Autre recherche fondamentale

Inoculées dans le bas-ventre avec une souche de toxoplasme puis vaccinées par deux injections intramusculaires dans les pattes arrière, 60 souris femelles sont toutes tuées à l'issue, l'infection par un agent pathogène interdisant tout autre devenir. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré pour la totalité des animaux. Le projet teste une immunothérapie à ARN visant les cellules qui hébergent les kystes du parasite, transposée des vaccins contre le Covid-19 et des traitements anticancéreux. Le porteur écrit pourtant que la souche choisie ne provoque ni symptôme clinique ni souffrance notable et que les seules nuisances attendues tiennent aux deux piqûres, ce qui laisse la souffrance modérée déclarée pour les 60 souris sans description.

Objectifs

Validation in vivo d'une immunothérapie à ARN contre les parasites persistants à l'intérieur des cellules. Ce projet propose une approche innovante pour traiter le parasite appelé toxoplasme en ciblant non pas directement le parasite dormant, mais les cellules qui l’hébergent sous forme de kyste. En s’inspirant des stratégies d’immunothérapie développées contre les rechutes du cancer et la vaccination contre le Covid-19, notre objectif est de stimuler une réponse capable de détruire de façon ciblé les cellules infectées par les kystes, via une thérapie à ARN. Nous testons une immunothérapie à ARN dans un modèle murin infecté par le toxoplasme. En ciblant des protéines capables d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques, nous espérons éliminer les cellules infectées par les kystes. Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité, la sécurité et la réponse immunitaire de cette approche innovante.

Bénéfices attendus

L’approche que nous proposons, est une première étape de validation d’une nouvelle stratégie thérapeutique adapté à l’infection de la souris par le toxoplasme extrapolable à l'ensemble de ses hôtes mammifères . Cette méthodologie pourrait ensuite être étendue à d’autres infections parasitaire à formes dormantes.

Procédures

Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont (1) l'inoculation dans le bas ventre de 100 µL d'une souche avirulente pour la souris (la durée de cette intervention est estimée à 15 secondes) et (2) l'inoculation de l’immunothérapie de 50 µL en intramusculaire dans chacune des 2 pattes postérieures soit 100 µL au total (la durée de cette intervention est estimée au maximum à 30 secondes par injections soit 2 x 30 s), qui peuvent entrainer une gêne sur un laps de temps très court. Ces interventions seront réalisées une seule fois pour chaque souris.

Impact sur les animaux

La souche de toxoplasme inoculée est sélectionnée pour sa non virulence pour la souris. Elles ne provoquent pas de symptômes cliniques ni de souffrance notable chez les animaux, ce qui garantit une charge parasitaire suffisante pour l’étude tout en préservant leur bien-être. Le protocole inclura un suivi rigoureux des animaux qui seront surveillés quotidiennement afin de détecter tout signe de détresse ou d'effet indésirable en lien avec le traitement. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiellement attendus sont liés à l'injection vaccinale : 2 injections intramusculaires de 50 µL chacune, même si les traitements à ARNm (vaccins COVID-19 ou immunothérapies anticancéreuses) ont démontré une innocuité préclinique solide chez la souris.

Devenir

Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris seront systématiquement mises à mort après avoir été au préalable endormis en fin de procédure.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible à ce stade du projet. L’objectif est de valider in vivo un traitement à base d’ARN visant à éliminer les formes dormantes de parasites intracellulaires. Les mécanismes immunitaires complexes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro. Le modèle murin infecté par le toxoplasme est actuellement le seul disponible pour reproduire une infection chronique à formes dormantes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été strictement limité. L’expérience sera conduite en duplicat sur trois groupes de 10 souris seulement, soit un total de 60 animaux, ce qui représente un compromis entre puissance statistique et minimisation du nombre de sujets. Ce design expérimental a été optimisé pour maximiser l’information obtenue par animal.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Du fait du faible nombre de souris inclues dans l’étude les souris inoculées seront hébergées dans des cages pouvant contenir plus de souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les souris recevront un traitement antalgique en cas de symptôme afin d'éliminer toute douleur potentielle liée à la procédure. L’infection sera induite par une souche adaptée à l’établissement d’une infection chronique sans signes cliniques pour la souris, ce qui permet d’éviter toute souffrance chez ces dernières. Les animaux seront anesthésiés et sous antalgique pour minimiser tous risque de stress et souffrance au cours de l'injection du traitement en intramusculaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter précocement tout signe de détresse ou de dégradation de l’état général et la fréquence d’observation est accentuée (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) en cas de symtômes. Des critères d’arrêt (score clinique) seront mis en place pour garantir leur prise en charge immédiate si nécessaire.

