cinq minutes de saignement laissées à mesurer, puis un transfert routier vers un autre établissement et des scanners de deux heures sous anesthésie pendant six à neuf mois. Le protocole ajoute deux porcs par groupe pour remplacer ceux qui mourront pendant la chirurgie ou qui seront tués à l'atteinte d'un point limite.
Objectifs
le projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs. Le pansement idéal n'existe pas, mais il doit avoir certaines caractéristiques importantes : 1/Garder la plaie humide et chaude, 2/Être changé selon les étapes de la cicatrisation, 3/Laisser passer l'air mais pas les bactéries, 4/Absorber l'excès de liquide de la plaie, 5/Ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller rapidement, 6/Être facile à appliquer et confortable, 7/Ne pas être toxique et être hypoallergénique, 8/Protéger des chocs, 9/Être transparent pour voir la plaie sans retirer le pansement, 10/Être le moins cher possible et réduire le temps de traitement. Les pansements à base d'alginate de calcium répondent à ces critères, mais ils sont principalement utilisés pour les plaies cutanées et très peu pour les organes internes lors de chirurgies. Pour contrôler les saignements, les chirurgiens utilisent différentes techniques. Si ces techniques ne suffisent pas, surtout en cas de saignements continus et étendus, ils utilisent des produits hémostatiques résorbables. Ces produits sont synthétiques et mettent du temps à se résorber. Nous voulons tester un produit naturel qui devrait se résorber plus rapidement. Enrichi en calcium, zinc et magnésium, il favorise la coagulation. Ce produit est un renfort de suture utilisé avec un système d'agrafage et sera suivi par imagerie scanner à différents moments. L'objectif est de vérifier son efficacité pour arrêter les saignements, suivre sa résorption et son impact sur les tissus. La preuve de concept de ce nouveau dispositif médical hémostatique pourrait mener à un nouveau produit pour gérer les saignements lors de sutures par agrafage en chirurgie. De plus, ce produit serait fabriqué en France, contrairement aux autres dispositifs fabriqués aux États-Unis et au Japon. La biocompatibilité de ce dispositif a été testée en laboratoire. Il y aura 4 groupes de 11 porcs opérés. Chaque groupe sera divisé en 3 sous-groupes de 3 porcs, correspondant à des périodes de suivi post-opératoire de 6, 7,5 et 9 mois. Deux porcs supplémentaires par groupe sont prévus en cas de décès pendant la chirurgie ou à cause d'une mise à mort liée à un point limite.
Bénéfices attendus
Le projet vise à vérifier l'efficacité d'un nouveau pansement naturel pour arrêter les saignements lors de chirurgies. Ce pansement sera utilisé avec des agrafes pour renforcer les sutures après l'ablation partielle d'un organe. Nous voulons aussi observer comment le pansement se dissout et s'intègre dans le corps au fil du temps. L'objectif est de développer un pansement hémostatique naturel, fabriqué en France, pour remplacer les produits synthétiques actuels
Procédures
EU1 fera la chirurgie, l’EU2 aura la charge de l’hébergement des animaux suite à la chirurgie et jusqu’à la fin u projet. Et l’EU3 aura la charge de réaliser les imageries à différentes étapes du projet. Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour permettre l’accès à l’organe d’intérêt tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie appropriées. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le retrait des points prendra quelques minutes (5 minutes) et se fera 15 jours minimum post-chirurgie. A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie pour évaluer le taux de résorption : transport, anesthésie et acquisition environ 2 h à chaque temps. Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Pour les chirurgies thoraciques, il est important de maintenir le vide pleural, qui permet au poumon de se gonfler et de se dégonfler correctement. Si ce vide est rompu, le poumon ne peut plus fonctionner correctement, ce qui peut entraîner une détresse respiratoire. Pour éviter cela, l'incision sera refermée hermétiquement et l'excès d'air sera aspiré de la cage thoracique pendant que le poumon est progressivement remis sous ventilation. La chirurgie sera réalisée sur le lobe accessoire droit du poumon, et la résection d'une partie de 8 cm de long sur 3 cm de large n'affectera pas la fonction respiratoire. Pour les chirurgies abdominales, comme celles impliquant l'estomac, le foie et la rate, l'incision des muscles peut causer une douleur importante. De plus, une ablation partielle d'un organe digestif peut perturber le transit intestinal. La résection des organes aura une taille de 8 cm de long sur 3 cm de large, mais cela n'affectera pas leur fonctionnalité. Des analyses biochimiques seront effectuées pour détecter toute perturbation à moyen ou long terme. C'est pourquoi un groupe d'animaux sera dédié à chaque type d'organe d'intérêt. Les procédures peuvent être douloureuses pour les animaux en post-opératoire, et des analgésiques seront administrés en fonction de leur état clinique. Après trois semaines, les animaux aptes au transport seront transférés dans une autre structure pour un hébergement de longue durée. À différents moments post-opératoires, les animaux seront transférés vers un centre d'imagerie pour passer des scanners. Le transport et les différentes manipulations peuvent générer du stress pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite, soit à l'issu de l'étude (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée après prélèvement de celui-ci.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu réséqué et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection d’organe en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.
Réduction
Nous utiliserons 44 animaux au total dont 11 animaux (9 animaux opérés et 2 animaux supplémentaires) répartis en 4 groupes. Les animaux supplémentaires par groupe sont prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Il n’y a pas d’approche statistique de réaliser. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur cadavres issus d'autres procédures.
Raffinement
Pour l’abord de la cage thoracique, l’intervention était prévue, initialement, en thoracoscopie (sous coelioscopie), ce qui ne nécessite que 3 incisions restreintes (caméra et 2 instruments). La forme de la cage thoracique est trop étroite pour travailler avec les pinces et le système d’agrafage sans risquer de provoquer des lésions des tissus environnants. La chirurgie ouverte a été retenue, avec un abord le long des côtes au niveau du 9ème espace intercostal. L’extrémité du lobe pulmonaire accessoire droit extériorisée permettra la mise en place de part et d’autre, des mors du système d’agrafage équipés du renfort. Cette résection volontairement limitée, n’empêche pas le poumon de fonctionner correctement par la suite et n'impacte pas significativement la respiration de l'animal au réveil. Pour l’abord abdominal, nous avons fait le choix d’une incision en suivant le bord sous costal d’une petite longueur à droite ou gauche suivant l’organe d’intérêt (estomac, foie ou rate) afin de n’avoir à sortir à l’aide d’une pince atraumatique l’extrémité de l’organe d’intérêt. De plus, nous réduisons au maximum la taille de l’incision afin de garder au maximum les autres organes dans la cavité empêchant ainsi la perte de chaleur corporelle et le dessèchement des organes. La procédure chirurgicale est réalisée sous analgésie et anesthésie, associée à l'application de points limites stricts et spécifiques du projet. Les animaux sont monitorés en continu. La survenue du moindre symptôme (dyspnée, détresse respiratoire, diarrhée, troubles digestifs) implique un avis vétérinaire. Si ceux-ci ne rétrocèdent pas spontanément ou après traitement, l'animal pourra faire l’objet d’une exclusion de l’étude ou d’une mise à mort sur avis vétérinaire. L’animal sera transporté dans un véhicule dédié (ambulance animalière ou transporteur agréé) vers l'établissement EU2 après avis vétérinaire. De plus, l’animal sera habitué (un renforcement positif), à monter dans la cage de transfert pour limiter le stress du départ. Suffisamment de foin pour permettre le couchage sera à disposition pendant le trajet en plus de la nourriture et de l'eau.