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l'entretien du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement et l'entretien de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas le maintien des souches). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur la culture in vivo du toxoplasme. Des souris femelles (âgées de 4 à 8 semaines) seront utilisées pour la mise en place d'une infection chronique par le toxoplasme et tester la réponse au traitement ARN. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimum pour lequel l’injection des volumes d’inoculum et de traitement envisagés sont bien tolérés.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, trente d'entre elles nourries pendant trente-huit semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour les rendre obèses. Vingt subissent un jeûne nocturne allant jusqu'à quinze heures, puis une injection de glucose et six prélèvements sanguins à la queue en deux heures, sur animal conscient. Le porteur écrit que ces souris prendront du poids et deviendront moins actives à cause de l'obésité, et qu'elles pourront ressentir la faim pendant le jeûne. Le bénéfice annoncé, un traitement contre la fibrose du foie, reste au futur, tandis que les tissus prélevés après la mise à mort alimenteront aussi d'autres projets de l'équipe sur l'obésité, le prédiabète et les atteintes cardiaques et rénales.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent un enjeu majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Parmi ces maladies, la stéatose hépatique non alcoolique, qui correspond à une cirrhose du foie sans consommation d’alcool, est en forte progression à cause de l’augmentation de l’obésité ou encore du diabète de type 2. Dans cette maladie, il y a une accumulation importante de graisses dans les cellules du foie ,ce qui entraine une cicatrisation du foie appelée fibrose hépatique. Cette fibrose va rigidifier des parties du foie conduisant progressivement à une perte de fonction du foie et pouvant évoluer vers une insuffisance hépatique terminale. De plus, la fibrose hépatique chronique peut être responsable du développement de cancer du foie, ce qui accentue la gravité de cette pathologie. La stéatose hépatique non alcoolique est souvent diagnostiquée à un stade avancé, lorsque les lésions dans le foie sont déjà présentes. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace pour inverser ou ralentir cette fibrose. Le développement de traitements efficaces contre la fibrose étant un enjeu majeur en santé, l’objectif principal de ce projet est de tester chez la souris un nouveau composé pour traiter la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement d’un traitement efficace pour lutter contre la progression de la fibrose hépatique. De plus ce projet permettra de mieux connaitre les mécanismes biologiques encore mal connus responsables du développement de la maladie.

Procédures

Pendant 38 semaines, 30 souris seront nourries avec un régime riche en graisses et cholestérol pour les rendre obèses et 10 souris recevront un régime standard. Pour tester la glycémie au cours du régime, 20 souris parmi les 40 souris du projet seront mis à jeun sur la nuit (maximum 15h). Le lendemain, une injection de glucose (moins de 20 secondes) sera réalisée sur l'animal conscient et des prélèvements de sang se feront au niveau de la queue. Les prélèvements seront réalisés sur un temps court (durée inférieure à 2 minute) et de façon répétée en 6 fois sur une période de 2h dans la même journée. Un autre prélèvement sanguin au niveau de la queue (une seule prise) sur la totalité des 40 souris sera réalisé 11 semaines plus tard.

Impact sur les animaux

Les souris qui recevront sur 38 semaines le régime riche en graisses et cholestérol vont prendre du poids et devenir un peu moins actives à cause de l'obésité. Durant la période de jeûne de 14-15h sur la nuit, les souris privées de nourriture pourront ressentir une sensation de faim. Lors de l’injection de glucose, le passage de l’aiguille de petite taille au travers de la peau sera de très courte durée (moins de 20 secondes) et entrainera un inconfort chez les souris. Des prélèvements sanguins à la queue seront pratiqués sur animaux conscients après 16 et 27 semaines de régime. Ces prélèvements bien que rapides (durée < 2 minutes) sont susceptibles d’induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Après les 38 semaines de régime, tous les animaux seront mis à mort par une méthode d'euthanasie réglementaire pour prélever les tissus et le sang. L'analyse de ces prélèvements nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement dans le foie de la fibrose et d'identifier les cibles thérapeutiques de notre composé.

Remplacement

ll n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire de manière fiable l’environnement in vivo que l'on retrouve dans un organisme vivant et dans lequel plusieurs types de cellules interagissent entre elles et participent au développement de la fibrose . De plus, cette maladie se développe lorsqu’il y a des problèmes métaboliques (ex hausse de la glycémie) dans l’organisme entier suralimenté, ce qui justifie l’utilisation d’animaux. Enfin il n’existe pas de méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire pour tester l’efficacité d’un composé sur la fibrose hépatique.

Réduction

Le nombre total de souris a été calculé pour avoir un effet statistique significatif sur les paramètres étudiés. A la fin de l’étude, des tissus autres que le foie pourront être prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe en lien avec d’autres maladies étudiées dans notre laboratoire (obésité, pré-diabète, atteintes cardiaques, rénales). Pour l’analyse des données recueillies lors des différentes expériences nous appliquerons les tests statistiques appropriés en utilisant un logiciel d'analyse.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement et la litière des cages sera plus fréquemment changée. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel expérimenté. Pour diminuer le stress lors des prélèvements de sang, les animaux seront habitués au mesure de contention quelques semaines avant la prise de sang. Pour éviter d’avoir recours au gavage source de stress, le traitement sera administré quotidiennement (5 jours sur 7) dans de la nourriture constituée de beurre de cacahuète pour l’appétence. Le traitement avec le composé a déjà été administré chez le rongeur (rat et souris) dans de précédents travaux sans entrainer d’effets indésirables

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont très sensibles au régime riche en graisses et développe une obésité et une stéatose hépatique non alcoolique similaire à la maladie humaine. Les souris utilisées seront de jeunes mâles âgés de 5 à 6 semaines car la plupart des études sur le modèle murin pour étudier cette maladie sur une longue période utilisent de jeunes souris adultes. Ainsi, grâce aux nombreuses études scientifiques publiées, de nombreuses informations sur la souris sont disponibles et permettront de mieux comparer les résultats obtenus dans ce projet.

Un trou est percé dans l'os du crâne ou dans la mandibule de chaque rat, sous anesthésie profonde, pour y implanter un biomatériau. 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des douleurs postopératoires de vingt-quatre heures au crâne, de trois jours à la mâchoire, des hématomes, des œdèmes mandibulaires et un risque de fracture. Le porteur présente le percement des deux côtés du crâne d'un même animal comme une économie d'animaux, et précise que la lésion mandibulaire ne sera faite que d'un côté pour ne pas empêcher les rats de s'alimenter. Tous sont tués à l'issue pour que les os implantés soient examinés au microscope.