Choix des espèces
Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver des organes capables d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille des organes d’intérêt ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Les organes font approximativement : -poumon : 26 cm de hauteur et 15 cm de diamètre, la résection représente 3% du volume. -estomac : 25 cm de longueur, 12 cm de largeur et 8 cm d’épaisseur, la résection représente 1% du volume. -foie : 28 cm transversale et 16 cm de hauteur, la résection représente 3% du volume. -rate : 12 cm de longueur, 7 cm de largeur et 4 cm d’épaisseur, la résection représente 2% du volume. Le volume de résection de l’organe reste inférieur à 50%. En effet, pour des organes comme le foie et les poumons, nous pouvons vivre avec 50% en moins. Pour les organes tel que l’estomac, la rate, il possible de vivre sans avec un suivi médical plus méticuleux (vaccination, poche d’alimentation). De plus, ce sont des organes de grandes tailles et qui sont très souvent impliqués dans les plaies traumatiques ou des pathologies comme le cancer. Ces tailles sont similaires à celles retrouvées chez l’homme. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois.
Impact du microbiote des puces sur leur dynamique de reproduction et d’infection
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un seul souriceau de deux à cinq jours fournit aux puces le volume de sang que donneraient quatre à cinq souris adultes. 2 602 souris vont être utilisées, 1 324 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 278 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le projet cherche à savoir comment le microbiote des puces modifie leur reproduction et leur aptitude à transmettre le bacille de la peste, et annonce la mise au point d'une lignée cellulaire de puce qui remplacerait plus tard certaines expériences. Le stade de deux à cinq jours est retenu parce que la peau des souriceaux est fine et glabre, ce qui limite aussi les fuites d'insectes, et parce que leur perception de la douleur ne serait, selon le porteur, encore que partiellement intégrée.
Objectifs
La peste est une maladie mortelle transmise par les puces. Ce projet vise à étudier comment le microbiote influence la physiologie des puces et leur capacité à transmettre le bacille de la peste. Il s’agira également d’identifier les mécanismes moléculaires associés à ces effets. Dans une perspective de réduction du recours aux animaux, nous tenterons de développer une lignée cellulaire de puce permettant l’étude de ces mécanismes in vitro. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les interactions entre microbiote, physiologie vectorielle et dynamique épidémique, d’améliorer les modèles prédictifs, de contribuer au développement de nouvelles stratégies de lutte, et d’éclairer les conditions ayant conduit à la disparition historique de la peste en Europe ainsi que les risques actuels de réémergence.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur l’impact d'endosymbionte sur la dynamique de reproduction des puces, leur infection par l’agent de la peste et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Ces résultats permettront d’améliorer la compréhension des interactions entre microbiote, physiologie vectorielle et transmission du bacille de la peste. Ils contribueront également à renforcer les modèles prédictifs utilisés en santé publique pour évaluer les risques de réémergence de la maladie, notamment dans les zones anciennement touchées. A terme, ces travaux pourraient orienter le développement de nouvelles stratégies de surveillance ou de lutte ciblant les vecteurs, tout en favorisant la réduction du recours aux animaux grâce à la mise au point d’une lignée cellulaire de puce.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte. Dans le cadre de ce projet, nous visons à développer une lignée cellulaire de puce qui pourra remplacer certaines expériences in vivo dans de futures études.