Objectifs

Les os du crâne et du visage sont particulièrement exposés aux pertes osseuses d’origine traumatique, tumorale, infectieuse ou congénitale. Leur réparation nécessite le développement de matériaux capables de soutenir mécaniquement la zone tout en favorisant la repousse osseuse. Avant toute application clinique, ces matériaux doivent être testés dans des modèles animaux adaptés. Le modèle le plus couramment utilisé est la réalisation d’une petite lésion dans l’os du crâne du rat. Cet os n’est pas soumis à des forces mécaniques importantes (il ne supporte pas de charge). Ce modèle est simple et reproductible ; il permet d’implanter deux matériaux chez le même animal (un de chaque côté du crâne), ce qui permet de vérifier la reproductibilité de la réparation de l’os au sein du même animal. Il est donc idéal pour sélectionner et comparer plusieurs matériaux selon leur capacité à favoriser la formation osseuse. Cependant, ce modèle ne reproduit pas les conditions réelles pour les os soumis à des forces mécaniques importantes, comme la mâchoire inférieure. C’est pourquoi un second modèle est utilisé en complément consistant en une petite lésion réalisée sur un seul côté de la mâchoire inférieure. Ce modèle simule un environnement mécanique plus réaliste, d’un seul côté pour ne pas gêner l’alimentation des rats. L’utilisation séquentielle et complémentaire de ces deux modèles permet de combiner leurs avantages : •Le modèle crânien, sans contrainte mécanique, sert à sélectionner les matériaux les plus prometteurs dans un contexte simple et reproductible. •Le modèle de la mâchoire inférieure, soumis à la mastication, permet ensuite de valider l’intégration osseuse de ces matériaux dans des conditions proches de la réalité clinique. L’objectif final est de développer et valider des matériaux capables de restaurer efficacement les pertes osseuses importantes de la tête et du visage, afin de préparer leur utilisation future chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet de recherche fondamentale pré-clinique pour la réparation des os du crâne et de la face. Alors que la prévalence des grandes pertes osseuses causées par des traumatismes diminue dans les pays de l'UE, les cas de cancer maxillo-faciaux attribués au papillomavirus humain augmentent, en particulier chez les jeunes adultes. Les techniques actuelles de reconstruction osseuse altèrent considérablement la qualité de vie des patients. Pouvoir proposer des matériaux qui s’intègre à l’os quel que soit les contraintes mécaniques qu’il subit, sans casser permettrait d’apporter de nouvelles solutions aux patients, y compris sur des os difficiles à reconstruire comme ceux de la mâchoire inférieure.

Procédures

Réalisation d'une petite lésion osseuse dans le crâne ou dans la mandibule, l'animal étant profondément endormi, (10min, n=12 rats / groupe / temps d'analyse), Prélèvement sanguin (1min, n= 6 rats/groupe/temps d'analyse), Imagerie scanner sous anesthésie gazeuse (10min, tous les rats non mis à mort). Injection de produit de contraste d'imagerie, l'animal étant endormi profondément (1min par injection/œil et 10 min entre les deux injections, n= 6 rats /groupe/temps d'analyse). Injection d'un produit de marquage vasculaire l'animal étant profondément endormi (1min, n= 6 rats /groupe/temps d'analyse).

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoires modérées au niveau du crâne pendant 24h, hématomes. Douleurs post opératoires modérées au niveau de la machoire pendant 3 jours, hématomes et œdèmes mandibulaires. Faible risque de fracture mandibulaire. Pour les rats subissant des injections, ils peuvent avoir des douleurs légères au point de prélèvement.

Devenir

Tous les animaux implantés seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de permettre des analyses histologiques.

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’interaction de différents types cellulaires. Les matériaux utilisés seront tous validés préalablement in silico par des tests de simultations informatiques et des tests mécaniques; puis par des tests in vitro pour vérifier leur biocompatibilité cellulaire. Néanmoins, les processus complexes impliqués dans la régération osseuse ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. La réalisation de défaut osseux dans le crane et la mandibule chez le rat permettra de sélectionner les matériaux adéquats pour favoriser leur intégration osseuse, y compris dans des situations de contraintes mécaniques importantes.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et par temps d'analyse est justifié en fonction de nos objectifs de mise au point. Sur le plan statistique, la réparation osseuse et la vascularisation seront quantifiés et les différents groupes comparés grâce à l'application de différents tests statistiques adaptés. Une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie générale, l’utilisation d’une anesthésie locale, et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication systématique en per et également post-opératoire 72h, et l’établissement de points limites adéquats. Concernant le modèle mandibulaire, une nourriture en gelée sera donnée 15 jours suivant la chirurgie pour prévenir au mieux tout risque de douleur et de fracture, le retour à la nourriture en croquette sera validée par l'imagerie à J15. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée les 5 premiers jours puis quotidienne (6 jours sur 7). Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de 2 individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude du tissu osseux. A partir de 8 semaines et jusqu'à 5 mois, les rats ont terminés leur croissance et sont considérés comme de jeunes adultes.

Réutilisés dans un autre projet plutôt que tués, 12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont castrés sous anesthésie, l'intervention étant plafonnée à une heure, puis évalués sur la douleur post-opératoire que le porteur qualifie de modérée et transitoire. La molécule analgésique testée peut par ailleurs entraîner une sédation, des troubles gastro-intestinaux et une modification du comportement. L'intervention retenue pour produire cette douleur est une chirurgie que le porteur nomme lui-même "de convenance", et l'étude vise un usage à la fois humain et vétérinaire.

Objectifs

L’analgésie représente un pilier fondamental de toute intervention chirurgicale, tant en médecine humaine qu’animale. Une gestion optimale de la douleur contribue non seulement à améliorer le confort du patient, mais aussi à favoriser une récupération post-opératoire plus rapide, plus sûre et avec moins de complications. Elle participe également à une meilleure qualité globale de la prise en charge. Dans ce contexte, cette étude vise à évaluer l’efficacité analgésique d’une molécule innovante, en vue de son potentiel usage en médecine humaine et vétérinaire. L’objectif est d’apprécier ses effets sur la douleur post-opératoire, sa tolérance et son intérêt en tant qu’alternative aux traitements antalgiques conventionnels.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge de la douleur post-opératoire : en évaluant une nouvelle molécule analgésique, ce projet vise à proposer des alternatives efficaces et potentiellement mieux tolérées que les traitements classiques. Réduction de la consommation d’antalgiques conventionnels : si la molécule testée montre une bonne efficacité, elle pourrait permettre de diminuer l’utilisation de médicaments opioïdes ou AINS, souvent associés à des effets secondaires.

Procédures

Les animaux sont soumis à une procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux;

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue : - Douleur post-opératoire : bien que des protocoles analgésiques soient mis en place, une douleur modérée transitoire peut survenir après la castration. - Effets secondaires liés aux molécules analgésiques : selon le traitement administré, des effets indésirables légers sont possibles (sédation, troubles gastro-intestinaux, modification du comportement, etc). - Stress de l’anesthésie, hypothermie lors de l’anesthésie.

Devenir

Le projet étant peu invasif et ne nécéssitant pas d'euthanasie, les chiens pouront être réutilisés pour un autre projet.

Remplacement

La réponse à l’objectif de l’étude nécessite une évaluation directe de la réponse à la douleur, ce qui ne peut être réalisé que sur l’animal vivant. En effet, il n’est pas envisageable de tester une molécule innovante directement chez l’homme ou en clinique vétérinaire, en raison des risques encore inconnus liés à son utilisation.

Réduction

Au total, 12 animaux seront utilisés (6 + 6). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables sur l’évaluation de l’efficacité d’une nouvelle molécule.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après la chirurgie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des chiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : AINS et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique.

Choix des espèces

Le modèle de chien a été choisie en raison de la pertinence directe du modèle animal avec l’application clinique visée. En effet, la molécule testée présente un potentiel d’utilisation non seulement en médecine humaine, mais également en médecine vétérinaire, notamment dans la gestion de la douleur post-opératoire. Le chien étant une des principales espèces concernées par ce type d’indication (chirurgie de convenance, douleur aiguë), il constitue un modèle approprié, à la fois pour l’évaluation de l’efficacité analgésique et pour l’extrapolation clinique future. De plus, les protocoles d’évaluation de la douleur sont bien validés chez cette espèce, ce qui garantit la fiabilité des données recueillies. Des chiens adultes seront utilisés dans ce projet, car ils représentent la catégorie d’animaux la plus fréquemment concernée par les interventions chirurgicales en pratique clinique. Leur utilisation permet ainsi de reproduire des conditions proches de la réalité vétérinaire.