Réduction
Nos approches expérimentales ont été conçues pour réduire significativement le recours aux animaux. (1) L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre restreint d’animaux. Un seul souriceau fournit un volume sanguin équivalent à celui obtenu à partir de quatre à cinq souris adultes dans un système artificiel comparable, ce qui contribue à une diminution notable du nombre total d’animaux utilisés. (2) Notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre le nourrissage des colonies pendant une semaine chaque mois sans compromettre leur survie, permettant ainsi de réduire la fréquence des nourrissages et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur maintien. (3) Nous avons également choisi de collecter des puces vierges d’âge similaire directement à partir des cocons présents dans les pots d’élevage pour les expériences de développement. Cette approche évite la mise en place de sous-colonies dédiées pendant deux mois, une méthode plus simple mais qui nécessiterait entre 16 et 24 souris par colonie, par traitement et par répétition, soit environ 384 à 576 souris. (4) Les expériences d’infection durent habituellement 27 jours. Nous avons choisi de les limiter à 20 jours, car notre expérience montre qu’il n’est plus nécessaire de prolonger les essais à 27 jours pour obtenir des données robustes et statistiquement fiables. Cette adaptation permet de réduire significativement le nombre de souris utilisées. (5) Ce protocole est mutualisé avec un autre projet impliquant le maintien des souches parentales. Les mêmes colonies de puces sont donc utilisées pour plusieurs projets, évitant la duplication des élevages et réduisant significativement le nombre total de souriceaux nécessaires. (6) Dans la mesure du possible, nous maximisons également les données obtenues à partir d’une seule expérience, en regroupant plusieurs tests sous une même condition témoin.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.
Microévolution du bacille de la peste dans le vecteur puce : dynamiques et conséquences fonctionnelles
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Exposés une heure au contact de puces, des souriceaux de deux à cinq jours sont utilisés pour nourrir les colonies d'insectes. 5 104 souris vont être utilisées, 2 760 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 344 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique qu'au-delà d'un millier de puces l'alimentation simultanée provoque une perte de sang importante, une perte de conscience puis un décès rapide, et qualifie la phase consciente de brève. L'objet du projet est de savoir si le bacille de la peste mute dans la puce, où et quand, et la description des procédures tient en une phrase, sans dire combien de souriceaux sont exposés à ces effectifs de puces.
Objectifs
Le bacille de la peste, responsable de la maladie du même nom transmise par les puces, connaît des phénomènes de microévolution, révélés par des signatures génétiques partiellement documentée. Toutefois, on ignore encore si ces microévolutions surviennent dans le vecteur. Si c’est le cas, on ne sait ni où ni quand elles apparaissent, ni quelles fonctions elles remplissent dans la colonisation de la puce. Ce projet vise à lever ces inconnues en identifiant ces signatures moléculaires, en les localisant de façon spatio-temporelle chez la puce, puis en évaluant leur impact sur la capacité du bacille à produire une infection transmissible chez l’insecte. En améliorant notre compréhension des mécanismes d’adaptation du bacille dans son vecteur, cette recherche contribuera à évaluer le risque d’émergence épidémique et à concevoir de nouvelles stratégies de lutte.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur les mécanismes d’adaptation de Y. pestis à ses vecteurs, en identifiant les mutations associées à la persistance et à la transmission. Ces données permettront d’évaluer plus finement le risque d’émergence épidémique et de cibler de nouvelles stratégies de lutte. Les bénéfices attendus sont en santé publique, animale, comme en recherche fondamentale.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte.
Réduction
L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin fourni par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent, ce qui contribue significativement à la réduction du nombre total d’animaux utilisés. Notre stratégie expérimentale a également été conçue pour limiter le recours aux animaux, tout en maintenant la robustesse scientifique du modèle. Nous avons aussi choisi de travailler avec une souche de puce dont le cycle biologique permet un nourrissage bihebdomadaire, contrairement à d’autres espèces qui nécessitent un nourrissage tous les deux jours à minima. Ce choix permet de réduire sensiblement le nombre de souriceaux requis. Par ailleurs, notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre un nourrissage une fois par mois sans compromettre la survie des colonies, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour leur maintien. Pour l’étude sur l’émergence de nouveaux variants, nous avons choisi un nourrissage tous les deux jours. Ce rythme est plus fréquent que le bihebdomadaire habituel, mais reste inférieur au quotidien. Il maximise les chances de détection d’un événement évolutif sans pour autant mobiliser davantage d’animaux qu’un nourrissage quotidien, qui ne nous apporterait pas d’information supplémentaire utile. Enfin, nous regroupons autant que possible plusieurs tests en présence d’une condition témoin.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.