Pour valider un substitut de peau fabriqué avec des cellules modifiées afin d'échapper au rejet, 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est anesthésié, un morceau de peau du dos lui est retiré et le substitut greffé, pour une chirurgie d'environ quinze minutes. Le porteur indique que l'opération peut provoquer une douleur et une perte de poids pendant trois à quatre jours, et que l'isolement en cage individuelle quatre jours avant l'expérience induit un stress. Toutes sont tuées pour prélever la peau en cours de cicatrisation, les observations visuelles de la plaie ne suffisant pas, selon lui, à conclure sur l'efficacité du substitut.

Objectifs

En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base aujourd’hui sur l’utilisation de substituts cutanés préparés avec les cellules du patient. Cependant, la disponibilité limitée de cellules saines du patient et le long procédé de fabrication peut mettre en jeu la vie du patient. Une des solutions envisagée pour pallier au problème de disponibilité de cellules saines et limiter les temps d’attente est d’utiliser les cellules d’une autre personne saine. La contrainte alors rencontrée est le phénomène de rejet. Pour contrer cela, il est possible d’utiliser les propriétés de tolérance immunitaire d’une molécule centrale dans la protection du foetus contre le rejet par le système immunitaire maternel. En se basant sur cette stratégie, nous avons développé une méthode permettant de modifier des cellules de peau de manière à permettre une production contrôlable de cette molécule. L’objectif de ce projet est maintenant de valider la capacité de notre substitut cutané immunotoléré, préparé dans des conditions correspondant aux exigences réglementaires d’un médicament, à reformer une peau fonctionnelle après greffe.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de sélectionner un milieu de culture chimiquement défini répondant aux exigences règlementaires d’un médicament et de valider la capacité du substitut immunotoléré à favoriser d’une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés immunotolérés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés). En d’autre terme, ce projet a pour objectifs, à court et moyen termes de sélectionner les conditions optimales de culture de substituts cutanés universels pour, à plus long terme, développer le traitement des grands brulés en proposant un accès plus rapide et universel à des greffons tissulaires pour des patients chez qui l’autogreffe est limitée voire même impossible.

Procédures

Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à l’enlèvement d’un morceau de peau et une greffe d’un substitut cutanée sur le dos pour une durée moyenne de chirurgie de 15 minutes par souris.

Impact sur les animaux

La nécessité d’isoler les animaux le temps de la procédure et la greffe d’un substitut de peau peuvent induire un stress. L’anesthésie peut provoquer chez les animaux une légère baisse d’activité au réveil pendant une ½ journée. La chirurgie peut provoquer une douleur et une légère perte de poids pendant 3 à 4 jours.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux inclus dans l’étude est nécessaire pour prélever la peau en cours de cicatrisation et réaliser les analyses qui viendront compléter les observations visuelles de la plaie et permettre de conclure à l’efficacité du substitut cutanée. .

Remplacement

Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts cutanés en 3D, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe, de sa maturation et des processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation ex vivo qui reproduisent plus fidèlement l’environnement structurel et moléculaire de la peau sont eux limités par l’absence de mécanismes de coagulation, d’inflammation et de réponse métabolique. Le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n’est ainsi pas possible ici car seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire, notamment des effets physiopathologiques de la possible réponse inflammatoire à la suite d’une xenogreffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études in vitro de culture cellulaire 2D et 3D ont été effectuées pour valider la non toxicité et la fonctionnalité biologique de la peau greffée préparée dans différents milieux de culture. Des tests statistiques prédictifs du nombre nécessaire d’animaux pour atteindre une différence significative ont été utilisés pour chaque procédure. Des calculs de puissance préalables ont été effectués pour prédéterminer la taille de l'échantillon à l'aide d'un logiciel en accès libre et sur la base d'expériences antérieures avec des modèles de cicatrisation similaires.

Raffinement

Tout le long du projet, les animaux auront un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Pour réduire au maximum le stress lié à l’isolement et que ce dernier n’influence pas les résultats de l’étude, les souris seront acclimatées 3 jours à l’environnement de l’animalerie puis hébergées dans des cages séparées 4 jours avant le début de l’expérimentation, en mélangeant une petite poignée de la litière précédente à la nouvelle litière lors du nettoyage des cages. Pour réduire au maximum le stress lié à l’isolement et que ce dernier n’influence pas les résultats de l’étude, les souris seront acclimatées 3 jours à l’environnement de l’animalerie puis hébergées dans des cages séparées 4 jours avant le début de l’expérimentation dans des cages en conditions standard d’animalerie, avec un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Le choix de la durée d’adaptation et d’isolement des souris est justifié par l’étude de la réaction immunitaire au greffon. Ainsi, la production de cytokines due au stress pourrait interférer avec notre étude, c’est pourquoi les souris doivent être adaptées à leur environnement afin de ne pas créer de biais supplémentaire. Par ailleurs, la durée d’adaptation a été réduite au maximum afin que la totalité de l’étude dure 21 jours. Le bien-être des animaux sera assuré par l’utilisation de moyens d’enrichissement du milieu de vie des animaux, par une visite quotidienne et un suivi analgésique avant, pendant et après les chirurgies. Une analgésie multimodale sera attribuée aux animaux associant du paracétamol quotidiennement (dans l’eau de boisson) pour une durée minimale de sept jours post-chirurgie (puis en fonction du comportement de l’animal) et un anti douleur en injection, 2 fois par jour pendant les 3 premiers jours après la chirurgie (puis en fonction du comportement de l’animal). Pour pallier l’éventuelle perte de poids, des gelées enrichies sont données aux animaux quotidiennement. Une grille de suivi des animaux est mise en place et des points limites ont été définis afin de réduire la souffrance animale. L’ensemble des effets indésirables sont pris en compte lors d’examens cliniques journaliers des animaux permettant la mise en place de traitements ou le cas échéants la mise à mort des animaux si les points limites sont atteints.

Choix des espèces

Nous avons choisi l’espèce souris car c’est un modèle largement décrit dans la littérature en ce qui concerne l’excision cutanée et l’évaluation de la greffe et la cicatrisation. De plus, la manipulation de cette espèce et de cette technique de chirurgie sont bien maîtrisées au sein du laboratoire. De plus, ce choix vise à standardiser ce modèle de greffe cutanée au sein du consortium expérimental du programme sur différents sites. Les souris seront utilisées au stade du jeune adulte (8 semaines). Un compromis a été effectué pour utiliser des souris à un stade du développement suffisamment avancé pour s’affranchir du cycle de croissance des souris (pouvant entrer en jeu dans les processus de greffe et de cicatrisation) mais suffisamment jeunes pour s’affranchir des processus de vieillissement de la souris.

Laissées vieillir jusqu'à dix-huit ou vingt et un mois, les souris de ce projet développent tumeurs, fibroses rénales, cataractes, alopécies et plaies cutanées, et le porteur anticipe qu'un cinquième d'entre elles mourra de mort naturelle avant la fin. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes. Chacune reçoit six injections en trois mois, trois prélèvements sanguins de 200 microlitres, trois collectes d'urine, de fèces et de poils, et douze pesées. Des points limites précoces sont annoncés dès les premiers signes de souffrance, alors que la dégradation liée à l'âge constitue ici le matériau même de l'expérience.

Objectifs

Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle d’une réponse immunitaire face à des cellules abîmées ou stressées par le vieillissement dites sénescentes. Nous avons observé que bloquer un composé présent sur les cellules sénescentes par un anticorps avait un effet bénéfique sur la survie des animaux et le développement des maladies liées à l’âge, notamment la fibrose pulmonaire. Cet effet est conservé jusqu’à un an après l’arrêt du traitement. Le sujet de cette étude est de comprendre le mécanisme de maintien de l’effet vaccinal induit par cet anticorps.