Comprendre le métabolisme de la souris présentant une altération du compartiment énergétique cellulaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
1 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue, chacune isolée de ses congénères pendant treize à soixante-dix jours. Elles passent cinq jours à 30 °C puis cinq jours à 14 °C, subissent un jeûne de vingt-quatre heures, un régime engraissant pouvant durer quatre-vingt-onze jours, un test d'effort et seize sessions de course de cinquante minutes sur tapis roulant. Le porteur qualifie lui-même le tapis de stimulation aversive et l'épuisement de transitoire. Les retombées annoncées, mieux prévenir ou traiter obésité, diabète et maladies du foie et du cœur, sont renvoyées au conditionnel et à un terme non précisé, quand l'isolement, le froid et l'épuisement sont, eux, programmés.
Objectifs
Les mitochondries, petites structures essentielles au bon fonctionnement des cellules, jouent un rôle central dans la régulation du métabolisme de l’organisme. Elles envoient des signaux importants pour permettre aux organes de communiquer entre eux. Ces signaux dépendent de l’état de leur membrane, de leur capacité à changer de forme pour s’adapter, et de leurs systèmes de contrôle de qualité, notamment la dégradation sélective des mitochondries défectueuses. Le rôle direct des protéines qui assurent ces fonctions dans la régulation du métabolisme dans l’organisme vivant reste pourtant mal compris. Notre projet vise à analyser ce qui se passe lorsque certaines de ces protéines sont absentes. Grâce à des modèles de souris modifiées, nous étudierons comment ces perturbations influencent le transfert d’énergie entre les cellules, l’équilibre du métabolisme, et la communication entre organes. Ces travaux permettront de mieux comprendre comment la stabilité des mitochondries contribue au bon fonctionnement global de l’organisme et d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre comment la qualité et le bon fonctionnement des mitochondries influencent l’équilibre métabolique de l’organisme. En identifiant les mécanismes qui permettent aux cellules de s’adapter à des contraintes physiologiques (changement de température, d’alimentation ou d’activité), ce travail pourrait aider à mieux prévenir ou traiter des maladies chroniques liées au métabolisme (obésité, diabête, maladie du foie et de coeur). À terme, il pourrait contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques centrées sur la préservation de la fonction mitochondriale.
Procédures
La mesure de la balance énergétique sera réalisée sur une période de 5 à 20 jours, impliquant l’individualisation des animaux pendant 13 à 70 jours. La température d’hébergement variera de 30 °C (5 jours) à 14 °C (5 jours), avec une phase intermédiaire à 22 °C (5 jours). Trois mesures d’imagerie sous anesthésie générale, d’une durée d’environ 20 minutes chacune, seront effectuées. Les animaux recevont un régime pour induire une prise de poids d'une durée maximal de 91 jours. Les animaux seront mis à jeun une fois et durant 24heures. Les animaux réaliseront un test d'effort de 30 minutes maximum et 16 sessions d’endurance de 50 minutes maximum chacune afin de stimuler l’activité physique. La mesure de la composition corporelle sera réalisée par imagerie magnétique, l'examen non invasif dure 2 minutes et il sera effectué un maximum de 13 fois par souris.
Impact sur les animaux
Individualisation (13 à 70 jours) : isolement social et absence de contacts tactiles → stress comportemental (nuisance modérée). Régime alimentaire enrichi en graisses : prise de poids (20–25 %) et surcharge métabolique progressive → nuisance modérée. Analyse de composition corporelle (~2 min) : immobilisation temporaire → stress léger. Variations de température (22 °C, 30 °C, 14 °C) : perturbation physiologique, risque de stress thermique surtout à 14 °C → nuisance modérée. Échocardiographie sous anesthésie: induction et réveil → stress léger à modéré ; faible risque d’effets transitoires (désorientation, altération comportementale). Mise à jeun de 24 h -> nuisance modérée, peut entraîner un stress transitoire, une légère perte de poids et une hypoglycémie modérée, sans effet délétère durable attendu. Tests sur tapis roulant : apprentissage du fonctionnement du tapis → nuisance légère (stimulation aversive, comportement d'évitement), tests d’effort/endurance → épuisement transitoire (nuisance modérée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.