Bénéfices attendus

Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement. Cela pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement les cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections: chaque animal recevra 6 injections, réalisées toutes les deux semaines pendant une durée de 3 mois. Prélèvements sanguins : chaque animal fera l’objet de 3 prélèvements de 200 µL, réalisés une fois par mois pendant la durée de l’étude (3 mois). Collecte d’urine, de fèces et de poils : chaque animal sera soumis à une collecte mensuelle, soit 3 collectes au total. Pesées : chaque animal sera pesé une fois par semaine, soit 12 pesées sur la durée de l’étude. Ces interventions sont réalisées sur l’ensemble des 200 animaux inclus dans le projet.

Impact sur les animaux

Le phénotype âgé favorise l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 21 mois, nous anticipons une perte de 20 % des animaux par mort naturelle. Les souris âgées peuvent ainsi développer : des tumeurs, de la fibrose rénales, des cataractes, des alopécies et des plaies cutanées Les injections peuvent provoquer une très légère douleur et de l’inflammation sur le site d’injection et l’animal peut ressentir un stress au moment de la contention.

Devenir

Afin de caractériser l'effet de notre vaccination notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les différents organes des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire, cellulaire et histologique est indispensable pour évaluer les effets de notre anticorps sur le vieillissement cellulaire.

Remplacement

Nous avons montré in vitro que certaines cellules sénescentes (cellules stressées ou endommagées qui s’accumulent avec le vieillissement) produisent des molécules capables de bloquer l’action du système immunitaire. L’utilisation d’un anticorps spécifique a permis de restaurer cette action et de limiter le développement de la fibrose, avec un effet bénéfique sur la survie des souris. Ces résultats ont été observés à la fois dans des modèles de fibrose induite et chez des souris âgées. Ces expériences ont permis d’identifier les doses efficaces et le bon moment d’action de l’anticorps. Nous souhaitons désormais comprendre comment ce traitement agit dans un organisme complet, en particulier chez des animaux âgés, où les cellules sénescentes apparaissent naturellement. Les interactions entre cellules immunitaires et cellules sénescentes sont complexes et impliquent plusieurs organes. Aucune méthode in vitro ne peut reproduire cette complexité. Seule une étude chez l’animal permet de savoir si le traitement réduit bien la présence de cellules sénescentes, réactive le système immunitaire, et limite les maladies liées à l’âge tout en améliorant la santé à long terme.

Réduction

Pour cette étude, nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer une taille d'effet attendue et ajuster en conséquence le nombre d'animaux nécessaires en utilisant des données préliminaires. Cela garantit des résultats fiables, tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous mettons en place plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et la souffrance : Suivi quotidien : Les animaux seront observés chaque jour à l’aide d’une grille clinique. En cas de dégradation de leur état, la fréquence du suivi sera augmentée. Cohésion sociale : Les animaux seront hébergés par petits groupes compatibles, afin de préserver leur bien-être social tout au long de l’étude. Habituation : Une phase d’habituation à la manipulation est prévue avant les interventions, afin de limiter le stress lors des gestes expérimentaux. Points limites précoces : Des seuils d’arrêt clairement définis seront appliqués dès l’apparition des premiers signes de souffrance, pour éviter toute douleur inutile. Suivi longitudinal : Un suivi dans le temps permettra de détecter précocement d’éventuels signes de mal-être, notamment par le contrôle du poids, du comportement et de l’état général. Alimentation adaptée : En cas de difficultés de déplacement ou de prise alimentaire, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition directement dans la cage. Utilisation d'une méthode d'anesthésie (la plupart des animaux expérimentaux). Enrichissements supplémentaires : matériaux à manipuler (copeaux de bois compacts) et des objets à déplacer (bâtonnets) Toutes ces mesures sont mises en place pour limiter la souffrance, améliorer le confort des animaux, et garantir des conditions expérimentales éthiques et rigoureuses.

Choix des espèces

Le modèle murin a une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court. Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes et l’avancement des maladies.