Remplacement
L’étude du rôle des protéines mitochondriales (siége de la production d'énergie) dans le métabolisme nécessite de comprendre leurs interactions dans l’organisme entier, car plusieurs organes communiquent entre eux pour maintenir l’équilibre énergétique. Ces échanges complexes ne peuvent pas être reproduits uniquement dans des modèles cellulaires. Cependant, chaque fois que cela est possible, nous utiliserons des approches in vitro (cultures cellulaires, lignées ou cellules primaires) pour limiter le recours aux animaux. Ces expériences permettront de mieux comprendre les mécanismes de base et de confirmer ensuite, de manière ciblée, les observations faites chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé à partir de nos données préliminaires afin de garantir la robustesse des résultats, tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Les effectifs retenus permettent d’obtenir des résultats fiables et seront analysés avec des méthodes statistiques adaptées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures sont mises en place. Les souris seront également utilisées après leur mise à mort pour des analyses complémentaires, ce qui évite d’élever des animaux supplémentaires. L’imagerie permettra de suivre les mêmes animaux sur le long terme, ce qui limite la constitution de nouvelles cohortes. De plus, l’utilisation de cages de calorimétrie indirecte rend possible la combinaison de plusieurs mesures (activité, alimentation, dépense énergétique, etc.) sur une même souris, ce qui réduit la variabilité et par conséquent le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les analyses calorimétriques et les mesures de composition corporelle sont non invasives. Les souris, une fois séparées de leurs congénères, sont logées individuellement dans un environnement enrichi comprenant une nacelle et du coton pour la nidification, ce qui favorise leur bien-être et garantit la fiabilité des données. Du matériel supplémentaire pour construire le nid est ajouté afin de permettre aux animaux de s’adapter aux variations de température et de maintenir leur température corporelle, même à des températures basses. Les cages sont non hermétiques pour permettre la circulation des odeurs, un contact visuel indirect et l’absence d’interférence avec les vocalisations des congénères. En cas de douleur ou d’inconfort, une anesthésie et/ou analgésie adaptées sont utilisées. Pour les tests sur tapis roulant, des points limites ont été établis pour éviter l’épuisement. Les souris sont surveillées en permanence, et le tapis est arrêté si un animal ne peut plus le remonter après trois passages ou s’il semble gêné dans sa course. Dans un objectif de raffinement, une fiche d’observation détaillée est utilisée pour chaque procédure, avec une évaluation hebdomadaire. Ces évaluations permettent de détecter rapidement toute anomalie comportementale ou physiologique. Toute atteinte des points limites entraîne une décision rapide, pouvant inclure la mise à mort anticipée si nécessaire, conformément aux principes éthiques de l’expérimentation animale.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour étudier ce processus in vivo, en raison de la forte conservation des mécanismes métaboliques et de la disponibilité d’outils génétiques et analytiques adaptés. Les animaux jeunes adultes (entre 8 et 18 semaines) seront utilisés pour les explorations en cages de calorimétrie indirecte, car à cet âge les structures cérébrales et la masse corporelle sont stabilisées, ce qui garantit des mesures fiables et comparables au cours du temps. Pour la première expérience, les animaux seront reçus jeunes, à 5 semaines, afin de permettre une semaine d’adaptation et quatre semaines de régime alimentaire avant les mesures. Trois analyses de la fonction cardiaque seront réalisées, entre 8 et 16 semaines, et deux mesures en calorimétrie indirecte seront effectuées, entre 10 et 18 semaines. Les résultats obtenus dans cette première exploration permettront de déterminer l’âge des animaux pour la suite de l'étude, en respectant la contrainte que les mesures en calorimétrie ne seront réalisées que chez des animaux âgés de 10 à 18 semaines.